МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ ДИАГНОСТИКА НАСЛЕДСТВЕННОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К РАЗВИТИЮ амилоидоза У ПАЦИЕНТОВ С РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ Инструкция по применению Минск 2011 1 Содержание Учреждения-разработчики: УО «Белорусский государственный медицинский университет»1 ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси»2 Авторы: А.К. Тушина1, канд. мед. наук К.А. Чиж1, д-р мед. наук, профессор Н.Ф. Сорока1, канд. биол. наук Н.Г. Даниленко2, канд. биол. наук Л.Н. Сивицкая2 Диагностика наследственной предрасположенности к развитию амилоидоза у пациентов с ревматоидным артритом.................................................................................... 4 Приложение 1. Обоснование целесообразности практического использования........................................................................... 13 Приложение 2. Отчет о предварительном клиническом испытании нового способа.................................................................................. 15 Тушина, А.К. Диагностика наследственной предрасположенности к развитию амилоидоза у пациентов с ревматоидным артритом : инструкция по применению / А.К. Тушина [и др.]. – Минск, 2011. – 16 с. 2 3 Определение связи генотипа с риском развития амилоидоза у пациентов с ревматоидным артритом в Республике Беларусь ранее не проводилось. Поэтому данная инструкция разработана с целью информирования врачей-ревматологов Республики Беларусь о возможности определения генетической предрасположенности к развитию вторичного амилоидоза при ревматоидном артрите. Перечень необходимого оборудования, реактивов Перечень необходимого лабораторного оборудования Программируемый термостат (амплификатор), мини-центрифуга (вортекс), холодильник с морозильной камерой, прибор для горизонтального электрофореза ДНК-фрагментов в агарозном геле, прибор для вертикального электрофореза ДНК-фрагментов в полиакриламидном геле, СВЧ-печь или водяная баня, источник питания, аппарат для визуализации электрофоретических спектров в ультрафиолете (трансиллюминатор), цифровая камера для съемки, микропипетки на разные объемы с одноразовыми сменными наконечниками (до 10, 200, 1000 мкл), пробирки Eppendorf объемом 1,5 мл и ПЦР-пробирки объемом 0,2 мл, штативы для пробирок, стеклянная химическая посуда. Биологический материал Метод ДНК-диагностики мутаций гена SAA1 основан на выделении микроколичеств ДНК из лейкоцитов периферической крови и последующем ПЦР-ПДРФ анализе. Для проведения анализа достаточно 50 мкл периферической крови, взятой из пальца пациента. Реактивы: • 10-кратный буфер для ПЦР (состав: 750 ммоль/л трис-HCl pH 8,8, 200 ммоль/л (NH4)2SO4, 0,1% Тритон X-100, 10 моль/л. Тартразин и 5% Фикол 400); • раствор 25мМ MgCl2; • смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ); • ДНК-полимераза Taq; • две пары специфических праймеров (последовательность праймеров приведена в табл. 1); • рестриктазы BclI и BanI и соответствующий 10-кратный буфер для рестрикции (Y+/Tango); • 40% раствор акриламида и бис-акриламида в соотношении 19:1; • 20% раствор персульфата аммония (ПСА); • темед как инициатор полимеризации; • маркеры молекулярного веса pUC19/MspI или 100 п.н. + 1,5 тыс. п.н. (НПО «Fermentas», Вильнюс); 4 • раствор краски бромфеноловый синий для нанесения образцов; • 10-кратный раствор трис-боратного буфера; • бидистиллированная деионизированная вода. Таблица 1 Последовательности праймеров к полиморфным участкам гена SAA1 Полиморфизм -13Т/С 2995С/Т, 3010С/Т Прямой праймер, 5`-3` Aca tct tgt tcc ctc agg ttg Gcc aat tac atc ggc ctc ag Обратный праймер, 5`-3` Gct gta gct gag ctg cgg Tgg cca aag aat ctc tgg at Рестрикционный анализ амплифицированных фрагментов гена SAA1 Материалы и оборудование: программируемый термостат, миницентрифуга, микропипетки с одноразовыми сменными наконечниками, пробирки Eppendorf объемом 1,5 мл и пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл. Реактивы: рестриктазы AciI, BanI и BclI и соответствующий 10кратный буфер для рестрикции, бидистиллированная деионизированная вода. Элекрофоретическое разделение рестриктных фрагментов Материалы и оборудование: камера для электрофореза, набор стекол, спейсеров и гребенок для электрофореза, источник питания, микропипетки с одноразовыми сменными наконечниками, химическая посуда. Реактивы: 40% раствор акриламида и бис-акриламида в соотношении 1:19, 20% ПСА, темед как инициатор полимеризации, маркер молекулярного веса pUC19/MspI или 100 п.н. + 1,5 тыс. п.н. (НПО «Fermentas», Вильнюс), раствор краски бромфеноловый синий для нанесения образцов, 10-кратный раствор трис-боратного буфера. Визуализация рестриктных фрагментов в УФ-свете Материалы и оборудование: трансиллюминатор, цифровая камера для съемки, емкость для окрашивания, микропипетки с одноразовыми сменными наконечниками. Реактивы: раствор бромистого этидия (0,0001%). 5 Методика определения полиморфных аллелей гена SAA1 Проведение полимеразной цепной реакции для идентификации 2995С/Т и 3010С/Т мутаций гена SAA1 1. Приготовить амплификационную смесь из расчета 15 мкл на один образец ДНК. Смесь должна содержать конечные концентрации: 10–20 нг геномной ДНК, однократный буфер для амплификации, 50 нмоль MgCl2, 2 нмоль каждого дезоксинуклеотидтрифосфата (дНТФ), 2,5 единицы ДНК-полимеразы Taq (НПО «Ферментас», Вильнюс), по 10 пмоль каждого праймера. Амплификационная смесь готовится в пробирке Eppendorf (1,5 мл). 2. В пробирки для ПЦР внести по 14 мкл амплификационной смеси и 1 мкл образца ДНК. Пробирки поместить в амплификатор с заданной программой: денатурация 94 °С – 5 мин [94 °С – 1 мин, отжиг 62 °С – 1 мин, синтез 72 °С – 1 мин ] × 30 циклов, досинтез 72 °С – 7 мин. В ходе ПЦР синтезируется фрагмент длиной 518 п.н. 3. По окончании ПЦР пробирки поместить в холодильник (4 °С). Проведение полимеразной цепной реакции для идентификации -13Т/С мутации гена SAA1 Полимеразная цепная реакция для идентификации -13Т/С мутации выполняется аналогичным образом, но с соответствующими праймерами и программой: денатурация 94 °С – 5 мин, [94 °С – 45 с, отжиг 60 °С – 60 с, синтез 72 °С – 60 с] × 35 циклов, досинтез 72 °С – 7 мин. В ходе ПЦР синтезируется фрагмент длиной 229 п.н. По окончании ПЦР пробирки поместить в холодильник (4 °С). Проведение рестрикционного анализа для идентификации 2995С/Т и 3010С/Т мутаций гена SAA1 1. Приготовить реакционную смесь из расчета 3 мкл на образец амплифицированного фрагмента ДНК (518 п. н.). В объеме 3 мкл смесь должна содержать: • для определения 2995С/Т аллелей – 0,3 единицы рестриктазы BanI, однократного буфера (НПО «Fermentas», Вильнюс); • для определения 3010С/Т аллелей – 0,3 единицы рестриктазы BclI, однократного буфера (НПО «Fermentas», Вильнюс). 2. Добавить по 3 мкл реакционной смеси в образцы ДНК после проведения ПЦР. Тщательно перемешать и отцентрифугировать на микроцентрифуге. 3. Поместить пробирки в термостат с оптимальной температурой для работы рестриктаз BanI, а также BclI – 37 °С. Выдержать пробы в течение 5–12 часов. 6 Проведение рестрикционного анализа для идентификации -13Т/С мутации Рестрикционный анализ на наличие -13Т/С выполняется аналогично с использованием рестриктазы AciI (НПО «Fermentas», Вильнюс). Пробы выдерживаются в термостате при 37 °С в течение 5–12 часов. После окончания рестрикции пробы поместить в холодильник. Проведение элекрофоретического разделения рестриктных фрагментов Разделение BanI-фрагментов для идентификации 2995С/Т полиморфных аллелей следует проводить в 6% полиакриламидном геле в однократном трис-боратном буфере при напряжении 1В/см в течение 5 часов. Схематическое изображение ПДРФ-анализа полиморфного локуса 2995С/Т гена SAA1 показано на рис. 1. Рис. 1. Схематическое изображение пдрф-анализа полиморфного локуса 2995С/Т гена SAA1 Основными фрагментами для генотипирования являются 72, 244 и 316 п.н. Все возможные комбинации длин рестриктных фрагментов после обработки рестриктазой BanI и их соответствие генотипам представлены в табл. 2. Таблица 2 Полиморфизм гена SAA1 по точечной замене 2995С/Т Длина фрагментов, п.н. 244 + 177 + 72 + 25 316 + 244 + 177 + 72 + 25 316 + 177 + 25 Генотип СС СТ ТТ 7 Возможные варианты длин рестриктных фрагментов после обработки рестриктазой AciI и их соответствие генотипам представлены в табл. 4. Указаны размеры фрагментов рестрикции, слева – маркер длин 1,5 + 100 п.н., снизу – генотипы Рис. 3. Схематическое изображение пдрф-анализа полиморфного локуса -13Т/С гена SAA1 Рис. 2. Электрофореграмма BanI фрагментов 2995С/Т локуса Детекцию результатов электрофоретического разделения фрагментов для идентификации 3010Т/С полиморфных аллелей следует осуществлять в 2% агарозном геле. В случае однонуклеотидной замены в положении 3010 гена SAA1 рестриктаза BclI разрезает амплифицированный фрагмент (518 п.н.) на 427 и 91 п.н. (рис. 2). Возможные варианты длин рестриктных фрагментов после обработки рестриктазой и их соответствие генотипам представлены в табл. 3. Таблица 4 Полиморфизм гена SAA1 по точечной замене -13T/C Длина фрагментов, п.н. 212 + 17 212 + 190 + 22 + 17 190 + 22 + 17 Генотип ТТ ТC CC Таблица 3 Полиморфизм гена SAA1 по точечной замене 3010С/Т Длина фрагментов, п.н. 518 518 + 427 + 91 427 + 91 Генотип СС СТ ТТ Детекцию результатов электрофоретического разделения фрагментов для идентификации -13С/Т полиморфных аллелей следует осуществлять в 8% полиакриламидном геле. Схематическое изображение ПДРФ-анализа полиморфного локуса -13Т/С гена SAA1 показано на рис. 3. 8 Указаны размеры фрагментов рестрикции, слева – маркер длин 1,5 + 50 п.н., внизу – генотипы Рис. 4. Электрофореграмма AciI фрагментов -13T/C локуса 9 Фрагменты длиной 17 и 22 п.н. в геле не обнаруживаются из-за низкой молекулярной массы и суммарного заряда. Генотипы устанавливаются по тяжелым фрагментам – 212 и 190 п.н. (рис. 4). Возможные генотипы по сочетанию аллельного полиморфизма в позициях 2995 и 3010 гена SAA1 представлены в табл. 5. Таблица 5 Возможные генотипы по сочетанию аллельного полиморфизма в позициях 2995 и 3010 гена SAA1 Генотипы по SAA1 2995 ТТ ТС ТС СС СС СС 3010 СС СТ СС ТТ ТС СС α, β, γ α/α α/β α/γ β/β β/γ γ/γ Перечень возможных осложнений или ошибок при определении мутаций и пути их устранения Учитывая крайне высокую чувствительность метода ПЦР, необходимо избегать загрязнения исследуемых образцов инородным биологическим материалом. Во избежание диагностических ошибок рекомендуется соблюдать следующие правила: • использовать исключительно химически чистую и стерильную посуду; • после работы с каждым объектом используемые поверхности лабораторных столов протирать этанолом; • использовать одноразовые пробирки и наконечники для микропипеток; • стерилизовать используемые растворы (если допустима их стерилизация) и хранить их разлитыми в стерильную посуду небольшими порциями, при возможности в замороженном состоянии; • перед открыванием крышек пробирок осаждать растворы со стенок центрифугированием; • в каждую серию проб включать отрицательный контроль – пробирку со всеми применяемыми растворами, но без ДНК; 10 • при выделении ДНК и постановке ПЦР лицо сотрудника должно быть защищено экраном или маской, либо работа может выполняться в ламинаре; работать следует в одноразовых перчатках, которые в случае попадания на них материала меняют. В молекулярно-генетической лаборатории необходимо выделять несколько зон: • зона выделения ДНК – в ней осуществляют все этапы обработки биологического материала и выделения геномной ДНК; • зона проведения ПЦР – в ней выполняется внесение в ПЦРпробирки очищенной ДНК и всех компонентов амплификационной смеси. В зонах экстрагирования ДНК и проведения ПЦР (первой и второй) не следует открывать пробирки с продуктами амплификации, эту процедуру осуществляют в изолированной третьей зоне; • зона анализа продуктов ПЦР – в ней проводят рестрикцию, подготовку образцов для внесения в гель, электрофоретическое разделение ПЦР-ПДРФ продуктов и регистрацию результатов. Показания к применению Наличие у пациентов ревматоидного артрита. Противопоказания Противопоказаний для использования описываемых методов исследования не установлено. Область применения и уровень внедрения Инструкция предназначена для организации ДНК-типирования больных с ревматоидным артритом по гену белка сывороточного амилоида А (SAA1). Определение у пациентов генотипа α/α (полиморфные локусы 2995С/Т и 3010С/Т гена SAA1) является генетическим фактором риска развития амилоидоза как осложнения ревматоидного артрита в белорусской популяции. При разработке и внедрении способа оценки риска прогрессирования патологии почек при ревматических заболеваниях данные по аллельному состоянию SAA1 гена у пациентов являются объективной информацией, позволяющей рассчитать увеличение риска развития амилоидоза в зависимости от генетической предрасположенности. В настоящее время возможность выполнения данного анализа в Республике Беларусь существует на базе ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» в качестве платной медицинской услуги. Ориен11 тировочная стоимость одного исследование (требуется однократное выполнение у любого пациента с ревматоидным артритом в течение всей жизни) составляет приблизительно 30 000 белорусских рублей. Приложение 1 Обоснование целесообразности практического использования В настоящее время достигнуты значительные успехи в понимании механизмов патогенеза ревматоидного артрита (РА) и разработке методов его лечения. За счет этого заметно увеличилась продолжительность жизни пациентов с данной патологией. Однако до сегодняшнего дня наиболее угрожающим и неблагоприятным осложнением РА является вторичный, или АА (Acquired Amyloidosis) амилоидоз. По оценкам различных авторов, амилоидоз развивается у 10–15% пациентов с РА. Этот патологический процесс практически не поддается терапевтическому контролю и неуклонно ведет к прогрессивному снижению функции почек. Поэтому на первый план решения проблемы развития вторичного амилоидоза выходит разработка методов профилактики возникновения данного осложнения, а также выделения возможных факторов риска его развития. До настоящего времени точная причина развития амилоидоза при ревматоидном артрите неизвестна. Было выдвинуто предположение, что развитие вторичного амилоидоза в значительной степени обусловлено особенностями генотипа. Механизм образования и отложения амилоида на данный момент до конца не изучен. Известно, что на коротком плече 11 хромосомы кодируется белок-предшественник амилоидного протеина А (Serum Amyloid A – SAA) – острофазовый белок, близкий по своим свойствам к С-реактивному белку и продуцируемый печенью в ответ на воспаление, при котором его концентрация в крови многократно повышается. В гене SAA1 описан ряд полиморфизмов, однако особое внимание исследователей приковано к двум однонуклеотидным заменам в третьем экзоне этого гена – 2995С/Т и 3010С/Т. Комбинации аллелей этих полиморфных вариантов определяют три SAA1 гаплотипа – α, b и g. Группа японских исследователей во главе с Baba и соавт. (1995) выявила ассоциацию генотипа γ/γ с риском развития амилоидоза. Было показано, что японские пациенты с РА, являющиеся носителями генотипа γ/γ, имеют более высокий риск развития у них амилоидоза по сравнению с пациентами, не несущими в своем генотипе γ-аллеля. Следовательно, генотип γ/γ у японцев является генетическим фактором риска развития амилоидоза. Кроме того, выявлена особая закономерность – продолжительность РА у больного до постановки дополнительного диагноза «амилоидоз» уменьшается с увеличением числа γ-аллелей по гену SAA1. 12 13 В отличие от данных, полученных японскими исследователями, в работе Faulkers и соавт. (1994) при анализе небольшой выборки здоровых европейцев (21 человек) не обнаружено ни одного носителя аллеля γ; частоты аллелей α и β распределились как 62% и 38% соответственно. А в исследовании Booth и соавт. (1998) частота встречаемости аллеля γ в европейской популяции составила лишь 5,3%. Эти результаты свидетельствуют в пользу того, что разные изоформы белка SAA1, а именно α и γ, являются генетическими факторами риска развития амилоидоза в разных этнических группах: у япон­цев – SAAγ, а в немногочисленных исследованиях в европейской популяции – SAAα. Описанный недавно однонуклеотидный полиморфизм в 5’фланкирующей области гена SAA1 (-13Т/С) продемонстрировал положительную ассоциацию с развитием АА-амилоидоза у больных РА как у японских, так и у некоторых групп европейских пациентов. Фактором риска в случае данного полиморфизма считают носительство аллеля -13Т. В работе Yamada и соавт. (2003) доля этого аллеля у японцев, страдающих РА с амилоидозом и без него, составила 70,8 и 52,1% соответственно; у американцев (европейского происхождения) – 53,6% (группа РА) и 19,6% (группа РА + амилоидоз). Некоторые исследователи предполагают, что именно -13Т – основополагающий генетический фактор развития амилоидоза у человека, а разница во встречаемости АА-амилоидоза в разных этнических группах является как следствием различий в частотах -13Т аллеля, так и, отчасти, гаплотипов по полиморфизмам 2995С/Т и 3010С/Т. 14 Приложение 2 Отчет о предварительном клиническом испытании нового способа Нами было обследовано 104 пациента с ревматоидным артритом (РА), разделенные на две группы. Отбор пациентов и взятие образцов крови осуществляли на базе отделения ревматологии УЗ «9-я ГКБ» г. Минска. Первую группу составили 45 пациентов с РА, осложненным амилоидозом почек. Во вторую группу были включены 59 пациентов без наличия данного осложнения. Пациенты обеих групп были сопоставимы по возрасту, полу и длительности основного заболевания. Во всех случаях диагноз «ревматоидный артрит» был установлен на основании критериев ARA (1987). Диагноз «амилоидоза почек у пациентов первой группы был подтвержден морфологически. Методом полимеразной цепной реакции с последующим рестрикционным анализом из крови исследуемых лиц после выделения нативной ДНК с последующей амплификацией было проведено генотипирование на носительство генотипов риска гена SAA1 по двум полиморфным сайтам гена SAA1: 2995С/Т и 3010С/Т. В результате проведенного исследования определены генотипы пациентов по двум полиморфным локусам гена SAA1. Сравнение опытных групп проводилось методом хи-квадрат (χ2) по значениям частот генотипов, а также по частотам двух аллелей. Обнаружены статистически достоверные различия между выборкой больных РА и больных РА, отягощенным амилоидозом. Наибольшее значение χ2 получено при сравнении этих выборок по генотипу α/α – χ2 = 39,97; p < 0,00001. При вычислении показателя «отношение шансов» (ОШ) по числу носителей генотипа α/α получено значение ОШ = 45,26; ДИ 9,9062–206,8153; то есть риск развития амилоидоза у пациентов с РА, являющихся носителями генотипа α/α, возрастает в 45 раз. Обнаружение генетической предрасположенности к развитию амилоидоза у больного с РА позволяет провести соответствующие профилактические мероприятия (более агрессивная терапия РА, тщательный контроль общего анализа мочи с целью выявления протеинурии, контроль показателей функции почек в биохимическом анализе крови). Результаты статистического анализа говорят в пользу того, что аллель α, а особенно генотип α/α (полиморфные локусы 2995С/Т и 3010С/Т) является генетическим фактором риска развития амилоидоза почек как осложнения ревматоидного артрита в исследуемой популяции белорусских пациентов. 15 Производственно-практическое издание Диагностика наследственной предрасположенности к развитию амилоидоза у пациентов с ревматоидным артритом Инструкция по применению Подписано в печать 00.00.2011. Формат 84х108 1/32. Бумага офсетная. Ризография. Усл. печ. л. Уч.-изд. л. Тираж экз. 16