66 предобработка незрелых зародышей гибридов

VI международная конференция молодых ученых и специалистов, ВНИИМК, 20 11 г.
ПРЕДОБРАБОТКА НЕЗРЕЛЫХ ЗАРОДЫШЕЙ ГИБРИДОВ РАПСА
ЯРОВОГО И ГОРЧИЦЫ БЕЛОЙ НА ЭТАПЕ ВВЕДЕНИЯ В КУЛЬТУРУ IN VITRO
Горягина Е.Б.
398020, Липецк, ул. Ленина, 42
ГОУ ВПО «Липецкий государственный педагогический университет»
rector@pedinst.lipetsk.su
Проводили предобработку незрелых зародышей гибридов рапса ярового
(Brassica napus L.) и горчицы белой (Sinapis alba L.) различными растворами в течение суток. Наилучшие результаты были получены при замачивании гибридных семян
в электрохимически активированной воде (католит и анолит в соотношении 1:1 и с
силой тока, равной 3) и в растворе гетероауксина с концентрацией 0,00001 %.
Отдаленная гибридизация в семействе Brassicaceae дает возможность получать формы, устойчивые к вредителям и болезням, с повышенной урожайностью,
измененным соотношением жирных кислот в масле и другими ценными характеристиками. Однако в результате отдаленной гибридизации в большинстве случаев
получается недостаточное количество гибридных семян, а те, что удается получить, отличаются недоразвитостью зародыша или эндосперма.
Изолированные зародыши в условиях нарушенных коррелятивных связей
требуют присутствия экзогенных регуляторов роста для образования новых
структур. В связи с этим для преодоления постгамной несовместимости, вследствие которой наблюдается недоразвитость гибридных семян, в селекции ярового
рапса перспективно применение эмбриокультуры, или культуры незрелых зародышей in vitro.
При ограниченном числе семян особенно важно получение большого числа регенерантов, поэтому незрелые зародыши нуждаются в дополнительной стимуляции развития. Для повышения регенерации в культуре in vitro используется
предобработка эксплантов низкими положительными температурами или регуляторами роста.
Важнейшими гормонами, применяемыми перед введением в культуру
in vitro, являются ауксины, которые активируют деление и растяжение клеток.
Природные ауксины (ИУК - индолилуксусная кислота) вырабатываются и накапливаются в высоких концентрациях в верхушечных меристемах (конусах нарастания побега и корня). Известно, что ИУК увеличивает энергетическую эффективность дыхания растений. Положительные сдвиги в энергетическом обмене вызывают усиление передвижения питательных веществ и воды, что является одной
из причин усиления роста растений [1]. Общим моментом в действии ауксинов на
деление клеток является предварительное усиление синтеза и накопление РНК.
Под их влиянием также уменьшается продолжительность различных периодов
митотического цикла [2].
Другим приемом, регулирующим активность различных этапов роста и
развития растений без значительных изменений морфологических признаков,
является использование электрохимически активированной воды. Положительной
стороной ее применения является то, что электрохимически активированная вода
является экологически чистым, дешевым и доступным стимулятором роста [3].
Вода, активированная на катоде (католит), обладает свойствами стимулировать многие биологические процессы жизнедеятельности живых организмов и
растений. Вода, активированная на аноде (анолит), наоборот, обладает свойством
ингибировать биологические процессы и убивать микроорганизмы. В растениеводстве предпосевная обработка католитом выводит из состояния глубокого покоя те
66
VI международная конференция молодых ученых и специалистов, ВНИИМК, 20 11 г.
семена, срок хранения которых истек или период прорастания не соответствует
вегетационному периоду данного вида. Католит применяют в основном как стимулятор роста и развития растений, а анолит – как антисептик и консервант.
В связи с этим целью работы являлось определение влияния предобработки гибридных семян рапса ярового на регенерацию в культуре незрелых зародышей in vitro.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
1. Выявить оптимальную концентрацию гетероауксина и соотношение католита и анолита для предобработки гибридных семян.
2. Изучить влияние предобработки гибридных семян от скрещивания ярового рапса и горчицы белой на регенерацию растений в эмбриокультуре.
Материал и методы. Исследования проводились в лаборатории физиологии растений ГОУ ВПО ЛГПУ и в селекционно-семеноводческом севообороте отдела селекции рапса ГНУ ВНИИ рапса в 2009-2010 гг.
С целью получения отдаленных гибридов в полевых условиях отдела селекции ГНУ ВНИИ рапса были проведены реципрокные межвидовые скрещивания
образцов рапса ярового (Brassica napus L.) коллекции лаборатории генетики и
иммунитета растений (№ 47, 54, 55), имеющих желтую окраску семенной оболочки, с горчицей белой (Sinapis alba L.) сортов Рапсодия и Litember).
Объектами исследования служили гибридные семена, изолированные из
стручков на 13-14 день после опыления и незрелые зародыши, выделенные из
них для введения в культуру in vitro.
Предобработку гибридных семян (яровой рапс × горчица белая) проводили замачиванием гибридных семян в течение суток электрохимически активированной водой и растворами гетероауксина различной концентрации (всего 13 вариантов опыта).
Приготовление анолита и католита производилось на установке СТЭЛ-4Н60-02 путем электрохимической обработки раствора хлорида натрия в питьевой
воде во ВНИИ сахарной свеклы и сахара (пос. Рамонь, Воронежская обл.). Для
получения разного уровня рН и окислительно-восстановительного потенциала
раствора использовали регулировку силы тока на источнике питания.
Для культивирования незрелых зародышей in vitro применялась безгормональная агаризованная питательная среда Мурасиге-Скуга (MS) [4]. На 7 день
измерялись длина корня и проростков.
Наблюдения за морфологическим и физиологическим состоянием незрелых зародышей и полученных новообразований проводили через каждые два дня
в течение всего периода культивирования. Все опыты проводили в трехкратной
повторности. При обработке экспериментальных данных использовали однофакторный дисперсионный анализ [5].
Результаты и обсуждение. Максимальное число регенерантов и достоверное отличие по сравнению с контролем отмечались в вариантах опыта № 7 с
одинаковыми объемами католита и анолита и с силой тока (J) равной 3 и № 13 с
наименьшей концентрацией гетероауксина (83 % и 85 % соответственно). При
этом длина их корешков и проростков также была наибольшей и составляла
2,1 см и 1,2 см в варианте № 7 и 2,8 и 3,2 см в варианте № 13 (табл. 1).
Длина проростков и корней, полученных из незрелых зародышей, обработанных чистым католитом с рН=5 и силой тока (J), равной 3 (вариант № 4), также превышала контроль на 5%-ном уровне значимости и составляла соответственно 1,1 и 1,8 см. Данные показатели в вариантах № 9 и № 12 аналогично
превышали контрольные (рис.). Однако частота регенерации в варианте № 4 (81
%) находилась на одном уровне с контролем (80 %), а в вариантах № 9 (75 %) и
№ 12 (70 %) значительно уступала ему.
67
VI международная конференция молодых ученых и специалистов, ВНИИМК, 20 11 г.
Таблица 1 – Воздействие гетероауксина и электрохимически активированной
воды на регенерацию незрелых зародышей гибридов
рапса ярового и горчицы белой
№
1
2
4
5
3
6
7
8
9
10
11
12
13
Растворы
веществ
Вода
(контроль)
Католит (К)
Анолит (А)
К:А=50:50
К:А=70:30
Гетероауксин
НСР05
Вариант
Получено
регенерантов, %
Длина
проростков, см
Длина
корня, см
-
80
0,9
1,2
рН=9, J*=7
рН=5, J=3
рН=5, J=3
рН=6, J=7
J=7
J=3
J=7
J=3
0,01 %
0,001 %
0,0001 %
0,00001 %
80
81
4
0
10
83
25
75
60
75
70
85
0,9
1,1
0
0
0,6
1,2
0,4
1,0
0,6
1,0
3,0
3,2
1,5
1,8
0,7
0
0,5
2,1
0,9
1,7
0,4
0,5
1,7
2,8
2,8
0,04
0,06
*J – сила тока
Анализ результатов опыта позволил установить, что предобработка незрелых зародышей раствором с высокой концентрацией гетероауксина (0,01 %)
уменьшает рост корней и проростков и задерживает их развитие (частота регенерации 60 %), а наиболее разбавленный раствор гетероауксина (0,00001 %)
стимулирует рост регенерантов в культуре in vitro (вариант опыта № 13).
Рисунок 1 – Прорастание незрелых зародышей гибридов рапса ярового
и горчицы белой, обработанных раствором гетероауксина с концентрацией 0,00001 %
(13 вариант опыта, фото автора)
68
VI международная конференция молодых ученых и специалистов, ВНИИМК, 20 11 г.
Результаты исследований свидетельствуют о том, что католит выступает в
роли регулятора роста при силе тока, равной 3, как в чистом виде, так и совместно с анолитом, ее повышение до 7 действовало отрицательно на регенерацию
зародышей.
Тот факт, что смесь анолита с католитом в равном соотношении и силой
тока, равной 3, оказала стимулирующее действие на регенерацию в условиях
культуры in vitro, согласуется с данными, полученными ранее другими исследователями [3, 6].
Зародыши, прошедшие предобработку чистым анолитом (рН=6, J=7), не
проросли в культуре in vitro, а при рН=5 и J=3 была получена минимальная частота регенерации (4 %). Следовательно, анолит, обладая хорошим дезинфицирующим эффектом, является токсичным для растительных тканей и угнетает
рост эксплантов.
Заключение. Таким образом, предобработку гибридных семян и незрелых
зародышей следует проводить замачиванием гибридных семян в течение суток в
электрохимически активированной воде (католит и анолит в равных соотношениях и с силой тока, равной 3) или в растворе гетероауксина с концентрацией
0,00001 %.
Предобработка семян гибридов рапса ярового и горчицы белой растворами, указанными выше, повышает регенерацию растений в эмбриокультуре, а
именно активизирует процесс физического набухания, обеспечивает интенсивное
поглощение воды зародышами, повышает энергию их прорастания и ускоряет
ростовые процессы. Подобные свойства позволяют преодолевать глубокий органический покой при старении семян, а также получить большее число растений
отдаленных гибридов, что имеет важное значение в селекционной работе по
яровому рапсу.
Литература
1. Якушкина Н.И. Физиология растений. – М.: Просвещение, 1993. – 351 с.
2. Полевой В.В. Физиология растений. - М: ВШ, 1989. – 464 с.
3. Васильченко Е.Н., Жужжалова Т.П. Преодоление старения семян активированной водой // Сахарная свекла. – 2004. – № 2. – С. 24–25.
4. Murashige T., Skoo F. A revised medium for rapid growth and bioassays
with tobacco tissue cultures // Plant Physiol. – 1962. – Vol. 15. – P. 473–497.
5. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической
обработки результатов исследований). – М.: Агропромиздат, 1985. – 351с.
6. Фоменко Н.Р. Эффективность влияния дезинфицирующих препаратов
на семена сахарной свеклы при введении в культуру in vitro // Достижения молодых ученых – будущее в развитии АПК: материалы межрегиональной научнопрактической конференции молодых ученых. – Воронеж: ФГОУ ВПО ВГАУ, 2007. –
Ч. 1. – С. 287–290.
PRETREATMENT OF IMMATURE EMBRYOS OF HYBRIDS OF SPRING RAPESEED AND WHITE MUSTARD DURING IN VITRO INRODUCTION
Goryagina E.B.
Pretreatment of immature embryos of hybrids of spring rapeseed ( Brassica napus L.) and white mustard (Sinapis alba L.) was carried out with various solutions with-
in a day. The best results were obtained by soaking the hybrid seeds in the electrochemically activated water (catholyte and anolyte in proportion 1:1 and with an amperage equal to 3) and in heteroauxin solution with a concentration 0.0000 1%.
69