изучение генетической структуры популяций судака с помощью днк

1905
КазНИВИ
МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО «КАЗАГРОИННОВАЦИЯ»
ТОО «КАЗАХСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ
ВЕТЕРИНАРНЫЙ ИНСТИТУТ»
ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ
ПОПУЛЯЦИЙ СУДАКА С ПОМОЩЬЮ ДНК МАРКЕРОВ
(методические рекомендации)
Алматы, 2014
УДК 639.31.04+639.2.09
Изучение генетической структуры популяций судака с помощью
ДНК- маркеров (методические рекомендации).
Составители: Сарбаканова Ш.Т., кандидат биологических наук,
Шалгимбаева Г.М., магистр биологических наук.
Адрес: 050016, г. Алматы, пр. Райымбека, 223; тел. +7 (727) 233-72-71
e-mail: kaznivialmaty@mail.ru
Рекомендации предназначены для гидробиологов, научных работников
и специалистов рыбного хозяйства, занимающихся популяционной
генетикой, а также студентов, обучающихся по соответствующей
специальности.
Рекомендации утверждены на заседании ученого совета ТОО
«Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт» АО
«КазАгроИнновация» (протокол № 2 от 09. 07. 2014г.)
2
СОДЕРЖАНИЕ
Введение
4
1
Сбор образцов плавников рыб
4
2
Выделение и очистка ДНК
6
3
Подбор микросателлитных праймеров
7
4
Проведение ПЦР с помощью микросателлитных ДНКмаркеров
8
5
Электрофорез ПЦР-продуктов в агарозном геле
9
6
Определение аллельного состава микросателлитных
локусов
9
Заключение
12
Литература
12
3
ВВЕДЕНИЕ
Судак Sander lucioperca относится к отряду окунеобразных
Perciformes, семейству окуневых Percidae, роду судак Sander. Судак
распространен в бассейнах Балтийского, Черного, Азовского, Каспийского и
Аральского морей. В последние годы именно судак в Казахстане является
наиболее коммерчески ценным видом рыб и одним из объектов экспорта. С
увеличением экспорта судака в Европу наблюдается промысловый пресс на
популяцию судака во всех водоемах Казахстана. Численность судака в
естественных водоемах стремительно сокращается, наблюдается падение его
размерно-весовых показателей, нарушение возрастной структуры рыб и
сокращение числа половозрелых самок.
Для сохранения высоких показателей уловов, поддержания
численности и эффективного проведения искусственного воспроизводства
судака необходимы знания о генетической структуре и его природном
популяционном полиморфизме в основных рыбохозяйственных водоемах
Казахстана. В условиях рыбоводных хозяйств Казахстана можно
целенаправленно сформировать ремонтно-маточное стадо, получить и
вырастить в карповых прудах жизнеспособный рыбопосадочный материал
судака (средней массой 60 г) для последующего зарыбления озер и
водохранилищ. До настоящего времени работы по искусственному
разведению судака для зарыбления естественных водоемов и прудовых
хозяйств в Казахстане не проводились. Изучение популяций судака, их
генетического полиморфизма с использованием ДНК-маркеров для
выращивания в аквакультуре является приоритетным направлением
современной науки.
1.Сбор образцов плавников рыб
Наиболее доступным материалом для последующего выделения и
анализа суммарной ДНК являются фрагменты плавников.
Сбор проб желательно унифицировать. Например, собирать только в
однотипные пробирки, заранее наполненные спиртом. Этикетки (вкладыши)
также следует подготовить заранее. Инструменты и материалы должны быть
предварительно проверены. Особое внимание следует обратить на
хирургический инвентарь (несколько наборов ножниц, скальпелей, пинцетов,
изготовленных из нержавеющей стали). Взятие проб удобно осуществлять
вдвоем.
Получение проб всегда должно быть строго индивидуализировано. Не
допускается смешение проб от разных особей в одной пробирке.
Непосредственно перед взятием пробы покровных тканей (плавник)
участок используемой поверхности должен быть очищен от слизи и
4
возможных эктопаразитов чистой салфеткой или тампоном, обильно
смоченными спиртом.
Все инструменты, используемые при взятии материала (скальпели,
ножницы, пинцеты и т.д.), при переходе от особи к особи должны тщательно
очищаться механически (чистой марлевой салфеткой), промываться
детергентом, затем чистой водой и обеззараживаться спиртом (70-96%). Не
допускается использование инструментов, загрязненных остатками тканей от
предыдущего взятия проб. В тех случаях, когда санитарная обработка
инструментария затруднена или невозможна, должны использоваться только
одноразовые инструменты (скальпели со сменяемыми лезвиями, полулезвия
безопасных бритв, пластиковые одноразовые пинцеты, салфетки, тампоны и
т.д.).
В качестве образца ткани, предназначенного для последующей
фиксации и выделения ДНК ножницами отсекают небольшой фрагмент (1-2
см2) любого здорового плавника (обычно спинного).
Использование для получения проб больных или снулых особей, с
признаками истощения, наличием серьезных аномалий развития и
отклонений от стандарта фенотипической нормы не допускается.
Для предотвращения деградации ДНК, полученные пробы тканей
должны быть немедленно помещены в фиксирующий раствор.
Для полевых условий наилучшим фиксатором является этанол (спирт
этиловый ректификованный, высшей очистки, 92-96%).
Первичная этанольная фиксация осуществляется при соотношении
спирт:образец (10:1). Вторичная фиксация, или перезаливка – в среднем не
ранее, чем через трое суток) производится в соотношении спирт:образец
(5:2). Ее выполняют, как правило, уже в стационаре. Вторичная фиксация
(перезаливка) улучшает сохранность образцов, поскольку тем самым
замещается первичный, частично обводненный этанол на свежий. Повторное
использование этанола от первичной заливки недопустимо.
Для дополнительной герметизации и предотвращения случайного
откручивания крышки место ее соединения с пробиркой желательно
обмотать пленкой типа "Parafilm", или парафинировать. В полевых условиях
можно использовать клейкую ленту «скотч».
Образцы, зафиксированные и перезалитые этанолом, могут храниться
при комнатной температуре в течение 30 и более суток. Длительное (многие
месяцы, годы) хранение образцов возможно только при низких (от -28ºС и
ниже) температурах.
Все зафиксированные тем или иным способом образцы подвергаются
сквозной маркировке, т.е. получают только порядковые номера, которые
должны быть нанесены несмываемым водой и спиртом маркером на
пробирку. В отсутствие подходящего маркера порядковый номер наносится
мягким простым карандашом на этикетку, которая вкладывается внутрь
пробирки. Маркирование пробирок и (или) подготовка этикеток должны
выполняться заранее).
5
Утрата порядкового номера или его неоднозначная интерпретация
равносильны утрате образца.
Параллельно сбору проб ведется протокол. С учетом возможного
использования
данных
молекулярно-генетического
анализа
для
интерпретации наблюдений другого уровня, он может быть дополнен иными
параметрами (например, морфометрическими протоколами), без, разумеется,
ущерба для основных данных.
Протокол составляется в двух экземплярах (копиях, ксерокопиях), один
из которых является сопроводительным листом для проб, второй сохраняется
у Коллекционера. Протокол должен быть авторизован (подписан
Коллекционером, непосредственно осуществлявшим сбор проб).
Коллекционер обязан вносить в протокол только достоверную
информацию, в особенности, касающуюся первичного определения видовой
(популяционной или иной) принадлежности особи, от которой получена
проба, включая ссылку на систему ее описания. В случае сомнений
относительно типичности фенотипа, соответствующая запись должна быть
обязательно произведена в протоколе. При этом необходимо точно указать,
какие именно меристические или пластические признаки и в какой системе
измерений (промеров) отклоняются от эталонных критериев и насколько [4].
Протокол фенотипической идентификации особи, равно как и иные,
существенные для дальнейшего использования образцов данные
(фотоснимки, номер индивидуальной метки, и/или ее логотип) прилагаются к
протоколу сбора образцов в обязательном порядке. В виде дополнений могут
прилагаться результаты биологических исследований иного уровня:
морфологические, физиологические, биохимические, токсикологические и
т.д.
2. Выделение и очистка ДНК судака
Выделение и последующую очистку ДНК из образцов проводили
методом абсорбции на колонках (PALL) [1]. c контролем качества выделения
на спектофотометре или солевым методом [2].
К образцу ткани (фрагмент плавника 2х2 мм) добавляют 400 мкл
солевого лизирующего буфера, содержащего 0,4 М хлорид натрия, 10 мМ
Трис-НСl (рН 8,0) и 2 мМ ЭДТА, а также 40 мкл 20% SDS и 5 мкл
протеиназы «К» (10 мг/мл), тщательно перемешивают и инкубируют в
термостатируемом шейкере (120 об/мин.) при температуре 55-60°С в течение
ночи. По окончании инкубации в пробирку добавляют 300 мкл 6 М хлорида
натрия (насыщенный раствор при комнатной температуре), тщательно
аккуратно перемешивают или 30 с на вортексе и центрифугируют в течение
30 мин. на скорости 14000 об/мин при 4 °С. Супернатант переносят в чистую
пробирку и добавляют равный объем (600 мкл) изопропилового спирта,
аккуратно перемешивают, выдерживают при температуре -20°С в течение
часа, после чего центрифугируют при +4°С на скорости 14000 об/мин. в
6
течение 30 минут Осадок промывают 70% этанолом, подсушивают и
растворяют в деионизованной воде. Для этого отбирают пипеткой
изопропанол, к осадку добавляют 500 мкл 70% этанола, затем
центрифугируют в течение 10 мин на скорости 14000 об/мин при 4 °С,
отобрать спирт и повторить процедуру промывки 70% этанолом. Снова
отобрать спирт и высушить осадок (только не пересушивая). Растворить
осадок в 50-500 мкл деионизованной воды или в 10мМ Трис-НС1, 1 мМ
ЭДТА, рН 7,4 буфере.
1. Подбор микросателлитных праймеров
В качестве одного из подходов к решению проблемы о
филогенетических отношениях между популяциями рыб используют метод
сравнения нуклеотидных последовательностей различных участков
митохондриальной ДНК (мтДНК) у особей. Выбор метода обусловлен тем,
что мтДНК передается только по материнской линии, эволюционирует с
большей скоростью, чем большинство ядерных генов, и в ней отсутствуют
механизмы рекомбинации. Изучение аллельного состава микросателлитных
локусов (STR-анализ) является одним из основных методов исследования
мтДНК. Именно эти регионы ДНК, не находящиеся под давлением отбора,
эволюционируя со своей собственной скоростью, постепенно накапливают
наследуемые в потомстве дифференциальные признаки, анализ которых
позволяет проводить межвидовую, внутривидовую (популяционную) и
индивидуальную идентификацию особей разных видов рыб.
В последние годы ученые активно используют ДНК-маркерные
последовательности для контроля происхождения рыбной продукции. Для
анализа полиморфизма судака использованы 11 пар микросателлитных
локусов, апробированные в работе Gharbkhani et al., (2009) и Khurshut,
Kohlmann (2008). Нами была проведена оптимизация ПЦР для всех
праймеров и отобраны 6 видоспецифических микросателлитных маркеров,
представленные в таблице 1.
Таблица 1 - Микросателлитные маркеры судака.
MSL-3
F: FAM-CCGGCATCCATACACCTTAC
R:CACACCTgTgTCTgCCTAACA
MSL-4
F: TAMRA-TCAAGACCCCAGAACCAATC
R: CAgACAgCTAAgAgAACAACAgg
MSL-5
F: FAM-CAATCGCTCTGAGGATGTCA
R: AAgggTggggAAATTATTCg
MSL-7
F:HEX-CACACAGCAGCATGTGACAA
R:ggCACggAggTAgAATggTA
Pfla 3
F:FAM-GCCGAATGTGATTGAATG
7
Yp 13
R:CgCTAAAgCCAACTTAATg
F:HEX-GGCACCCAAACTACCACT
R:ATCAAACAAgCCCCATACA
Оптимизации ПЦР для всех праймеров осуществлялась при проведении
ПЦР при варьирующих условиях. Температура отжига праймеров изменялась
от 46 до 58 оС. Результат амплификации при различных температурах
анализировался методом капиллярного электрофореза, и выбирались
наиболее оптимальные условия для каждого локуса. Результат проверки и
оптимизации протокола амплификации микросателлитных локусов позволяет
выбрать панель маркеров для дальнейших популяционно-генетических
условий.
4. Проведение ПЦР с помощью микросателлитных ДНК-маркеров
Молекулярно-генетические
исследования
выполняются
по
общепринятым методикам: полимеразная цепная реакция (ПЦР) [3].
Лабораторные исследования опытных образцов на микросателлитный
анализ проводятся методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с
использованием наборов реактивов, разрешенных к применению для этих
целей в установленном порядке. Работа включает несколько этапов:
пробоподготовку; процедуру выделения ДНК; проведение реакции
амплификации; интерпретацию результатов.
Проводится ПЦР с отобранными микросателлитными праймерами,
температура отжига праймеров изменяется от 54 до 58 оС. Реакции
амплификации проводят в конечном объеме 15 мкл [70 мМ Трис-HCl (pH
8.6); 16,6 мМ (NH4)2SO4; 1,8 мM MgCl2; по 200 мкМ каждого
дезоксирибонуклеозидтрифосфата; 1 пкМ праймера, модифицированного на
5’-конце флуоресцентным красителем FAM, HEX или TAMRA; 4 пкМ
обратного (не меченного) праймера; 50-100 нг ДНК-матрицы и 1,2 единиц
Taq-полимеразы («Силекс»)] по следующей схеме: предварительная
денатурация ДНК: 94 оC – 2 мин; 8 циклов: плавление – 90 оС – 20 сек, отжиг
праймеров – 58 оС в первом цикле – 25 сек и в каждом последующем цикле
температура отжига снижалась на 0,5°С до 54 оС, синтез ДНК – 65 оС – 40
сек; 40 циклов: плавление – 90 оС – 20 сек, отжиг праймеров – 54 оС - 25 сек,
синтез ДНК – 65 оС – 40 сек); досинтез ДНК при 70 оС – 10 мин.
Полученную ПЦР смесь разбавляют Н2О milliQ, затем по 1,2 мкл
разбавленной реакции переносят в 12 мкл формамида Hi-Di с добавленным
молекулярным стандартом для определения размера амплифицируемых
фрагментов ДНК.
Электрофоретическое разделение продуктов амплификации проводят с
помощью системы капиллярного электрофореза «ABI3100/3130 Genetic
analyzer», определение длин аллелей осуществляют с применением
программного обеспечения GeneMarker (Version 1.2). Определение
8
вероятности принадлежности особей к каждой из предполагаемых популяций
(видов) проводят в программе Structure 2.3.3.
5. Электрофорез ПЦР-продуктов в агарозном геле
Присутствие продуктов ПЦР определяют путем регистрации методом
электрофореза [4].
Для проведения горизонтального электрофореза ДНК в агарозном геле
используют электродный ТВЕ (трисборатный) буфер, состоящий из 0,089М
Трис, 0,089М борной кислоты и 0,002М ЭДТА. Трис-боратный буфер
обеспечивает хорошее разделение фрагментов ДНК и имеет высокую
буферную емкость. В буфер добавляют бромистый этидий до 0,5 мкг/мл для
детекции нуклеиновых кислот. Используют 1,7% агарозный гель, толщиной
около 0,6см. Движение ДНК осуществляется от отрицательного электрода к
положительному. Электродный буфер заливают в камеру сверху геля на
высоту 1-5 мм. Пробы ДНК смешивают с буфером для нанесения образца,
содержащим в конечной концентрации 30 % глицерина или 40% сахарозы,
0,025 % краситель БФС (бромфеноловый синий) и 0,25% ксилолцианол. При
наличии в образце большого количества фрагментов ДНК разной длины
можно наносить по 5-10 мкг в лунку. Электрофорез проводят в течение 25
минут при оптимальной напряженности электрического поля 10 В/см. Гели
анализируют и фотографируют под ультрафиолетом в трансиллюминаторе.
6. Определение аллельного состава микросателлитных локусов
Образцы выделенной ДНК анализируют по отобранным 6 локусам:
MSL3, MSL 4, MSL 5, MSL 7, Pfla3 и Yp13.
Аллели локусов определяют по хроматографическим пикам после
капиллярного электрофореза на генетическом анализаторе при фрагментном
анализе ДНК. По количеству пиков посчитывают количество аллелей по
тому или иному микросателлитному локусу (рисунок 1).
9
Рисунок 1. Хроматограмма, полученная методом капиллярного
электрофореза по локусу MSL 7 у двух особей судака. Вверху – гомозигота
по аллелю 263, внизу – гетерозигота по аллелям 249 и 267.
Все локусы по 6 микросателлитным маркерам оказались
полиморфными (количество аллелей на локус варьирует от 5 до 25 в
зависимости от вида и локуса). Размерный состав и частоты встречаемости
аллелей по судаку для всех 6 локусов представлены в таблице 2.
Таблица 2 - Размерный состав и частоты встречаемости аллелей
№п
/п
1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
MSL 5
Раз Час
мер тот
а
2
3
226 0,01
232 0,09
236
0
238 0,02
240 0,09
242 0,03
244 0,01
248 0,09
250 0,02
MSL3
Раз Часто
мер
та
4
229
237
239
241
243
245
247
249
251
5
0,026
0,061
0,009
0,123
0,018
0,061
0
0,08
0,18
Pfla3
Раз Час
мер тот
а
6
7
100 0,02
102 0,03
104 0,17
106 0,16
108 0,24
110 0,06
112 0,3
114 0,02
118
0
10
MSL 4
Раз Час
мер тот
а
8
9
172 0,02
176 0,08
178 0,05
180 0,23
182 0,16
184 0,32
186 0,07
188 0,03
196 0,03
MSL 7
Раз Час
мер тот
а
10
11
249 0,2
251 0,02
255 0,01
263 0,15
265 0,47
267 0,12
269 0,03
Yp13
Раз Час
мер тот
а
12
13
254
0
272 0,3
275 0,02
287 0,51
293 0,17
1
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
2
252
254
256
258
260
262
264
266
268
272
278
282
284
286
288
290
3
0,15
0,06
0,12
0,10
0,01
0,02
0,02
0
0,02
0,01
0,07
0,02
0,01
0,01
0,01
0,02
4
253
255
257
259
261
263
279
5
0,22
0,09
0,06
0,02
0,03
0,03
0
6
122
124
126
128
130
134
7
0
0
0
0
0
0
8
9
198 0,02
10
11
12
13
Как видно из таблицы 2, значительный полиморфизм обнаруживается
по локусу MSL 5 (25 аллелей) и наименьший по локусу Yp13 (5 аллелей). С
помощью представленных в таблице 1 олигонуклеотидных праймеров
выявлено 146 аллелей, из которых 51 специфический.
Следует отметить, что не все аллели некоторых локусов встречаются у
судака. Многие из тех, которые не обнаруживались у судака, были выявлены
у берша.
Например, праймер MSL 4 обнаруживал аллели только у судака, у
берша же этот праймер не выявлял ни одного аллеля (рисунок 2).
0,35
MSL4
0,3
0,25
0,2
судак
0,15
берш
0,1
0,05
0
172 176 178 180 182 184 186 188 196 198
Рисунок 2. Распределение частот аллелей по локусу MSL4
11
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
На основании полученных результатов исследования выбрана панель
маркеров для дальнейших популяционно-генетических исследований в виде
шести микросателлитных праймеров: MSL-3, MSL-4, MSL-5, MSL-7, Pfla3 и
Yp13.
С использованием отобранных праймеров проведен микросателлитный
анализ ДНК судака, определены размерный состав и частоты встречаемости
аллелей по всем изученным локусам: значительный полиморфизм
обнаруживается по локусу MSL 5 (25 аллелей) и наименьший по локусу Yp13
(5 аллелей). Панель ДНК-маркеров из 6 микросателлитных локусов
позволяет по обнаруженным определенным локусам и количеству и размеру
аллелей каждого локуса охарактеризовать и изучить генетический
полиморфизм каждой популяции судака.
С помощью полученных для микросателлитного анализа и изучения
генетической структуры судака шести молекулярных маркеров изучена
генетическая структура ДНК судака рыбохозяйственных водоемов
Казахстана. На основании проведения микросателлитного анализа выявлено,
что по локусу MSL 4 обнаружены аллели только у судака, при сравнении с
бершом. Этот же праймер не выявлял ни одного аллеля у берша, что в
дальнейшем дает возможность по этому ДНК-маркеру проводить видовую
идентификацию судака.
Сравнение полученных результатов с аналогичными результатами
отечественных и зарубежных работ [5-13] дает основание утверждать, что
использование микросателлитного анализа ДНК является эффективным
методом изучения генетического полиморфизма различных популяций рыб,
позволяет осуществлять видовую идентификацию рыб и в будущем
проводить контроль за происхождением рыбной продукции.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1 Ivanova N.V., deWaard J.,Hebert P.D.N. An inexpensive, automationfriendly protocol for recovering high-quality DNA // Molecular Ecology Notes.
V.6. P. 998-1002.
2 Aljanabi, S.M., Martinez, I. Universal and rapid salt-extraction of hign
quality genomic DNA for PCR-based techniques // NUCLEIC Acids Research.
1997. V. 25. P. 4692-4693.
3 Mullis K., Faloona F.,Scharf S. Specific enzymatic amplification of DNA
in vitro: the polymerase chain reaction // Cold Spring Harbor Symp. Quant.
Biol.1986.v.5.P. 263-273.
4 Маниатис, Т., Фритч, Э., Сэмбрук, Дж. Методы генетической
инженерии. Молекулярное клонирование // М.: Мир, 1984. С. 159-172.
5 Шалгимбаева, Г.М., Сарбаканова, Ш.Т., Булавина, Н.Б. Оценка
генетического разнообразия искусственно выращенных осетровых рыб
12
молекулярно-генетическими методами // Вестник КазНУ, серия
экологическая № 1 (33,) 2012. С. 148-150.
6 Kohlmann, K., Kersten, P. Isolation and characterization of nine
microsatellite loci from the pike-perch, Sander lucioperca (Linnaeus, 1758) /
Molecular Ecology Resources.2008.8: Р.1085-1087.
7 Khurshut, E., Kohlemann, K. Application of nine species-specific
microsatellite loci to characterize three pike-perch (Sander lucioperca) populations
from the Aral Sea basin in Uzbecistan / Environmental biotechnology. 2009.5 (1).
C.3-10.
8 Кahilainen, K.K., Teacher, A.G.F., Kahkonen, K., Vinni, M., Lehtonen,
H., Merila, J. First record of natural hybridization end introgression between
pikeperch (Sander lucioperca) and perch (Perca fluviatilis // Ann. Zool. Fennici,
48. March. 2011, P.39-44.
9 Sruoga, A., Butkauskas, D., Rashal,.I. Еvaluation of genetic diversity of
perch (Рerca fluviatilis) and pikeperch(sander lucioperca) population s from
curonian lagoon and inshore waters of the Вaltic Sea //. Acta Biol. Univ. Daugavp.
8 (1). 2008. ISSN. Р. 1407 – 8953.
10 Leclerc, D., T.Wirth, L. Bernatchez. Isolation and characterization of
microsatellite loci in the yellow perch (Perca flavescens), and cross-species
amplification within the family Percidae. // Molecular Ecology. 2000.9: Р.995-997.
11 Björklund, M., Aho, T., Larsson, L.C.. Genetic differentiation in
pikeperch (Sander lucioperca): the relative importance of gene flow, drift and
common history.// Journal of Fish Biology 71(Supplement B). 2007: Р. 264-278.
12 Gharibkhani, M., Pourkazemi, M., Soltani, M., Rezvani, S., Azizzadeh,
L. Population Genetic Structure of Pikeperch (Sander lucioperca Linnaeus, 1758)
in the Caspean Sea Using Microsatellite Markers // Journal of Fisheries and
Aquatic Science. 2009. 4 (3). P. 161-168.
13 Li, L., Wang, P., Givens, C., Czesny, S., Broun, B. Isolation and
characterization of microsatellites in yellow perch (Perca favesens) // Mol/ Ecol.
Notes. 2007. 7: Р.600-603.
13