119-123 - ВНИИМК

VII международная конференция молодых ученых и специалистов, ВНИИМК, 20 13 г.
ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ЛЕКТИНОВ В СЕМЕНАХ ЛЬНА МАСЛИЧНОГО
Левчук А.Н. 
69600, Украина, г. Запорожье, ул. Жуковского, 66
Запорожский национальный университет
anna.levchuck@yandex.ua
Обнаружено, что в семенах льна масличного присутствуют 2 группы лектиноподобных белков, одна из которых локализуется в жировом слое, а вторая –
в обезжиренном остатке. Активность лектиноподобных белков первой группы
была выше у низкомасличных генотипов, а второй – у высокомасличных. Независимо от локализации и генотипа активность лектиноподобных белков семян льна
масличного проявлялась как в виде реакции гемагглютинации, так и в виде гемолиза, что, наряду со способностью этих лектинов распознавать глюкозамин,
даёт нам основание отнести их к группе рибосоминактивирующих лектинов.
Лектины – это белки или гликопротеины, способные распознавать и избирательно связывать углеводы, расположенные на поверхности клеток. Как биологически
активные вещества лектины характеризуют по двум показателям – количественному
(лектиновая активность) и качественному (углеводная специфичность) [1]. В связи с
этим они нашли широкое применение в различных отраслях биологии и медицины.
Наибольшее количество этих белков находится в семенах, поэтому именно эта часть
растения является наиболее перспективной для их получения [2]. Однако их физиологическая роль в самом растении изучена недостаточно.
Поэтому актуальным является выделение лектиноподобных белков из семян
и установление их физиологических функций в растении. По общепринятым методам [2] лектины из семян масличных культур выделяют путём экстракции солевыми
растворами после обезжиривания. Однако, известно, что гидролитические ферменты могут проявлять лектиновую активность. Так, известно, что некоторые гидролитические ферменты растений (например, амилаза), могут проявлять лектиновую
активность [3]. Также среди лектинов найдены так называемые бифункциональные
лектины [4], обладающие, кроме лектиновой, ещё и ферментативной активностью.
Так, по мнению некоторых авторов [4, 5] одной из основных функций лектинов в
микроорганизмах, растениях и животных является кофункционирование с литическими ферментами.
Лён является важной масличной культурой [6], запасным веществом у которого является масло, а гидролитическим ферментом, который его расщепляется –
липаза. Ранее нами было установлено, что препарат кислой липазы семян льна масличного проявляет лектиновую активность [7], на основе чего сделано предположение, что липаза и лектин образуют лектин-липолитический ферментный комплекс,
локализованный в жировой фракции и принимающий участие в утилизации запасных
жиров при прорастании семян льна масличного. Поэтому целью работы было количественное выделение и характеристика лектиноподобных белков льна масличного из 2
фракций семян: обезжиренного остатка и жирового слоя.
Материалом для исследования служили семена льна масличного трёх генотипов: сорта Золотистый, сортообразцов К-7276 и К-7354, существенно различающихся
по уровню масличности. Так, масличность сортообразца Золотистый составляла 49%,
К-7276 – 42,0%, а К-7354 – 38,7%.
Для извлечения лектиноподобных белков из жирового слоя извлекали кислую
липазу [8], которая проявляет лектиновую активность, для чего 0,5 г измельчённых
семян гомогенизировали в течение 20 мин. с 10 мл 0,1 М цитрат-фосфатного буфера
при рН 4,2. Полученную суспензию центрифугировали при 10 000 g в течение
15 мин., отбирали верхний жировой слой и высаливали содержащиеся в экстракте
белки насыщенным раствором хлорида натрия с 0,05% содержанием Тритона Х-100.
Осадок отделяли центрифугированием и растворяли в 0,5 мл физиологического рас-

Работа была выполнена под руководством, к.б.н., Войтович Е. Н. и профессора, д.б.н., Ляха В. А.
119
VII международная конференция молодых ученых и специалистов, ВНИИМК, 2013 г.
твора – экстракт лектиноподобных белков жировой фракции. Лектиноподобные белки
обезжиренного остатка извлекали по методу Алексидзе в нашей модификации [9],
для чего 0,5 г измельчённых семян обезжиривали ацетоном, навеску обезжиренных
семян гомогенизировали в 0,02 М калий-фосфатном буфере при рН 6,8, содержащим
0,35 М сахарозы, 0,1 М аскорбиновой кислоты, 0,05% Тритона Х-100 и 0,01 М ЭДТА.
Полученную смесь центрифугировали 15 мин при 10 000 g. Надосадок содержал лектиноподобные белки фракции обезжиренных семян. Лектиновую (гемагглютинирующую и гемолитическую) активность определяли по реакции гемагглютинации и гемолиза соответственно с 2% суспензией трипсинизованих эритроцитов кролика [1, 2]. В
качестве критерия лектиновой и гемолитической активностей принимали минимальное количество белка, при котором наблюдалась гемагглютинация или гемолиз эритроцитов соответственно. Общее содержание белка в экстракте определяли по методу
Варбурга-Кристиана [10]. Гемагглютинирующую и гемолитическую активности выражали как обратную величину – коэффициент гемагглютинирующей (мкг/мл)-1 и гемолитической активности (мг/мл)-1. Изменение формы эритроцитов при воздействии
лектинов в процессе гемолиза регистрировали на микроскопических препаратах при
помощи тринокулярного микроскопа XS-3330 и окулярной камеры MA88-500 при увеличении Ч1 600: на предметное стекло помещали 5 мкл суспензии эритроцитов и
добавляли к ней равный объём экстракта лектиноподобных белков (опыт) или 0,9%
раствора хлорида натрия (контроль). Углеводную специфичность лектиноподобных
белков определяли путем угнетения реакции гемагглютинации различными углеводами. Исследования проводили в пятикратной повторности, результаты обрабатывали с
помощью стандартных статистических методов.
В результате исследований нами было обнаружено, что семена льна масличного содержат, как минимум, два комплекса различных лектиноподобных белков
(табл. 1), отличающихся по функциям, которые они выполняют в растении. Так, первый был выделен из обезжиренных семян и выполняет функцию защиты растения
льна при прорастании от патогенов и способствует формированию биотического
окружения корневой системы. Такие белки по количеству составляют основную массу
лектиноподобных белков семян (около 90-95%) и высвобождаются во внешнюю среду
при набухании семян [4].
Таблица 1 – Количество лектиноподобных белков, выделенных из различных
фракций семян льна масличного, мг/г
Фракция семян
Обезжиренный остаток
Жировой слой
Золотистый
6,2±0,47
0,3±0,016
Генотип
К-7276
6,2±0,08
0,6±0,07
К-7354
6,4±0,40
0,3±0,03
Второй комплекс лектиноподобных белков семян льна был выделен из жировой
фракции и, принимает участие в утилизации запасных питательных веществ – расщеплении запасного масла при прорастании семян [7]. По количеству в семенах он оказался минорным компонентом и составил примерно 5-10% от общего количества лектиноподобных белков семян льна (табл. 1).
Однако для лектинов как биологически активных веществ важно не их количество, а активность, которую традиционно для лектинов определяют по реакции гемагглютинации эритроцитов. Обнаружено, что, в целом, лектиноподобные белки обезжиренного остатка семян характеризовались более высокими показателями гемагглютинирующей активности, чем лектиноподобные белки жировой фракции (рис. 1).
Однако уровень активности лектинов различных фракций семян льна зависел
также от генотипа и уровня масличности. Между активностью лектиноподобных белков обезжиренного остатка и масличностью наблюдалась прямая зависимость, а между последней и активностью лектинов жировой фракции – обратная. Например, у
высокомасличного сорта Золотистый активность лектиноподобных белков обезжиренного остатка является наибольшей среди всех анализируемых генотипов и составляет
порядка 1×1012 (мкг/мл)-1, активность лектиноподобных белков жировой фракции –
является наименьшей и составляет порядка 1×103 (мкг/мл)-1.
120
VII международная конференция молодых ученых и специалистов, ВНИИМК, 20 13 г.
гемагглютинирующая активность,
(мкг/мл)-1
обезжиренный остаток
жировой слой
1E+14
1E+12
1E+10
100000000
1000000
10000
100
1
Золотистый
К-7276
К-7354
генотип льна
Рисунок 1 – Гемагглютинирующая активность различных фракций
семян льна масличного
Кроме того, нами было обнаружено, что лектины семян обеих фракций в
больших концентрациях вызывают не агглютинацию, а гемолиз эритроцитов. Динамика развития реакции гемолиза при действии лектиноподобных белков исследуемых
генотипов оказалась различной (рис. 2).
а
б
а
в
г
а
Рисунок 2 – Изменение формы эритроцитов под действием экстрактов лектинов семян
различных генотипов:
а) контроль (0,9% раствор хлорида натрия) – сверху; б) сорт Золотистый;
в) сортообразец К-7276; г) сортообразец К-7354
В процессе этой реакции под действием лектина происходит изменение формы
эритроцитов, однако степень этого изменения зависит от генотипа льна. Лектины сорта
Золотистый приводили к получению эритроцитами амёбоидной формы (рис. 2 б), сортообразца К-7276 – к увеличению эритроцитов и их скручиванию в трубку (рис. 2 в), а
лектины сортообразца К-7354 – к сморщиванию (рис. 2 г).
Уровень же гемолитической активности подчинялся тем же закономерностям,
что и уровень гемагглютинирующей и зависел от генотипа и уровня масличности
(рис. 3).
121
гемолитическая активность,
(мг/мл)-1
VII международная конференция молодых ученых и специалистов, ВНИИМК, 2013 г.
обезжиренный остаток
2
жировой слой
1,5
1
0,5
0
Золотистый
К-7276
К-7354
генотип льна
Рисунок 3 – Гемолитическая активность различных фракций семян
льна масличного
Известно, что помимо гемагглютинирующей, наличие гемолитической активности характерно для группы рибосоминактивирующих лектинов растений [11]. Обнаружение в выделенных нами комплексах лектиноподобных белков гемолитической
активности позволяет отнести их к этой группе лектинов.
Кроме активности немаловажное значение имеет качественная характеристика лектинов – углеводная специфичность и именно она может показать разные ли
белки были выделены нами из различных фракций семени льна или это один белок,
который различается по уровню активности (табл. 2).
Таблица 2 – Углеводная специфичность лектиноподобных белков,
выделенных их различных фракций семян льна масличного
Фракция семян
Углеводы
гал
глю
ман
кси
ара
мальт
сах
лакт
+
+
фр
гл А
Золотистый
обезжиренный остаток
+
жировой слой
+
+
+
+
+
+
+
К-7276
обезжиренный остаток
+
+
жировой слой
+
+
+
+
+
+
+
+
К-7354
обезжиренный остаток
+
+
жировой слой
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Как видно, независимо от локализации и генотипа лектиноподобные белки
семян льна являются глюкозоспецифичными – способны распознавать глюкозу, ксилозу и глюкозамин. Наличие у выделенных нами лектиноподобных белков специфичносити к глюкозамину подтверждает наше предположение относительно принадлежности их к группе рибосоминактивирующих лектинов. Кроме того, лектины различных
фракций обладают дополнительной углеводной специфичностью – лектины фракции
обезжиренного остатка способны ещё распознавать арабинозу, а жирового слоя –
маннозу. Таким образом, нами было обнаружено, что лектиноподобные белки разных
фракций семян льна масличного имеют разную углеводную специфичность, то есть
являются различными лектинами.
122
VII международная конференция молодых ученых и специалистов, ВНИИМК, 20 13 г.
Таким образом, нами было обнаружено, что в семенах льна масличного присутствуют 2 группы лектиноподобных белков, одна из которых локализуется в жировом слое, а вторая – в обезжиренном остатке. Количественно существенно преобладают лектиноподобные белки обезжиренного остатка, однако по уровню активности
такого распределения обнаружено не было – он зависел от уровня масличности семян. У высокомасличных генотипов более активными были лектиноподобные белки
обезжиренного остатка, а у низкомасличных – лектиноподобные белки жирового
слоя. Независимо от локализации и генотипа лектиноподобные белки семян льна
масличного в больших концентрациях вызывают гемолиз и способны распознавать
глюкозамин, что даёт нам основание отнести эти белки к группе рибосоминактивирующих лектинов.
Литература
1. Антонюк, В.О. Лектини та їх сировинні джерела / В.О. Антонюк. – Л.: Основа,
2005. – 554 с.
2. Луцик, М.Д. Лектины / М.Д. Луцик, В.М. Панасюк, А.Д. Луцик – Львов: Вища школа, 1981. – 156 с.
3. Феоктісов П.О. Сполученість в динаміці амілолітичної та лектинової активності в процесі проростання зернівок озимої пшениці / П.О. Феоктісов, І.П. Григорюк,
А.К. Ляшок //Физиология и биохимия культурных растений. – 2002. – Т.34, № 3. – С.
260 – 263.
4. Линевич, Л.И. Лектины и углевод-белковое узнавание на разных уровнях
организации живого / Л.И Линевич // Успехи биологической химии. – 1979. – Т.20. –
С. 71 - 89.
5. Gilboa-Garber, N. – Purification of the galactose-binding hemagglutinin of Pseudomonas aeruginosa by affinity column chromatography using sepharose / N. GilboaGarber, L. Mizrahy, N. Garber // FEBS Lett. – 1972. – Vol. 28. - Р. 93-95.
6. Лях, В.А. Ботанические и цитогенетические особенности видов рода Linum
и биотехнологическте пути работы с ними : монография / В.А. Лях, А.И. Сорока. Запорожье: ЗНУ, 2008. – 182 с.
7. Левчук, А.Н. Лектиновая активность кислой липазы семян льна масличного (Linum humile Mill.) / А.Н. Левчук, Е.Н.Войтович, В.А.Лях // Вісник Одеського національного університету. Біологія. – 2012. – Т., № 2. – С. 45-49.
8. Броберхоф, Х. Липолитические ферменты / Х .Броберхоф, Р. Дженсен. –
М.: Мир, 1978. – 396 с.
9. Левчук, Г.М. Оптимізація виділення лектиноподібних білків листя льону
олійного / Г.М. Левчук, О.М. Войтович // Вісник Запорізького національного університету. – 2013. - № 1. – С 25-29.
10. Dawson, R. Data for Biochemical Research / R. Dawson, D. Elliott, U .Elliott, K.
Jones. – 2nd edn. Oxford: Clarendon Press
11. Sehgal, P. Purification, characterization and toxicity profile of ricin isoforms
from castor beans / P. Sehgal, M. Khan, O. Kumar, R. Vijayaraghavan // Food Chem.
Toxicol. – 2010. – Vol. 48, № 11. – P. 3171-3176.
PHYSIOLOGICAL ROLE OF LECTINS IN OIL FLAX SEEDS
Levchuck A.N.
Two groups of lectinlike proteins, one of which is localized in the fat layer, and the second
group is localized in the fat-free residue was founded in the seeds of oil flax. Lectinlike proteins
activity of the first group in genotypes with low oil level was highest, and lectin activity of the
second group in genotypes with high oil level was highest. Regardless of the location and the
genotype the activity of lectinlike proteins in oil flax seed was expressed both in haemagglutination
reaction, and in hemolysis. This, along with the ability of these lectins recognize glucosamine, gives
us reason to take them to the group of ribosome-inactivating lectins.
123