Технология рекомбинантной ДНК

12/10/2014
Технология
рекомбинантной
ДНК
Анализ генов
ДНК
РНК
Белок
Секвенирование
Northern-blot
Western-blot
ПЦР
RT–ПЦР
Секвенирование
Southern-blot
Гибридизация
in situ
Изучение
функции
Гибридизация in situ
Гистохимический
анализ
Изучение нуклеиновых кислот
Изучение ДНК:
Определение мутантных генов → точная диагностика
наследственных болезней (пренатально, постнатально);
Определение индивидуальных полиморфизмов →
геномный отпечаток (филиация, криминалистика);
Определение чужеродной ДНК (бактериальной вирусной)
→ диагностика инфекционных заболеваний и уровня
инфекции.
Изучение мРНК:
Тканеспецифическая экспрессия;
Определение уровня экспрессии (для нормальных и
патологических генов).
1
12/10/2014
Выделение и очистка ДНК
•
Сбор
биологического
материала
(любая
ядросодержащая клетка; бактерии, вирусы)
•
Лизис клеток в гипотоническом растворе
•
Лизис клеток/ядер при помощи детергентов
•
Депротеинизация: протеазы и органические солвенты
•
Осаждение ДНК при помощи спиртов
Выделение и очистка РНК
•Сбор биологического материала (нужная ткать, на
необходимом этапе, в определенных условиях)
•Лизис клеток при помощи детергентов в присутствии
ингибиторов РНК-аз
•Депротеинизация при помощи органических солвентов
•Выборочное осаждение РНК при помощи солей (LiCl,
CH3COONa)
•Конечное осаждение РНК при помощи этанола
ДНК человека
Ген для
клонирования
Плазмида –
вектор для
клонирования
Расщепление
рестриктазами
Лигирование
Рекомбинантная ДНК –
это молекула ДНК
содержащая
двуцепочечные
фрагменты разного
происхождения
Рекомбининтная
ДНК
Генетическая трансформация
Клетка хозяин
Клонирование
Экспрессия
гена человека
2
12/10/2014
Цели методов
рекомбинантной ДНК
Клонирование последовательности / гена:
Увеличение количества;
Получение библиотек ДНК;
Молекулярного анализа.
Экспрессия гена:
Анализ функции гена;
Получение белков.
Этапы получения рекомбинантной ДНК
1. Выделение необходимого фрагмента и векторной ДНК
2. Расщепление фрагмента ДНК и вектора при помощи
рестриктаз
3. Лигирование фрагмента ДНК и ДНК вектора
4. Генетическая трансформация – внедрение
рекомбинантных молекул в клетку - хозяин
5. Клонирование молекул при помощи репликации in vivo
6. Экспрессия гена и получение белка
7. Скрининг трансформированных клеток
Компоненты необходимые для
клонирования in vivo
- ДНК для клонирования: ФР, кДНК
- Вектор для клонирования:
- молекула ДНК способная выжить в чужой клетке
- способна переносить чужеродные фрагменты ДНК
- способна реплицироваться самостоятельно
- Ферменты рестрикции - рестриктазы
- Клетка-хозяин
- Система скрининга клеток
- Набор ферментов для работы с ДНК
3
12/10/2014
Векторы для клонирования
Вектор
Длина клонируемого
фрагмента
Клеткахозяин
Плазмиды
До 10 kb (геномная ДНК,
кДНК)
Бактерии,
дрожжи
Бактериофаги
До 25 kb (геномная ДНК,
кДНК)
Бактерии
Космиды
30-45 kb (геномная ДНК)
Бактерии
BAC (Bacterial artificial
chromosome)
До 300 kb (геномная ДНК)
Бактерии
YAC (Yeast artificial
chromosome)
0,2-2.0 Mb (геномная ДНК) Дрожжи
Вектор для клонирования:
- Содержит точку ori
- Может переностить чужие фрагменты (содержит СР)
- Содержит гены устойчивости к антибиотикам
Бактериальная клетка
Лигирование вставки в векторную ДНК
4
12/10/2014
Получение рекомбинантной ДНК
ДНК – вектор для клонирования
ДНК для клонирования
СРBamH I
СРBamH I
Определение сайтов
рестрикции
Необходимый фрагмент
Расщепление при
помощи
рестриктазы
РФ
РФ
РФ
РФ
СРBamH I
РФ
Лигирование
Рекомбинантная
ДНК
Получение рестриктных фрагментов
при помощи рестриктаз
СР
BamH I
Определение
СР
СР BamH I
СР Hae III
СР Hae III
Расщепление при
помощи ФР
BamH I
Hae III
Рестриктные
фрагменты (РФ)
РФ1
Липкие концы
РФ2
Липкие концы
РФ3
Сайты, узнаваемые разными
рестриктазами
5
12/10/2014
A. ДНК пациента X
СР Hae III
СР Hae III
Определение СР
Расщепление при помощи ФР
РФ 3X
РФ 2X
РФ1X
B. ДНК пациента Z
СР Hae III
Определение СР
Расщепление при помощи ФР
РФ 1Z
РФ 2Z
RFLPs – ПДРФ – Полиморфизм Длины Рестриктных
Фрагментов (Restriction Fragments Length Polymorphism)
пациентов X и Z
ФР – фермент рестрикции – сайт-специфическая
эндонуклеаза которая распознает и расщепляет дцДНК
СР – сайт рестрикции – палиндромный участок
узнаваемый ФР
РФ – рестриктный фрагмент – фрагмент дцДНК
полученный после расщепления при помощи ФР
ПДРФ – Полиморфизм Длины Рестриктных
Фрагментов
RFLPs – Restriction Fragments Length Polymorphisms
Рестриктная карта – физическая карта указывающая
расположение СР для разных рестриктаз
12 kb
10 kb
10 kb
8 kb
2,5 kb
10 kb
6 kb
6 kb
5 kb
6 kb
4 kb
5 kb
2,5 kb
2 kb
+
M
6
12/10/2014
ДНК человека
Ген для
клонирования
Плазмида –
вектор для
клонирования
Расщепление
рестриктазами
Клонирование человеческих
генов in vivo
Проблемы
 Величина генома
человека;
 Регуляторные области
Лигирование
Рекомбининтная
ДНК
отличаются от
бактериальных;
 Содержат интроны,
Генетическая трансформация
Клетка хозяин
Клонирование
Экспрессия
гена человека
которые не вырезаются в
бактериальных системах.
Решение:
синтез кДНК на основе
мРНК соответствующей
изучаемому гену
7
12/10/2014
Этапы получения кДНК
(комплементарной ДНК))
•Выделение Poly(A)+ РНК
•Гибридизация poly(A) с
oligo(dT)
•Синтез первой цепи кДНК при
помощи ревертазы
•Расщепление мРНК
•Синтез второй цепи ДНК при
помощи ДНК-полимеразы
Обнаружение ДНК
При помощи красителей
Основной
фуксин
(in situ)
При помощи меченных зондов
Флуоресцентные Радиоактивные
(холодные)
(горячие)
Бромистый этидий
(в гелях)
Большое количество
ДНК
Необходимо знать
изучаемую
последовательность
Практическая роль анализа ДНК:
1. Научная – секвенирование ДНК, получение
библиотек генов, изучение экспрессии генов, изучение
контроля экспрессии, определение мутаций.
2. Определение носителей мутаций – предупреждение
рождения детей с серьезными нарушениями.
3. Генная терапия (внедрение нормального гена в геном
носителя мутации).
4. Определение чужеродной ДНК (вирусной,
бактериальной) при диагностике инфекций.
5. Определение индивидуального полиморфизма при
филиации, в криминалистике.
8
12/10/2014
Клонирование ДНК = многократная
репликация
in vitro
in vivo
 Рекомбинантная
ДНК
 Необходима клеткахозяин
 Необходим вектор
содержащий ori
 Есть возможность
получения белка
 ПЦР / PCR
 В искусственных
условиях
 Репликация с
использованием
искусственных
компонентов
Клонирование in vitro – ПЦР
(полимеразная цепная реакция)
PCR (polymerase chain reaction)
Компоненты необходимые для ПЦР
- ДНК для анализа
- Специфичные праймеры
- Taq-полимераза
- dNTP
- Аппарат для контроля температуры:
- tº денатурации ДНК
- tº отжига праймеров
- tº для полимеризации ДНК
9
12/10/2014
Этапы ПЦР
A. Приготовление реакционной смеси
B. Денатурация – ренатурация – элонгация 30-35 цикла
•Денатурация ДНК при 96oC
•Охлаждение до температуры отжига праймеров
•Элонгация при 72oC
C. Изучение амплифицированных фрагментов
- Электрофорез
- Окрашивание
- интерпретация результатов
Библиотеки генов
•Геномные библиотеки – содержат
последовательности всего генома организма
•Библиотеки кДНК – содержат фрагменты
ДНК соответствующих мРНК клетки / ткани
•Хромосомные библиотеки – содержат
фрагменты определенной хромосомы
10
12/10/2014
Этапы получения
геномных библиотек
•Выделение геномной
ДНК
•Рестрикция ДНК
•Лигирование
рестриктных
фрагментов с вектором
•Генетическая
трансформация
•Селекция клонов
Этапы получения библиотек кДНК
•Выделение мРНК
•Синтез кДНК
•Лигирование
линкеров к концам
•Рестрикция кДНК
и вектора
•Лигирование
кДНК-вектор
•Генетическая
трансформация
•Селекция клонов
11