АНАЛИЗ АЛЛЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНОВ ИММУНОГЛОБУЛИН
реклама
УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН На правах рукописи ЗВЯГИН ИВАН ВЛАДИМИРОВИЧ АНАЛИЗ АЛЛЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНОВ ИММУНОГЛОБУЛИН-ПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ У ПАЦИЕНТОВ СО СПОНДИЛОАРТРОПАТИЯМИ Специальность 03.01.03 – Молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва – 2011 Работа выполнена в лаборатории сравнительной и функциональной геномики Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Научный руководитель: д. б. н. Юрий Борисович Лебедев Официальные оппоненты: чл.-корр. РАН, д. х. н., профессор Александр Габибович Габибов д. б. н. Игорь Викторович Коробко Ведущая организация: Центр «Биоинженерия» РАН Защита состоится «30» сентября 2011 г. в 10:00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.019.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, ГСП-7, г. Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10. С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Автореферат разослан «26» августа 2011 г. Учёный секретарь диссертационного совета доктор физ.-мат. наук В.А. Олейников -3- ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Аутоиммунные патологии занимают второе место по распространенности среди заболеваний человека. Общим принципом всех аутоиммунных состояний является нарушение толерантности иммунной системы к клеткам собственного организма. Молекулярные и клеточные механизмы нарушения толерантности в большинстве случаев в настоящее время остаются невыясненными, что связано с недостатком детальных фундаментальных знаний о многих процессах иммунного ответа, а также о процессах инициации и развития аутоиммунной реакции. Многие аутоиммунные заболевания имеют генетически обусловленную природу, связанную с присутствием в генотипе определенных аллельных вариантов генов, продукты которых прямо или опосредованно участвуют в регуляции иммунного ответа. Вклад отдельных локусов в риск развития заболевания, как правило, модулируется влиянием всего генетического окружения, а также воздействием различных факторов окружающей среды. Одним из таких заболеваний, характеризующихся многофакторной генетической составляющей, является анкилозирующий спондилит (АС). Для АС показана связь присутствия в генотипе ряда аллельных вариантов генов, продукты которых участвуют в процессах презентации и распознавания пептидов организма и антигенов клетками иммунной системы (МНС-I, МНС – II, ERAP1, KIR3D), а также ряда аллелей генов цитокинов и рецепторов к ним (TNFa, IL23R, IL1R), с повышенным риском развития заболевания. Данная работа посвящена изучению вклада аллельных вариантов и их сочетаний гена иммуноглобулин-подобных рецепторов натуральных киллеров (KIR3D), аминопептидазы ERAP1, участвующей в процессе подготовки презентируемого в комплексе с МНС пептида, и МНС-подобного мембранного белка MICA в риск развития АС. Детальное изучение генетических особенностей, связанных с риском развития аутоиммунных заболеваний, в частности на примере АС, позволяет исследовать клеточные и молекулярные механизмы, приводящие к инициации заболевания и, в дальнейшем, разрабатывать средства диагностики предрасположенности, а также подходы к терапии и профилактике подобных состояний. Цели и задачи исследования Целью данной работы было изучение факторов генетической предрасположенности к развитию аутоиммунных заболеваний человека на примере анкилозирующего спондилита. В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие экспериментальные задачи: -4- 1) Создание коллекции образцов гДНК и РНК больных анкилозирующим спондилитом с классической формой заболевания и соответствующей контрольной группы здоровых доноров. 2) Разработка систем для генотипирования и проведение анализа представленности аллельных вариантов гена иммуноглобулин-подобного рецептора KIR3D. 3) Разработка систем для генотипирования и анализ представленности аллельных вариантов генов аминопептидазы ERAP1 и МНС-подобного мембранного белка MICA. 4) Многолокусный анализ и выявление сочетаний аллелей по трем локусам: KIR3D, erap1 и micA, вносящих вклад в генетический риск развития анкилозирующего спондилита. Научная новизна и практическая значимость работы Показана связь группы аллелей KIR3DS1, кодирующих активирующий вариант иммуноглобулин-подобного рецептора KIR3D с повышенным риском развития анкилозирующего спондилита у пациентов российской популяции. Впервые установлено, что носительство ряда аллелей, кодирующих функциональные ингибиторные варианты рецептора KIR3D, оказывает протективный эффект. Показана ассоциация нескольких несинонимичных нуклеотидных замен гена аминопептидазы ERAP1с риском развития АС в российской популяции. Впервые выявлены, на основе теоретического расчета и экспериментального подтверждения, рисковый и протективный гаплотипы гена аминопептидазы. С использованием полученных данных по локусам KIR3D, erap1 и micA впервые проведен анализ ассоциаций генетических паттернов с риском развития АС на выборке больных российской популяции. Выявлены несколько сочетаний аллелей исследуемых генов, статистически достоверно преобладающих в геномах выборки больных АС российской популяции. Полученные результаты вносят вклад в понимание механизмов развития аутоиммунных состояний и функционирования иммунной системы. Результаты могут быть использованы при исследовании молекулярных и клеточных механизмов возникновения анкилозирующего спондилита, а также для разработки средств диагностики предрасположенности и средств профилактики развития данного заболевания. Кроме того, полученные в работе результаты представляют несомненный интерес при разработке средств терапии анкилозирующего спондилита. Апробация работы и публикации Результаты работы были представлены на XXI зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, -5- 2009), 15th International Summer School on Immunology “IMMUNE SYSTEM: GENES, RECEPTORS AND REGULATION” (Hvar, Croatia, 2009), школе-конференции «Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины 2010» (Москва, 2010), 4th ESF Conference on functional genomics and desease, Dresden, Germany, 2010), 14th International congress on immunology (Kobe, Japan, 2010), Human genome meeting 2011 (Dubai, UAE, 2011), European Human Genetics Conference 2011 (Amsterdam, The Nederlands, 2011), 36th FEBS Congress (Torino, Italy, 2011). По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ в российских и зарубежных научных журналах. Структура и объем работы Диссертационная работа изложена на 101 странице, содержит 4 рисунка и 12 таблиц; состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и библиографического списка, включающего 121 источник. -6- ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ 1. Роль аллельных вариантов иммуноглобулин-подобных рецепторов натуральных киллеров KIR3D в определении генетической предрасположенности к анкилозирующему спондилиту Белки семейства иммуноглобулин-подобных рецепторов KIR экспрессируются на наружной мембране НК-клеток, а также Т-лимфоцитов, включая субпопуляцию цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ). Семейство рецепторов KIR кодируется 15 функциональными генами и 2 псевдогенами. Кодируемые функциональными генами рецепторы разделяют на 2 группы: «активирующие», т.е. запускающие сигнальный каскад, приводящий к активации цитотоксических функций клетки, и «ингибирующие», передающие ингибирующий сигнал внутрь клетки. Отдельные субпопуляции НК-клеток экспрессируют свой набор рецепторов KIR из каждой группы. Предполагается, что от баланса между «активирующим» и «ингибирующим» сигналами от различных рецепторов, поступающими в лимфоцитарную клетку, зависит активация цитотоксической функции при взаимодействии с клеткой-мишенью. Сигнал, обеспечиваемый связыванием KIR-рецептора, экспрессируемого лимфоцитарной клеткой, с молекулой МНС-I, вносит соответствующий вклад в общий уровень сигнала активации. Таким образом, рецепторы семейства KIR, могут быть вовлечены в процессы инициации и развития аутоиммунных процессов. 1.1 Распределение частот аллельных вариантов, кодирующих ингибирующий и активирующий рецепторы KIR3D, в выборке больных АС В настоящее время в литературе опубликованы противоречивые данные о вкладе различных аллельных вариантов, кодирующих ингибирующий и активирующий рецепторы KIR3D (группы аллелей KIR3DL1 и KIR3DS1 соответственно), в определение генетической предрасположенности к анкилозирующему спондилоартриту у пациентов разных этнических групп. С целью выявления роли аллельных вариантов KIR3D нами было проведено генотипирование по локусу KIR3D образцов геномной ДНК (гДНК) выборки больных анкилозирующим спондилитом (АС) и образцов геномной ДНК контрольной выборки, состоящей из здоровых hlaВ*27-положительных доноров. Выборка больных состояла на 96,6% из носителей аллельного варианта hlaB*27, который наиболее жестко ассоциирован с риском развития АС у представителей европеоидной расы. С учетом того, что АС сопровождается неоднородными клиническими проявлениями, что приводит к сложности дифференцировки АС от ряда других спондилоартропатий и, как следствие, возможным неоднозначным результатам генетических исследований, значительное внимание в работе было уделено формированию анализируемой выборки -7- пациентов. В конечную выборку были включены только пациенты с признаками «классического» АС, подтвержденными клиническим диагнозом и данными радиологического обследования. Определение генотипов образцов геномной ДНК пациентов и контрольной выборки было проведено методом двустадийной аллель-специфической ПЦР. На первом этапе работы использовали несколько пар аллель-специфических праймеров, специфичных к разным участкам локуса KIR3D, позволяющих однозначно отличать группы аллельных вариантов KIR3DL1 и KIR3DS1. Схема расположения праймеров приведена на рис. 1. 3DL3 2DS2 2DL2 2DL5B 2DS3/5 2DP1 2DL1 3DP1 2DL4 3DL1/S1 2DL5A 2DS3 2DS5 2DS1 3DL2 19q13.4 L1/S1For L1/S1For2 1 2 L1Rev2 3 L01/05For 1 2 3 6 001Rev 7 8 01/07Rev 9 L01/07For2 001Rev2 007Rev S1Rev S1For L1/S1For2 5 01/07For 005Rev F*Rev L1/S1For 3DL1 L1Rev 4 nF*Rev L1For2 L1For 3DS1 S1Rev3 4 5 6 7 8 9 Рис. 1. Схема расположения праймеров для определения аллельных вариантов KIR3D. Прямоугольниками с номерами показаны экзоны гена KIR3D. Стрелками схематично изображены праймеры для ПЦР с соответствующими названиями. Звездочками схематично показано положение маркеров аллелей. В верхней части рисунка приведена схема локуса KIR. После статистической обработки результатов генотипирования было показано, что среди представителей исследованной выборки больных с центральной формой анкилозирующего спондилита российской популяции значимо повышена частота встречаемости «активирующей» группы аллелей KIR3DS1 (p<0,01, OR=1,90) и снижена частота встречаемости «ингибирующей» группы аллелей KIR3DL1 (p<0,01, OR=0,53) по сравнению с контрольной группой. Также в исследованной выборке пациентов существенно снижена распространенность гомозиготного генотипа, содержащего оба «ингибирующих» аллеля KIR3D (KIR3DL1/KIR3DL1) и повышена частота встречаемости гетерозиготного генотипа, несущего «активирующий» и «ингибирующий» аллельные варианты (KIR3DL1/KIR3DS1) (табл. 1). В то же время, частоты генотипов, гомозиготных по «активирующему» аллелю, не различаются существенно между выборками больных АС и здоровых hlaB*27-положительных доноров. -8- Полученные нами характеристики выборок российской популяции по частотам встречаемости аллельных вариантов KIR3D совпадают с рядом опубликованных данных для нескольких выборок больных европеоидной и азиатской рас и, в то же время, не совпадают с результатами других авторов. Выявленные особенности российской популяции больных АС могут быть связаны с многофакторной генетической природой анкилозирующего спондилита и, соответственно, различной вовлеченностью разных локусов, в условиях неоднородного генетического окружения, в риск развития заболевания. Таблица 1. Распределение встречаемости генотипов по «активирующим» и «ингибирующим» аллельным вариантам гена рецептора KIR3D среди больных АС и в контрольной группе российской популяции Частота встречаемости OR** (95% Частота встречаемости среди контрольной доверительный среди больных АС, % р группы, % интервал) (n=87) (n=107) Генотип 3DL1/3DL1 49,4 (43) 69,2 (74) 0,008 0,44 (0,24-0,79) 3DL1/3DS1 40,2 (35) 24,3 (26) 0,026 2,09 (1,13-3,90) 3DS1/3DS1 10,3 (9) 6,50 (7) нз* Аллель 3DL1 69,5 (121) 81,3 (174) <0,01 0,53 (0,33-0,84) 3DS1 30,5 (53) 18,7 (40) <0,01 1,90 (1,19-3,06) *нз – статистически незначимые отличия; **OR – отношение шансов. 1.2 Распределение частот генотипов, несущих аллель кодирующий нефункциональный вариант ингибирующего рецептора KIR3DL1. К настоящему времени в группе аллелей, кодирующих ингибирующий рецептор KIR3DL1, описано более 65 аллельных вариантов, которые по уровню экспрессии белка на клеточной поверхности можно разделить на три подгруппы: высокоэкспрессирующиеся (например, аллели KIR3DL1*001 и *002), слабоэкспрессирующиеся (аллели *005, *006, *007) и неэкспрессирующиеся (например, «нефункциональный» аллель KIR3DL1*004). Отсутствие на поверхности лимфоцита рецептора KIR3D, кодируемого «нефункциональным» аллелем KIR3DL1*004, у гомо- или гетерозиготных по данному аллелю индивидуумов, может приводить к снижению общего уровня ингибиторного сигнала в некоторых субпопуляциях цитотоксических клеток, что может вносить вклад в инициацию аутоиммунного заболевания. Для экспериментальной проверки данного предположения с помощью аллельспецифической ПЦР (рис. 1) в описанных выборках доноров (больных АС и контрольной группы) были определены частоты встречаемости группы аллелей KIR3DL1, кодирующих аминокислотную замену Ser86Leu, наличие которой приводит к нарушению экспонирования вновь синтезированной молекулы рецептора на поверхности клеточной мембраны. Аллельные варианты, несущие кодон Ser86, объединены в настоящей работе обозначением -9- KIR3DL1*F (functional), аллельные варианты с кодоном Leu86 объединены обозначением KIR3DL1*nF (non-functional). Проанализированные выборки больных АС и здоровых hlaB*27-положительных доноров не отличаются по частоте встречаемости аллельных вариантов, кодирующих нефункциональный ингибирующий рецептор (KIR3DL1*nF) и по частоте носителей данного аллельного варианта. Также не найдено статистически значимых различий между выборками в частотах встречаемости гомо- и гетерозигот по данному аллельному варианту (табл. 2). В то же время, показано достоверное снижение частоты встречаемости генотипа KIR3DL1*F/KIR3DL1*F, гомозиготного по аллельным вариантам, кодирующим функциональный ингибирующий рецептор, и повышение частоты встречаемости генотипа KIR3DL1*F/KIR3DS1, несущего аллельные варианты, кодирующие функциональные ингибирующий и активирующий рецепторы. Таблица 2. Распределение генотипов по аллельным вариантам гена KIR3D, кодирующим функциональный и нефункциональный ингибирующий, а также активирующий рецептор среди больных АС и контрольной группы российской популяции Частота Частота встречаемости среди OR (95% встречаемости среди Генотип контрольной группы, доверительный р больных АС, % % интервал) (n=87) (n=107) 23,0 (20) 44,9 (48) 0,002 0,37 (0,19-0,69) 3DL1*F/3DL1*F 20,7 (18) 19,6 (21) нз 3DL1*F/3DL1*nF 5,8 (5) 4,7 (5) нз 3DL1*nF/3DL1*nF 32,2 (28) 18,7 (20) <0,05 2,06 (1,06-4,04) 3DL1*F/3DS1 8,1 (7) 5,6 (6) нз 3DL1*nF/3DS1 10,3 (9) 6,5 (7) нз 3DS1/3DS1 Сниженная частота встречаемости генотипа KIR3DL1*F/KIR3DL1*F среди больных АС позволяет предположить протективный эффект присутствия функционального ингибирующего рецептора на всех KIR3D-позитивных клетках носителя такого генотипа в отношение риска развития АС. В то же время, доля гетерозиготных генотипов KIR3DL*F/KIR3DL1*nF среди представителей обеих выборок примерно равна. Таким образом, снижение уровня ингибирующего сигнала, за счет отсутствия на поверхности мембраны функционального рецептора, возможно, чаще приводит к формированию специфических клеточных популяций, существенных для развития аутоиммунной реакции. В то же время, значительное повышение частоты встречаемости генотипа KIR3DL*F/KIR3DS1 и заметное, хотя и статистически недостоверное при исследованном объеме выборок, повышение частоты «активирующего» генотипа (KIR3DS1/KIR3DS1) среди больных АС, позволяет предполагать, что присутствие активирующего рецептора вносит больший вклад в процесс инициации АС. - 10 - 1.3 Присутствие аллельных вариантов KIR3DL1*005 и *007, кодирующих низкоэкпрессирующийся продукт, в геномах пациентов c генотипами KIR3DL1*F/KIR3DL1*F Наряду с отсутствием функциональной молекулы на мембране, низкий уровень экспрессии ингибирующего рецептора также может приводить к снижению ингибирующего сигнала в цитотоксической клетке, и, таким образом, вносить вклад в инициацию АС. Присутствие низкоэкспрессирующихся аллельных вариантов KIR3DL1 возможно связано с развитием заболевания у тех индивидуумов, чей генотип содержит оба аллеля KIR3D, кодирующих функциональный ингибирующий рецептор. Для проверки данной гипотезы с помощью аллель-специфической ПЦР мы определили присутствие 2-х аллельных вариантов из группы KIR3DL1*F, чей продукт экспрессируется на низком уровне – KIR3DL1*005 и KIR3DL1*007, у 20 пациентов с гомозиготными по функциональным аллельным вариантам KIR3DL1*F генотипами. Генотипы 10 пациентов из проанализированной выборки содержат низкоэкспрессирующиеся аллельные варианты группы KIR3DL1: 6 KIR3DL1*F/KIR3DL1*005, 3 – KIR3DL1*005/KIR3DL1*005 и 1 – KIR3DL1*F/KIR3DL1*007. Генотипы остальных 10 пациентов содержат другие аллельные варианты KIR3DL1, кодирующие функциональный ингибирующий рецептор, предположительно, экспрессирующийся на высоком уровне. Образцы крови 7 пациентов (негативных по аллелям KIR3DL1*005 и KIR3DL1*007) были проанализированы на проточном цитофлуориметре, с использованием специфического антитела для KIR3DL1, не узнающего активирующий рецептор KIR3DS1 и остальные рецепторы семейства KIR. У 4-х пациентов по результатам цитофлуориметрии среди CD8+ клеток фракция KIR3DL1+ клеток разделялась на две субпопуляции, которые, предположительно, экспрессировали рецептор KIR на высоком (KIR3DL1high) и низком уровнях (KIR3DL1low). У трех других пациентов наблюдалась лишь популяция CD8+KIR3DL1high клеток. На рис. 2 приведен пример результатов цитофлуорометрии образцов крови 2 пациентов (KIR3DL1high и KIR3DL1high/ KIR3DL1low) и 3 контрольных образцов. Наличие популяции CD8+KIR3DL1low клеток может быть связано с особенностями регуляции транскрипции/трансляции отдельных аллельных вариантов группы KIR3DL1, а также с присутствием популяций клеток с различным уровнем экспрессии рецептора KIR3D на мембране в зависимости от состояния пациента. Однако, никакой корреляции с состоянием пациентов на момент забора крови (стадия острого воспаления или ремиссия) и наличием или отсутствием популяции клеток CD8+KIR3DL1low не выявлено. Полученные результаты указывают на значимость уровня экспрессии ингибирующего рецептора KIR3D на поверхности лимфоцитов для возникновения или развития заболевания. - 11 - Вместе с тем, сниженный уровень экспрессии ингибирующего рецептора представляет лишь дополнительный фактор риска, вклад которого не является решающим. Существуют другие генетические факторы, определяющие развитие заболевания при наличии двух аллелей группы KIR3DL1 экспрессирующихся на высоком уровне. Определение детальных механизмов и уточнение роли низкоэкспрессирующихся аллельных вариантов KIR3DL1*005 KIR3DL1-FITC KIR3DL1-FITC и *007 в развитии АС требуют дальнейших исследований. Рис. 2. Анализ субпопуляций лимфоцитов периферической крови пациентов с АС. А – контрольные образцы. В – образцы крови пациентов, гомозиготных по высокоэкспрессирующимся аллельным вариантам KIR3DL1. Генотипы всех образцов указаны над графиками. 2. Анализ репертуара генов Т-клеточных рецепторов у пациента с анкилозирующим спондилитом. Другим типом рецепторов, относящихся к семейству иммуноглобулин-подобных рецепторов являются специфические рецепторы Т-клеток (ТкР), распознающие пептиды в комплексе с белками главного комплекса гистосовместимости и в норме активирующие лимфоцит при связывании с чужеродными пептидами или пептидами трансформированных клеток собственного организма. Специфичность распознавания ТкР антигена в комплексе с молекулой МНС определяется структурой вариабельного домена субъединиц рецептора, в основе разнообразия которой, лежит рекомбинация участков V, D и J при созревании гена рецептора. Каждый клон Т-клеток несет на своей поверхности ТкР с уникальной структурой антигенсвязывающего участка вариабельного домена. Различные нарушения в системе - 12 - презентации антигена и его последующего распознавания, а также структурное сходство бактериальных (вирусных) и пептидов собственного организма приводят к активации Тлимфоцитов против нормальных клеток собственного организма и развитию аутоиммунных патологий. Активация Т-лимфоцитов сопровождается экспансией активированного клона. .В нашей работе мы использовали один из существующих подходов для полуколичественной характеристики клонального разнообразия популяций Т-лимфоцитов из периферической крови пациента с анкилозирующим спондилитом. В основе метода лежит анализ, с разрешением в 1 нуклеотид, репертуара длин ПЦР-продуктов, заключающих в себе гипервариабельную область (CDR3) зрелого гена b-цепи ТкР, образованную сочетанием 3’концевой части V-сегмента, D-сегментом и J-сегментом. Метод позволяет выявить отличия от нормального распределения длин ПЦР-продуктов и детектировать наличие клональной экспансии внутри субпопуляции Т-лимфоцитов, несущих ТкР с определенным V-сегментом b-цепи. В ходе работы были получены флуоресцентно меченые ПЦР-продукты с кДНК из мононуклеарной фракции клеток периферической крови пациента с АС, а также с кДНК ядерных клеток этого пациента, выделенных из синовиальной жидкости пораженного сустава. Полученные ПЦР-продукты были проанализированы по длине и интенсивности флуоресценции с помощью капиллярного электрофореза в акриламидном геле (рис. 3). Распределение длин ПЦР-продуктов полученных с праймеров специфичных к 1, 2 и 4 V-сегментам соответствует характерной картине, получаемой в отсутствие выраженной клональной экспансии, когда кривая, проведенная через вершины пиков, соответствующих разным длинам ПЦР-продуктов (кратным 3 нуклеотидам) не отличается значительно от формы гауссовской кривой. На основе полученных результатов можно предположить наличие клональной экспансии в субпопуляциях Т-лимфоцитов, несущих ТкР, кодируемый зрелым геном с 3 и 11 V-сегментами (субпопуляции bV3 и bV11). Из двух предположительно перепредставленных клонов в субпопуляции bV3 в образце из периферической крови пациента один присутствует в значительном количестве также и в образце из синовиальной жидкости, что позволяет предполагать участие этого клона Тклеток в патологическом процессе. Другой перепредставленный клон этой же субпопуляции значительно менее представлен в синовиальной жидкости пораженного сустава, чем в периферической крови. Кроме того, в образце синовиальной жидкости обнаружен еще один предположительно перепредставленный клон субпопуляции bV3, представленность которого в периферической крови существенно отличается. Субпопуляция Т-лимфоцитов bV11 в синовиальной жидкости пациента представлена в основном одним клоном, тогда как распределение длин ПЦР-продуктов с кДНК из периферической крови сходно с нормальным распределением в отсутствие клональной - 13 - экспансии. Присутствие перепредставленного клона субпопуляции bV11 в образце синовиальной жидкости данного пациента было подтверждено секвенированием соответствующей библиотеки фрагментов кДНК 6000 5500 5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 7233 3400 3500 3600 3700 В 26477 3800 флуоресценция, отн. ед. флуоресценция, отн. ед. А периферическая кровь 3900 4000 синовиальная жидкость 6000 5500 5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 3300 18351 bV3 3400 флуоресценция, отн. ед. флуоресценция, отн. ед. 3400 3500 3600 3700 3800 3900 4000 6000 5500 5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 3300 4000 4000 3500 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 5900 6000 6100 6200 3600 3700 3800 3900 4000 6300 bV4 3400 3500 3600 3700 3800 3900 4000 время удержания, отн. ед. флуоресценция, отн. ед. флуоресценция, отн. ед. время удержания, отн. ед. 0 5800 3500 время удержания, отн. ед. время удержания, отн. ед. 6000 5500 5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 3300 10841 6400 6500 3000 bV11 2500 2000 1500 1000 500 0 5700 5800 5900 6000 6100 6200 6300 6400 6500 время удержания, отн. ед. время удержания, отн. ед. Рис. 3. Репертуар пула специфических ПЦР-продуктов с кДНК из образцов периферической крови и синовиальной жидкости пациента с АС, полученных с праймерами специфичными к разным V-сегментам гена b-цепи ТкР. В правом столбце рисунка указаны номера Vсегментов. Обнаруженные перепредставленные клоны Т-лимфоцитов, локализующиеся в синовиальной жидкости пораженного сустава пациента с АС, возможно, связаны с патологическим процессом, что определяет необходимость установления первичной структуры вариабельного участка CDR3 ТкР таких клонов и проведения функциональных тестов, для определения их специфичности. 3. Роль аллельных вариантов гена аминопептидазы ERAP1 в риске развития АС Связь определенных аллельных вариантов молекул МНС I типа и иммуноглобулинподобных рецепторов цитотоксических лимфоцитов, распознающих эти молекулы, с предрасположенностью к развитию анкилозирующего спондилита позволяет предполагать также роль презентируемых МНС пептидов в процессе инициации и развития заболевания. - 14 - Презентация пептида в контексте молекул МНС I типа зависит от функционирования иммунопротеасомного комплекса, а также от активности аминопептидаз ERAP1 и ERAP2, локализующихся, в основном, в эндоплазматическом ретикулуме и выполняющих функции дальнейшего N-концевого протеолиза пептидов, поступающих из иммунопротеасомы, для корректного связывания с молекулами MHC I типа. В настоящее время считается, что основную роль в этом процессе играет аминопептидаза ERAP1. Для пептидазы ERAP1 также описана протеолитическая активность в отношении ряда рецепторов провоспалительных цитокинов (рИЛ-1, рИЛ-6, рФНОа), приводящая к образованию растворимых форм данных рецепторов. Вариации структуры белка ERAP1, определяемые заменами в кодирующей части гена erap1, могут приводить к образованию функциональных продуктов различающихся по сродству или специфичности к субстрату, скорости его расщепления, а также уровню экспрессии данного белка. Различные варианты ERAP1, могут вносить вклад в общий риск развития АС. 3.1 Повышенная частота встречаемости ряда однонуклеотидных полиморфизмов гена erap1 среди пациентов с анкилозирующим спондилитом Для выявления предполагаемых различий частот встречаемости аллельных вариантов erap1 среди больных аутоиммунными заболеваниями и в контрольной группе, мы провели генотипирование по пяти молекулярно-генетическим маркерам локуса erap1 образцов геномной ДНК выборки из 84 пациентов с АС и контрольной группы, состоящей из 102 hlaB*27-положительных здоровых доноров. Разработанный набор аллель-специфических праймеров (рис. 4), позволял отличать аллельные варианты гена erap1 по 5 молекулярногенетическим маркерам, представляющим собой несинонимичные однонуклеотидные замены: rs2287987 (C/T, Met349Val), rs30187 (C/T, Lys528Arg) , rs10050860 (C/T, Asp575Asn), rs17482078 (C/T, Arg725Gln) и rs27044 (C/G, Glu730Gln). Аминокислотная замена Met349Val (маркер rs2287987), расположена вблизи цинксвязывающего мотива HEXXH в составе той же альфа-спирали. Аминокислотные варианты, кодируемые остальными маркерами, расположены в удаленных от активных центров аминопептидазы частях молекулы. По результатам генотипирования были определены частоты встречаемости 10 аллельных вариантов гена erap1 и соответствующих генотипов в обеих выборках. Показано, что частота встречаемости минорных аллельных вариантов гена erap1 по двум из пяти маркеров: rs2287987 (p < 0,004, OR = 0.39) и rs10050860 (p < 0,018, OR = 0.45), статистически значимо снижена среди больных АС в российской популяции по сравнению со здоровыми донорами (табл. 3). Полученные нами результаты позволяют говорить об ассоциации двух аллельных вариантов гена erap1 с повышенным риском развития АС: rs2287987 [T] (OR = 2.86) и - 15 - rs10050860 [C] (OR = 2.54). Несмотря на значительную разницу в частоте встречаемости минорного аллеля маркера rs17482078 статистически достоверность различий не подтверждается (p = 0,051), однако значение p близко к достоверному. 100 A/G rev 228 A/G for 5 30 A/G for 10 228 intr rev 100 A/G for 11 30 intr rev 27/174 intr for 12 13 100 intr rev 14 27 G/C rev гаплотипирование: генотипирование: cDNA + 228Afor/100Arev + 228Afor/100Grev + 228Gfor/100Arev + 228Gfor/100Grev gDNA + 228Afor/228intr rev + 228Gfor/228intr rev генотип: A/A, A/G, G/G гаплотип: AA/AA, AA/AG AA/GG … etc. Рис. 4. Схема расположения праймеров для гено- и гаплотипирования локуса erap1. Прямоугольниками с цифрами обозначены экзоны гена аминопептидазы. Стрелками схематично изображены праймеры для ПЦР с соответствующими названиями. Звездочками условно отмечено положение маркеров. В нижней части рисунка приведен пример определения генотипа по маркеру rs2287987 и гаплотипа по маркерам rs2287987 и rs10050860. Разница в частотах встречаемости минорных аллельных вариантов по маркерам rs30187 и rs27044 между двумя выборками (больных АС и контрольной группой) российской популяции незначительна. В то же время, согласно литературным данным, аминокислотная замена Glu730Gln, соответствующая маркеру rs27044, не оказывает влияния на расщепление пептидазой природных и синтетических субстратов. Этот факт, а также отсутствие достоверного генетического сцепления между указанными маркерами и маркерами, для которых показана ассоциация с АС, позволяют предполагать, что аминокислотные замены Glu730Gln и Lys528Arg не оказывают влияния на предрасположенность к развитию АС в российской популяции. Таблица 3. Частоты встречаемости минорных аллельных вариантов по исследованным маркерам среди больных АС и представителей контрольной выборки Частота минорного аллеля OR p Маркер [нуклеотид] (95%CI) [полиморфный Здоровые Больные АС, нуклеотид] доноры, n = 84 n = 102 rs2287987 [C/T] 0,09 [C] 0,20 [C] <0,004 0,39 (0,20–0,72) rs30187 [C/T] 0,38 [T] 0,34 [T] нз rs10050860 [C/T] 0,11 [T] 0,21 [T] <0,018 0,45 (0,25–0,82) rs17482078 [C/T] 0,12 [T] 0,20 [T] нз rs27044 [C/G] 0,33 [G] 0,33 [G] нз Снижение частоты встречаемости минорных аллелей по маркерам rs2287987, rs10050860 и rs17482078 сопровождается снижением количества гетерозигот и возрастанием - 16 - количества гомозигот по ассоциированному с АС аллельному варианту гена в выборке больных (табл. 4). Гетерозиготность по маркерам rs30187 и rs27044, не ассоциированным с АС в российской популяции, наоборот, возрастает у больных, однако частота минорного аллельного варианта при этом меняется незначительно. Таблица 4. Частоты встречаемости генотипов по 5 маркерам гена erap1 в выборке больных АС и контрольной группе Маркер Больные АС, Здоровые доноры, OR (95%CI) p [полиморф n = 84 n = 102 ный Число генотипов Число генотипов нуклеотид] (частота) (частота) СС 1 (0,01) СС 3 (0,03) нз rs2287987 CT 13 (0,15) CT 34 (0,34) <0,006 0,35 (0,17-0,76) [C/T] TT 70 (0,83) TT 62 (0,63) <0,003 2,97 (1,48-6,15) СС 28 (0,33) СС 46 (0,45) нз rs30187 CT 49 (0,58) CT 43 (0,42) <0,041 1,92 (1,07-3,45) [C/T] TT 7 (0,08) TT 13 (0,13) нз СС 66 (0,79) СС 63 (0,63) нз rs10050860 CT 18 (0,21) CT 32 (0,32) нз [C/T] TT TT 5 (0,05) нз СС 65 (0,77) СС 64 (0,63) <0,045 2,02 (1,06–3,94) rs17482078 CT 17 (0,20) CT 35 (0,34) <0,048 0,49 (0,25-0,95) [C/T] TT 2 (0,02) TT 3 (0,03) нз G/G 7 (0,08) G/G 12 (0,12) нз rs27044 G/C 42 (0,5) G/C 42 (0,42) нз [C/G] C/C 35 (0,42) C/C 45 (0,45) нз 3.2 Определение гаплотипов по исследованным маркерам гена erap1 в выборках больных АС и здоровых доноров российской популяции. По результатам генотипирования обеих выборок с использованием программы Haploview была определена степень неравновесного генетического сцепления между парами аллельных вариантов по исследуемым маркерам. Полиморфизмы rs2287987, rs10050860 и rs17482078 находились в статистически достоверном неравновесном сцеплении (D' ≥ 0.85, 95%CI 0.76-0.99) и были объединены в блок. Для маркеров в блоке были рассчитаны теоретические частоты встречаемости гаплотипов в выборке больных АС и контрольной группе для определения гаплотипов, возможно, связанных с риском развития АС. С использованием парных комбинаций аллель-специфических праймеров к исследуемым маркерам и образцов кДНК той же выборки больных были определены фактические частоты встречаемости гаплотипов по всем пяти молекулярно-генетическим маркерам гена erap1 и сопоставлены с результатами теоретических расчетов. Фактическая частота встречаемости предположительно рискового гаплотипа ССТ (rs17482078 -rs10050860-rs2287987) среди больных АС составляет около 88%, что согласуется с теоретически рассчитанной частотой. В то же время, фактическая частота встречаемости предположительно протективного гаплотипа ТТС (rs17482078 -rs10050860- 17 - rs2287987) составляет около 2%, тогда как теоретически рассчитанная величина равна примерно 8% (табл. 5). Эти различия, вероятно, связаны с недостаточным для точного определения фактической частоты встречаемости протективного гаплотипа размером выборки больных АС, а также с недостаточной точностью существующего алгоритма расчета. Таблица 5. Расчетные и практические частоты встречаемости протективного и рискового гаплотипов по маркерам rs2287987, rs10050860 и rs17482078 гена erap1 Частота встречаемости Частота встречаемости среди Гаплотип среди OR (95%CI) р больных АС здоровых доноров теоретическая, практическая, теоретическая, n = 84 n = 69 n = 102 0,86 0,88 0.77 0.043 1.74 (1.02–3.04) ССТ 0,08 0,02 0.18 0.003 0.38 (0.19–0.73) ТТС По результатам сравнения расчетных частот встречаемости гаплотип CCT статистически достоверно ассоциирован с риском развития АС (p = 0.043, OR 1,74). Расчетная частота гаплотипа ТТС достоверно ниже в выборке больных (p = 0.003, OR 0.38), что позволяет предполагать протективное свойство данного гаплотипа erap1 в отношении риска развития АС (табл. 5). 4. Многолокусный анализ факторов генетической предрасположенности к анкилозирующему спондилиту 4.1. Анализ представленности аллельных вариантов гена МНС-подобного белка MICA среди пациентов с АС российской популяции. MICA является поверхностным белком клеточной мембраны, экспрессирующимся на всех клетках организма. Структура MICA гомологична структуре молекул МНС-I, однако белок не принимает участия в антиген-презентации. Считается, что экспрессия MICA повышается при воспалительных и опухолевых процессах. MICA является лигандом для активирующего рецептора Т- и НК-клеток NKG2D, связывание с которым приводит к выработке ко-стимулирующего сигнала у Т-лимфоцитов или прямой активации НК-клеток. Аффинность взаимодействия MICA с NKG2D зависит от вариабельной аминокислоты в положении 129 белка MICA, кодируемой маркером rs1051792. Вариант MICA-Met129 связывается с рецептором с большей аффинностью, чем вариант MICA-Val129. В ряде опубликованных исследований на выборках различной этнической принадлежности получены противоречивые результаты относительно связи аллельных вариантов micA-Val129и micA-Met129 с риском развития хронических воспалительных - 18 - заболеваний кишечника (острого неспецифического язвенного колита, болезни Крона, которые часто встречаются у больных АС) и ранним развитием симптомов анкилозирующего спондилита. Мы провели первое исследование связи вариабельности Val129Met белка MICA с риском развития анкилозирующего спондилита у представителей российской популяции. Учитывая вероятное неравновесное сцепление между аллельными вариантами micA и hlaB, расположенного на расстоянии 200 т.п.о., мы проанализировали частоты встречаемости групп аллельных вариантов micA, различаемых по варианту полиморфного маркера rs1051792, безотносительно остальных маркеров, различающих аллели micA, что позволяет оценить вклад функционально различающихся продуктов данных групп аллелей в риск развития АС. С этой целью нами разработана система праймеров для аллель-специфической ПЦР, позволяющая определять варианты полиморфного нуклеотида маркера rs1051792 в образцах геномной ДНК (рис. 6) и проведено генотипирование образцов выборки из 83 пациентов с АС и контрольной группы из 105 hlaB*27-положительных здоровых доноров (табл. 6). specDir 1 70 2 6840 255 specRev2 3 274 3EF 4 288 587 279 5 6 3’ 99 138 2551 125 3ER-C 3ER-T Рис. 6. Схема расположения праймеров для определения полиморфного маркера rs1051792 локуса micA. Стрелками схематично показаны праймеры и даны соответствующие названия. Прямоугольниками с номерами обозначены экзоны гена micA. В нижней части рисунка схематично изображен продукт 1 раунда ПЦР и праймеры, используемые для 2 раунда; цифрами указаны размеры экзонов и интронов в парах оснований. Статистически значимых различий между частотами встречаемости аллелей micA, кодирующих Val129 или Met129, и соответствующих генотипов между исследованными выборками hlaB*27-положительных больных АС и здоровых доноров найдено не было. В то же время, отмечено повышение частоты гомозиготного генотипа Met129/Met129 среди больных АС, а также снижение частоты группы аллелей кодирующих Val129. Таблица 6. Распределение генотипов и аллельных вариантов гена micA, кодирующих Val129 или Met129, в выборке больных АС и в контрольной группе Частота встречаемости, (кол-во) OR p здоровые (95%CI) больные АС hlaB*27+ доноры n=83 n=105 генотип 0,04 (3) 0,06 (6) нз Val129/Val129 0,61 (51) 0,70 (74) нз Val129/Met129 0,35 (29) 0,24 (25) нз Met129/Met129 2n=166 2n=210 аллель 0,34 (57) 0,41 (86) нз Val129 0,66 (109) 0,59 (124) нз Met129 - 19 - Для выявления возможной фенотипической связи, проявляющейся в повышенном риске развития АС, между функционально различающимися аллелями гена micA и ассоциированными с АС аллелями гена KIR3D, кодирующими активирующий вариант рецептора (KIR3DS1), были проанализированы частоты генотипов по micA среди KIR3DS1положительных и KIR3DS1-отрицательных индивидуумов обеих выборок (табл. 7). Таблица 7. Частоты встречаемости гомо- и гетерозиготных генотипов по аллелям micAVal129 и micA-Met129 среди выборок больных и здоровых доноров ранжированных по аллелю KIR3DS1 Частота встречаемости, (кол-во) Генотип KIR3DS1+ Val129/Val129 Val129/Met129 Met129/Met129 KIR3DS1Val129/Val129 Val129/Met129 Met129/Met129 Больные АС Здоровые hlaB*27+ доноры n = 43 n = 32 0,02 (1) 0,54 (23) 0,44 (19) 0,56 (24) 0,44 (19) 0,06 (2) 0,66 (21) 0,28 (9) n = 39 0,05 (2) 0,69 (27) 0,26 (10) 0,72 (23) 0,28 (9) n = 73 0,74 (29) 0,26 (10) 0,06 (4) 0,73 (53) 0,22 (16) 0,79 (57) 0,22 (16) Примечание: во втором столбце для каждой выборки приведены частоты гомозиготного генотипа Met129/Met129 и суммарные частоты для генотипов включающих аллель Val129. По результатам сравнения отмечено выраженное увеличение частоты встречаемости гомозиготного генотипа Met129/Met129 в группе KIR3DS1-положительных больных АС по сравнению с аналогичной группой hlaB*27-положительных здоровых доноров. Различия в частотах встречаемости генотипов по локусу micA, при сравнении групп KIR3DS1отрицательных больных АС и здоровых доноров, отсутствуют. Частоты встречаемости генотипа Met129/Met129 в обеих группах здоровых доноров примерно совпадают с частотой для всей контрольной выборки в целом. Частота встречаемости генотипа Met129/Met129 среди KIR3DS1-отрицательных больных также приблизительно совпадает с частотой встречаемости в контрольной выборке, однако в объединенной выборке больных она выше (0,35 в выборке больных против 0,24 в выборке здоровых; табл. 6). Изменение средней частоты встречаемости генотипа Met129/Met129 среди больных АС происходит за счет группы KIR3DS1-положительных пациентов (табл. 7). Проведенное сравнение позволяет предположить, что наличие гомозиготного генотипа Met129/Met129 в присутствии аллельного варианта KIR3DS1 приводит к возрастанию риска развития анкилозирующего спондилита. Исходя из полученных результатов, можно заключить, что соответствующая rs1051792 аминокислотная замена Val129Met белка MICA, повышающая аффинность активирующего - 20 - рецептора иммунных клеток NKG2D к MICA, не вносит решающий вклад в риск развития анкилозирующего спондилита. Однако генотипы гомозиготные по варианту micA-Met129 и несущие также и активирующий аллельный вариант рецептора KIR3D чаще встречаются среди больных АС и, возможно, определяют более высокий риск развития заболевания. Описанный факт требует дальнейшего изучения на выборках большего объема, а также проведения функциональных исследований. 4.2 Выявление генетических паттернов по локусам KIR3D, erap1, micA, ассоциированных с риском развития АС Генетическая предрасположенность к развитию АС определяется вкладом нескольких локусов, продукты которых вовлечены в различные иммунные процессы. С помощью программы, использующей модифицированный алгоритм Metropolis-Hastings, был проведен поиск специфических для АС комбинаций аллельных вариантов (генетических паттернов) локусов KIR3D, erap1, micA в выборках больных АС и контрольной группе hlaB*27 – положительных доноров российской популяции (табл. 8). Таблица 8. Генетические паттерны, различающиеся по частоте встречаемости между исследованными выборками российской популяции Частота генотипов в выборке (N) OR Генотип FDR pperm Больные Контрольная (95%CI) АС, группа, n = 88 n = 109 0,34 0,16 (14) 0,34 (37) 0,005 0,020 rs228*C(0,17-0,68) 2,98 0,80 (70) 0,57 (62) 0,005 0,020 rs228TT (1,48-6,03) 2,85 0,38 (33) 0,17 (19) 0,005 0,020 KIR3DS1- / rs174CC (1,46-5,54) 2,82 0,36 (32) 0,17 (18) 0,007 0,027 KIR3DS1- / rs100CC (1,44-5,55) 2,66 KIR3DS1- / rs228T- / rs100C- / 0,48 (42) 0,25 (27) 0,005 0,020 (1,43-4,93) rs174C2,60 0,48 (42) 0,26 (28) 0,005 0,021 KIR3DS1- / rs100C- / rs174C(1,41-4,80) 2,59 0,48 (42) 0,25 (27) 0,005 0,020 rs30T- / rs100CC / rs27C(1,40-4,80) 2,58 0,46 (40) 0,24 (26) 0,009 0,034 KIR3DS1- / rs27C(1,38-4,80) 2,50 0,47 (41) 0,28 (30) 0,011 0,039 KIR3DS1- / micA-Met129 (1,36-4,58) * rs228 - rs2287987; rs30 - rs30187; rs100 - rs10050860; rs174 - rs17482078; rs27 - rs27044; pperm - значение р с поправкой на множественность (метод пермутаций); FDR - средняя доля ложных отклонений нулевой гипотезы; N – число генотипов в выборке. Среди паттернов, различающихся по встречаемости между исследованными выборками, только один однолокусный паттерн является протективным (rs2287987-С), в то время как его - 21 - противоположный вариант (rs2287987-T) является рисковым только в гомозиготном состоянии. Большая часть выявленных паттернов относится к одной группе, которая включает в себя варианты, состоящие из аллелей локуса erap1, входящих в определенный нами ранее рисковый гаплотип, и аллеля KIR3DS1. Эти результаты позволяют предполагать, что сочетание двух рисковых факторов: аллеля KIR3DS1 и гаплотипа CCT (rs17482078rs10050860-rs2287987) существенно повышает риск развития АС. В то же время, один из паттернов (rs30-T / rs100-CC / rs27-C) включает аллели маркеров rs30187 и rs27044, для которых не показана ассоциация с риском АС в исследованной выборке больных. Аллель rs27044-C также входит в состав еще одного рискового паттерна в сочетании с аллелем KIR3DS1. На основе этого можно предположить, что аллельные варианты несущие маркеры rs30187-T и rs27044-C также вносят вклад в риск развития АС либо в сочетании с аллелем KIR3DS1, либо в сочетании с гаплотипом CCT (учитывая неравновесное сцепление между аллелями маркеров rs10050860 и rs17482078). Результаты проведенного анализа также статистически подтверждают наше предположение о взаимосвязи распределения аллелей KIR3DS1 и micA-Met129 у больных АС российской популяции. - 22 - Выводы 1. Показана повышенная встречаемость группы аллелей KIR3DS1, кодирующей активирующий вариант иммуноглобулин-подобного рецептора KIR3D, в выборке больных анкилозирующим спондилитом российской популяции по сравнению с выборкой здоровых hlaB*27- положительных доноров. Высказано предположение, о функциональной роли активирующих рецепторов KIR3DS1 в инициации анкилозирующего спондилита. 2. Показано, что присутствие в генотипе аллельных вариантов, кодирующих функциональный ингибирующий рецептор KIR3DL1, оказывает протективный эффект. 3. Показана ассоциация нескольких несинонимичных однонуклеотидных замен гена аминопептидазы ERAP1 с риском развития анкилозирующего спондилита. 4. Определены предположительно рисковый и протективный гаплотипы, включающие три несинонимичные однонуклеотидные замены гена erap1; определена фактическая частота встречаемости рискового гаплотипа в выборке больных АС. 5. Выявлены сочетания аллельных вариантов по локусам KIR3D, erap1, micA, частоты встречаемости которых статистически достоверно различаются между выборкой больных АС и контрольной группой. - 23 - Список опубликованных работ: 1) Mamedov I.Z., Britanova O.V., Chkalina A. V., Staroverov D.B., Amosova A. L., Mishin A.S., Kurnikova M.A., Zvyagin I.V., Mutovina Z.Y., Gordeev A.V., Khaidukov S.V., Sharonov G. V., Shagin D.A., Chudakov D.M., Lebedev Y.B. Individual characterization of stably expanded T cell clones in ankylosing spondylitis patients // Autoimmunity. 2009; 42(6): p. 525–536. 2) А.В. Чкалина, И.В. Звягин, И.З. Мамедов, О.В. Британова, Д.Б. Староверов, Ю.Б. Лебедев. Олигоклональная экспансия Т-клеток: изучение ее стабильности во времени // Биоорганическая химия. 2010; 36(2): с. 206-214. 3) I.V. Zvyagin, I.Z. Mamedov, O.V. Britanova, D.B. Staroverov, E.L. Nasonov, A.G. Bochkova, A.V. Chkalina, A.A. Kotlobay, D.O. Korostin, D.V. Rebrikov, S. Lukyanov, Y.B. Lebedev, D.M. Chudakov. Contribution of functional KIR3DL1 to ankylosing spondylitis // Cellular and Molecular Immunology. 2010; 7(6): p. 471-476. 4) Звягин И.В., Дородных В.Ю., Мамедов И.З., Староверов Д.Б., Бочкова А.Г., Ребриков Д.В., Лебедев Ю.Б. Ассоциация аллельного варианта гена аминопептидазы ERAP1 с риском развития анкилозирующего спондилита // Acta Naturae. 2010; 2(3): с.86-92. 5) Mamedov I.Z., Britanova O.V., Bolotin D. , Chkalina A.V., Staroverov D.B., Zvyagin I.V., Kotlobay A.A., Turchaninova M.A., Fedorenko D.A., Novik, A. A., Sharonov G. V., Lukyanov S., Chudakov D.M., Lebedev Y.B. Quantitative tracking of T cell clones after hematopoietic stem cell transplantation // EMBO Mol Med. 2011; 3(4): p. 201-207. Материалы конференций: 1) Звягин И.В., Чкалина А.В., Котлобай А.А., Анисимова В.Е., Мамедов И.З., Лебедев Ю.Б. Создание гибридных белков, содержащих TCR-Vb, для элиминации семейства Тлимфоцитов // XXI зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2009; сборник тезисов, с. 58. 2) Чкалина А.В., Звягин И.В., Мамедов И.З., Лебедев Ю.Б. Новый метод выявления клональной экспансии Т-лимфоцитов. // XXI зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2009; сборник тезисов, с. 60. 3) Mamedov I.Z., Britanova O.V., Chkalina A.V., Zvyagin I.V., Staroverov D.B., Amosova A.L., Chudakov D.M., Lebedev Y.B. Detection, study of stability and characterization of expanded T cell clones in patients with AS // 15th International Summer School on Immunology “IMMUNE SYSTEM: GENES, RECEPTORS AND REGULATION”, Hvar, Croatia, 2009; Abstract book, p. 134. - 24 - 4) I.V. Zvyagin, I.Z. Mamedov, A.V. Chkalina, D.M. Chudakov, S.A. Lukyanov, Y.B. Lebedev. Involvement of KIR3D receptor functional variants in ankylosing spondylitis initiation. // New Biotechnology. Abstracts of the 4th ESF Conference on Functional Genomics & Disease. Dresden, Germany, 2010; 275: p. s60. 5) I. V. Zvyagin, V. Y. Dorodnykh, I. Z. Mamedov, A. V. Chkalina, D. M. Chudakov, Y. B. Lebedev. Analysis of association of 5 ERAP1 SNPs and KIR3D alleles in patients with ankylosing spondylitis. // 14th International Congress on Immunology, Kobe, Japan, 2010; Abstract book, p. i128. 6) Звягин И.В., Мамедов И.З., Лебедев Ю.Б. Разработка подходов к восстановлению толерантности цитотоксических клеток при аутоиммунных патологиях. // школаконференция «Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины 2010», Москва , 2010; материалы конференции, с. 34. 7) Dorodnykh Valeria, Zvyagin Ivan, Mamedov Ilgar, Chudakov Dmitry, Lukyanov Sergey, Lebedev Yuriy. Individual genome variability of patients with ankylosing spondilitis. // Human genome meeting 2011, Dubai, UAE, 2011; Abstract book, p. 216. 8) I. V. Zvyagin, I. Z. Mamedov, A. V. Chkalina, V. Y. Dorodnykh, D. M. Chudakov, S. A. Lukyanov, Y. B. Lebedev. Role of KIR3D receptor functional variants in ankylosing spondylitis. // European Journal of Human Genetics. Abtracts of the European Human Genetics Conference 2011. Amsterdam, The Netherlands, 2011; 19(S2): p. 383. 9) I. Zvyagin, V. Dorodnykh, I. Mamedov, D. Khmelkova, A. Chkalina, D. Chudakov, S. Lukyanov, Y. Lebedev. Analysis of association of several non-MHC loci with ankylosing spondylitis in Russian population // FEBS Journal. Abstracts of the 36th FEBS Congress. Torino, Italy, 2011; 278(S1): p. 255. - 25 -
