докладе - ФГБНУ "НИИСХ Юго

Сибикеев С.Н.
Увеличение генетического разнообразия Саратовских пшениц.
В настоящее время к селекции каждой сельскохозяйственной культуре сложилась
система требований и научных методов достижения их решения. Огромный вклад в
разработку первых научных основ селекции, как науки, внёс Н.И. Вавилов, которые в
1935 г. он отразил в одноименной статье «Селекция как наука». Он определил
селекцию,
как
науку,
как
искусство
и
как
определенную
отрасль
сельскохозяйственного производства. Н.И. Вавилов отмечал, что селекция, как
научная дисциплина, характеризуется высокой степенью комплексности.
По его
словам, она опирается «в управлении наследственностью на данные генетики,
цитологии, эмбриологии. ….помимо генетики, она опирается на биологию цветения,
на физиологию, химию, технологию, фитопатологию, энтомологию».
В этой же
работе Н.И.Вавилов определил основные разделы селекции как науки. Как видно
Вавилов ставил на первое место учение об исходном сортовом, видовом и родовом
потенциале, более того (Сайд 2) он считал «исходный материал краеугольным
камнем». Далеко не последнее место Н.И.Вавилов отводил «теории гибридизации, как
в пределах близких форм, так и отдалённых видов». Другими словами расширению
генофонда селектируемой культуры или увеличению её генетического разнообразия.
В первой половине 20 века Поволжье было крупнейшим регионом страны
по
производству яровой мягкой и твердой пшеницы (посевы озимой пшеницы
не
достигали и 1 процента). Поэтому, сразу же после открытия Саратовской опытной
станции, главное внимание было обращено на яровую пшеницу, на создание сортов,
сочетающих устойчивость к засухе, высокое качество зерна и высокую урожайность.
Первым вопросом встал вопрос об исходном материале (Сайд 3). На слайде 3
приведены
основные
направления
увеличения
генетического
разнообразия
Саратовских пшениц за 100 лет деятельности НИИСХ Юго-Востока). Естественно, что
сначала обратились к местным сортам-популяциям. Результаты индивидуальных
отборов из народных сортов широко известны: из местной Полтавки – Лютесценс 62,
Альбидум 604, Альбидум 721, из Селивановского Русака – Эритроспермум 341, из
местного сорта твёрдой пшеницы Белотурка – Гордеиформе 432. Однако с первых
дней стало очевидным, что селекция здесь затрудняется, прежде всего, из-за
недостатка или отсутствия генов (признаков) устойчивости к засухе, жаре,
вредителям, болезням. Это особенно четко стало осознаваться после того, как
выяснилось, что ресурсы местных сортов весьма ограничены и уже впервые годы
селекции Г.К. Мейстер и его ученик А. П. Шехурдин не ограничились только отбором
из местных крестьянских сортов и внутривидовыми скрещиваниями, а приступили к
межвидовой
и
даже
межродовой
гибридизации.
На
перспективность
этого
направления указывал Н.И. Вавилов (Слайд 4). Первым выдающимся, приоритетным
результатом межвидовой гибридизации между мягкой (гексаплоидной) и твердой
(тетраплоидной) пшеницей было создание высококачественного белозерного сорта
яровой мягкой пшеницы Саррубра,
По инициативе и при поддержке Г. К. Мейстера на станции Н.В.Цицин, С. М.
Верушкин (1936) и их коллеги осуществили гибридизацию пшеницы с рядом видов
пырея и других сородичей. Н.В. Цицин и его сотрудники от гибридизации Triticum
aestivum L. с Agropyron intermedium Host. и Agropyron elongatum Host. вывели ряд
сортов (Цицин Н.В., 1954; Горюнов, 1958; Крыжановский, 1958; Артемова, Яковлева,
1970). Эта группа сортов включала в себя 42-хромосомные формы, а также новые
промежуточно-пырейные гибриды (2n = 56). Следует отметить, что большинство из
этих сортов представляли ценность больше как зерно-фуражные сорта, чем как
продовольственные из-за ряда причин: низкая цитологическая стабильность,
невысокая урожайность, плохое качество хлеба. Несмотря на районирование
некоторых из них, широко в практику они не пошли.
К сожалению, С. М. Верушкина (1936), который не менее продуктивно работал по
гибридизации пшеницы с пыреем, в 1938 г. расстреляли как врага народа, а созданный
им селекционный материал загубили. Еще ранее (в 1937 г.) был репрессирован Г.К
Мейстер.
Отдельно хотелось бы отметить приоритетные скрещивания А.П.
Шехурдина сортов мягкой пшеницы Лютесценс 62 и Прелюд с житняком Agropyron
desertorum. Подлинность его гибридов была подтверждена цитологически цитологом
Фаворским Н.В. Необходимо отметить, что Н.И.Вавилов отмечал на ряд трудностей,
которые ограничивают применение отдалённой гибридизации в практической
селекции. В основном это бесплодие гибридов первого поколения, ненормальная
конъюгация
хромосом
разных
видов,
дисгармония
отдалённых
гибридов
и
сцепленность с нежелательными признаками, низкая продуктивностью. Тем не менее,
Н.И.Вавилов отметил большие достижения в этой области Саратовской станции.
После репрессий в 1937-1938 гг. и августовской сессии 1948 г. генетические
исследования на станции были полностью прекращены, возобновить их удалось лишь
в середине 60-х годов. К этому времени стало ясно, что традиционные приемы
межвидовой и межродовой гибридизации в большинстве случаев не дали должного
результата. Однако исследования зарубежных и ряда отечественных исследователей за
этот период позволили решить проблемы классификации хромосом кариотипа
пшеницы, выделения трёх геномов (Слайд 5), что в целом способствовало развитию
селекции непросто в направлении отдалённой гибридизации, а направленной
интрогрессии чужеродной генетической изменчивости. Особое внимание стали
обращать на перенос в пшеницу единичных генов, прежде всего устойчивости к
возбудителям заболеваний и вредителям. На основе родства хромосом у мягкой
пшеницы было выделено три группы фонда генов, в разной степени доступных для
использования в гибридизации и соответственно этому были предложены методы
переноса генетической изменчивости. В 1973 г. в НИИСХ Юго-Востока была
организована лаборатория генетики и цитологии в задачи, которой в ряду прочих,
входит расширение генетической изменчивости у яровой мягкой пшеницы за счёт
интрогресии генов и плазмогенов от других видов рода Triticum, а также от различных
родичей (виды пырея, эгилопс и другие), а также
цитогенетическое изучение
межвидовых и межродовых гибридов и линий с чужеродными транслокациями,
пребридинговые исследования и оптимизация селекционного процесса. В качестве
доноров в первую очередь использовали следующие виды рода Triticum L.: T.durum
Desf., T.dicoccum (Schrank) Shuebl., из рода Aegilops L.– Ae. speltoides Tausch, из рода
Secale L.– S.cereale L., из рода Agropyron Gaerth.– A. intermedium Host., A. elongatum
Host и др.
При интрогрессии чужеродного генетического материала для практических целей
селекции мягкой пшеницы необходимыми являются следующие этапы (Слайд 6): 1)
цитогенетическое изучение комплексом доступных методов; 2) изучение передачи
интрогрессивного материала через пыльцу и яйцеклетки в связи с наследованием
чужеродного генетического материала; 3) идентификация интрогрессивных генов как
гибридологическим, так и ДНК-маркерным методом, а в случае с генами устойчивости
и набором изолятов патогена; 4) пребридинговые изучение влияние интрогрессивного
материала на агрономические признаки.
Целью цитогенетического изучения является выявление состояния чужеродной
генетической изменчивости, его количества и включение в реконструированный геном
мягкой пшеницы, а именно, в виде целых геномов, дополненных или замещенных
хромосом, транслокаций. В дальнейшем это будет определять наследование нужного
признака. Цитогенетическое изучение в настоящее время включает набор методов
позволяющих выявить состояние интрогрессивного материала. Это анализ родства
хромосом в мейозе у гибридов F1 между изучаемым материалом и сортами или
линиями, не имеющими чужеродного хроматина. Метод позволяет выявлять
чужеродные
геномы,
дополненные
и
замещенные
хромосомы,
и
крупные
транслокации. Преимущества - простота и доступность, недостатки не возможность
идентифицировать хромосомы и небольшие транслокации. (сл 7 и
сл 8). Так, в
лаборатории генетики НИИСХ Юго-Востока при изучении пшенично-пырейных
линий Агро139 и Агро 58 и Пысар 29 этот метод не показал никаких нарушений в
мейозе. Тем не менее, эти линии несут транслокации первые две от пырея
промежуточного, а третья
широко известную
Lr19-транслокацию от пырея
удлиненного. Следующий метод-дифференциальное окрашивание хромосом по Гимза,
in situ –гибридизация в различных вариантах с радиоактивными метками, биотин
меченная,
FISH,
GISH.
Преимущества
–
позволяет
не
только
выявлять
интрогрессивный материал, но и идентифицировать его. У приведенных методик
разная разрешающая способность, основанная на различиях в окрашивании или
маркировании разных участках хромосом.
Так, окрашивание по Гимза позволяет
выявлять гетерохроматиновые участки хромосом, остальные же методы основаны на
специфическом маркировании либо всего генома мягкой пшеницы, либо отдельных
его участков. Тем не менее, метод окрашивания по Гимза наиболее доступный и
менее дорогостоящий, хотя он также требует специальной подготовки. Недостатками
метода
является
не
возможность
идентификации
небольших
транслокаций
локализованных в эухроматиновых участках хромосом. Так, уже вышеназванные
пшенично-пырейные линии Аго58, Агро139, Пысар 29 по кариотипу после
окрашивания по Гимза не отличались от мягкой пшеницы. Однако, этот метод
позволил при изучении интрогрессивного материала отдела генетики НИИСХ ЮгоВостока выявить ряд замещенных пшенично-пырейных, пшенично-эгилопсных и
пшенично- ржаных линий, а также набор транслокаций (Слайды 9, 10, 11, 12).
Определив цитологическое состояние интрогрессивного материала, необходимо
изучить его передачу через половые гаметы. Этот этап необходим для определения
нарушений или их отсутствий в функционировании пыльцы и яйцеклеток, вызванные
как наличием чужеродного хроматина, так и в случае дополненных, замещенных
хромосом и тем более геномов вида-донора, анеуплоидии. Образно говоря, это начало
изучения наследования необходимого интрогрессивного признака.
способом
являются
маркирование
реципрокные
чужеродного
скрещивания.
материала
Другим
каким-либо
Классическим
способом
является
морфологическим,
физиологическим или биохимическим признаком. Так, в отделе генетики НИИСХ
Юго-Востока при изучении пшенично-ржаных линий Л2037 (5R(5A), Л2075 (1BL1RS)
маркерами
чужеродного
материала
служили
опушение
под
колосом,
устойчивость к листовой ржавчине и секалины, соответственно, а у пшеничнопырейной линии Мульти 6R (6Agi(6D) и пшенично-эгилопсной линии Л170 (2U(2A)
устойчивость к листовой ржавчине и мучнистой росе, соответственно. Необходимо
учитывать, что установленные частоты передачи изучаемого признака имеют генотип
специфический характер. Другими словами, установленная частота передачи
интрогрессивного материала
через пыльцу и яйцеклетки специфична только для
изучаемого генотипа. Кроме того, нами было (Слайд 13) установлено на модельной
линии Л2037 = Л503/Саратовская 5//Л503, где Л503 сорт яровой мягкой пшеницы, а
Саратовская 7 сорт озимой ржи, при замещении 5R(5A), что установленные частоты
передачи 5R и 5A хромосом на основе реципрокных скрещиваний с сортом Л503 не
отражают частоты 5R и 5А хромосом при самоопылении в F2. По-видимому,
необходимо учитывать частоты выживания оплодотворенных зигот. Кроме того, в
различных генотипах наблюдается различная передача чужеродных хромосом (Слайд
14). Так, при скрещивании с С29 и Мульти 6R наблюдается нормальная передача
пырейной хромосомы, с Л583 –повышенная передача, а при скрещивании с С68 –
пониженная.
Учитывая передачу интрогрессивного материала через гаметы легче
ориентироваться в расщепление гибридной популяции F2 и F3 по изучаемому признаку
и определении его наследования.
Следующий этап - идентификация изучаемых
интрогрессивных генов. Классическим способом является скрещивание с тестерными
линиями и определение выщепления в гибридной популяции F2 растений без
изучаемого и тестерного генов (в случае устойчивости к заболеваниям –
восприимчивых растений). В данном способе многое определяется полнотой набора
тестерных линий. Однако, в случае с интрогрессивным материалом важно учитывать,
что один и тот же чужой ген в составе разных транслокаций может быть перенесен в
различные гомеологичные, а в некоторых случаях даже и в не гомеологичные
хромосомы пшеницы. Так, например, (Слайд 15) Lr19-транслокация локализована на
7А, 7В и 7D хромосомах, Lr24- транслокация на 1В и 3D, Lr38- транслокация на пяти
различных хромосомах мягкой пшеницы. Другой встречающийся случай, когда
транслоцируются в хромосомы мягкой пшеницы разные гены из одной и той же
хромосомы, но разных источников одного и того же вида-донора. Наконец, нередки
случаи, когда чужеродные хромосомы замещают одну и ту же хромосому пшеницы,
естественно, что при скрещивании друг с другом вероятность получить в популяции
F2 только растения с изучаемым признаком велика, хотя гены будут разными. Для
идентификации, в случаях изучения устойчивости к патогенам, необходимо применять
фитопатологический анализ идентифицированными изолятами патогена. (Слайд 16) В
наших исследованиях пшенично-ржаной линии Л2075= Л503 / Саратовская 5 // Л503,
устойчивой к патотипу рр19 листовой ржавчины и имеющей транслокацию 1BL-1RS
при скрещивании с тестером Тетчер Lr26, также имеющую 1BL-1RS – транслокацию в
популяции
F2
не
было
выявлено
восприимчивых
растений.
Однако,
при
инокулировании 40 патотипами возбудителя листовой ржавчины были выявлены
патотипы поражающие Л2075, но авирулентные к Тетчер Lr26 и наоборот. Таким
образом, было установлено, что гены устойчивости у Л2075 и Тетчер Lr26 различные.
Надежным способом идентификации являются ДНК-маркеры изучаемых генов. Это
направление интенсивно развивается, но, к сожалению, пока мало применяется в
нашей стране (Слайд 17). С помощью ДНК-маркёров в материале лаборатории
генетики были идентифицированы или подтверждены транслокации (гены) Lr19,
Lr19+26, Lr19+37, Lr35.
Необходимо отметить еще один важный этап в интрогрессивной селекции –
ускоренное
введение
необходимой
чужеродной
генетической
изменчивости
(хромосом или транслокаций) в нужные адаптированные перспективные генотипы
мягкой пшеницы и дальнейшее их размножение. Одним из методов позволяющий
быстро получить гомозиготный материал является андрогенез
in vitro. Однако
сильная
культивирования
генотипическая
зависимость
реакции
на
условия
ограничивает применение этого метода. Так, (Слайд 18) при изучении влиянии Lr9 и
Lr19 – транслокаций и их взаимодействий с генами понижающие высоту растений, не
чувствительность к длине фотопериода и повышающие содержание зернового белка
было
выявлено
следующее.
Названные
транслокации
уменьшали
выход
новообразований и зеленых растений регенерантов. Было выявлено, что Lr19 –
транслокация при взаимодействии с генами понижающими высоту растений и не
чувствительность к длине фотопериода уменьшали выход новообразований и
растений-регенерантов, а при взаимодействии с
растений
и
повышающие
содержание
генами понижающими высоту
зернового
белка
повышали
выход
эмбриоструктур и зеленых растений-регенерантов. Широко известно что, Lr26транслокация положительно влияет на все показатели андрогенеза in vitro, однако
нашими исследованиями (Слайд 19) на почти изогенных линиях было показано, что
данный эффект наблюдается лишь при прямом действии этой транслокации. При ее
взаимодействии с Lr19 – транслокацией выход новообразований и растений
регенерантов понижается ниже уровня прямого действия Lr19 – транслокации.
Другими словами, применение этого метода должно быть с учетом возможных как
положительных, так и отрицательных влияний интрогрессивного материала. Нередко
для размножения особо ценного материала используют культуру тканей, причем в
качестве эксплантатов могут быть как незрелые зародыши, так и незрелые колосья.
Необходимо отметить, что этот метод особенно перспективен в начальный период,
когда работа проводится на единичных растениях, а также при индукции
рекомбинаций между чужеродным
хроматином и пшеничными хромосомами.
Однако, и в этом случае, разные замещенные хромосомы вида-донора в генотипе
мягкой пшеницы по-разному влияют на выход регенерантов. Так, (Слайд 20) нашими
исследованиями у модельной линии
Л2037 = Л503/Саратовская 5//Л503 при
замещении 5R(5A) выход регенерантов повышался по сравнению с сортом
реципиентом Л503 (в качестве эксплантатов использовали незрелые колосья), но при
скрещивании с сортами Саратовская 29 и Саратовская 58 у гибридов F1 были
выявлены различия. Реакция на соматический эмбриоидогенез in vitro на уровне Л2037
было у гибридов F1 Саратовская 58/Л2037, а у Саратовская 29/Л2037 значимо ниже.
Таким образом, есть основания предполагать, что в генетической среде сорта Л503
влияние
замещения 5R(5А) значительно сложнее, чем прямое действие
5R
хромосомы.
Последним этапом являются пребридинговые исследования. Наиболее точным
методом, позволяющим определить эффекты чужеродных генов, является метод почти
изогенных линий. Он основан на сравнении сибсовых линий, идентичных по всем
генам, за исключением изучаемых (в нашем случае чужеродных хромосом или
транслокаций). В этом случае все прямые и косвенные эффекты последних
выявляются наиболее полно. Данный метод позволяет перенести изучаемые гены
(чужеродные хромосомы или транслокации) в генотип желательного сорта или линии,
изучить
его
морфофизиологические
эффекты,
сохраняя
при
этом
принцип
единственного различия в большей мере, чем при любом другом подходе (Крупнов
В.А., 1984). В лаборатории генетики ГНУ НИИСХ Юго-Востока при проведении
пребридинговых исследований наиболее интересные результаты были получены при
использовании в качестве доноров полезных хозяйственно-ценных признаков (генов)
пырея удлиненного, комбинации транслокаций пырея удлиненного и ржи посевной,
двух транслокаций пырея удлиненного, хромосом пырея промежуточного и материала
от твёрдой пшеницы и эммера (Слайды 21, 22, 23, 24). На этих слайдах можно
увидеть, что комбинация Lr19+26 значимо влияет на урожайность зерна, но не влияет
на показатели качества муки и хлеба, что особенно
утверждают
интересно, так
как обычно
о вредном влиянии ржаной транслокации 1BL-1RS на показатели
качества. Лаборатория работает и на опережающую селекцию и от такого опасного
патогена как раса Ug99 стеблевой ржавчины (Слайд 24). Как видно устойчивость
определяется как отдельными транслокациями (генами), так и их комбинациями. В
целом перспективность и правильность теоретических исследований была доказана и
практическими результатами – сортами яровой мягкой пшеницы, которые заняли своё
место в Нижневолжском и Средневолжском, Центральночернозёмном и Уральском
регионах. На слайдах 25, 26 показаны два последних сорта – Фаворит и Лебёдушка, а
на слайдах 27, 28 - перспективные линии с генным материалом от пырея удлинённого
и ржи посевной, пырея промежуточного и элимуса гигантского.
Коллектив авторов благодарит за внимание.