признак летальности пыльцы и митохондриальный геном

ПРИЗНАК ЛЕТАЛЬНОСТИ ПЫЛЬЦЫ
И МИТОХОНДРИАЛЬНЫЙ ГЕНОМ
САХАРНОЙ СВЕКЛЫ BETA VULGARIS L.
И.Б.Хворостов*, С.Г.Вепрев, С.И.Малецкий, Г.М.Дымшиц*
*Лаборатория структуры генома
Институт цитологии и генетики СО РАН
630090, Новосибирск, просп. ак. Лаврентьева, 10
тел.: (3832) 33–39–10, факс: (3832) 33–12–78
еmail: van@niboch.nsc.ru
Признак цитоплазматической мужской стерильности (ЦМС) приводит к нарушению микроспорогенеза и образованию летальной (стерильной) пыльцы. Он является полигенным и проявляется при взаимодействии рецессивных аллелей нескольких ядерных генов, называемых закрепителями стерильности, а также цитоплазматических детерминант, расположенных в митохондриальном геноме.
Исследование признака проводится как генетическими так и молекулярнобиологическими методами. Ядерные гены, отвечающие за проявление ЦМС, к насто-ящему времени малоизучены на молекулярно-генетическом уровне, в отличие
от митохондриальных детерминант. Многочисленные исследования показали, что
мтДНК при переходе к состоянию ЦМС подвергается целому ряду структурных перестроек, набор которых стабилен и позволяет однозначно дискриминировать мужскостерильные и фертильные растения молекулярно-биологическими методами.
Для большей части перестроек мтДНК не показано непосредственной причинноследственной связи с развитием признака ЦМС.
Большая часть перестроек, происходящих в мт-геноме при развитии признака
пыльцевой стерильности, может быть объяснена рекомбинационными событиями
по протяженным или коротким повторенным последовательностям, выявленным к
настоящему моменту в составе мт-ДНК. Кроме этого, развитие признака ЦМС, как
правило, сопровождается изменением в наборе плазмидоподобных молекул, интенсивности экспрессии отдельных митохондриальных генов, а также спектра продуктов транскрипции и трансляции.
Ранее нами было показано, что клеткам сахарной свеклы свойственно гетероплазматическое состояние [1], при котором в клетках одно-го растения присутствуют
митохондрии как стерильного (S-) так и нормального (N-) типа. Была выдвинута гипотеза о связи такого состояния с наследованием признака ЦМС в ряду поколений. Поскольку перестройки мт-генома, коррелирующие с приз-наком ЦМС, являются стабильными, а последовательности генов atpA и atp6 (α- и 6-я субъединицы F1F0фактора АТФазного комплекса) обнаружены только в мтДНК, мы разработали тестсистему на основе полимеразной цепной реакции с использованием трех праймеров
для проведения скрининга различных линий сахарной свеклы по типу цитоплазмы без
учета их фенотипического состояния (рис. 1).
После проведения амплификации должны образовываться либо два продукта
реакции для гетероплазматичных растений, либо один амплификационный продукт
(специфичный для митохондрий стерильных растений или специфичный для митохондрий нормальных растений) в случае гомоплазматичных растений.
С использованием этой системы было проанализировано потомство от переопыления 9 фертильных растений линии СОАН-31, имеющей стабильный признак конверсии к стерильному фенотипу. Частота конверсии к ЦМС в данной серии составила
33,3%. На анализ была взята выборка из 14 растений, из которых 2 имели мс0 фено-
тип (полная стерильность), 4 – мсI (полустерильность) и 8 были фертильными. Тотальная ДНК для проведения амплификации индивидуально выделялась из каждого
растения. Электрофорез продуктов амплификации показал, что у растений с фенотипом мс0 и мсI присутствует основной фрагмент, характерный для мт-генома Sцитоплазмы. Однако у всех этих растений также образовывался минорный продукт
реакции, специфичный для мт-генома N-цитоплазмы. Для фертильных растений обнаружен либо один фрагмент, специфичный для N-цитоплазмы, либо дополнительно
присутствовал в значительно меньшем количестве фрагмент, характерный для Sцитоплазмы (рис. 2).
маркер
фертильн. №18
фертильн. №18
фертильн. №16
фертильн. №14
фертильн. №14
фертильн. №15
фертильн. №8
фертильн. №8
фертильн. №21
мcI №12
мcI №11
мcI №10
фертильн. №6
мcI №7
фертильн. №6
мcI №5
мcI №2
маркер
Рис. 1. Стратегия проведения амплификации. Показано схематичное положение праймеров
P1, P2, P3, а также размер продуктов, образующихся в реакции амплификации последовательностей, специфичных для нормального (N) и «мутантного» (S) гена atpA митохондриального генома сахарной свеклы; Н – сайт рестрикции эндонуклеазой HindIII; В – сайт рестрикции эндонуклеазой BamHI.
S→
N→
Рис. 2. ПЦР-анализ плазмотипа 14 растений линии СОАН-31. Над дорожками указан номер и
фенотип растения.
Эти данные соответствуют ранее полученным результатам по конверсии типа
цитоплазмы при репродукции линии СОАН-31 [2], а именно: митохондриальный геном мс-растений в основном содержит копии мтДНК S-цито-плазмы, а фертильных
растений – N-цитоплазмы. Увеличение чувствительности метода тестирования мтгенома с помощью ПЦР позволило установить, что у мс-растений в митохондриях
наряду с преобладающей «мутантной» копией области гена atpA сохраняется в малой концентрации исходная нормальная копия. У исследованных фертильных растений обнаружен полиморфизм по типу цитоплазмы: часть клеток содержит митохондрии только с нормальной копией гена atpA, в других в малой концентрации есть
и «мутантная» копия. Полученные данные о клеточном полиморфизме фертильных
растений подтверждают возможность конверсии типа цитоплазмы и возникновения
ЦМС-форм в результате процесса сортировки митохондрий с нормальной и «мутантной» копиями ДНК в ряду клеточных поколений.
С целью экспериментальной проверки роли ядерных генов в процессе конверсии N-типа цитоплазмы в S-состояние нами проведены скрещивания растений с Nцитоплазмой и линии-мутатора СОАН-31 (рис. 3).
Рис. 3. Схема эксперимента по проверке роли ядерных генов в процессе конверсии типа цитоплазмы.
Линии с N-цитоплазмой отобраны нами по следующим критериям: а) они являются закрепителями ЦМС; б) в их мт-геноме методом ПЦР не выявляются S-последовательности мтДНК (N-гомоплазматичные растения). Этим требованиям соответствуют две отобранные линии: FC-504 – линия закрепитель ЦМС Оуэновского
типа (международный стандарт, предоставлена д-ром L.Panella, USA); линия СОАН252 – закрепитель ЦМС, получена в ИЦиГ СО РАН. Используя амплификационную
систему, мы провели скрининг 50 растений (по 25 из каждой линии) по типу цитоплазмы. ПЦР анализ показал, что они все N-гомоплазматичные. Эти растения были
опылены пыльцой гетероплазматичной линии СОАН-31. В поколении F1 методом
ПЦР проверены потомства 3 материнских растений линии FC-504 (30 растений) и 2
материнских растений линии СОАН-252 (20 растений). Все гибридные растения были гомоплазматичными и имели N-тип цитоплазмы. Летом 1998 г. в полевых условиях проведена оценка поколения F1 по фертильности пыльцы. Всего исследовано
133 растения. Все растения были фертильны, признаков ЦМС не обнаружено.
Аналогичные скрещивания были проведены в обратном направлении, при
этом в качестве отцовских использовали ранее исследованные, а затем взятые в
прямые скрещивания растения линий FC-504 и СОАН-252. Опылялось во всех случаях то же самое растение линии СОАН-31, которое в прямых скрещиваниях выступало как пыльцевой родитель. Гибридные растения F1 также оказались
N-гомоплазматич-ными (ПЦР анализом тестировано 50 растений). В полевых условиях все исследованные 112 растений были нормальными – фертильными.
Для завершения гибридологического анализа летом 1998 года было получено
поколение F2 путем самоопыления прямых и обратных гибридов, а также проведено
беккроссирование линией СОАН-31. В настоящее время проводится выращивание
корневого материала в теплице для анализа растений второго поколения по признаку ЦМС и определения типа цитоплазмы. Описанная схема классического гибридологического анализа имеет целью проверить гипотезу о существовании ядерного
гена-мутатора, вызывающего конверсию N-цитоплазмы в S-состояние. Использование
прямых
скрещиваний,
где
в
качестве
матери
используются
N-гомоплазматичные растения, и обратных скрещиваний, где в качестве материнских выступают растения СОАН-31 (гетероплазматичные), позволит разграничить
две возможные причины конверсии типа цитоплазмы: либо ген-мутатор вызывает
образование S-последовательностей de novo, либо он «запускает» процесс сортировки митохондрий в гетероплазматических растениях в пользу S-варианта.
Кроме анализа наследования типа цитоплазмы в ходе конверсии N-типа цитоплазмы в S-состояние, нами также была проанализирована передача в потомстве
мтДНК при агамоспермном размножении сахарной свеклы. Имеющиеся в нашем
распоряжении линии сахарной свеклы мсСОАН-31 (ИЦиГ СО РАН), msKWS1,
msKWS3 и msKHBC2 (немецкие и польские линии, получены от Р.Крысинского),
способные размножаться апомиктично, позволили нам проанализировать их агамоспермное потомство, полученное от исходно стерильных растений. Описанной системой ПЦР было проанализировано 53 растения поколения А1 от 1 до 9 из каждой
линии. Результаты представлены в таблице. Высокая частота конверсии фенотипа
от стерильного к фертильному не может быть объяснена только мутационным процессом. Все проанализированные растения были гетероплазматичны с преобладанием в большей части случаев митохондрий S-типа (см. линии мсСОАН-31,
msKWS1-3А). Однако у некоторых линий такое преобладание было незначительным
(см. линии msKWS3-22А, msKWS1-5A, msKHBC2-8A), либо митохондрии как
N- так и S-типа были представлены в равном отношении (см. линии msKHBC2-10A,
msKHBC2-22A). У одного растения наблюдалось преобладание нормального типа
митохондрий (см. msKHBC2-10А растение № 13). Резких скачков по содержанию того или иного типа митохондрий внутри линий не наблюдалось. И что самое интересное – не было никакой связи между плазмотипом и фенотипическим проявлением
признака ЦМС.
Мы проследили дальнейшее наследование плазмотипов с различным содержанием митохондрий двух типов в следующем агамоспермном поколении (А2), полученном от растений сахарной свеклы линии msKHBC2-10A. На анализ было взято
по 7 потомков растений № 6, 10, 12, 13 (см. таблицу). Для выделения ДНК использовали листовую ткань растений возрастом месяц. ПЦР-анализ показал, что потомки всех растений имеют одинаковый плазмотип, в котором преобладает содержание последовательностей S-типа гена atp6, но также сохраняются в значительном
количестве и последовательности N-типа.
СОАН-3144-n-A2
(502)
msKWS1-3A
(680)
msKWS3-22A
(683)
msKWS1-5A
(681)
Плазмотип
Фенотип
1
2
3
5
6
7
8
10
11
2
3
5
10
12
13
1
2
3
4
5
11
12
14
15
16
S >> N
S >> N
S >> N
S >> N
S >> N
S >> N
S >> N
S >> N
S >> N
S >> N
S >> N
S >> N
S >> N
S >> N
S >> N
S>N
S>N
S>N
S>N
S>N
S>N
S>N
S>N
S>N
S>N
мс0
мс2
мс1
мс1
мс1
мс0
мс0
мс0
мс2
ф
мс0
ф
мс1
ф
мс2
мс1
мс1
ф
ф
мс1
мс2
ф
ф
ф
мс0
Линия
msKHBC2-40A
(695)
msKHBC2-10A
(690)
msKHBC2-3A
(685)
msKHBC2-22A
(691)
msKHBC2-8A
(689)
№ растения
Линия
№ растения
Таблица
Анализ плазмотипа и фенотипа при агамоспермном размножении
сахарной свеклы Beta vulgaris L.
Плазмотип
Фенотип
2
4
9
11
12
13
17
18
S >> N
S >> N
S >> N
S >> N
S>N
S >> N
S>N
S>N
мс2
ф
мс2
ф
мс2
мс0
ф
ф
3
5
6
10
12
13
2
6
9
11
13
1
2
10/б
10
13
3
6
7
12
S=N
S=N
S=N
S=N
S=N
S<N
S>N
S >> N
S>N
S>N
S >> N
S=N
S=N
S=N
S>N
S=N
S>N
S>N
S>N
S>N
мс2
ф
ф
мс0
ф
мс1
мс0
ф
ф
мс1
мс0
мс2
мс1
ф
ф
мс0
мс2
мс0
мс0
ф
S >> N – значительное преобладание митохондрий S-типа;
S > N – незначительное преобладание митохондрий S-типа;
S = N – митохондрии S- и N- типов представлены в равном отношении;
S < N – незначительное преобладание митохондрий N-типа.
Из результатов нашего анализа мы можем сделать несколько выводов:
1. Фенотипическое проявление признака стерильности-фертильности пыльцы (система ЦМС) зависит, с одной стороны, от гетероплазматического состояния цитоплазмы, а с другой – от эпигенетической (новообразованной в онтогенезе) изменчивости генов закрепителей стерильности – восстановителей фертильности.
2. Относительное содержание нуклеотидных последовательностей S- и N-типа в
ткани листа иногда может быть противоположным фенотипическому проявлению
признака.
3. После прохождения через «бутылочное горлышко» агамоспермного размножения относительное содержание последовательностей S- и N-типа может смениться на противоположное (как в случае потомства растения № 13, линия
msKHBC2-10A).
Таким образом мы предполагаем, что основное влияние на фенотипическое
проявление признака, скорее всего, оказывает ядерная компонента системы ЦМС.
Список литературы
1. Хворостов И.Б., Вепрев С.Г., Малецкий С.И., Дымшиц Г.М. ПЦР-анализ конверсии N-типа цитоплазмы в S-тип у сахарной св-клы (Beta vulgaris L.) // Докл. АН.
1997. T. 357, № 4. C. 572–574.
2. Dikalova A.E., Dudareva N.A., Kubalakova M., Salganik R.I. Rearrangements in the
sugar beet mitochondrial DNA induced by cell suspension, callus cultures and
regeneration // Theor. Appl. Genet. 1993. V. 86. P. 699–704.