ПРЯМЫЕ И ОТДАЛЕННЫЕ ЭФФЕКТЫ РАДИАЦИОННОГО ОБЛУЧЕНИЯ У ПРОСТЕЙШИХ И РАКООБРАЗНЫХ

На правах рукописи
САРАПУЛЬЦЕВА Елена Игоревна
ПРЯМЫЕ И ОТДАЛЕННЫЕ ЭФФЕКТЫ
РАДИАЦИОННОГО ОБЛУЧЕНИЯ
У ПРОСТЕЙШИХ И РАКООБРАЗНЫХ
03.01.01 – радиобиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Москва − 2015
Работа выполнена в Обнинском институте атомной энергетики –
филиале ФГАОУ ВПО «Национальный исследовательский ядерный
университет «МИФИ» (ИАТЭ НИЯУ МИФИ)
Официальные оппоненты:
Д.б.н., профессор, Медицинский радиологичеУльяненко
Лилия Николаевна
ский научный центр им. А.Ф. Цыба - филиал
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский радиологический центр»
Гапеев
Андрей Брониславович
Д. физ-мат. н., профессор, ФГБУН «Институт
биофизики клетки» РАН
Чуйко
Григорий Михайлович
Д.б.н., ФГБУН «Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина» РАН
Ведущая организация: ФГБУ ГНЦ «Федеральный медицинский
биофизический центр имени А. И. Бурназяна» ФМБА России
Защита диссертации состоится 7 апреля 2016 г. в 16.30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.65 по защите докторских
и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном
бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени
М. В. Ломоносова» по адресу 119234, Москва, Ленинские горы,
МГУ, д. 1, стр. 12, биологический факультет, аудитория 389.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ
имени М.В. Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, д. 27) и на сайте биологического факультета
www.bio.msu.ru
Автореферат разослан «24» декабря 2015 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета, д.б.н.
Веселова Т.В.
2
Актуальность проблемы. Комплекс факторов окружающей
среды природного и антропогенного происхождения, способных
оказывать влияние на биологические системы, включает широкий
спектр химических и физических агентов. Среди радиационных факторов значимыми в практическом отношении являются γ-излучение
и радиоволны. Широкое использование ядерной энергии позволило
достичь значительных успехов во многих отраслях науки и техники.
При этом невозможно исключить попадание источников излучения в
окружающую среду в связи с авариями на атомных объектах, захоронением радиоактивных отходов, использованием ядерных технологий в медицине, сельском хозяйстве и промышленности. В настоящее время создается система оценки действия ионизирующей радиации на компоненты природной среды [ICRP, 2008, 2009]. Развитие
беспроводных технологий радиосвязи (мобильная сотовая связь,
WiFi, GPS и проч.) обуславливает усиление электромагнитного загрязнения среды радиоволнами низкой интенсивности. При этом вопрос об оценке допустимых уровней радиочастотного излучения на
природные экосистемы в нормативных документах не рассматривается.
Оценка действия ионизирующего излучения на биоту была определена в качестве необходимого подхода к защите и смягчению последствий возможных радиоактивных выбросов в окружающую среду международными директивами (например, ERICA и PROTECT
[Howard et al., 2008; 2010]). Однако, несмотря на то, что необходимость радиационной защиты окружающей среды уже давно установлена, отсутствие научного консенсуса относительно диапазона доз,
при которых происходят значимые биологические эффекты у разных
представителей биоты, и согласованных данных разных лабораторий
мира затрудняет оценку риска радиоактивного загрязнения окружающей среды [Beresford, Copplestone, 2011; Garnier-Laplace et al.,
2013]. Для химического загрязнения антропогенного происхождения
концепция защиты (т.е., понятие оценки экологического риска) хорошо разработана [Bréchignac, 2003].
В диссертационной работе предложены принципы построения
биомониторинга на простейших и ракообразных для обеспечения
3
более детального анализа последствий радиационного воздействия
на окружающую среду. Акцент сделан на приоритетность научных
исследований на ракообразных, группе организмов, которые определены в качестве ключевой модели для разработки экологических основ радиационной защиты [ICRP, 2009].
Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в оценке
радиационных эффектов ионизирующего и неионизирующего излучения на субклеточном и организменном уровнях у облученных инфузорий Spirostomum ambiguum и ракообразных Daphnia magna и их
потомства в нескольких пострадиационных поколениях и в разработке на этой основе принципов биологического мониторинга радиоактивного загрязнения гидросферы.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить
следующие задачи.
1. Установить закономерности формирования прямых радиационно-индуцированных биологических эффектов от источников
ионизирующего излучения в широком диапазоне доз у простейших
Spirostomum ambiguum и ракообразных Daphnia magna по изменению показателей выживаемости, продолжительности жизни и плодовитости и оценить возможность использования этих тесторганизмов и тест-функций в качестве модели для радиационных
исследований.
2. Установить закономерности формирования отдаленных радиационно-индуцированных биологических эффектов от источников
ионизирующего излучения в широком диапазоне доз в нескольких
пострадиационных поколениях у простейших S. ambiguum и ракообразных D. magna при вегетативном и партеногенетическом размножении.
3. Выявить закономерности формирования прямых и отдаленных
биологических эффектов от разных источников ионизирующего и
неионизирующего излучения у S. ambiguum по морфофункциональным критериям (поведенческая активность и морфология) и оценить
возможность использования этих тест-функций в качестве показателей радиационного стресса.
4
4.
Проанализировать
биохимические
радиационноиндуцированные эффекты: вклад свободнорадикальных реакций в
формирование прямых и отдаленных эффектов облучения, изменение метаболической активности и эпигенетические нарушения у D.
magna в нескольких поколениях.
5. Разработать принципы построения биологического мониторинга действия на гидробионтов радиационного фактора на основе анализа прямых и отдаленных эффектов у простейших S. ambiguum и
ракообразных D. magna при надфоновых уровнях облучения.
Научная новизна. Впервые на единой методологической основе
проведен всесторонний анализ прямых и отдаленных (в нескольких
пострадиационных поколениях) эффектов облучения у представителей двух филогенетических групп низших гидробионтов: инфузорий
Spirostomum ambiguum и ракообразных Daphnia magna, по изменениям ряда биологических показателей, вызванных ионизирующим и
неионизирующим излучением в широком диапазоне доз, включая
низкие и средние их уровни.
Впервые выявлены диапазоны доз острого γ-облучения, вызывающие изменение продолжительности жизни и плодовитости у облученных S.ambiguum и D. magna и их потомства в ряду вегетативных
и партеногенетических поколений.
Впервые описан нелинейный характер кривой «доза – эффект» по
изменению поведенческой активности простейших S. ambiguum при
радиационном воздействии.
Впервые описан процесс восстановления жизнеспособности ракообразных D. magna во втором пострадиационном поколении после
острого γ-облучения исходной выборки.
Впервые описаны закономерности формирования прямых и отдаленных эффектов облучения в электромагнитном поле сотовой связи
у инфузорий S. ambiguum. Показана возможность применения поведенческого критерия для оценки радиационного стресса.
Впервые разработана система построения биологического мониторинга для оценки радиационных эффектов острого облучения на
простейших и ракообразных. Принцип биологического мониторинга
основан на анализе радиационно-индуцированных эффектов в не5
скольких пострадиационных поколениях. Подчеркнута значимость
исследований на Daphnia magna в качестве тест-объекта. Биологические характеристики этих ракообразных хорошо изучены. Они являются одним из важных звеньев пищевой цепи водных экосистем и
широко применяются в экотоксикологических исследованиях степени загрязнения гидросферы. Применяемый в лабораторных условиях
анализ партеногенетических поколений дафний дает возможность
изучить дозовый и временной интервал, при которых происходит
восстановление популяции.
Практическая значимость. Доказана биологическая значимость
радиационных воздействий в низких и средних дозах от разных источников излучения как фактора окружающей среды, требующего
контроля в рамках экологического мониторинга.
Предложено и экспериментально обосновано введение в практику
радиационного контроля окружающей среды инфузорий S. ambiguum
и ракообразных D. magna как доступных универсальных тестобъектов, пригодных для оперативных оценок.
Доказана эффективность использования инфузорий S. ambiguum и
ракообразных D. magna для исследования прямых и отдаленных эффектов действия ионизирующих и неионизирующих излучений на
организм, что позволяет не только ускорить получение результатов
оценки, но и сделать такие исследования более экономичными и гуманными.
Разработанная система биологического мониторинга на простейших и ракообразных внедрена в учебный процесс подготовки научных кадров всех уровней высшего профессионального образования
(бакалавров, магистров и аспирантов) по направлениям «Биология»
и «Экология и природопользование» в Обнинском институте атомной энергетики – филиале национального исследовательского ядерного университета «МИФИ».
Материалы диссертации включены в учебник «Биологический
контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирование»,
получившего рекомендательный Гриф Министерства образования и
науки РФ в качестве учебного пособия для студентов вузов.
6
Положения, выносимые на защиту.
1. Ракообразные Daphnia magna могут быть предложены в качестве референтного вида в биологическом мониторинге радиоактивного загрязнения гидросферы, построенном на анализе прямых и
отдаленных радиационно-индуцированных эффектов в нескольких
поколениях. Плодовитость D. magna является более чувствительным
критерием радиационного облучения, чем выживаемость.
2. Прямые и отдаленные биологические эффекты от разных источников ионизирующего и неионизирующего излучения у инфузорий Spirostomum ambiguum и ракообразных D. magna имеют нелинейную зависимость от дозы с порогом в области низких и средних
доз и выходом на плато, высокую чувствительность к этим дозам и
способность сохраняться в ряду пострадиационных поколений. У
ракообразных восстановление продолжительности жизни и плодовитости происходит во втором пострадиационном поколении.
Апробация работы. Работа апробирована на расширенном заседании кафедры «Биология» ИАТЭ НИЯУ МИФИ. Работа также
представлена на заседаниях кафедры гидробиологии и научном семинаре кафедр биофизики и радиоэкологии и экотоксикологии МГУ
им. М.В. Ломоносова.
Основные положения диссертационной работы и результаты исследований представлены на международных симпозиумах по биоиндикаторам (Сыктывкар, 2001; Москва, 2009, 2013); международных экологических симпозиумах (Екатеринбург, 2001; Москва, 2002,
2004; Рим, 2003; Борок, 2005, 2007, 2008; Оренбург, 2006; Астрахань,
2007; Минск, 2008, 2009; Алушта, 2011), международных конференциях и конгрессах по радиационной защите (Монако, 2002; Хельсинки, 2010; Гамильтон, 2011; Глазго, 2012; Плимут, 2012; Барселона, 2014), по неионизирующим излучениям (Калуга, 2005, 2008;
Санкт-Петербург, 2009, 2012, 2015), по радиационным исследованиям (Антверпен, 2002; Москва, 2001, 2006, 2010, 2014; Ереван, 2005;
Сыктывкар, 2009; Варшава, 2011; Лондон, 2012; Стокгольм, 2013;
Дублин 2013; Оксфорд, 2014).
Результаты диссертационной работы получены при выполнении
НИР в рамках целевой программы сотрудничества Министерства
7
образования РФ и Министерства РФ по атомной энергии по направлению «Научно-инновационное сотрудничество» в 2002−2004 гг.; по
темпланам НИР Обнинского государственного технического университета атомной энергетики, проводимых по заданию Федерального агентства по образованию (2005−2011 гг.); по Федеральной
целевой программе «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009−2013 гг. Госконтракт № П968
(2010−2012 гг.), а также по грантам РФФИ № 12-08-97540
(2012−2013 гг.) и № 14-48-03002 (2014−2016 гг.).
Результаты, полученные в диссертационной работе, внедрены в
образовательный процесс ИАТЭ НИЯУ МИФИ подготовки научных
кадров всех уровней высшего образования (бакалавриат, магистратура и аспирантура) по направлениям «Биология» и «Экология и
природопользование».
Личный вклад автора. Автор лично участвовал в формулировке
проблемы, постановке цели и задач, планировании и проведении
экспериментальных исследований, обосновании методологических
подходов, разработке методов исследования, их проведении и анализе полученных экспериментальных данных, интерпретации результатов, формулировке выводов, подготовке отчетов и публикаций.
Под руководством автора в рамках грантов ФЦП и РФФИ работала
научная группа, состоящая из студентов, аспирантов и молодых ученых. Под руководством автора в заявленном направлении защищены
две кандидатские диссертации и 11 дипломных работ, результаты
которых обобщены в данной работе.
Публикации. По материалам исследования опубликованы 116
работ. Из них пять статей в международных изданиях, 28 статей в
рецензируемых журналах из перечня ВАК, в том числе четыре в переводных изданиях. Опубликованы два учебника с Грифами Минобрнауки РФ и УМО по классическому университетскому образованию и 12 учебных пособий для студентов вузов.
Структура и объем диссертационной работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, списка используемых источников. Работа изложена на 218 с., содержит 33 рисунка
и 23 таблицы. Список литературы включает в себя 316 источников,
из них 229 на иностранном языке.
8
Глава 1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1.1 Объекты исследования
В работе использовали одноклеточных простейших инфузорию
Spirostomum ambiguum. Культивировали тест-объект в массовой
культуре в биологических пробирках при температуре 20  2о С,
кормили пищевыми дрожжами раз в неделю. Другим объектом исследования были ракообразные Daphnia magna. Дафний культивировали в биологических стаканах в климатостате марки Р2 (Спецкомплектресурс, Россия) в режиме свет-тьма 12:12 ч при оптимальной температуре 20±2о С. Кормили через сутки суспензией водорослей Chlorela vulgaris (1200 тыс. кл/мл).
1.2 Схема облучения γ-квантами
Облучение γ-квантами проводили на базе Медицинского радиологического научного центра (ФГБУ МРНЦ им А.Ф. Цыба Минздрава РФ, г. Обнинск) на терапевтической установке «Луч-1»
(Латвэнерго, Латвия, 60Со) в дозах 0,01 – 10 Гр (мощность дозы 2,8 –
100 сГр/мин) и «Исследователь» (Россия, 60Со) в дозах 20 – 1500 Гр
(мощность дозы 19 – 33 Гр/мин). Дозиметрический контроль и облучение тест-объектов осуществляли специалисты лаборатории медицинской радиационной физики МРНЦ. Инфузорий облучали в массовой культуре с плотностью посадки 30 − 50 особей/мл вне зависимости от клеточного цикла. Дафний облучали на первые сутки после
рождения, отбирая для анализа особей из третьего помета. В облучаемом объеме было не более 1 особи на миллилитр воды. Контрольные выборки простейших и ракообразных всегда находились в тех
же условиях, но облучению не подвергались. ЛД50 для инфузорий
составляет 1000 и более Гр, для дафний – 50 Гр [Choppin et al., 1995;
Сахаров, 2006].
1.3 Схема облучения в радиочастотном поле
Облучение в низкоинтенсивном радиочастотном (НИ РЧ) поле
проводили на кафедре «Экология» Обнинского ИАТЭ НИЯУ МИФИ
на лабораторных установках, генерирующих электромагнитное излучение с частотой 1 ГГц (диапазон мобильной связи) и 10 ГГц
(диапазон радаров и спутникового телевидения). Исследуемые плотности потока энергии (ППЭ) составляли 0,05, 0,10 и 0,50 Вт/м2 и ле9
жали в диапазоне принятых в РФ допустимых уровней воздействия
на население [CанПиН, 2003]. Электромагнитный фон в лабораторном помещении не превышал 0,0015 Вт/м2. Плотность потока энергии контролировали приѐмником П3-54 (Риал, Нижний Новгород) с
ошибкой измерения 12 %, температуру − инфракрасным термометром (Precision Mastech Enterprises, Китай) с точностью ± 0,1o C.
Облучение тест-объектов проводили в открытых пластиковых
чашках Петри диаметром 3,5 см в 5 мл воды согласно табл. 1.
Таблица 1 − Схема облучения в низкоинтенсивном радиочастотном поле
Частота облучения, ГГц
1
10
ППЭ, Вт/м2
0,05
0,10
0,50
0,05
0,10
0,50
Время экспозиции, ч
5; 7, 8, 9, 10
0,25; 0,50; 0,75; 1; 2; 3; 4; 6; 8; 10
0,05; 0,08; 0,17; 0,33; 0,5; 0,75; 1
1; 2; 3; 4; 5; 6; 7, 8, 9, 10
0,25; 0,50; 0,75; 1; 2; 3; 4; 6; 8; 10
0,05; 0,08; 0,17; 0,33; 0,5; 0,75; 1
Плотность посадки инфузорий составляла 30 − 50 особей/мл. Высота водного столба не превышала 0,5 см. Дозу электромагнитного
излучения выражали в Дж/м2 по формуле:
Эдоза (Дж/м2)=ППЭ (Вт/м2)·t (ч)·3600,
(1)
где ППЭ – плотность потока энергии, t – время экспозиции в
электромагнитном поле, ч.
1.4 Методы анализа прямых и отдаленных радиационноиндуцированных биологических эффектов
Методы, примененные для анализа эффекта у инфузорий, и объем
исследуемого материала в контрольных и облученных группах простейших, приведены в табл. 2.
Клеточный цикл инфузорий составляет 2 − 3 сут [Witcherman,
1986], двигательная активность в норме − 2,5 см/мин [Александров,
1958]. В каждой серии опытов в контрольных и дозовых группах
было от 20 до 50 особей.
10
Таблица 2 – Методы анализа и количество инфузорий в опытах
Метод
Эффект, особей
Прямой
Ссылки
Отдаленный
Выживаемость в «индивидуальных линиях» в 10-15
поколениях
456
456
[Witcherman
1986; Бычковская, 2006]
Поведенческая активность.
Метод «открытого поля» в
10-15 поколениях
4500
3400
[Тушмалова,
1986; 2004]
Морфометрические изменения. Метод прижизненной
компьютерной морфометрии в программе Imige-Pro
1350
2400
[Тирас и др,
2013]
Размножающихся партеногенетически дафний культивировали
индивидуально в стеклянных лабораторных стаканах в объеме 50 мл
воды. В каждой контрольной и дозовых группах в каждой серии
опытов было от 20 до 40 особей. Из 1-суточных новорожденных
дафний третьего помета исходной контрольной и облученной выборок формировали первое поколение, которое не облучали. Аналогичным образом из первого поколения получали второе и третье поколения и анализировали методами, приведенными в табл. 3.
В работе впервые применен клеточный МТТ-тест, который широко используется для оценки цитотоксичности противоопухолевых
лекарственных препаратов. Метод основан на способности дегидрогеназ активно пролиферирующих клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетра-зола
(МТТ) до голубого фармазана. Понижение показателя оптической
плотности в МТТ-тесте в опытах in vitro отражает токсичность исследуемых агентов за счет инактивации митохондриальных дегидрогеназ [Van Meerloo et al., 2011].
11
Таблица 3 – Методы анализа и количество дафний в опытах
Метод
Эффект, особей
Ссылки
Прямой
Отдаленный
Выживаемость, анализ рисков в поколениях F0, F1, F2, и
F3 от 21 до 60 сут
680
502
[OECD, 2011]
Средняя продолжительность
жизни. Метод КапланаМейера в поколениях F0 и F1
до 90 сут
320
120
[Rothman,
Greenland, 1998]
Плодовитость по трем показателям в поколениях F0, F1 и
F2 до 21 сут
159
237
[OECD, 2011]
Биохимическая активность
МТТ-методом в поколениях
F0, F1 и F2
302*
400*
[Cancer Cell Culture. Methods
and Protocols,
2011]
Уровень свободных радикалов в поколениях F0 и F1 радиоиндикаторным методом
привитой сополимеризации.
27**
27**
[Козлов, 1970;
Мелехова, 2010]
Метилирование ДНК в поколениях F0 и F1 методом жидкостной хроматографии.
23*
13*
[Vandegehuchte
et al., 2009-2012]
*количество образцов по 50 особей в каждом
**количество образцов по 20 особей в каждом
Анализ изменения в паттерне метилирования ДНК выполнен дром Michal Vandegehuchte в лаборатории экотоксикологии и водной
экологии университета г. Гент (Бельгия).
12
1.5 Статистическая обработка данных
В каждом опыте проведено не менее трех независимых серий
экспериментов. Статистическая обработка выполнена с помощью
пакета программ SYSTAT 13 и STATISTICA 12. Проведен лог-ранк
тест для оценки динамики выживаемости в облученных и контрольных выборках. Гомогенность количественных признаков внутри
групп и значимость отличия с контрольной группой оценивали тестом Крускала-Уоллиса с поправкой Бонферрони на множественное
сравнение, гомогенность качественных признаков – с помощью χ2теста [Hosmer et al., 2008].
Глава 2 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
2.1 Прямые и отдаленные радиационно-индуцированные эффекты выживаемости у облученных инфузорий Spirostomum ambiguum и их необлученного потомства
Ежедневные наблюдения за индивидуальными линиями спиростом в 96-луночных планшетах в течение 30 сут показали, что в каждой совокупности подопытных линий происходит более интенсивное снижение их численности, чем в контроле (рис. 1 А). При этом
речь идет об изменениях в выживаемости, которые проявляются и у
отдаленного потомства облученных особей, размножающихся делением. Из рисунка 1 Б видно, что с увеличением дозы облучения происходит снижение жизнеспособности особей. В диапазоне доз от
0,01 до 20 Гр значимых отличий с контролем не обнаружено (Р =
0,498). Повышение частоты гибели простейших в индивидуальных
линиях наблюдали только после облучения в дозе 50 Гр (Р = 0,002).
При этом в диапазоне 50 – 500 Гр обнаружилось дозонезависимое
плато (Р = 0,617). При облучении в дозах 1000 и 1500 Гр гибель инфузорий происходила в ранние сроки после облучения либо без деления, либо после не более двух делений. ЛД50 для инфузорий составляет 1000 и более Гр. При облучении в дозах до 500 Гр темп деления спиростом по сравнению с темпом деления в контрольных
группах не изменялся.
13
А
Р = 0,6171
Б
Рис. 1 − А − динамика выживаемости инфузорий S. ambiguum в
«индивидуальных линиях» в контроле и после γ-облучения, Б − кривая «доза-эффект» к 30-м сут после облучения в % к контролю со
стандартными ошибками (SE) для процентных величин.
Цифрами на графике обозначены дозы исходных выборок, Гр;
1 – 0,01, 2 – 0,1, 3 – 1, 4 – 20, 5 – 50, 6 – 100, 7 – 200, 8 – 1000 и
9 – 1500, n – количество особей.
14
За 30 сут наблюдения спиростомы поделились в среднем 10 – 15
раз, что соответствует клеточному циклу 2 – 3 сут [Witcherman,
1986]. Следовательно, облучение может вызвать отдаленные эффекты снижения численности простейших.
2.2 Прямые и отдаленные радиационно-индуцированные эффекты выживаемости и продолжительности жизни у ракообразных Daphnia magna в нескольких поколениях
Установленные на инфузориях закономерности сравнивали с радиационно-индуцированными эффектами у многоклеточного организма − ракообразного D. magna. ЛД50 для дафний составляет около
50 Гр. Эффект изменения выживаемости и средней продолжительности жизни у облученных в дозах 10, 100 и 1000 мГр дафний проанализирован методом Каплана-Мейера [Rothman, Greenland, 1998] в
60-суточном эксперименте (рис. 2 А).
Расчеты показали, что при облучении в дозе 10 мГр продолжительность жизни дафний значимо не отличается от контроля
(Р = 0,075). C увеличением дозы до 100 и 1000 мГр обнаружено статистически значимое снижение выживаемости и средней продолжительности жизни на 20 – 30 % (Р = 0,0004 и Р = 3,8·10-5 соответственно). При этом разница между средней продолжительностью
жизни дафний в этих двух группах была статистически не значима
(Р = 0,141).
На рисунке 2 Б представлена кривая «доза-эффект» для выживаемости дафний к 30-м сут после облучения в широком диапазоне доз,
на которой усреднены результаты по всем независимым сериям экспериментов. Видно, что значимое снижение выживаемости рачков
происходит скачкообразно при облучении в дозе 0,1 Гр. Далее
наблюдается дозонезависимый участок протяженностью до 20 Гр, в
пределах которого выживаемость значимо не меняется и остается
ниже, чем в необлученных группах дафний (Р = 0,626). При более
высоких дозах (100, 250 и 600 Гр) имеет место переход к линейной
зависимости гибели животных с увеличением дозы облучения.
15
А
n = 120 n = 80
Р = 0,08
n = 80
Р < 10-5
n = 80
n = 45
Р = 0,6262
n = 45
Б
Рис. 2 – А – динамика выживаемости дафний в контроле и после
облучения в дозах 10, 100 и 1000 мГр в % относительно исходного
количества дафний в каждой выборке (N=40), Б − кривая «дозаэффект» для выживаемости дафний на 30-е сут после облучения в
дозах 0,01 – 600 Гр в % к соответствующему контролю со стандартными ошибками (SE)
16
Как показано на рис. 3, выживаемость в потомстве дафний поколения F1, полученного от облученных в дозах 100 и 1000 мГр дафний исходной выборки, также потенциально более низкая, чем у
рачков из контрольной группы.
Рис. 3 − Выживаемость D. magna в первом поколении в контроле
и в группах, облученных в поколении F0 в дозах 100 и 1000 мГр, в %
относительно исходного количества дафний в каждой выборке
(N=40)
Средняя продолжительность жизни дафний в первом поколении,
как и в непосредственно облученной выборке, на 20% ниже, чем в
контрольных группах. Величина эффекта значимо отличалась от
средней продолжительности жизни дафний в контроле (P = 0,007 и
P = 0,018 соответственно для дозовых групп 100 и 1000 мГр) и не
зависела от дозы облучения исходной выборки при этих значениях
доз (P = 0,366).
Таким образом, необлученное потомство поколения F1 проявляет
качественно те же реакции, что и особи в поколении F0 (рис. 4). Это
указывает
на
возможность
сохранения
радиационноиндуцированного эффекта при партеногенетическом размножении.
Проведя соответствующие наблюдения в выборках более отдаленно17
го потомства дафний, облученных в дозах 100 и 1000 мГр, было обнаружено, что эффект не сохраняется в поколениях F2 и F3 (рис. 4).
Рис. 4 − Выживаемость D. magna в четырех поколения к 21-м сут
в % по отношению к соответствующему контролю. * Р<0,05. N=40 в
каждой выборке поколений F0 и F1 и N=20 в поколениях F2 и F3
Приведены средние значения со стандартными ошибками
2.3 Прямые и отдаленные радиационно-индуцированные эффекты изменения плодовитости у D. magna в поколениях
В эксперименте, направленном на анализ радиационноиндуцированных эффектов изменения плодовитости у ракообразных
D. magna в облученном поколении F0 и в поколениях F1 и F2, которые не облучали, дафнии начинали производить потомство в среднем с 9-суточного возраста, что соответствует биологической норме
[Ebert, 2005].
Дафний исходных выборок остро облучали в дозах 10, 100, 1000 и
10 000 мГр. Опыты проводили при ежедневном анализе выживаемости и плодовитости в 21-суточном эксперименте в каждом поколении. Исходное количество дафний, использованное в эксперименте,
составило 396 особей. Количество дафний, выживших во всех дозо18
вых группах и в контроле к концу опыта − 357 особей. Таким образом, общая выживаемость дафний составила 90,15%.
В табл. 4 представлены данные по выживаемости и средней продолжительности жизни дафний в контроле и дозовых группах в трех
поколениях. Приведены статистические различия с показателями в
контрольных выборках дафний.
Таблица 4 – Радиационно-индуцированный эффект изменения
выживаемости и продолжительности жизни
Доза, мГр
10
100
1000
10000
Контроль: N0=83, NT=81, Средняя продолжительность жизни 20,77 сут
Поколение F0
Анализируемая выборка
34
30
31
31
дафний, N0
Число выживших особей, NT 31
27
26
26
Ср. продолжительность
19.98
20.02
18.98
19.58
жизни, сут
Z*
1.577
1.751
2.739
2.724
p†
0.4596
0.3200
0.0248
0.0256
Поколение F1
N0
28
26
30
28
Число выживших особей, NT 27
24
24
22
Ср. продолжительность
20.43
19.89
19.01
19.51
жизни, сут
Z*
0.340
1.273
3.258
3.349
p†
1
0.8210
0.0044
0.0032
Поколение F2
N0
17
20
18
20
Число выживших особей, NT 16
19
16
18
Ср. продолжительность
20.57
20.56
20.05
20.49
жизни, сут
Z*
0.742
0.604
1.689
1.543
p†
1
1
0.3652
0.4912
Лог-ранк тест для оценки значимых отличий между облученными и контрольными выборками Daphnia.
†
Вероятность лог-ранк теста с поправкой Бонферрони на множественное сравнение.
*
19
Как видно из таблицы, выживаемость дафний, облученных в дозах 1000 и 10 000 мГр, и их потомства из поколения F1 значимо
нарушена. В то же время, выживаемость потомства из поколения F2
существенно не отличается от таковой в контрольной группе. Двухфакторный дисперсионный анализ изменения плодовитости всей
выборки дафний и только выживших к концу опыта особей показал,
что облучение изменяет основные компоненты общей плодовитости
– число пометов и их размер (новорожденных на помет) в поколении
F0. Снижение этих показателей может быть обусловлено снижением
выживаемости дафний. Для того, чтобы проверить это предположение, были проанализированы параметры плодовитости у дафний,
которые дожили до конца эксперимента. Как показало исследование,
эффекты сохранились в выборке только выживших дафний. Поскольку показатели плодовитости в контрольных выборках дафний
из всех поколений были гомогенными, мы объединили их в одну
группу. Таким образом, численность особей в контроле составила 81
дафнию.
Данные по выживаемости хорошо согласуются с данными по
плодовитости (рис. 5 Г). Облучая 1-суточных дафний, мы исключили
прямое действие радиации на яйца и эмбрионы. При этом облучение
соматических клеток в поколении F0 приводило к постепенному вымиранию части особей, а облучение половых клеток – к снижению
числа и размера пометов. Из потомства облученных дафний формировали поколение F1, которое не облучали. При этом, как видно на
рис. 5 Б, число пометов в поколении F1 не нарушено, но попрежнему изменен их размер (рис. 5 В). Наблюдаемое в поколениях
F0 и F1 снижение выживаемости дафний можно объяснить механизмом удаления «нежелательных клеток», открытого в 2002 г. на примере C. elegans. Этот механизм позволяет сдерживать накопление
генетического груза и сохранять в популяции только «здоровый»
генофонд.
Гибель
организмов-носителей
радиационноиндуцированных нарушений благоприятна для популяции, поскольку удаляются потенциально дефектные единицы. Как видно из результатов проведенных экспериментов, период «чистки» может быть
достаточно продолжительным – от одного пострадиационного поко20
ления размножающихся партеногенетически дафний до 10 − 15 поколений вегетативно размножающихся инфузорий.
Рис. 5 − Радиационно-индуцированные эффекты γ-облучения у
ракообразных D. magna в трех поколениях по изменению А − числа
новорожденных на дафнию, Б − число пометов, В − средний размер
помета и Г − выживаемость (светлые) и общая плодовитость (заштрихованные)
Проведенное исследование представляет собой одну из первых
систематических попыток проанализировать эффекты облучения по
изменению плодовитости в мультигенерационных тестах.
21
Наши данные согласуются с результатами недавних исследований отдаленных последствий хронического облучения дафний в нескольких поколениях по показателям выживаемости и плодовитости
[Parisot et al., 2015; Alonzo et al., 2008] и изменения плодовитости
нематоды Caenоrhabditis elegans в трех поколениях [Buisset-Goussen
et al., 2014]. В цитируемых работах обнаружено радиационноиндуцированное снижение размера кладки яиц у нематод и пометов
у дафний в поколениях F1 − F3. Авторы объясняют этот эффект
сложным сочетанием генетических (мутации) и эпигенетических
событий, происходящих в предшествующих поколениях.
Из полученных нами данных следует, что влияние облучения на
плодовитость D. magna начинает проявляться при значительно более
низких дозах, чем на выживаемость. Это также согласуется с данными из литературы. Например, в исследовании [Parisot et al., 2015]
наблюдали небольшое увеличение смертности при облучении D.
magna 137Cs с мощностью дозы 35,4 мГр/ч-1, при этом плодовитость
дафний снижалась при значительно меньшей мощности дозы
0,007 мГр/ч-1. У человека летальная доза составляет 6 Гр, а стерильность наблюдается при дозе облучения ниже 0,5 Гр [Hall, 2000].
Обнаруженные у инфузорий и ракообразных прямые и отдаленные радиационно-индуцированные эффекты имеют нелинейную зависимость от дозы и сохраняются в ряду пострадиационных поколений. Похожие закономерности выявлены у разных видов простейших и беспозвоночных животных – амеб, инфузорий других видов,
нематод, моллюсков и др. [Бычковская и др., 2006; Sowmithra et al.,
2014; Hagger et al., 2005]. Возможно, выявленные нами на дафниях и
инфузориях радиационные эффекты в области низких и средних доз
являются видонеспецифическими.
В целом, результаты исследования продемонстрировали высокую
чувствительность репродуктивной функции дафний к облучению в
дозах от 100 мГр и выше. Так как долгосрочное выживание видов
зависит от индивидуальной плодовитости и выживаемости их
потомства, изменения в репродуктивном процессе необходимо рассматривать как один из наиболее значимых сублетальный последствий загрязнения окружающей среды.
22
2.4 Прямые и отдаленные радиационно-индуцированные
морфофункциональные изменения у инфузорий S. ambiguum в
нескольких поколениях
2.4.1 Изменение поведенческой активности у простейших после γ-облучения
Изменение поведенческой реакции является эволюционнообусловленным показателем физиологического состояния животных.
Как считают физиологи, возникшие на заре эволюции закономерности проявления поведения у простейших, сохраняются и у более развитых животных [Флеров, 1989]. На основании изменений в поведенческих эффектах одного вида животных можно прогнозировать
нарушения поведения вообще.
При отсутствии гибели инфузорий в ранние сроки после облучения в низких и средних дозах, мы, впервые применив метод «открытого поля» для анализа радиационного стресса у этих простейших,
обнаружили, что облучение в дозе 0,1 Гр приводит к значимому (Р =
3,08·10-7) снижению их двигательной активности (рис. 6). Эффект
зарегистрирован у еще не поделившихся особей в первые часы после
воздействия. На рисунке видно, что после скачкообразного снижения двигательной активности инфузорий в дозе 0,1 Гр на кривой
«доза-эффект» наблюдается длительное дозонезависимое плато. Вероятность гомогенности выборки в диапазоне доз 0,1 – 100 Гр, рассчитанная тестом Крускала-Уоллис, составляет Р = 0.0680 (рис. 6 А)
и в диапазоне доз 0,1 – 850 Гр (Р = 0.1174) (рис. 6 Б).
Продлив наблюдения за облученными в дозах 0,1 500 Гр инфузориями, мы обнаружили, что низкая двигательная активность сохраняется в последующих генерациях простейших до 30-и сут. Из
рис. 7 видно, что на всех сроках исследования уже при дозе облучения исходной выборки 0,1 Гр наблюдается угнетение функции движения инфузорий, степень которого не возрастает с ростом дозы на
три порядка (до максимальной из использованных в данном опыте
дозы  500 Гр).
23
Р = 3,08 x 10-7
Р = 0,068
Р = 0,117
Рис. 6 − А − зависимость изменения двигательной активности у S.
ambiguum (в % относительно контроля) от величины дозы радиации
в диапазоне 0,1 − 100 Гр в полулогарифмическом масштабе и Б − от
0,1 до 1500 Гр в линейном масштабе (n = 60)
На рисунке 7 видно, что дозонезависимое плато, которое простирается в данной серии опытов от 0,1 до 500 Гр, сохраняется на каждом пострадиационном сроке, причем, степень изменений значимо
не меняется со временем (0,08 < Р <0,65). Эффект регистрировали
даже через 30 сут после воздействия, за время которых произошла
смена 10 – 15-ти поколений простейших.
Следовательно, эффект облучения может проявляться не только в
виде снижения численности инфузорий, но и в виде функциональных расстройств – нарушения двигательной активности простейших.
24
Рис. 7 − Динамика изменения двигательной активности инфузорий S. ambiguum (в аб. ед) сразу после γ-облучения в дозах 0,1 –
500 Гр и на 0, 4, 14, 21 и 30 сут со стандартными ошибками (n = 60)
Тест Крускала-Уоллиса, 0,08 < Р <0,65
Таким образом, примененный впервые для анализа радиационного воздействия тест, характеризующий изменение двигательной активности простейших, позволяет выявить нарушения в организме в
более ранние сроки и при более низких дозах, чем тест, фиксирующий явные признаки клеточной гибели. Анализ изменения двигательной активности инфузорий методом «открытого поля» может
быть предложен для ранней диагностики радиационного воздействия
на простейших.
2.4.2 Морфометрические изменения у простейших после
γ-облучения
При исследовании изменения подвижности инфузорий мы обратили внимание на то, что снижение двигательной активности у облученных особей сопровождается появлением таких ярко выраженных морфометрическими расстройств, как изменение характера
25
движения от «прямолинейного» до «верчения» или сжатия «в каплю». Из литературы известно, что такие изменения, если они развиваются, оказываются необратимыми и неизбежно ведут к гибели инфузорий, даже если их поместить в чистую среду [Тушмалова, 1986].
Нами были проведены специальные методические разработки, в которых мы адаптировали метод прижизненной компьютерной морфометрии, используемый ранее для изучения активности регенерации планарий, для анализа морфометрических изменений у инфузорий S. ambiguum [Ускалова и др., 2013].
На рис. 8 приведены результаты количественного учета случаев
морфометрических изменений у облученных инфузорий сразу и в
отдаленные сроки после облучения (до 7 сут).
Рис. 8 − Динамика морфометрических нарушений1 у S. ambiguum
после γ-облучения в дозах от 0,1 до 1000 Гр в разные сроки после
воздействия.
1
M  m – средняя частота встречаемости инфузорий с морфометрическими нарушениями относительно общего количества проанализированных в каждой выборке простейших (n = 44 − 71) со стандартной ошибкой
26
На рисунке видно, что в контрольных группах морфометрические
изменения минимальные. Однако они появляются сразу после облучения простейших и постепенно увеличиваются в течение всего периода наблюдения. С использованием двухстороннего критерия
Фишера был выполнен анализ достоверности отличий наблюдаемого
эффекта в дозовых группах и в контроле. Анализ показал, что на
первые сутки достоверных отличий нет. Затем, начиная с дозы 20 Гр
(4 сут, Р = 0,0005) и 1 Гр (7 сут, Р = 0,0069), число особей с морфометрическими изменениями возрастает.
Таким образом исследование показало, что действие γ-излучения
вызывает у инфузорий морфологические нарушения, которые можно
зафиксировать по изменению формы тела облученных простейших.
Эти изменения сохраняются длительное время, коррелируют с
нарушением двигательной активности инфузорий (рис. 6) и являются «предвестниками гибели» (рис. 1).
В проведенных исследованиях получены данные, демонстрирующие высокую чувствительность инфузорий S. ambiguum к облучению γ-квантами как по признаку снижения подвижности, так и по
увеличению частоты морфологических нарушений. Таким образом,
морфометрический показатель являются дополнительным биомаркером функциональных нарушений у облученных простейших в биологическом мониторинге радиационного воздействия на гидросферу.
2.4.3 Изменение двигательной активности у простейших после
радиочастотного облучения с параметрами сотовой связи
Как и при исследовании действия ионизирующего излучения, у
инфузорий, помещенных в радиочастотное низкоинтенсивное поле,
был обнаружен эффект снижения двигательной активности. Результаты представлены на рис. 9. Дозы облучения рассчитаны по формуле (1) (см. гл. 1.3). Анализ кривых «доза-эффект» показал, что доза
примерно 300 Дж/м2, поданная с относительно высокой плотностью
потока энергии (ППЭ) (0,1 и 0,5 Вт/м2) и соответствующая нахождению в ЭМП в течение 45 и 20 мин, приводит к 35 – 40%-му снижению двигательной активности инфузорий (P = 1,78·10-9
и
P = 1,15·10-7 соответственно).
27
Рис. 9 − Зависимость изменения двигательной активности инфузорий (в аб. ед.) от дозы облучения в электромагнитном поле на частоте 1 ГГц с разными плотностями потока энергии в линейном
масштабе (на графике представлены средние величины для каждой
дозы в контрольной и опытной группах, в каждой точке n = 60)
В диапазоне доз от 300 до 1800 Дж/м2 для ППЭ = 0,5 Вт/м2 и от
300 до 3600 Дж/м2 для ППЭ = 0,1 Вт/м2, соответствующих нахождению в ЭМП до 10 ч, низкий уровень двигательной активности простейших оставался на одном уровне (Р = 0,128). В отличие от этого,
действие электромагнитного поля (ЭМП) с ППЭ = 0,05 Вт/м2 изменяло подвижность простейших при значительно более высокой пороговой дозе 1400 Дж/м2 (P = 3,22·10-8), соответствующей нахождению в ЭМП около 9 ч. Как и при облучении с частотой 1 ГГц, снижение двигательной активности было обнаружено при всех ППЭ на
частоте излучения радаров военно-промышленного комплекса и
спутникового телевидения (10 ГГц). Полученные кривые дозаэффект были похожи на те, что описывают радиочастотное воздействие на простейших с частотой мобильной связи (1 ГГц).
28
Возможность сохранения эффекта снижения двигательной активности S. ambiguum до 30-ти сут была проанализирована после облучения в ЭМП с частотой 10 ГГц, ППЭ 0,1 Вт/м2 и разными экспозициями. На рис. 10 приведены средние величины в % относительно
контроля со стандартными ошибками. Проведено три независимые
серии экспериментов с репрезентативной выборкой простейших
(n = 60).
Рис. 10 – Зависимость изменения двигательной активности инфузорий от дозы облучения исходной выборки в электромагнитном поле на частоте 10 ГГц с плотностью потока энергии 0,1 Вт/м2. Приведены средние значения величин со стандартными ошибками (n = 60)
На рисунке видно, что при всех исследуемых дозах облучения,
соответствующих нахождению в ЭМП от 1 до 10 ч, низкий уровень
двигательной активности инфузорий, обнаруженный сразу после
облучения (0 сут), значимо не изменялся до 30-х сут наблюдения
29
(критерий Крускала-Уоллиса, 0,06 <Р <0,55). Следовательно, эффект
облучения длительно передавался необлученному потомству.
Следует отметить, что значимые изменения в подвижности инфузорий были обнаружены нами в результате действия довольно низких доз РЧ-ЭМП с ППЭ 0,05 Вт/м2, соответствующих значению
SAR = 22 мВт/кг для 900 МГц. Поскольку эти значения ППЭ находятся в пределах максимально допустимых уровней воздействия
ЭМП на человека, рекомендуемых в России [СанПин, 2003], наши
данные, таким образом, показывают, что инфузории S. ambiguum
представляют собой полезную модель для анализа последствий облучения в РЧ-ЭМП. Результаты исследования изменения поведенческой активности инфузорий показали, что S. ambiguum представляет
собой высокочувствительную модель для оценки радиационных эффектов ионизирующего и неионизирующего излучения.
2.4.4 Морфометрические изменения у простейших после радиочастотного облучения с параметрами сотовой связи
На рис. 11 представлены данные по изменению морфометрических показателей у контрольных и облученных в электромагнитном
поле сотовой связи инфузорий. Согласно полученным результатам,
уже при дозе 900 Дж/м2, соответствующей 30-минутной экспозиции
в ЭМП с частотой 1 ГГц и ППЭ=0,50 Вт/м2 происходят значимые
морфометрические нарушения, зарегистрированные по таким параметрам как отношение максимального к минимальному диаметру
тела инфузории (Aspect), максимальный диаметр, периметр и отклонение от окружности (Roundness). Морфометрические нарушения
коррелируют со снижением подвижности у инфузорий при облучении в аналогичном режиме, т.е. отражают индуцированные низкоинтенсивным радиочастотным излучением морфофизиологические
изменения у S. ambiguum.
Полученные результаты показывают, что метод прижизненной
компьютерной морфометрии на простейших может быть предложен
для ранней диагностики повреждающих уровней ЭМИ, которые могут вызвать нарушение морфометрии клеток и, как следствие, снижение их подвижности.
30
Рис. 11 – Изменения средних значений морфометрических параметров у контрольных и облученных в низкоинтенсивном радиочастотном поле сотовой связи (1 ГГц, 0,5 Вт/м2) S. ambiguum. На графиках приведены средние значения со стандартными ошибками и
вероятности (P) непараметрического теста Крускала-Уоллиса
Данный показатель может быть применен в биологическом мониторинге в качестве дополнительного биомаркера радиационного воздействия на организм.
2.5 Прямые и отдаленные радиационно-индуцированные биохимические эффекты у ракообразных в нескольких поколениях
Эффекты, обнаруженные на макроуровне, были сопоставлены с
возможными механизмами в биохимических и молекулярных тестах
Известно, что к числу наиболее радиочувствительных процессов в
клетке относят окислительное фосфорилирование [O'Dowd, 2009;
31
Wu, Zhou, 2012]. Нарушение этого процесса выявлено в клетках уже
через несколько десятков минут после облучения в дозе 1 Гр [Ильин
и др., 2010]. Оно проявляется в повреждении системы генерирования
АТФ. В ряде работ показано, что концентрация свободных радикалов в тканях коррелирует с функциональной активностью организма
и является чувствительным показателям повреждений клеток и тканей [Бурлакова и др., 2001, 2003; Мелехова, 2010]. Свободные радикалы повреждают митохондриальную и ядерную ДНК, а также мембраны и белки клетки [Мелехова, 2010; Скулачев, 2013], приводя к
укороченной продолжительности жизни [Зайнуллин и др., 2001;
Москалев, 2013]. Поэтому далее были изучены радиационноиндуцированные биохимические эффекты у ракообразных D. magna
в нескольких поколениях.
2.5.1 Влияние радиации на биохимические изменения у D.
magna в нескольких поколениях
В данном исследовании, впервые применив клеточный МТТ-тест
в опыте in vivo на дафниях, мы обнаружили эффект снижения активности митохондриальных дегидрогеназ в облученной выборке F0 и в
поколении F1 (рис. 12). В поколении F2 эффект не сохранялся. Значения, полученные МТТ-тестом, суммируют изменение соотношения в организме нормальных и поврежденных клеток, а также подавление активности митохондриальных дегидрогеназ, в частности,
за счет токсического действия супероксид анион-радикала. Данные
биохимического теста коррелируют с изменением продолжительностью жизни дафний в трех поколениях (рис. 5 Г). Двухфакторным
дисперсионным анализом был выявлен значительный вклад облучения в эффект. В табл. 6 приведены данные по изменению оптической
плотности в образцах дафний, демонстрирующие нарушение биохимической активности в клетках D. magna в контроле и после γоблучения в дозах 10 – 10000 мГр в поколении F0 и в поколениях F1
и F2.
32
Рис. 12 – Изменение активности митохондиральных дегидрогеназ
(в % относительно значений в контрольных выборках) у D. magna в
трех поколениях с увеличением дозы облучения исходной выборки
Приведены средние значения со стандартными ошибками, N = 20 -53
Таблица 6 – Изменение оптической плотности в образцах D. magna в
трех поколениях после острого γ-облучения исходной выборки
Поколение F0
Поколение F1
Поколение F2
Доза,
P*
P*
P*
M ± SE
M ± SE
M ± SE
мГр
Контрольная выборка: 0.215±0.005
10
0.210±0.015 1
0.160±0.007
3.08·10-10
0.206±0.011 1
-13
100
0.129±0.008 1.25·10
0.144±0.006
9.97·10-12
0.206±0.016 1
1000
0.118±0.006 2.49·10-14
0.148±0.007
3.58·10-11
0.167±0.031 1
10000
0.105±0.015 1.72·10-8
0.014±0.012
2.33·10-11
0.164±0.002 0.061
p†
9.99·10-16
9.99·10-16
0.1495
M ± SE – средние значения оптической плотности со стандартной
ошибкой
*
Вероятность теста Крускала-Уоллиса с поправкой Бонферрони.
†
Вероятность теста Крускала-Уоллиса на гомогенность каждого поколения.
33
Из таблицы видно, что в образцах дафний из поколения F0, начиная с дозы 100 мГр, наблюдается достоверное влияние облучения на
активность митохондриальных дегидрогеназ. В поколении F1 эффект
сохраняется. В поколении F2 эффект во всех дозовых группах значимо не отличается от соответствующего контроля.
Таким образом, радиация является индуктором, вызывающим
нарушение биохимических процессов у облученных дафний и у их
потомства вследствие токсического действия АФК, приводящего к
снижению активности ферментов окислительного фосфорилирования.
2.5.2 Влияние радиации на свободнорадикальные процессы у
ракообразных D. magna в нескольких поколениях
На рис. 13 показано, что облучение дафний в дозах 100 и
1000 мГр значимо (Р = 0,049) повышает уровень свободных радикалов (СР) по сравнению со спонтанным уровнем у дафний в контрольных выборках. Уровень СР сохранялся высоким и значимо отличался от контроля у необлученного потомства первого пострадиационного поколения дафний (Р = 0,019).
Применив на дафниях метод привитой сополимеризации, мы
суммировали токсическое действие всех быстро- и долгоживущих
АФК [Мелехова, 2010]. Поскольку все регуляционные явления в
клетке и в организме в целом связаны с окислительным фосфорилированием, большое значение для выживания облученных дафний
имеет тот факт, что стрессовые реакции идут с образованием АФК,
которые инициируют процессы перекисного окисления липидов
мембран и нарушают внутримембранные потоки энергии, связанные
в митохондриях с синтезом АТФ. Известно, что подобные изменения
приводят к нарушению морфологических процессов у эмбрионов
Rana sp. [Мелехова, 2010], ускоренному старению и сокращению
продолжительности жизни Drosophila melanogaster [Зайнуллин и др.,
2001; Москалев, 2013]. Проведенные нами исследования показали,
что АФК могут вызвать нарушения жизнеспособности, обнаруженные у ракообразных D. magna. Таким образом, проведенный анализ
показал, что радиация индуцирует у дафний изменения метаболиче34
ских путей, направленных, в частности, на детоксикацию свободных
радикалов.
P = 0,0493
P = 0,0186
Рис. 13 – Эффект γ-облучения в дозах 100 и 1000 мГр в исходной
выборке дафний (F0) и в первом необлученном поколении (F1) по
изменению уровня свободных радикалов в опыте (Со) и в контроле
(Ск). Приведены средние значения со стандартными ошибками,
n = 27
Молекулярно-генетические механизмы, лежащие в основе эффектов облучения у простейших и ракообразных пока неясны. Из литературы известно, что в результате деления могут передаваться дочерним клеткам структурные изменения ДНК, которые определяют
экспрессию генов и формирование эффекта [Jablonka et al., 2009].
Одним из механизмов нарушения экспрессии генов может быть изменение в структуре метилирования ДНК. Например, значительное
количество цитозинов в геноме млекопитающих метилированы. Если такая эпигенетическая модификация происходит в промоторе, она
может эффективно изменить экспрессию генов [Ting et al, 2006].
35
В сотрудничестве с д-ром Майклом Vandegehuchte из лаборатории экологической токсикологии и водной экологии университета г.
Гента (Бельгия) мы проанализировали, может ли облучение повлиять на паттерн метилирования ДНК у облученных дафний и их
потомства поколения F1. Методом жидкостной хроматографии высокого разрешения (Waters Acquity Ultra Performance Liquid
Chromatography, UPLC) [Vandegehuchte, Lemière, Janssen, 2009] был
проведен тотальный анализ метилирования ДНК D. magna из поколений F0 и F1 с исходной дозой облучения 10 – 50000 мГр и оценен
уровень метилирования и геномное содержание цитозин-гуанина. В
результате исследования не обнаружено значимых отличий в метилировании ДНК. Возможно, необходим поиск в геноме дафнии генов-кандидатов для анализа эпигенетических изменений при радиационном воздействии. Поиск таких специфических генов может
стать отдельной задачей радиационно-молекулярных исследований
на дафниях.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенный анализ эффектов радиационного воздействия ионизирующей и неионизирующей природы на простейших и ракообразных выявил ряд закономерностей их формирования и методические
возможности для применения инфузорий Spirostomum ambiguum и
ракообразных Daphnia magna в качестве тест-организмов в биологическом мониторинге.
Обнаружено, что прямые и отдаленные радиационноиндуцированные эффекты у исследуемых простейших и ракообразных имеют нелинейную зависимость от дозы излучения, сохраняются в ряду поколений вегетативно делящихся простейших и в одном
пострадиационном поколении дафний. Анализ литературы показал,
что сопоставимые эффекты были обнаружены разными авторами у
других видов простейших, дафний и прочих беспозвоночных гидробионтов. Принимая во внимание сведения из литературы и полученные в диссертации результаты экспериментальных исследований,
можно унифицировать методологию биологического мониторинга с
36
использование S. ambigum и D. magna для оценки радиационных эффектов у низших гидробионтов.
Проведенный анализ прямых и отдаленных биологических эффектов у инфузорий и ракообразных показал возможность индукции
серьезных изменений в показателях жизнеспособности (выживаемости, продолжительности жизни и плодовитости) при остром воздействии на организм ионизирующего излучения с надфоновыми уровнями. Тем самым показана биологическая значимость радиационных
воздействий в низких и средних дозах как фактора окружающей среды, требующего контроля в рамках экологического мониторинга.
Анализируя данные по выживаемости инфузорий S. ambiguum в
индивидуальных линиях, мы пришли к заключению, что повреждения, полученные исходной выборкой инфузорий при облучении, могут передаваться бесконечно долго при вегетативном делении клеток
(особей), вплоть до их гибели от радиационно-индуцированных повреждений. Однако, по всей видимости, не следует преувеличивать
опасность облучения в низких дозах на инфузорию. Наблюдая за интенсивностью гибели инфузорий в индивидуальных линиях, мы анализировали динамику этого процесса, моделируя его в стандартных
условиях лаборатории и создавая условия только для вегетативного
размножения. При этом хорошо известно, что управляет жизнедеятельностью инфузории активно транскрибирующийся макронуклиус. В природных условиях инфузории способны переходить от вегетативного деления (которое длится значительное время существования популяции) к краткосрочному делению путем конъюгации. Это
позволяет инфузориям при необходимости избавляться от поврежденного макронуклиуса и строит новое вегетативное ядро на генетическом материале микронуклеуса. При этом на «выброс» идут мобильные генетические элементы и некодирующие последовательности. Для изучения этого процесса на популяционном уровне требуются специальные эксперименты, которые в данном исследовании
не проводились. Все вышесказанное подчеркивает фундаментальную значимость исследования выживаемости инфузорий S. ambiguum в индивидуальных линиях, но снижает практическую ценность
анализа для целей биологического мониторинга радиационного загрязнения.
37
Однако, на инфузориях S. ambiguum прошел в данном исследовании успешную апробацию метод, анализирующий радиационноиндуцированные поведенческие изменения у этого вида простейших.
Известные методы анализа изменения поведения, описанные в обзоре литературы, были весьма субъективны и, по мнению авторов этих
исследований, не подходили для однозначных оценок радиационных
эффектов. Примененный нами метод «открытого поля», модифицированный для исследования изменения двигательной активности у S.
аmbiguum, позволил обнаружить радиационные эффекты облучения
в дозах от 100 мГр. Нарушение двигательной активности коррелировало с морфометрическими изменениями, которые были зафиксированы методом прижизненной компьютерной морфометрии. Компьютерный метод прижизненной морфометрии и метод открытого поля
были успешно применены для выявления радиационноиндуцированных эффектов от другого источника радиации – неионизирующего излучения в радиочастотном диапазоне сотовой связи и радаров военно-промышленного комплекса. Таким образом,
анализ прямых и отдаленных эффектов изменения поведения и морфометрических показателей у инфузорий S. ambiguum может быть
использован для ранней диагностики радиационного воздействия на
организм.
У партеногенетически размножающихся ракообразных изучение
радиационно-индуцированных биологических эффектов по экологически важным популяционным показателям – выживаемости, продолжительности жизни и плодовитости, позволили обнаружить диапазон доз, при которых происходило значимое снижение этих параметров в облученном (нулевом) поколении и в первом поколении,
которое не облучали. Радиационно-индуцированный эффект исчезал
во втором и третьем пострадиационных поколениях дафний. Эффект
был сопоставим с данными по радиационно-индуцированному
нарушению плодовитости, и с имеющимися в литературе сведениями о значительно более сильном влиянии γ-облучения на плодовитость, чем на выживаемость особей в хронических опытах.
Более детальный анализ компонентов общей плодовитости позволил заключить, что облучение в низких и средних дозах приводит
к гибели половых и соматических клеток, что, в свою очередь, при38
водит к повышенной частоте гибели дафний, снижению их плодовитости и нарушению плодовитости в первом поколении. Наблюдаемое во втором поколении F2 восстановление показателей жизнеспособности в группах, в которых прародительницы были облучены в
дозах 100 и 1000 мГр, указывает на возможность устранения из популяции генетических повреждений в течение одного пострадиационного поколения. Однако процесс восстановления у дафний наблюдали не при всех исследуемых дозах облучения. Было обнаружено,
что при наибольшей из исследуемых доз 10 Гр, восстановление плодовитости не происходит и во втором поколении. Из полученных
результатов можно заключить, что при отсутствии повторного облучения дафний в надфоновых дозах, произойдет восстановление жизнеспособности популяции в поколении F2.
Из всего вышесказанного следует, что анализ прямых и отдаленных радиационно-индуцированных эффектов изменения выживаемости, продолжительности жизни и плодовитости у ракообразных D.
magna, может быть использован для целей биологического мониторинга радиационного воздействия на гидробионтов, а результаты
исследования включены в существующие базы данных, например
FREDERICA [доступ на http://www.frederica-online.org], для обоснования величины приемлемого риска радиационного воздействия на
гидросферу.
Выявленные нами радиационно-индуцированные биохимические
эффекты у D. magna показали, что одним из механизмов формирования прямых и отдаленных последствий радиационного воздействия
является изменение метаболических процессов, связанных с нарушением активности митохондриальных дегидрогеназ, направленных
на детоксикацию индуцированного радиацией повышенного уровня
свободных радикалов. Возможные эпигенетические изменения в
анализируемых выборках дафний из поколений F0 и F1 в данном исследовании обнаружить не удалось. По всей видимости, это связано
с тем, что существуют особые фрагменты в геноме ДНК, которые
отвечают за экспрессию генов при радиационном воздействии. Поиск таких генов может стать отдельной задачей радиационномолекулярных исследований на дафниях.
39
Итак, в диссертационной работе разработаны принципы построения биологического мониторинга на простейших и ракообразных
для обеспечения более детального анализа последствий радиоактивного загрязнения окружающей среды. В основу мониторинга положен анализ прямых и отдаленных радиационно-индуцированных
биологических эффектов у инфузорий S. ambiguum и ракообразных
D. magna. Акцент сделан на приоритетность научных исследований
на ракообразных, группе организмов, которые определены в качестве ключевой модели для разработки экологических основ радиационной защите.
Обнаруженные в экспериментах с использование инфузорий и
дафний в качестве модельных тест-объектов закономерности радиационно-индуцированных эффектов станут значимым практическим
приложением к решению задач радиационной защиты биоты. Использование в целях биомониторинга низших гидробионтов значительно сократит количество экспериментов с млекопитающими с
последующим облегчением этических, моральных и экономических
трудностей, которые существуют в области радиационной защиты.
Мы убеждены, что инфузории Spirostomum ambiguum и особенно
низшие ракообразные Daphnia magna представляют собой полезные
экспериментальные модели, которые позволят эффективно и быстро
анализировать многие еще не известные аспекты действия на водные
экосистемы ионизирующего и неионизирующего излучения с надфоновыми уровнями.
ВЫВОДЫ
1. У ракообразных Daphnia magna выявлено значимое снижение
продолжительности жизни в поколения F0 после γ-облучения в дозах
от 100 мГр. Эффект сохраняется у потомства в необлученном поколении F1. Во втором пострадиационном поколении F2 продолжительность жизни дафний восстанавливается.
2. Плодовитость партеногенетически размножающихся D. magna
значимо снижается при γ-облучении в дозах от 10 мГр, что связано
со снижением числа и размера пометов. В необлученном поколении
40
F1 плодовитость остается значимо ниже контроля в группах дафний с
исходными дозами облучения от 100 мГр. Эффект обусловлен снижением размера пометов. В поколении F2 плодовитость восстанавливается, за исключением дозовой группы, исходно облученной в дозе
10 000 мГр.
3. У вегетативно размножающихся инфузорий Spirostomum ambiguum выявлено пролонгированное в 10 – 15 поколениях снижение
выживаемости при остром γ-облучении исходных выборок в дозах
от 50 Гр.
4. В морфофизиологических тестах обнаружено, что у S. ambiguum в ранние сроки после облучения в дозах от 100 мГр ионизирующего излучения, от 300 Дж/м2 радиочастотного излучения при плотностях потока энергии 0,1 и 0,5 Вт/м2 и от 1400 Дж/м2 при плотности
потока энергии 0,05 Вт/м2 происходит значимое наследуемое снижение поведенческой активности, являющейся эволюционнообусловленной формой физиологического состояния простейших.
Методом прижизненной компьютерной морфометрии выявлены
морфологические патологии у 30 − 40 % особей на 4 – 7 сутки после
γ-облучения в дозах от 1000 мГр и от 900 Дж/м2 в радиочастотном
поле с плотностью потока энергии 0,5 Вт/м2.
5. У D. magna в поколении F0, облученных в дозах от 100 мГр, и
у их потомства в необлученном поколении F1 обнаружено нарушение активности митохондриальных дегидрогеназ, обусловленное
повышенным в 1,5 – 3 раза уровнем свободных радикалов. В поколении F2 токсический эффект радиации не выявлен. Данные биохимического анализа коррелируют с выживаемостью и плодовитостью
D. magna в трех поколениях.
6. Тотальный анализ метилирования ДНК у D. magna не выявил
значимых изменений в поколениях F0 и F1 после облучения в дозах
10 – 50 000 мГр. Необходим анализ уровня метилирования ДНК кандидатных генов для выявления возможных эпигенетических изменений при радиационном воздействии на D. magna.
7. Радиационно-индуцированные эффекты от разных источников
излучения, выявленные у S. ambiguum и D. magna, имеют нелинейную зависимость от дозы облучения с порогом в области низких и
средних доз и выходом на плато, высокую чувствительность к тако41
му уровню воздействия и способность сохраняться в ряду пострадиационных поколений.
8. Ракообразные D. magna могут быть предложены в качестве
референтного вида для проведения радиоэкологической экспертизы
пресноводных экосистем. Компьютерный анализ морфометрии и
двигательной активности инфузорий S. ambiguum методом «открытого поля» могут быть использованы в биологическом мониторинге
в качестве дополнительного биомаркера радиационного воздействия
для ранней диагностики загрязнения гидросферы.
ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Публикации в журналах из перечня ВАК
1. Сарапульцева Е.И., Мелехова О.П., Коссова Г.В., Иголкина
Ю.В., Алексеева Н.А. Свободнорадикальные реакции in vivo при облучении дафний в малых дозах // Радиационная биология. Радиоэкология, 2014. Т. 54, № 3. С. 305-308.
2. Тушмалова Н.А., Иголкина Ю.В., Лебедева Н.Е., Сарапульцева Е.И. Инфузория спиростома как индикатор загрязнения водной
среды // Вестник Московского ун-та, 2014. № 2. С. 27-30.
3. Сарапульцева Е.И., Рябченко Н.И., Иголкина Ю.В., Иванник
Б.П. Использование клеточного биохимического метода для биотестирования in vivo радиационного загрязнения окружающей среды //
Радиационная биология. Радиоэкология, 2013. Т. 53. № 6. С. 634-638.
4. Ускалова Д.В., Баранова М.М., Сарапульцева Е.И., Иголкина
Ю.В. Применение метода компьютерной морфометрии в исследовании биологического действия низкоинтенсивного радиочастотного
излучения на простейших // Биомедицинская радиоэлектроника,
2013, № 3. С. 48-52.
5. Сарапульцева Е.И, Иголкина Ю.В. Изучение зависимости
биологической опасности слабых радиочастотных воздействий от
значения плотности потока энергии. Эксперименты на инфузориях
Spirostomum ambiguum, облученных на частоте мобильной связи
(1 ГГц) // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины,
2011. №4. С. 459-462.
42
6. Сарапульцева Е.И., Горский А.И., Малина Ю.Ю. Радиацион-
ные риски смертности и сокращение продолжительности жизни
-облученных в малых дозах дафний // Радиация и риск, 2011. Т. 20.
№1. С. 34-40.
7. Сарапульцева Е.И., Тушмалова Н.А. Поведенческая активность простейших: место в иерархии критериев биотестирования
окружающей среды // Вестник Московского ун-та, 2011. №3. С. 3-6.
8. Иголкина Ю.В., Сарапульцева Е.И, Литовченко А.В. Зависимость биологической опасности слабых радиочастотных воздействий от плотности потока энергии. Сообщение 2. Опыты на инфузориях Spirostomum ambiguum, облученных на частоте 10 ГГц //
Биомедицинская радиоэлектроника, 2011. №11. С. 51-54.
9. Бычковская И.Б., Степанов Р.П., Федорцева Р.Ф., Сарапульцева Е.И. Особые эффекты малых доз и проблема продолжительности жизни животных и человека // Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях, 2011. №2. С. 58-64.
10. Сарапульцева Е.И, Иголкина Ю.В. Нарушение функции движения у одноклеточных гидробионтов при слабых радиочастотных
воздействиях. Сообщение 1. Опыты на инфузориях Spirostomum ambiguum, облученных на частоте мобильной связи (1 ГГц) при разных
значениях плотности потока энергии // Биомедицинская радиоэлектроника, 2010. № 10. С. 49-54.
11. Бычковская И.Б., Сарапульцева Е.И., Иголкина Ю.В., Федорцева Р.Ф., Алексанин С.С. Нестохастические эффекты как новый
тест радиационной опасности для биоты. Сообщение 2. Наследственные формы повреждения // Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях, 2010. № 3. С. 65-69.
12. Иголкина Ю.В., Сарапульцева Е.И. Наследуемое снижение
спонтанной двигательной активности Spirostomum ambiguum после
низкоинтенсивного электромагнитного воздействия на частоте 10
ГГц // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника, 2010. № 1.
С. 45-48.
13. Сарапульцева Е.И., Малина Ю.Ю. Изменение жизнеспособности Daphnia magna после γ-облучения в диапазоне относительно
43
малых доз // Радиационная биология. Радиоэкология, 2009. Т. 49, №
1. С. 82-84.
14. Сарапульцева Е.И., Иголкина Ю.В., Литовченко А.В. Исследование предельно-допустимого уровня низкоинтенсивного электромагнитного облучения на частоте мобильной связи (1 ГГц) по
изменению двигательной активности Spirostomum ambiguum // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2009. Т. 147, № 4.
С. 431-433.
15. Иголкина Ю.В., Сарапульцева Е.И., Литовченко А.В. Изменение спонтанной двигательной активности инфузорий Spirostomum
ambiguum после низкоинтенсивного электромагнитного облучения
как информативный метод биотестирования // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника, 2009. №9. С. 49-52.
16. Сарапульцева Е.И. Спонтанная двигательная активность инфузорий Spirostomum ambiguum после γ-облучения в широком диапазоне доз как информативный методов биотестирования // Радиационная биология. Радиоэкология, 2008. Т. 48, № 3. С. 346-348.
17. Сарапульцева Е.И., Федорцева Р.Ф., Бычковская И.Б. Нестохастическое снижение жизнеспособности организма после слабых
лучевых воздействий. Модельные опыты на Daphnia magna // Медицинская радиология и радиационная безопасность, 2008. Вып. 53, №
5. С. 3-7.
18. Сарапульцева Е.И., Бровин А.И., Лычагин А.А. Сравнение
эффективности малых доз после γ-облучения Spirostomum ambiguum
на установках «γ-cell» и «Луч». Дозиметрический контроль // Радиация и риск, 2008. Т.17. № 3. С. 59-63.
19. Сарапульцева Е.И., Иголкина Ю.В. Наследование снижения
спонтанной двигательной активности у одноклеточных гидробионтов Spirostomum ambiguum после γ-облучения в малых дозах // Радиация и риск, 2008. Т.17. № 3. С. 54-58.
20. Сарапульцева Е.И., Малина Ю.Ю., Сарапульцев Б.И. Линейно-пороговые эффекты γ-облучения Daphnia magna в диапазоне малых доз // Радиация и риск, 2007. Т. 16. № 2-4. С. 32-37.
44
Публикации в международных изданиях
21. Sarapultseva E.I., Igolkina J.V., Tikhonov V.N., Dubrova Y.E.
The in vivo effects of low-intensity radiofrequency fields on the motor
activity of protozoa // Int. J. Rad. Biology, 2014. V. 90. No 3. РP. 262267.
22. Sarapultseva E., Gorski A. Low-dose γ-irradiation affects the survival of exposed Daphnia and their offspring // Dose Response, 2013. V.
11, No 4. PP. 460-468.
23. Bychkovskaya I., Sarapultseva E. Special effects of low doses and
life span of irradiated daphnids // Int. J. Low Radiation, 2011. V. 8. No 1.
PP. 35-41.
24. Sarapultseva E., Malina J., Gorski A. Radiation in low doses reduces life span of Daphnia magna // Radioprotection, 2011. V. 46, No 6.
S. 349-353.
25. Sarapultseva E.I., Bychkovskaya I.B. Peculiar low radiation effects as a risk factor. Assessment of organism viability in the model experiments with Daphnia magna // Int. J. Low Radiation, 2010. V. 7. No 1.
PP. 1-9.
Учебные пособия
1. Гераськин С.А., Сарапульцева Е.И., Цаценко Л.В. и др. Биологический контроль окружающей среды: генетический мониторинг:
уч. пособие для студентов вузов / Под ред. С.А. Гераськина и Е.И.
Сарапульцевой. – М.: Академия, 2010. 208 с. Гриф УМО по классическому университетскому образованию
2. Мелехова О.П., Сарапульцева Е.И., Евсеева Т.И. и др. Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирование: уч. пособие для студентов вузов / Под ред. О.П. Мелеховой и
Е.И. Сарапульцевой – М.: Академия, 2010 (2007, 2008). 288 с. Гриф
Минобрнауки РФ
45
Редакторы З.И. Сныкова и Н.И. Сарапульцева
Компьютерная верстка автора
ЛР N 020713 от 27.04.1998
Подписано к печати 10.12.2015
Формат бумаги 60х84/16
Печать ризограф
Бумага KYMLUX
Печ.л. 2,81
Заказ N
Тираж 100 экз.
Цена договорная
Отдел множительной техники ИАТЭ
249040, г. Обнинск, Студгородок, 1
46