53 иССЛедоВание генеТиЧеСКиХ ФаКТороВ У деТей С

53
▪ медицинские науки ▪
УДК 616.2-002.5- 053.2:612.6.05
ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ У ДЕТЕЙ
С ЛАТЕНТНОЙ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ
Н.В. Ст авицкая
ГОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет»,
г. Краснодар, stavitskaya@mail.ru
В статье приведены результаты исследования локуса DRB1 главного комплекса
гистосовместимости (HLA) и NRAMP1 у детей, проживающих на территории Краснодарского края. Установлено наличие положительных и отрицательных ассоциаций
некоторых аллелей HLA DRB1и генотипов NRAMP1с заболеваемостью туберкулезом,
что позволило рассматривать их как факторы устойчивости и предрасположенности
к туберкулезу.
Ключевые слова: латентная туберкулезная инфекция, дети, генетика.
RESEARCH OF GENETIC FACTORS IN CHILDREN WITH
LATENT TUBERCULOSIS INFECTION
N.V. Stavitskaya
Kuban State Medical University, Krasnodar, stavitskaya@mail.ru
The article provides the research results of locus DRB1 major histocompatibility (HLA)
and NRAMP1 of children living Krasnodar region.
The existence of positive and negative associations of alleles HLA DRB1 and genotypes
of NRAMP1 with the prevalence of tuberculosis is determined, with makes it possible
to consider they as factors of either stability or predisposition to tuberculosis.
Keywords: latent tuberculosis infection, children, genetic.
В XXI век человечество вступило с высо-
Ухудшение эпидемиологической ситуа-
кой заболеваемостью туберкулезом. Пред-
ции привело к увеличению числа инфи-
полагалось, что туберкулез останется од-
цированных туберкулезом лиц. Согласно
ним из самых тяжелых заболеваний в мире
официальным
до 2010 года [3]. Однако появление и бы-
за последнее 10-летие инфицированность
строе распространение в мире туберкулеза
туберкулезом детей в России увеличилась
с обширной лекарственной устойчивостью
в 2,5 раза и в настоящее время в 10 раз пре-
(XDR-TB) обусловило анонсирование но-
вышает аналогичный показатель в развитых
вой стратегии ВОЗ, рассчитанной на период
странах [1].
статистическим
данным,
до 2015 года, центральным положением ко-
Персистирование жизнеспособных M. tu-
торой объявлено продолжение интенсивных
berculosis на протяжении всей жизни в зара-
исследований в области туберкулеза [9].
женном организме определяет особенность
фундаментальные исследования №5, 2010
54
▪ медицинские науки ▪
инфекционного процесса — как малую
болезнь, с длительным скрытым течением
и постоянной угрозой развития заболевания
при снижении сопротивляемости инфекции [8].
В ходе работы сформированы следующие клинические группы:
Дети славянской национальности, больные различными формами туберкулеза ор-
Обобщенное представление об этапности
в патогенезе туберкулеза [4] возродило интерес среди исследователей к проблеме латентной (скрытой) туберкулезной инфекции
(LBTI) в отличие от манифестной (явной).
Изучение методов диагностики LBTI
по Национальным руководствам 50-ти стран
показало, что кожный туберкулиновый тест
применяется с этой целью, однако определить угрозу прогрессирования инфекции
по нему не представляется возможным [6].
Чувствительность кожного теста снижена
у людей с иммунодефицитом, специфичность его ограничена перекрестными антигенами MBT и BCG, интерпретация затруднена в условиях массовой вакцинации
BCG [5]. Такое же отношение высказали
многие авторы и к недавно разработанному
методу диагностики LBTI ex vivo — IGRA,
который измеряет продукцию IFNγ в ответ
на специфические
Материалы и методы
антигены
микобакте-
рий туберкулеза [2]. Они пришли к выводу о том, что туберкулиновый кожный тест
и IGRA «не различают» активную и латентную инфекцию. К тому же туберкулиновые
пробы и результаты IGRA плохо коррелируют из-за позитивного результата кожного
теста у лиц, вакцинированных BCG [7].
Цель исследования
ганов дыхания — 129 человек.
Дети с латентной туберкулезной инфекцией (LTBI), здоровые инфицированные —
118 человек славянской национальности.
С целью формирования группы контроля для молекулярно-генетических исследований проведена случайная выборка
из новорожденных популяции славянской
национальности. Отобрано 109 здоровых
новорожденных детей с отсутствием у родителей рентгенологических признаков локального туберкулеза органов дыхания.
Контролем для сравнительного исследования цитокинового профиля служили
результаты исследования у 30 здоровых неинфицированных детей из регионального
банка данных кафедры аллергологии и иммунологии КГМУ.
У всех детей проводили общепринятый
комплекс
клинико-лабораторного
обсле-
дования с применением обязательных, дополнительных и факультативных методов
исследования. В каждом случае обращали
внимание на семейный анамнез и возможный контакт с больными туберкулезом.
Генотипирование локуса DRB1HLA и локуса INT4 NRAMP1 проводили по методике
C. Søborg et al. (2002).
Разработать способ определения риска
Концентрацию IL-4, IL-10, IL-18 и IFN-γ
прогрессирования латентной туберкулезной
определяли в сыворотке крови иммунофер-
инфекции у детей с учетом генетической
ментным методом с использованием на-
устойчивости/предрасположенности к забо-
боров CYTELISATM («Cytimmune», США).
леванию.
Оценку результатов проводили на имму-
фундаментальные исследования №5, 2010
55
▪ медицинские науки ▪
ноферментном анализаторе ANTHOS 2010
ми туберкулеза, в 2,2-1,6 раза соответствен-
(фирма «Becton Dickinson», США).
но (р<0,05) (рис.1).
Частота встречаемости аллелей *03 и *11
Статистическую обработку полученных
результатов проводили методом вариаци-
среди
онной статистики на основе анализа абсо-
из популяции
лютных и относительных величин. Наличие
повышена: *03 в 3,9, *11 — в 5 раз, а среди
взаимосвязи между группами и ее досто-
здоровых, инфицированных МБТ — в 3,1
верность оценивали с помощью статистики
и в 3,9 раза соответственно (р<0,05). Аллель
хи-квадрат, включающей поправку на не-
*12 встретилась только у здоровых и совсем
прерывность Иэйтса [http://www.biometrica.
отсутствовала у больных детей. В то же вре-
tomsk.ru]. Различия или показатели считали
мя в группе больных туберкулезом органов
значимыми при уровне р<0,05. Обработку
дыхания и у здоровых, как новорожден-
полученного материала проводили с ис-
ных, так и инфицированных МБТ детей,
пользованием программ Microsoft Excel
установлена одинаковая (48,2 и 47,9% со-
и STATISTICA.
ответственно против 55,4%) частота встре-
Результаты исследования и их обсуж-
здоровых
новорожденных
по сравнению
детей
с больными
чаемости аллельных специфичностей гена
HLA локуса DRB1 *01, *07, *08, *10, *13, *14,
дение
*15 (р>0,05).
Исследование ассоциации антигенов системы HLA локуса DRB1у детей, больных
Полученные результаты исследования
локальными формами туберкулеза органов
позволили нам рассматривать аллельные
дыхания, показало, что для них характерно
специфичности в генотипе HLA DRB1 *03,
увеличение частоты встречаемости аллель-
*11, *12 как генетические факторы устойчи-
ных специфичностей *04 и *16 по сравне-
вости, а *04 и *16 — как генетические фак-
нию со здоровыми новорожденными детьми
торы предрасположенности к заболеванию
из популяции в 4,4 и 3,5 раза и здоровыми
туберкулезом. Обнаруженные в значитель-
детьми, инфицированными микобактерия-
ном количестве аллельные специфичности
25
Б о л ь ны е
З д о р о в ы е но в о р о жд енны е д ет и из по пул я ц ии
Инф иц ир о в анны е
%
20
15
10
5
0
1
3
4
7
8
10
11
12
13
14
15
16
Н о м ер ал л ел и
Рис. 1. Частота встречаемости аллелей гена HLA локуса DRB1 у больных туберкулезом, здоровых новорожденных из популяции и инфицированных МБТ детей
фундаментальные исследования №5, 2010
56
▪ медицинские науки ▪
HLA DRB1, одинаково часто встречающие-
и 4,3 раза (61,5±4,6 и 53,4±4,5 соответствен-
ся у больных и здоровых детей, мы назвали
но против 12,5±2,5%, р<0,05) превышает
нейтральными и отнесли к этой группе ал-
таковую у больных. Одновременно генотип,
лели *01, *07, *08, *10,*13, *14, *15.
состоящий из двух разных специфичностей,
Следует отметить полное отсутствие
включающий аллель с маркерным признаком
у жителей Краснодарского края специфич-
предрасположенности, встречается в 4 и 3
ностей HLA DRB1 *02, *05, *06, *09.
раза чаще у больных по сравнению со здо-
Сравнительный анализ вариантов геноти-
ровыми новорожденными детьми из по-
па, то есть сочетания двух аллелей системы
пуляции и здоровыми, инфицированными
HLA DRB1 локуса, на устойчивость/ пред-
МБТ (55,8±4,3 против 18,3±3,7 и 18,6±3,5%,
расположенность у детей, заболевших ло-
р<0,05). В то же время у здоровых детей
кальным туберкулезом, в сравнении со здо-
по сравнению с больными, сочетания спец-
ровыми
из популяции
ифичностей с маркерным признаком устой-
и здоровыми, инфицированными МБТ по-
чивости и с признаком нейтральности обна-
казал, что для больных больше характе-
ружены чаще в 7,8 и 6 раза соответственно
рен наследственный фактор парности двух
(36,7 и 30,5 против 4,7%, р<0,05), что может
аллелей DRB1 *04/*04, *04/*16, *16/*16
свидетельствовать о разграничении «зна-
с маркерным признаком предрасположен-
чимого» и «незначимого» антигена HLA,
ности к заболеванию (17,8%), тогда как у
определяющего устойчивость/предрасполо-
здоровых новорожденных детей из популя-
женность к заболеванию.
новорожденными
ции подобные наследственные компоненты
Вместе с тем существенной разницы
вообще не обнаружены, а у здоровых инфи-
между изучаемыми показателями в кон-
цированных МБТ, составили 9,3% (р<0,05).
трольной группе новорожденных из популя-
Кроме того, среди больных детей соче-
ции и в группе здоровых, инфицированных
тание специфичностей с признаками, ас-
МБТ детей не установлено, кроме полного
социированными с высокой вероятностью
отсутствия генотипа HLA DRB1 с наличием
развития туберкулеза — DRB1 *04 и*16,
обеих аллелей предрасположенности к за-
с аллелями, имеющими другие признаки
болеванию у новорожденных.
(устойчивости, нейтральности), обнаруже-
Генетическое сочетание аллелей, наде-
но в 2 раза чаще по сравнению с группой
ленных маркерными признаками нейтраль-
здоровых новорожденных и здоровых, ин-
ности — DRB1 *01, *07, *08, *10, *13,*14,
фицированных МБТ детей (38,0±4,2 про-
*15, обнаруживалось у больных так же ча-
тив 18,3±3,7 и 18,6±3,5 соответственно,
сто, как и у здоровых новорожденных детей
р<0,05).
из популяции и здоровых, инфицированных
Наличие в генотипе здоровых новорож-
МБТ (36,4 против 26,6 и 28,0%, р>0,05).
денных из популяции и здоровых, инфици-
Анализ вариантов генотипа DRB1 с соче-
рованных МБТ детей, сочетания антигенов
танием антигенов устойчивости и предрас-
HLA, которые обусловливают устойчивость
положенности показал, что количественный
к туберкулезу — DRB1 *03, *11, *12 в 5,5
показатель сочетания этих наследственных
фундаментальные исследования №5, 2010
57
▪ медицинские науки ▪
компонент только у здоровых новорожден-
стей NRAMP1 INT4 у наблюдаемых детей
ных детей из популяции существенно пре-
(табл. 1).
Из представленного видно, что аллель
восходит таковой у больных (11,9 против
G в локусе INT4 гена NRAMP1 обнаруже-
4,7%, р<0,05).
Таким образом, результаты исследования
на в 68,3% случаев. Аллель C вообще бо-
позволяют прийти к выводу о влиянии на-
лее редко встречается — на нее приходится
следственной компоненты HLA DRB1 локу-
31,7%, что в 2,2 раза меньше по сравнению
са на прогрессирование возникшей туберку-
с аллелью G. В то же время у здоровых
лезной инфекции.
детей показатель частоты встречаемо-
В ходе изучения ассоциации полимор-
сти аллели C существенно выше (38,1%)
физмов генов-кандидатов проведено иссле-
по сравнению
дование одной из самых распространен-
она встретилась в 20,5% (р<0,05). Несмо-
ных мутаций гена NRAMP1 — в интроне
тря на то, что аллель G отличается более
4 (INT4).
частой встречаемостью у всех детей, все же
Прежде всего мы установили частоту
встречаемости
аллельных
специфично-
с больными,
у которых
разница между здоровыми и больными
детьми
прослеживается.
В частности,
Таблица 1
Частота встречаемости аллельных специфичностей NRAMP1 локуса INT4
у здоровых и больных туберкулезом детей (%, М±m), n=356
Частота встречаемости аллельных специфичностей
Аллели
NRAMP1
C
G
Итого
у здоровых
у здоровых
новорожденных детей инфицированных
из популяции
МБТ детей
у больных туберкулезом
детей
всего
абс.
%±m
абс.
%±m
абс.
%±m
абс.
%±m
83
135
218
38,1±2,3**
61,9±2,3
100
90
146
236
38,1±3,1**
61,9±3,1
100
53
205
258
20,5±2,5
79,5±2,8*
100
226
486
712
31,7±
68,3±
100
* достоверность по отношению к здоровым, p<0,05;
** достоверность по отношению к больным, p<0,05
у больных детей она встретилась в 79,5%
против 41,1%, p<0,05) чаще по сравнению
случаев, у здоровых — в 61,9%.
с больными. В то же время гомозиготный
Исследование наиболее часто встречаемых
генотип С/С у детей с локальным туберкуле-
генотипов NRAMP1 — в интроне 4 (INT4) —
зом не был обнаружен вовсе, а в группе здо-
C/C, C/G и G/G показало, что среди здоровых
ровых он встретился в 10,2% и 11,0% слу-
детей, как новорожденных из популяции,
чаев соответственно (рис. 2). Гомозиготный
так и инфицированных МБТ, встречается
генотип G/G более часто (на 25,0 и 24,1% со-
генотип C/G на 14,8% — 13,1% (55,9 и 54,2
ответственно) обнаружен у больных детей,
фундаментальные исследования №5, 2010
58
▪ медицинские науки ▪
по сравнению со здоровыми при этом разли-
вании наследственной компоненты устойчи-
чие достоверно (р<0,05).
вости/ предрасположенности к туберкулезу
С целью получения дополнительных све-
мы провели сопоставительный анализ ча-
дений о роли генов-кандидатов в формиро-
стоты встречаемости аллельных специфич-
Рис. 2. Частота встречаемости генотипов локуса INT 4 гена NRAMP 1 у больных туберкулезом и здоровых детей
ностей NRAMP1 среди детей, у которых
в 31,1% — вариант G/G и в 15,0% — вари-
в HLA системе превалирующими являются
ант C/C. Из всех случаев встречаемости ал-
те или иные антигены. Так, в 53,9% случа-
лелей предрасположенности в 57,6% обна-
ев встречаемости HLA аллелей устойчиво-
ружен вариант G/G, в 42,4% — вариант C/G
сти регистрируется вариант C/G NRAMP1,
(табл. 2).
Таблица 2
Соотношение аллельных специфичностей HLA локуса DR B1 и генотипов NRAMP 1
INT4 n=356 (%, М±m)
Генотипы
устойчивости
NRAMP1 INT4
абс.
%±m
C/G
104
53,9±3,5
n=178
G/G
60
31,1±3,3
n=154
C/C
29
15,0±2,5
n=24
Итого
193
100
Аллельные специфичности системы HLA DRB1
предрасположенности нейтральности
Всего
абс.
%±m
абс.
%±m
абс.
%±m
67
42,4±3,9
185
51,2±2,6
356
50,0±1,8
91
57,6±3,9
157
43,5±2,6
308
43,3±1,8
-
-
19
5,3±1,1
48
6,7±0,9
158
100
361
100
712
фундаментальные исследования №5, 2010
59
▪ медицинские науки ▪
Очевидно, что генотип G/G в локусе INT4,
существенно чаще сочетающийся с аллеля-
риска прогрессирования туберкулезной инфекции.
ми HLA DRB1, предрасполагающими к за-
Список литературы
болеванию, может быть одним из главных
1. Аксенова В.А. Внелегочные формы
претендентов на прогностический индика-
туберкулеза у детей в России // Репро-
тор прогрессирования возникшей туберку-
дуктивное здоровье детей и подростков:
лезной инфекции. В противоположность
научно-практический журнал. — 2007. —
этому генотипы C/C и C/G, обнаруживаемые
N 3. — С. 21–25.
в 68,9±3,3% случаев в сочетании с аллеля-
2. Bakir M., Millington K.A., Soyal A. et al.
ми устойчивости, по-видимому, обладают
Prognostic value of a T-cell-based, interferon-γ
возможностью стабилизировать возникшую
biomarker in children with tuberculosis contact. //
туберкулезную инфекцию путем ограниче-
Ann. Intern. Med. — 2008; 149: 777–787.
3. Dye C. Tuberculosis 2000-2010: con-
ния репликации микобактерий.
Выводы
Исследование
trol, but not elimination. // Int. J. Tuberc. Lung
генетических
факторов
главного комплекса гистосовместимости
Dis. — 2000; 4 (Suppl.). — P. 146–52.
4. Dannenberg A.M., Jr. Immune mecha-
связанно-
nisms in the pathogenesis of pulmonary tu-
го с резистентностью белка макрофагов
berculosis // Rev. Infect. Dis. — 1989. —
(NRAMP1), позволяет определить, насколь-
11(Suppl. 2). — P. 369–378.
(HLA)
и гена
естественного,
ко реальна угроза прогрессирования тубер-
5. Lalvani A., Millington K.A. T-cell based
кулезной инфекции у детей после ее воз-
diagnosis of childhood tuberculosis infection.//
никновения.
Curr. Opin. Infect. Dis. — 2007; 20:264–271.
Генетическая предрасположенность к ту-
6. Mack U., Migliori G.B., Sester M. et al.
беркулезу у детей славянской национально-
LTBI: latent tuberculosis infection or lasting
сти Краснодарского края связана с аллелями
immune reponses to M. tuberculosis? A TB-
*04 и *16, генетическая устойчивость —
NET consensus statement // Eur. Respir. J. —
с аллелями *03, *11, *12 системы HLA ло-
2009; 33: 956–973.
куса DR B1.
7. Pai M., Menzies D. Interferon-γ release
Исследование гена-кандидата NRAMP1
assays: what is their role in the diagnosis of ac-
показало, что генотип С/С локуса INT4 яв-
tive tuberculosis? // Clin. Infect. Dis. — 2007;
ляется наследственной компонентой, опре-
44: 74–77.
деляющей устойчивость к туберкулезной
8. Rook G.A., Zumla A. Advances in the im-
инфекции. Сочетание генотипа G/G локу-
munopathogenesis of pulmonary tuberculosis //
са INT4 гена NRAMP1 со специфичностя-
Curr Opin Pulm Med. — 2001; 7: 116–123.
ми гена HLA, которым присущи признаки
9. World Health Organization. Guidelines
предрасположенности к заболеванию — *04
for management
of drug-resistant
Tubercu-
и *16 и нейтральности — *01, *07, *08, *10,
losis. WHO/HTM/TB/2006.361. — Geneva,
*13, *14, *15, определяет высокий уровень
World Health Organization, 2006.
фундаментальные исследования №5, 2010