1. Генетика прокариот 1.1. Генетический материал прокариот

1. Генетика прокариот
1.1. Генетический материал прокариот
Химическая природа носителя информации
Цитогенетические основы генетики бактерий
Репликация ДНК
1. Генетика прокариот
Наследственный материал прокариот – ДНК, подобно всем другим клеточным
организмам. В основе наследственности прокариот находятся общие понятия о мутациях,
репликации ДНК и рекомбинации генов. Многие закономерности современной генетики
были открыты на моделях – прокариотах, самый распространенный объект исследования
– бактерии кишечной палочки Escherichia coli.
Прокариотические клетки содержат хромосомы и обладают половыми признаками,
например, разделение клеток на доноров и реципиентов генетического материала.
Хромосома прокариот не отделена от цитоплазмы ядерной мембраной и не связана с
гистоновыми белками, в то же время она образует сложный комплекс с молекулами РНК
и белками – нуклеоид. Важнейшую роль в жизни прокариот играют мобильные элементы,
содержащие множество факультативных генов, дополняющих хромосомные «гены
домашнего хозяйства». К числу мобильных элементов относятся инсерционные
последовательности, транспозоны, конъюгативные транспозоны, островки патогенности и
плазмиды. Мобильные элементы способны свободно приходить в геном хозяина и
покидать его; возможно, лишь меньшая их часть обладает адаптивным значением.
Генетические
особенности
прокариот
–
организация
генов
в
опероны,
регулируемые общими элементами, трансляция полицистронной РНК с участием
нескольких рибосом (полисома) – обеспечивают высокую скорость метаболизма и
адаптаций. Наиболее удивительное приспособление прокариот – способность к
горизонтальному переносу генов (ГПГ) – дает им несравненные способности к адаптации.
Роль ГПГ существенно переосмыслена в последние годы, очевидно массированный
перенос генов, повсеместно распространенный среди прокариот, имеет огромное значение
в эволюции живого мира. Гены прокариот представляют общий пул генов, обладающий
сложной
структурой и способный к постоянному перемешиванию с различной для
отдельных групп генов частотой.
1
1.1. Генетический материал прокариот
Генетическая информация хранится в виде последовательности азотистых
оснований ДНК. Основания представлены аденином (6-аминопурин), гуанином (2-амино6-оксипурин),
цитозином
(2-окси-4-аминопиримидин)
и
тимином
(2,4-диокси-5-
метилпиримидин). Нуклеотидный состав ДНК подчиняется правилу Чаргаффа (19501952 гг.), структура ДНК представлена двойной правосторонней спиралью из
антипараллельных цепей.
Роль ДНК как носителя генетической информации была доказана в опытах
О. Эвери, К. Маклеода и М. Маккарти в 1944 г. (трансформация стрептококка). В
эксперименте А. Херши и М. Чейза в 1952 г. было показано, что при инфицировании
E. coli фагом Т2 в клетку проникает только ДНК, которая переносит информацию о
белках вируса.
Генетическая информация передается от
родительских клеток дочерним
(вертикально). Реализация информации происходит с помощью механизмов транскрипции
и трансляции, принципиально схожих у представителей всех 3 доменов живого (Бактерии,
Археи и Эукариоты). Основная догма молекулярной биологии «Один ген – один фермент»
существенно дополнена в наши дни. Выяснено, что многие РНК-продукты экспрессии
генов также могут регулировать процессы клетки, регуляторные функции выполняют как
одно-, так и двуцепочечные молекулы РНК. Многие гены прокариот организованы в
опероны и регулоны, управляемые общими регуляторными элементами.
Химическая природа носителя информации
Каждый нуклеотид ДНК состоит из азотистого основания, связанного Nгликозидной связью с С1 атомом углерода (1′) в составе 2-дезоксирибозы. Соединение
основания и пентозы называется нуклеозидом. Нуклеозид способен присоединить 1, 2 или
3 фосфатных группы в 3′ или 5′ положениях пентозного кольца, такие соединения
называется дезоксинуклеотидами. В молекуле ДНК дезоксинуклеотиды соединены 3′-5′фосфодиэфирными связями, которые связывают кольца дезоксирибозы. На 5′-конце
молекулы находится фосфатная группа, на 3′-гидроксильная группа, это свойство делает
всю цепь ДНК полярной. В составе двойной спирали, отдельные цепи направлены
противоположно (свойство антипараллельности) (рис. 1.1).
2
Рис. 1.1. Строение молекулы ДНК [Passarge, 2007]
3
Модель структуры ДНК в виде двойной правосторонней спирали была предложена
Уотсоном и Криком в 1953 году. Основой для построения модели служили данные
рентгеноструктурного анализа, полученные Морисом Уилкинсоном и Розалинд Франклин
(1951-1953) и открытие Эрвина Чаргаффа сделанное в 1950 г.
Морис Уилкинс (1916-2004)
Розалинд Франклин (1920-1958)
Эрвин Чаргафф обнаружил, что частота встречаемости аденина в составе ДНК
соответствует частоте тиминов, аналогично частота гуанинов соответствует частоте
цитозинов. Отношение (А+Т) : (G+C) является видоспецифичным признаком данного
вида организмов. Эта закономерность (правило Чаргаффа) объясняется тем, что аденин
связывается с тимином, образуя две водородные связи, а гуанин с цитозином, образуя
тройную связь.
Двойная
спираль
имеет
диаметр
2
нм,
ее
структура
не
зависит
от
последовательности нуклеотидов (рис. 1.2). Полный виток спирали составляют 10,4 пар
оснований, шаг спирали равен 3,4 нм (В-форма ДНК). В клетках эукариот ДНК имеет
линейную структуру, клетки прокариот содержат ДНК, замкнутую в кольцо. Молекулы
ДНК, обладающие разной топологией, получили название топоизомеров, ферменты,
катализирующие взаимное превращение форм – топоизомеразы.
4
Рентгенограмма волокон натриевой соли тимусной
Эрвин Чаргафф (1905-2002)
ДНК в B-форме, полученная Розалин Франклин в
1952 г. [Franklin, Gosling, 1953]
Рис. 1.2. Структура молекулы ДНК (вид со стороны конца цепочки). Белым цветом
выделена ближайшая пара оснований (АТ-пара), красным показаны атомы кислорода,
водящие в состав рибозы [Joanne M. Willey et al., 2008]
5
Цитогенетические основы генетики бактерий
Строение бактериальной хромосомы
ДНК прокариот – компактное образование в цитоплазме клетки. Генетический
аппарат получил название нуклеоид, он
занимает, как правило, центральную
часть клетки и заполнен нитями ДНК.
Нуклеоид по морфологии напоминает
соцветие цветной капусты и занимает
примерно 30% объема цитоплазмы. Его
составляет одна кольцевая молекула
ДНК – бактериальная хромосома.
Бактериальная
представляет
двуспиральную
собой
хромосома
кольцевую
правозакрученную
Рис. 1.3. Кольцевая
(слева)
может
молекула
образовывать
ДНК
вторичную
молекулу ДНК (рис. 1.3), которая
суперспиральную структуру [Joanne M. Willey
свернута во вторичную спираль. Длина
et al., 2008]
бактериальной хромосомы составляет
примерно 4,7 млн. нуклеотидных пар (п.н.), или ~ 1,6 мм. В растущей культуре число
бактериальных хромосом может достигать 4-8 на клетку. Вторичная структура хромосомы
поддерживается с помощью гистоноподобных (основных) белков и РНК. Точка
прикрепления бактериальной хромосомы к мезосоме (складке плазмалеммы) является
точкой начала репликации ДНК (эта точка носит название OriC).
Организация генома прокариот (на примере E. coli)
Бактериальная хромосома удваивается перед делением клетки, и сестринские
копии распределяются по дочерним клеткам с помощью мезосомы. Репликация ДНК идет
в две стороны от точки OriC и завершается в точке TerC. Молекулы ДНК, способные себя
воспроизводить путем репликации, называются репликоны. Бактериальные хромосомы
содержат 2000 – 4000 генов. Обычно это гены «домашнего хозяйства», то есть
необходимые для поддержания жизнедеятельности клетки.
Хромосома бактерий
•
Хромосома бактерий = крупный репликон.
•
Имеются точки начала и терминации репликации.
6
•
Бактериальная ДНК не организована в нуклеосомы, но покрыта гистоноподобными
белками, структурирующими нуклеоид.
•
Область нуклеоида почти не содержит рибосом.
Репликация ДНК
Репликация ДНК прокариот
Бактериальные хромосомы,
хромосомы в отличие от
эукариотических,
имеют
только
одну точку
начала репликации. Репликация ДНК происходит
одновременно и сразу в двух направлениях
кольца хромосомы, создавая две репликационные
вилки (рис. 1.4).
Раскручивание спирали ДНК в обоих
направлениях
должно
вызвать
скручивание
хромосомы
мы в направлении спирали и сделать
хромосому
такой
плотной,
что
репликация
должна бы закончиться, если бы не действие
фермента ДНК-гиразы.
Это представитель группы ферментов,
называемых топоизомеразами,
топоизомеразами которые могут
изменять
форму
молекул
ДНК.
предотвращает
суперскручивание,,
ДНК
ДНК-гираза
положительное
скручивая
ДНК
в
Рис.
1.4.
Полуконсервативный
механизм репликации ДНК [Joanne
M. Willey et al
al., 2008]
противоположном направлении.
В репликационных вилках ДНК расплетаются ферментом,
ферментом, называемым геликазой.
Как только отдельные нити расплетутся, белки, связывающиеся с однонитевыми ДНК
(ССБ-белки),
), не дают расплетенным нитям соединяться друг с другом вновь.
Тета-репликация
Фермент праймаза использует участок на каждой нити расплетенно
расплетенной ДНК как
матрицу для синтеза коротких нитей РНК, называемых праймерами
праймерами, которые, в свою
очередь, требуются для начала дупликации ДНК ферментом ДНК
ДНК-полимеразой.
7
Примерно в середине процесса репликации хромосома похожа на греческую букву тета θ,
поэтому процесс
цесс называется тета-репликацией (рис. 1.5, 1.6).
Рис. 1.5. Репликация ДНК прокариот происходит одновременно в двух направлениях
направлениях,
показан механизм «тета-репликации»
«тета
[Joanne M. Willey et al., 2008]
2008].
Рис. 1.6. Изображение реплицирующейся хромосомы E. coli,, полученное с помощью
авторадиографии (слева) и графическая
графическая схема этого процесса (справа) [Joanne M. Willey et
al., 2008].
Сигма-репликация
репликация
Сигма-репликация
репликация служит для полной или частичной репликации
ре ликации ДНК. Бактерии
передают фрагмент ДНК в процессе конъюгации или при заражении бактерии вирусом.
При сигма-репликации
репликации разрезается одна из нитей двойной спирали ДНК, а геликаза и
ССБ-белки
белки стабилизируют репликационную вилку в этом месте. Во время репликации
ведущей нити матрица отстающей нити смещается и реплицируется
реплицируется в виде коротких
8
фрагментов Оказаки.. Репликация происходит так же, как репликация линейной ДНК у
эукариот. В результате образуется кольцо с линейным хвостом. Формируется характерная
структура, давшая второе название этому механизму репликации – «катящееся колесо»
(рис. 1.7).
Рис. 1.7. Репликация типа «катящееся колесо» или сигма-репликация
сигма репликация [Joanne M. Willey et
al., 2008]
Синтез каждого сегмента Оказаки происходит последовательно через следующие
стадии (рис. 1.8, 1.9):
1. Раскручивание нитей ДНК.
2. Расплетение (разделение нитей).
3. Стабилизация однонитевых участков.
4. Формирование праймосомы. Праймосома – мультиферментный комплекс, в ко
который
входят фермент ДНК-праймаза
праймаза и ряд других белков.
5. Синтез с участием ДНК-праймазы
ДНК
(англ. Prime – подготавливать) затравочной РНК.
Затравочная РНК необходима для синтеза каждого сегмента Оказаки потому, что сама
ДНК-полимераза
полимераза не способна инициировать синтез ДНК, для этого ей нужна
специальная затравка, роль которой и выполняют короткие, длиной не боле
более 10
нуклеотидов, фрагменты РНК, комплементарные ДНК-матрице.
ДНК
6. Синтез сегмента Оказаки.
9
7. Вырезание
затравочной
РНК
и
замещение
ее
дезоксирибонуклеотидами,
комплементарными
плементарными основаниям ДНК-матрицы.
ДНК
8. Сшивание сегмента Оказаки с предсуществующей нитью ДНК с помощью лигазы.
9. Суперспирализация вновь синтезированных участков нитей ДНК.
10.
Ревизия ДНК-полимеразой
полимеразой вновь синтезированного
синтезированного фрагмента ДНК – нет ли
ошибочного включения нуклеотидов.
Если произошла ошибка, то ошибочно включенный нуклеотид с часть
частью этой нити
вырезается и образовавшаяся брешь заполняется
заполняется правильными нуклеотидами.
Рис. 1.8. Синтез ДНК у прокариот. Синтез лидирующей и запаздывающей цепей
принципиально не отличается от механизмов синтеза ДНК эукариот [Joanne M. Willey et
al., 2008]
10
Рис. 1.9. Синтез ДНК у прокариот (продолжение) [Joanne M. Willey et al., 2008]
Особенности
нности репликации ДНК прокариот
•
Скорость репликации ДНК у Е. coli при температуре 37 градусов соответствует
включению 2000 пар нуклеотидов в 1 с. У эукариот скорость репликации составляет 100
100300 нуклеотидов за секунду.
•
При благоприятных для роста бактерий условиях, когда еще не закончился один
цикл репликации, могут возникать вторичные и третичные репликативные вилки,
11
благодаря чему в клетке и происходит увеличение массы ДНК и числа копий хромосом.
Благодаря этой особенности скорость деления бактериальных клеток может значительно
превышать скорость репликации ДНК.
•
В осуществлении процессов репликации ДНК участвует целый комплекс
ферментов, образующих единую структуру – реплисому.
•
Генетический контроль репликации ДНК осуществляется большим количеством
генов (у Е. coli не менее 25), локализованных в самой ДНК (репликация – процесс
саморегулируемый).
•
Комплекс
генов
обеспечивает
строгую
временную
и
пространственную
координацию функционирования ферментов, участвующих в репликации.
•
Репликон – автономная репликационная единица, содержащая точку начала
репликации. Хромосома бактерии является большим репликоном, плазмиды также
являются репликонами.
Механизм распределения бактериальных хромосом:
Рис. 1.10. Механизм распределения бактериальных хромосом [Гусев, Минеева, 2003].
1 - ДНК; 2 - прикрепление хромосомы к ЦПМ; 3 - ЦПМ; 4 - клеточная стенка; 5 синтезированный участок ЦПМ; 6 - новый материал клеточной стенки
А - бактериальная клетка содержит частично реплицированную хромосому,
прикрепленную к мембране в точке (или точках) репликации;
Б - репликация хромосомы завершена. В бактериальной клетке две дочерние
хромосомы, каждая из которых прикреплена к ЦПМ;
В - продолжающийся синтез мембраны и клеточной стенки приводит к разделению
дочерних хромосом. На рис. 1.10 показано начало деления клетки путем образования
поперечной перегородки.
12