ПРИМЕНЕНИЕ ГОМОЛОГИЧНЫХ КЛЕТОЧНЫХ ПЕПТИДОВ ПРИ

«Новые технологии микрохирургии глаза»
УДК 617.713
Борзенок С.А.1, Ролик О.И.1, Онищенко Н.А.2, Комах Ю.А.1,
Делекторская В.В.3, Шацких А.В.1
1
ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Росмедтехнологии , Москва
2
ФГУ «ФНЦ трансплантологии и ИО им. акад. В.И. Шумакова», Москва
3
Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
E#mail: oktarin@mail.ru
ПРИМЕНЕНИЕ ГОМОЛОГИЧНЫХ КЛЕТОЧНЫХ ПЕПТИДОВ
ПРИ СРЕДНЕСРОЧНОЙ КОНСЕРВАЦИИ ДОНОРСКИХ РОГОВИЦ
В ГИПОТЕРМИЧЕСКОМ РЕЖИМЕ
Исследовано защитное действие тканеспецифических регуляторных пептидов на эндотели
альные клетки донорских роговиц в процессе гипотермической консервации. Проанализирова
на плотность эндотелиальных клеток, проведена электронная микроскопия. Установлено, что
тканеспецифические регуляторные пептиды оказывают защитное действие на ультраструктур
ную архитектонику ЭК.
Ключевые слова: эндотелий роговицы, трансплантат роговицы, цитоплазматические пеп
тиды, регуляторные пептиды, консервация роговицы.
Актуальность
Проблема трупного тканевого донорства и
трансплантации роговицы является одним из
наиболее сложных и актуальных аспектов оф
тальмологии [3, 5, 1, 15, 14].
Для прозрачного приживления сквозного
трансплантата роговицы необходима макси
мальная сохранность жизнеспособности эндо
телиальных клеток (ЭК), обеспечивающих нор
мальную гидратацию и прозрачность посред
ством осуществления ими транспортной и на
сосной функций [14]. ЭК роговицы являются
высокодифференцированными и имеют нейро
глиальное происхождение [8, 7, 2, 13]. Так как
ЭК не способны к митотической регенерации,
при их значительной потере в посттрансплан
тационном периоде возникает сначала функци
ональная декомпенсация, затем необратимое
помутнение трансплантата [14].
Выкраивание и фиксация роговичного
трансплантата при сквозной и задней послой
ной кератопластиках сопровождаются потерей
ЭК, в связи с чем исходная плотность эндотели
альных клеток (ПЭК) должна быть не менее
28003000 кл/мм2 [15].
Однако уже на этапе консервации в ЭК
трупных донорских роговиц возникает ряд мор
фофунциональных перестроек, сопровождаю
щихся десквамацией ЭК и снижением их жиз
неспособности [12, 14].
В этой связи повышение жизнеспособнос
ти и стабилизация плотности ЭК трупных до
норских роговиц на этапе их консервации яв
ляется крайне важной и актуальной задачей [1].
Из анализа публикаций по проблеме куль
тивирования и консервации донорских роговиц
можно сделать вывод, что первостепенной за
дачей на сегодняшний день для среднесрочно
го хранения и последующего выполнения сквоз
ной и задней послойной кератопластик являет
ся усовершенствование составов консервацион
ных сред для сохранения жизнеспособности и
морфофункциональной сохранности эндоте
лиальных клеток трансплантатов донорских
роговиц, путем повышения биохимической ус
тойчивости к гипотермическому стрессу и вре
менному фактору [10].
Наибольший интерес в этой области вызы
вает добавление в культуральные среды и ра
створы для консервации различных биологи
чески активных веществ [16, 17, 18].
В целях восстановления и поддержания
структуры и функции ЭК трупных донорских
роговиц в процессе их консервации значитель
ный интерес могут представлять фармаколо
гические препараты на основе регуляторных
клеточных пептидов, полученные из тканей гла
за. К таким препаратам нового поколения от
носятся Цитамины отечественного производ
ства [4, 9] и тканевая панель препаратов NeyDIL
импортного производства [6, 11]. К сожалению,
отечественная фармакологическая промышлен
ность не производит препаратов регуляторных
пептидов с адресным действием к эндотелиаль
ным клеткам роговицы. До настоящего време
ни единственным органотропным препаратом,
полученным из регуляторных пептидов клеточ
ной цитоплазмы эмбриональных роговых обо
ВЕСТНИК ОГУ №14 (133)/ноябрь`2011
79
XXII Межрегиональная научно%практическая конференция с международным участием
лочек промышленных животных, является пре
парат NeyDIL Nr.37 «Cornea», который выпус
кается немецкой фирмой «VitOrgan», имеющий
Государственную регистрацию в Российской
Федерации.
Данные о фармакологической защите труп
ных донорских роговиц с помощью гомологич
ных регуляторных пептидов на этапе консер
вации в литературе отсутствуют.
Цель
Изучить влияние тканеспецифических ре
гуляторных пептидов на морфофункциональ
ную сохранность клеток эндотелия трупной
донорской роговицы в процессе консервации
методами нормотермического органного куль
тивирования и гипотермической консервации.
Материалы и методы
Для эксперимента были отобраны 20 до
норских роговиц лиц зрелого трудоспособного
возраста. Средний возраст доноров составил
32±4 лет. Время от смерти до консервации со
ставляло не более 12 часов.
Использовался моноорганный препарат
NeyDIL Nr.37, полученный из фетальных и юве
нильных роговиц крупного рогатого скота и
содержащий гомологичные клеточные пептиды
роговицы в концентрации 100 мкг/мл.
В эксперимент вошли донорские роговицы,
консервированные в гипотермических услови
ях при +4°С. Консервация трансплантатов до
норских роговиц проводилась в среде Борзен
каМороз.
Опытная группа состояла из 10 роговиц,
консервированных в среде БорзенкаМороз с
добавлением в опытную среду пептидного пре
парата NeyDIL Nr.37. Контрольная группа со
стояла из 10 роговиц парных глаз от тех же
доноров. Сроки консервации составили 3, 6, 9
суток, в эти же сроки проводился анализ мор
фометрических и ультраструктурных харак
теристик эндотелиальных клеток с помощью
электронной сканирующей и трансмиссион
ной микроскопии.
Сканирующая микроскопия проводилась
на растровом ионноэлектронном микроскопе
Quanta 200 3D (Голландия) с возможностью
проведения исследований объектов в режиме
естественной среды без применения глубокого
вакуума, напыления и жесткой фиксации с по
80
ВЕСТНИК ОГУ №14 (133)/ноябрь`2011
мощью альдегидов, что не нарушало архитек
тонику и морфометрию клеток.
Для трансмиссионного электронномикро
скопического исследования материал фиксирова
ли в 2,5% растворе глутарового альдегида по стан
дартной методике с последующей заливкой в эпок
сидную смолу ЭПОН812. Ультратонкие и полу
тонкие срезы готовили на ультрамикротоме LКВ
III (Швеция). Полутонкие срезы окрашивали
толуидиновым синим. Ультратонкие срезы кон
трастировали насыщенным раствором уранила
цетата и цитратом свинца и изучали в электрон
ном микроскопе JЕМ 1200 ЕХ II (Япония).
Исследования ПЭК, площади, показателя
гексагональности эндотелиальных клеток до
норских роговиц, проводились неинвазивным
способом с помощью компьютерного Кератоа
нализатора для Глазных банков Kоnan (Япо
ния). Для подсчета плотности эндотелиальных
клеток, а также для более полной оценки состо
яния эндотелиального пласта применялся ин
вертированный световой микроскоп 307 –
143.003 Leitz Wetzlar GmbH (Германия) с циф
ровой камеройокуляром DCM510 (Китай).
Результаты
Для ультраструктуры эндотелия роговицы
в норме характерна богатая органеллами ци
топлазма, содержащая большое количество ми
тохондрий. Такое обильное содержание орга
нелл обеспечивает выполнение эндотелием энер
гозатратной помпальной функции, при нару
шении которой роговица быстро набухает и
мутнеет. Поэтому при анализе результатов
электронной микроскопии в первую очередь
обращали внимание на ультраструктурную со
хранность митохондриального аппарата эндо
телиальных клеток.
При трансмиссионной микроскопии на 3
сутки гипотермической консервации не было
выявлено существенной разницы в ультраструк
турной архитектоники эндотелиальных клеток
опытной и контрольной групп (Рис. 1 А, Б). Но
на 6 сутки консервации в эндотелиальных клет
ках контрольной группы наряду с ультраструк
турно сохраненными органеллами присутству
ют митохондрии с совершенно прозрачным мат
риксом, кристы которых либо отсутствовали
либо были фрагментированы (Рис. 1Г).
На 9 сутки консервации в эндотелиальных
клетках опытной группы митохондрии имели
«Новые технологии микрохирургии глаза»
округлую форму, отмечался начинающейся отек
митохондриальных мембран, кристы митохон
дрий были сохранены (Рис. 2А, Б), в то время
как в контроле выявлены грубые ультраструк
турные изменения, цитоплазма фрагментиро
вана, цитоплазматический матрикс просветлен,
в нем видны многочисленные пузырьки различ
ного размера практически полное отсутствие со
хранных органелл, что является явным призна
ком аутолиза (Рис. 2В, Г).
При сканирующей ЭМ на 9 сутки в опыте
отмечался полимегитизм, но клетки сохранили
гексо и пентогональность (Рис. 3А,Б) В конт
роле выявлено выраженное разрушение меж
клеточных взаимоотношений, уменьшение элек
троннооптической плотности внутри клеток,
свидетельствующее о деструкции цитоскелета
и липидного слоя мембран, что не наблюдалось
в опытной группе (Рис. 3В,Г).
Было проведено дополнительное электрон
номикроскопическое исследования роговиц
опытной и контрольной групп на 12 сутки кон
сервации. И в опытной, и в контрольной груп
пах были выявлены грубые ультраструктурные
повреждения пласта эндотелия.
За 9 сут гипотермической консервации по
теря ЭК в опытной группе составила 4,1%, в
контрольной – 7,2%.
Площадь клеток в опыте увеличилась на
1,8%, в контроле на 2,9%, процент гексагональ
ных клеток к 9 суткам в опыте снизился на всего
6,86%, а в контроле на 28%.
Заключение
Выполненное исследование показало, что
присутствие регуляторных клеточных пептидов
в средах для гипотермической консервации донор
ской роговицы в процессе среднесрочной консер
вации, способствовало стабилизации ПЭК. При
гипотермической консервации донорских роговиц
человека (до 9 суток) с применением клеточных
регуляторных пептидов роговицы, потеря эндо
телиальных клеток была всего 4,1% и допустимо
возможной для выполнения сквозной кератопла
стики по сравнению с роговицами контрольной
группы, где потеря составила 7,2%.
На основании анализа сканирующей и
трансмиссионной электронной микроскопии
можно сказать, что гомологичные клеточные
пептиды оказали выраженное протективное дей
ствие как на липопротеидный слой клеточных
мембран, так и на ультраструктурную архитек
тонику органелл эндотелия донорских роговиц
в процессе гипотермической консервации.
10.11.2011
Рисунок 1
Рисунок 2
Рисунок 3
ВЕСТНИК ОГУ №14 (133)/ноябрь`2011
81
XXII Межрегиональная научно%практическая конференция с международным участием
Список литературы:
1. Борзенок С.А. Медикотехнологические и методологические основы эффективной деятельности Глазных тканевых банков
России в обеспечении операций по сквозной трансплантации роговицы // Дис. ... дра мед. наук. – М. 2008. С. 309.
2. Вит В.В. Строение зрительной системы человека. Одесса: «АстроПринт», 2003. – 655 с.
3. Каспаров А.А., Ермаков Н.В., Раппопорт Ю.М. Эндотелий трансплантата донора после сквозной кератопластики //
Вестн. офтальмол. 1990. т. 106. № 5. С. 1216.
4. Максимов И.Б. Применение препарата ретиналамин в офтальмологии. // Пособие для врачей. СПб., 2005.20с.
5. Мороз З.И., Тахчиди Х.П., Калинников Ю.Ю. и др. Современные аспекты кератопластики //Федоровские чтения –
2004. «Новые технологии в лечении заболеваний роговицы». – М., 2004. – С. 280288.
6. Ролик И.С. Пептидотерапия: клиническое применение. М.: РегБиоМед, 2010. 448 с.
7. Ронкина Т.И. Закономерности возрастных изменений эндотелия роговицы человека в норме и патологии, возможности
активации пролиферации эндотелия и их назначение в офтальмологии: Дис. дра мед. наук в форме науч. доклада. М.,
1994. 48 с.
8. Федоров С.Н., Ронкина Т.И., Явишева Т.М. Эндотелий роговицы человека. – М.: МНТК «Микрохирургия глаза», 1993.
– 126 с.
9. Хавинсон В.Х., Трофимова С.В. Пептидные биорегуляторы в офтальмологии. // СПб, 2003. 44 с.
10. Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Кирпатовский В.И. Фармакологическая защита трансплантата. М.: Медицина, 1983.
232 с.
11. Heine H. Wissenschaftliche Grundlagen der Organtherapie. // Tierдrztliche Umschau. 1996.51. P.7173.
12. Hsu J.K.W., Cavanagh H.D., Jester J.V. et al. Changes in corneal endothelial apical functional protein organization after corneal
cold storage //Cornea. 1999. Vol. 18. N 6. P. 712720
13. Hwang D.G. Proliferative Capacity of the Corneal Endothelium //V World Cornea Congress. Washington, DC, 2005. – P. 16.
14. Krachmer J.H., Mannis M.J., Holland E.J. Cornea. Fundamentals, Diagnosis and Management: 2nd Edition. ElsevierMosby,
2005. – Vol. 1. – 1409 p.
15. Melles G.R., Eggink F., Lander F. A surgical technique for posterior lamellar keratoplasty // Cornea. – 1998. № 17. – P. 618–626.
16. Tripathi B.J., Kwait P.S., Tripathi R.C. Corneal growth factors: a new generation of ophthalmic pharmaceuticals //Cornea. 1992. Vol. 9. P. 29.
17. Vincent P. T. Hoppenreijs, Elisabeth Pels, Gijs F.J. M. Vrensen and W. Frits Treffers. Basic fibroblast growth factor stimulates
corneal endothelial cell growth and endothelial wound healing of human corneas // Invest Ophthalmol Vis Sci. 1994. Vol.35.
№.3.P.931944.
18. Xin Gu, EunDuck P. Kay. Distribution and Putative Roles of Fibroblast Growth Factor2 Isoforms in Corneal Endothelial
Modulation// Invest Ophthalmol Vis Sci. 1998. Vol. 39. №. 12. Р. 22522258.
UDC 617.713
Borzenok
S.A. 1 ,
Rolik
O.I. 1 ,
Oniscenko
N.A. 2,
Komakh
Y.A. 1 ,
Delektorskaya V.V.3, Shatskikh A.V.1
1
The S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution, Moscow
2
Academician V.I. Shumakov Federal Research Center of Transplantology and Artificial Organs, Mos
cow
3
N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow
THE USE OF HOMOLOGOUS CELLULAR PEPTIDES DURING MEDIUMTERM CORNEAL COLD STOR
AGE
There was studied the protective effects of homologous cellular peptides on corneal graft endothelium cells
during the medium#term corneal cold storage. The analysis of endothelial cell density, scanning and transmis#
sion electronic microscopy were performed. Tissue#specific regulatory corneal peptides exhibited clear protec#
tive effect on ultra structure of grafts’ endothelial cells during the preservation.
Key words: cornea endothelium cells, corneal graft, cytoplasm peptides, regulatory peptides, cornea preser#
vation.
82
ВЕСТНИК ОГУ №14 (133)/ноябрь`2011