М Е Т О Д И Ч Е С К... «МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ТРАНСФЕРАЗ И ГИДРОЛАЗ»

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ОБРАЗОВАНИЯ, МОЛОДЕЖИ И СПОРТА УКРАИНЫ
Одесский национальный университет
имени И. И. Мечникова
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
для выполнения экспериментальных исследований по большому
специальному практикуму
«МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ
ТРАНСФЕРАЗ И ГИДРОЛАЗ»
для студентов биологического факультета
Одесса 2011
Печатается по решению Ученого Совета
биологического факультета ОНУ им. И.И. Мечникова
(протокол № 7 от 01 марта 2011 г.)
Практикум позволяет студентам овладеть и приобрести навыки самостоятельной
работы и методами качественного и количественного анализа в биологическом материале
в норме, при экспериментальных патологиях и их коррекции биологически активными
соединениями (витаминами, витаминными смесями, гормонами и т.д.), которые могут
быть использованы для выполнения курсовых и дипломных работ, а также для работы по
избранной специальности.
В учебное пособие введены контрольные вопросы и задания по программе
«Большого специального практикума» для национальных университетов, что позволяет
студентам глубоко усвоить теоретический материал.
Пособие может быть использовано студентами других обучающих учреждений,
которые готовят специалистов по биологии, а также студентами медицинских вузов
Украины.
Методические указания составлены доц. Вовчук И.Л., доц. Чернадчук С.С., доц.
Захариевой З.Е., доц. Федорко Н.Л., доц. Будняком О.К., доц. Сорокиным А.В., ст.
преп. Кокошкиной О.О., проф. Петровым С.А., доц. Запорожченко О.В. на основании
учебного плана специальности, обобщая учебную и научную литературу.
Утверждено на заседании кафедры биохимии
(протокол № 7 от 02 февраля 2011г.)
Зав. кафедрой доц. Запорожченко А.В.
Ученый секретарь доц. Федорко Н.Л.
Рецензенты:
доктор биологических наук, профессор Карпов Л.М.
кандидат биологических наук, доцент Швец Г.А.
2
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
КРАТКАЯ ИНСТРУКЦИЯ ПО ТЕХНИКЕ БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ
В БИОХИМИЧЕСКОЙ ЛАБАРАТОРИИ
Раздел 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТОВ КЛАССА
ТРАНСФЕРАЗ И НЕКОТОРЫХ ЕГО ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ
Лабораторная работа № 1
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КРЕАТИНКИНАЗЫ
Лабораторная работа № 2
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ γ-ГЛУТАМИЛТРАНСПЕПТИДАЗЫ (ГГТП)
Лабораторная работа № 3
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АСПАРТАТ-АМИНОТРАНСФЕРАЗЫ И
АЛАНИН-АМИНОТРАНСФСРАЗЫ
Лабораторная работа № 4
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АСПАРТАТ-АМИНОТРАНСФЕРАЗЫ И
АЛАНИН-АМИНОТРАНСФСРАЗЫ ДИНИТРОФЕНИЛГИДРАЗИНОВЫМ
МЕТОДОМ (ПО РАЙТМАНУ, ФРЕНКЕЛЮ)
Лабораторная работа № 5
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ГЛУТАТИОНТРАНСФЕРАЗЫ
Раздел 2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТОВ КЛАССА
ГИДРОЛАЗ И НЕКОТОРЫХ ЕГО ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ
2.1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭСТЕРАЗ
Лабораторная работа № 6
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ
Лабораторная работа № 7
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КИСЛОЙ ФОСФАТАЗЫ
Лабораторная работа № 8
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЛИПАЗЫ
Лабораторная работа № 9
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ
Лабораторная работа № 10
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ НУКЛЕАЗ
2.2. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ГЛИКОЗИДАЗ
Лабораторная работа № 11
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ γ-АМИЛАЗЫ
3
Лабораторная работа № 12
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ХИТИНАЗЫ
Лабораторная работа № 13
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЛИЗОЦИМА
Лабораторная работа № 14
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ НЕЙРАМИНИДАЗЫ
2.3. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПЕПТИДГИДРОЛАЗ
Лабораторная работа № 15
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПЕПСИНА
Лабораторная работа № 16
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ТРИПСИНА
2.4 МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЭКЗОПЕПТИДАЗ
Лабораторная работа № 17
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЛЕЙЦИНАМИНОПЕПТИДАЗЫ
Лабораторная работа № 18
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ А
ЛИТЕРАТУРА
ПРИЛОЖЕНИЕ
4
ВВЕДЕНИЕ
Определение активности ферментов наиболее широко используется при
диагностике как первичных врожденных ферментопатий, так и вторичных, т.е.
развивающихся в результате патологических нарушений на клеточном и субклеточном
уровнях. Изменение активности одних и тех же ферментов может наблюдаться при самых
различных заболеваниях и, следовательно, не является специфичным для какой-либо
патологии. В связи с этим определение активности ферментов имеет диагностическую
значимость только при сопоставлении с изменениями других показателей и клинической
картиной заболевания в целом.
Чаще всего для определения активности ферментов в клинико-диагностических
лабораториях используют плазму. Ферменты, выявляемые в плазме, условно делятся на
три группы:
- собственные ферменты плазмы, выполняющие свои функции только в
сосудистом русле (ферменты свертывания крови, холинэстераза, церулоплазмин);
- экскреторные ферменты, попавшие в плазму из секретов (дуоденального сока, слюны);
клеточные
ферменты,
попавшие
в
плазму
из
поврежденного
органа.
Появление, степень, длительность сдвига ферментативной активности ферментов в плазме
или сыворотке крови обусловлены несколькими причинами: размерами и степенью
повреждения клеток, величиной молекул фермента, его внутриклеточной локализацией,
прочностью связей со структурными элементами клеток, влиянием разных факторов на
активность
и
скорость
деградации
фермента
в
клетках.
Каждый орган в организме имеет определенный спектр ферментов. Его характеристикой
может быть более или менее типичная группа ферментов, типичная энзиматическая
констелляция. Это позволяет с помощью определения группы органоспецифических
ферментов получать сведения о функциях отдельных органов организма. Обычно
ферментодиагностика — это определение ряда ферментов. Моноорганоспецифических
ферментов практически не существует.
Измеряемая в сыворотке крови активность ферментов — результат совместной и
согласованной работы клеточных структур (процессов синтеза и распада ферментов),
функции мембран, скорости инактивации. Кроме того, на активность ферментов в крови
значительное влияние оказывает продолжительность жизнедеятельности. Для основного
числа ферментов период полураспада составляет от 10 до 120 ч. При этом ферменты с
коротким периодом полураспада лучше отражают процессы, протекающие в органе.
Определение активности ферментов в сыворотке или плазме крови начато с 1954
г., когда было выяснено диагностическое значение нарастания активности ACT и АЛТ.
Последующие годы подтвердили, что ряд заболеваний (в первую очередь инфаркт
миокарда) вызывает преходящий подъем активности ряда ферментов плазмы и сыворотки
крови. Каждый фермент в процессе заболевания отличает время первоначального
появления в сыворотке и плазме; достижение максимальной активности; инактивация. По
мере развития патологического процесса в органе происходит прогрессирующее
нарушение целостности клеточных стенок и утечка ферментов. В плазме или сыворотке
накапливается добавочное количество ферментов, набор которых характеризует их состав
в пораженном органе. Абсолютное повышение активности определенного фермента
связано со степенью повреждения ткани, его активность зависит от молекулярной массы и
количества фермента в органе. Длительность периода полураспада ферментов является
5
главным фактором, определяющим период времени, когда активность фермента
повышена в плазме или сыворотке крови.
Цель настоящего пособия – помочь студентам при изучении одного из разделов
биохимии, посвященного усвоению методов исследования активности ферментов
биологических объектов, получить
знания: о функционировании и регуляции активности ферментов;
умения: работать с биологическими объектами, химической посудой, готовить
реактивы, работать с измерительными приборами, строить калибровочные кривые, вести
протоколы эксперимента;
навыки: самостоятельно планировать и проводить эксперимент, анализировать
полученные данные, делать логичные выводы.
Настоящее учебное руководство включает классические биохимические методы
и новые методики. В процессе проведения лабораторных работ студенты должны усвоить
большой объем фактического материала и выполнить практические части лабораторных
работ.
Студенты не всегда знакомы с правилами техники безопасности в химической
лаборатории, что может привести к случаям травматизма. В связи с этим мы приводим
краткую инструкцию по технике безопасности, которую должны строго соблюдать
студенты. Ознакомившись с ней, студенты обязаны расписаться в специальном
журнале инструктажа по технике безопасности.
Каждое задание, формулы, и расчеты к нему оформляются в виде протокола в
специальной тетради. Задание считается выполненным только после проверки и подписи
преподавателя.
КРАТКАЯ ИНСТРУКЦИЯ
по технике безопасности при работе
в биохимической лаборатории
Химические вещества при неумелом и неправильном использовании могут стать
причиной отравления лиц, которые работают, вызывать пожар, взрыв или химический
ожог. С целью исключения случаев травматизма при работах в химических лабораториях
необходимо выполнять следующие требования:
1. Каждый студент к началу опыта должен хорошо ознакомиться со свойствами веществ, с
которыми будет работать и необходимыми условиями безопасного проведения работы с
учетом возможных побочных реакций.
2. При работе в вытяжном шкафу, с целью более эффективного действия вентиляции,
следует поднять дверцы вытяжного шкафа на 1\3 - 1\4 ее подъема. По окончанию работы
необходимо плотно прикрыть дверцы шкафа.
3. В случае перерыва действия вентиляции все работы в вытяжных шкафах, которые
связаны с выделением вредных газов, паров, нужно немедленно прекратить.
4. Не хранить вещества в посуде без этикеток. Не делать никаких опытов в нечистой
посуде. Посуду мыть сразу же после опыта.
5. Не оставлять включенными нагревательные приборы, электроплиты, сушильные
шкафы, термостаты, горящие горелки, открытые газовые и водопроводные краны.
При работе с едкими веществами необходимо соблюдать следующие правила:
1. При смешивании концентрированных серной и азотной кислот пользоваться только
тонкостенной химической или фарфоровой посудой.
2. Во избежание разбрызгивания при разведении концентрированной серной кислоты добавлять кислоту в воду, а не наоборот.
3. При попадании кислот или щелочей на поверхность кожи их необходимо немедленно
смыть сильной струей воды.
6
4. Едкие щелочи дают ожоги всех степеней. Поэтому при работе с едкими щелочами
необходимо применять меры против разбрызгивания и использовать защитную
спецодежду
и
предохранительные
очки.
5. Наполнение пипеток концентрированными кислотами, щелочами путем всасывания
ртом категорически запрещается, для этого нужно пользоваться сифонами или
специальными пипетками с резиновой грушей.
При работе с горючими и легковоспламеняющимися жидкостями (сероуглерод, эфир,
спирт, бензол и т.д.) необходимо соблюдать правила:
1. Не пользоваться открытым пламенем для нагревания;
2. Не держать эти соединения на столах в больших количествах;
3. Переливать вдали от огня, а при переливании больших количеств все нагреватели
(газовые и другие горелки) в помещении потушить;
4. Не выливать эти вещества в раковину;
5. Не нагревать на открытом огне, а только на водяной бане.
6. При работе с масляными банями пользоваться термометром и не превышать
температуру воспламенения горючих веществ.
7. Не наклоняться над сосудом, в котором кипит раствор или в который наливают какуюлибо жидкость (особенно едкую), потому что брызги могут попасть в глаза.
8. Пробирку, в которой нагревается жидкость, держать отверстием в сторону, а не к себе
или к рядом работающему, потому что жидкость в результате нагревания нередко
выбрасывается из пробирки.
9. В случае воспламенения горючих жидкостей:
а)
немедленно
погасить
все
горелки,
отключить
электронагревательные приборы;
б) отставить сосуды с огнеопасными веществами от очага воспламенения;
в) прикрыть пламя мокрым одеялом, а по необходимости засыпать песком;
г) отключить вентиляционные установки;
д) при необходимости использовать углекислотный огнетушитель;
е) срочно сообщить в отделение МЧС (тел. 01) и руководству факультета.
Пра работе с электрическими приборами необходимо соблюдать следующие правила:
1. Перед включением электроприборы должны быть заземлены.
2. Работать с электронагревательными приборами, которые имеют открытую спираль, в
химической лаборатории категорически запрещено.
3. Перед включением прибора необходимо проверить исправность розетки и целостность
шнуров, особенно от электроплит.
4. При работе с приборами, которые генерируют высокое напряжение, необходимо
тщательным образом проверить их заземление, а также не касаться электронесущих узлов.
5. При работе с центрифугами центрифужные пробирки попарно уравновешивать на
центрифужных весах и помещать в гнезда ротора одну напротив другой. При разливе проб
гнезда тщательным образом очистить и высушить.
6. По окончанию работы необходимо выключить все использованные в работе
электроприборы.
Внимание! После изучения данной инструкции в специальном журнале делается
соответствующая отметка, где каждый студент ставит свою подпись.
РАЗДЕЛ 1
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТОВ КЛАССА ТРАНСФЕРАЗ И
НЕКОТОРЫХ ЕГО ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ
7
Трансферазы (от лат. transtero — переношу), класс ферментов, катализирующих
в живых клетках перенос различных групп от одного соединения (донор группы) к
другому (акцептор группы). Трансферазы широко распространены в расти тельных и
животных тканях, а также в микроорганизмах. Играют ведущую роль в промежуточном
обмене веществ, участвуя в превращениях углеводов, аминокислот, нуклеиновых кислот,
липидов и других биологически важных соединений.
Реакции, катализируемые трансферазами, в общем случае выглядят так:
A—X + B ↔ A + B—X.
Молекула A в здесь выступает в качестве донора группы атомов (X), а молекула
B является акцептором группы. Часто в качестве донора в подобных реакциях переноса
выступает один из коферментов. Многие из катализируемых трансферазами реакций
являются обратимыми. Класс трансфераз включает более 450 ферментов, разделённых по
химической природе переносимых групп на подклассы: трансферазы, катализирующие
перенос одноуглеродных групп (метилтрансферазы); трансферазы, переносящие остатки
сахаров (гликозилтрансферазы); трансферазы, переносящие группы, содержащие азот
(например, аминотрансферазы); трансферазы, переносящие фосфатные группы
(фосфотрансферазы), и т.д. Трансферазы. различных подклассов имеют различные
коферменты.
Систематические названия ферментов класса образуются по схеме:
«донор:акцептор + группа + трансфераза».
Или же используются чуть более общие названия, когда в название фермента включается
имя либо донора, либо акцептора группы:
«донор + группа + трансфераза» или «акцептор + группа + трансфераза».
Например, аспартатаминотрансфераза катализирует перенос аминной группы с
молекулы аспарагиновой кислоты, катехол-О-метилтрансфераза осуществляет перенос
метильной группы S-аденозилметионина на бензольное кольцо различных катехоламинов,
а гистон-ацетилтрансфераза переносит ацетильную группу с ацетил-кофермента А на
гистон в процессе активации транскрипции.
Кроме того ферменты 7 подгруппы трансфераз, переносящие остаток фосфорной
кислоты, используя в качестве донора фосфатной группы АТФ, часто называют также
киназами; аминотрансферазы (6 подгруппа) часто называют трансаминазами.
Согласно международной классификации и номенклатуре ферментов
трансферазы относятся ко 2 классу, в пределах которого выделяют девять подклассов:
КФ 2.1 включает ферменты, переносящие одноуглеродные группы;
КФ 2.2 — ферменты, переносящие альдегидные и кетонные группы;
КФ 2.3 — переносящие ацильные остатки (ацилтрансферазы);
КФ 2.4 — переносящие остатки сахаров (гликозилтрансферазы);
КФ 2.5 — переносящие алкильные и арильные группы за исключеним
метильного остатка;

КФ 2.6 — переносящие группы атомов, содержащие азот;

КФ 2.7 — переносящие фосфор-содержащие остатки;





8


КФ 2.8 — переносящие группы, содержащие серу;
КФ 2.9 — переносящие группы, содержащие селен.
Киназы(КФ 2.7) — ферменты, относящиеся к подклассу фосфотрансфераз и
катализирующие реакции переноса фосфорильного остатка (—РО3Н2) от АТФ (реже — от
других нуклеозидтрифосфатов) на различные субстраты. Катализируемые киназами
реакции фосфорилирования играют важную роль в регуляции обмена веществ, в первую
очередь в сохранении, переносе и использовании энергии макроэргических связей АТФ и
других нуклеозидтрифосфатов. Активность некоторых киназ в биологических жидкостях
человека имеет диагностическое значение при ряде патологических состояний.
При участии киназ происходит фосфорилирование низкомолекулярных (глюкозы,
витаминов, креатина и др.) и высокомолекулярных (белков, в т.ч. ферментных белков)
соединений. Фосфорильная группа в киназных реакциях может быть перенесена на
гидроксильную группу (фосфотрансферазы со спиртовой группой в качестве акцептора),
карбоксильную группу (фосфотрансферазы с карбоксильной группой в качестве
акцептора), азотистую группу (фосфотрансферазы с азотистой группой в качестве
акцептора) или фосфатную группу (фосфотрансферазы с фосфатной группой в качестве
акцептора). Катализируемые киназами реакции, связанные с превращением богатой
энергией фосфатной связи АТФ в бедную энергией связь, практически необратимы.
Однако
реакции,
катализируемые
аденилаткиназой,
ацетаткиназой,
нуклеозидмонофосфаткиназой, нуклеозиддифосфаткиназой и некоторыми другими
киназами, одинаково легко протекают справа налево и слева направо. Как правило, для
проявления полной активности киназ необходимы ионы двухвалентных металлов,
образующих металлонуклеотидный комплекс, который и является истинным субстратом
киназ.
В
организме
человека
такими
ионами
являются
ионы
Mg2+.
Киназы представляют собой белки с молекулярной массой от 21000 до 1300000.
Функционально-активные молекулы многих киназ имеют субъединичное строение, ряд
киназ существует в тканях во множественных формах. Субстратная специфичность киназ
варьирует от узкой (у креатинкиназы) до широкой (у нуклеозиддифосфаткиназы).
Важную роль в углеводном обмене человека и животных играет гексокиназа, которая
катализирует первую реакцию гликолиза, лимитирующую его скорость, — реакцию
фосфорилирования гексозы, в первую очередь глюкозы, с образованием гексозо-6фосфата. Интенсивный синтез гексокиназы, повышение ее активности и изменение
изоферментного состава происходят в опухолевой ткани. В сыворотке крови здоровых
людей гексокиназа отсутствует, но появляется в сыворотке крови при опухолевых
заболеваниях, поэтому определение активности гексокиназы в сыворотке крови является
дополнительным тестом при диагностике злокачественных опухолей и оценке
эффективности их лечения. Другим ключевым ферментом углеводного обмена является
фосфофруктокиназа, принимающая участие в регуляции скоростей гликолиза и
гликогенолиза, и пируваткиназа, катализирующая образование АТФ в процессе гликолиза
при превращении фосфоенолпировиноградной кислоты (фосфоенолпирувата) в
пировиноградную (пируват).
Аденилаткиназа (аденилаткиназу, выделенную из мышц, называют миокиназой)
катализирует обратимую реакцию взаимопревращения адениловых нуклеотидов (АТФ +
АМФ → 2АДФ) и тем самым обеспечивает сохранение и использование энергии
аденилатной системы и включение АМФ в качестве активного компонента в систему
обмена энергии. Участвуя в поддержании равновесия между адениловыми нуклеотидами,
аденилаткиназа осуществляет метаболический контроль в клетке, поскольку соотношение
концентраций адениловых нуклеотидов является фактором, регулирующим баланс между
биохимическими системами, образующими и использующими АТФ. Активность
аденилаткиназы в сыворотке крови резко возрастает в первые дни после развития
9
инфаркта миокарда, при ряде других патологических состояний. В мышцах и
цереброспинальной жидкости активность аденилаткиназы значительно снижается при
мышечной дистрофии Дюшенна.
Особую группу киназ составляют протеинкиназы, катализирующие перенос
фосфорильного концевого остатка АТФ на остаток серина или треонина в молекуле
белкового субстрата. Протеинкиназы, зависимые от циклического 3,5-АМФ, кальция,
кальмодулина и фосфолипидов, участвуют в передаче сигналов внутри клеток,
регулируют активность многих ферментов за счет фосфорилирования их молекул и
изменения их каталитической активности. Разнообразные протеинкиназы являются
ключевыми регуляторными ферментами на важнейших путях обмена веществ в
организме, в т.ч. регуляторными ферментами мембранных процессов в различных тканях.
С генетически обусловленной недостаточностью или отсутствием киназ связан ряд
наследственных болезней человека. Так, врожденная недостаточность гексокиназы,
фосфоглицераткиназы или аденилаткиназы в эритроцитах может быть причиной
гемолитической анемии. Одна из наиболее распространенных наследственных
ферментопатий — недостаточность пируваткиназы в эритроцитах у гомозигот —
выражается хронической гемолитической анемией. При наследственно обусловленной
недостаточности галактокиназы в крови в раннем детском возрасте развиваются
галактозурия («галактозный диабет») и катаракта. Дефект фосфофруктокиназы мышц
приводит к миопатии. Наследственная недостаточность киназы фосфорилазы b в печени
вызывает нарушение депонирования гликогена в печени, гепатомегалию и задержку роста
у детей. Генетически обусловленная недостаточность карбамоилфосфатксинтазы
(ключевого фермента синтеза мочевины), относящейся к фосфотрансферазам с
карбоксильной группой в качестве акцептора, может привести к смерти новорожденных
вследствие развития гипераммониемии при кормлении их белковой пищей.
Метод определения активности киназ зависит от конкретной исследуемой реакции и часто
состоит в оценке содержания фосфорилированного или дефосфорилированного продукта
в пробе. Общим для многих киназ методом определения активности является регистрация
количества АДФ или АТФ.
Креатинкиназа (креатинфосфокиназа) катализирует реакцию обратимого переноса
фосфорильной группы с АТФ на креатин с образованием макроэргического соединения
креатин-фосфата, участвует в регуляции динамического соотношения концентраций АТФ:
АДФ в клетках. В мышечной ткани креатинкиназа составляет 10—20% от всех
растворимых саркоплазматических белков. Активность креатинкиназы в сыворотке крови
возрастает при миопатиях, прогрессирующих мышечных дистрофиях, гипотиреозе, после
инфекционных болезней; как правило, при этом изменяется и изоферментный спектр
фермента. Определение активности креатинкиназы служит ценным диагностическим
тестом при инфаркте миокарда. В первые часы и дни заболевания активность фермента в
крови резко возрастает за счет выхода в кровоток так называемой МВ-формы,
содержащейся в сердечной мышце. На основании последовательных измерений
активности креатинкиназы в сыворотке крови можно судить о степени некротического
процесса в миокарде и оценить эффективность проводимой терапии.
В связи с тем, что креатинкиназа является димером, возможно образование трех
различных пар субъединиц: BB (КК-1), МВ (КК-2) и ММ (КК-3). На основании
последовательности нуклеотидов кДНК креатинкиназ была установлена первичная
структура изоферментов ММ и ВВ. Степень гомологии субъединиц составляет 80%.
Высокая степень гомологии изоферментов объясняется практически равным
соотношением в их молекулах ароматических, гидрофобных и кислых аминокислотных
остатков. Наблюдаемые различия в электрофоретической подвижности (она у
10
изофермента ВВ выше, чем у ММ) объясняют большим числом остатков лизина в
молекуле ММ по сравнению с ВВ.
Для определения изоферментов КК было предложено несколько групп методов.
-Энзимэлектрофорез. Большинство авторов отдают предпочтение агарозе в
качестве носителя для разделения изоферментов. Сопряженная система гексокиназа–
глюкозо-б-фосфатдегидрогеназа оказалась пригодной для определения активности любых
АТФ-образующих
ферментов
не
только
спектрофотометрическим,
но
и
флюориметрическим методом.
Подобный прием позволяет определить ферментативную активность в блоках
геля или на полосках ацетатцеллюлозы после электрофореза. АТФ, образующаяся в
реакции,
определяется
в
сочетанной
гексокиназной
(ГК)
и
глюкозо-6фосфатдегидрогеназной реакции. Гексокиназа катализирует фосфорилирование глюкозы
при участии АТФ с образованием глюкозо-6-фосфата, при этом происходит регенерация
АДФ для креатинкиназной реакции. Глюкозо-6-фосфат под действием глюкозо-6-фосфат
дегидрогеназы превращается в 6-фосфоглюконовую кислоту и образуется НАДФН2:
Интенсивность флюоресценции НАДФН2 в длинноволновой области
ультрафиолетового излучения на электрофореграмме определяется активностью
изоферментов КК при условии, что концентрации всех других компонентов в
сопряженной системе обеспечивают оптимальные условия для протекания сопряженных
реакций. Соотношение между изоферментами КК может быть рассчитано после
денситометрии в УФ области. Данный подход позволяет выявить три изофермента: ККММ, КК-МВ, КК-ВВ и атипичные формы КК. При использовании флюоресцентного
сканирования следует считаться с возможностью выявления на электрофореграммах
флюоресцирующих полос с атипичной подвижностью. Эти полосы могут оказаться либо
комплексами альбумина с билирубином, либо флюоресцирующими соединениями у
больных с заболеваниями почек. Митохондриальная КК, постсинтетические варианты
изофермента ММ, а также макро-КК1 и макро-КК2 могут обладать атипичной
подвижностью, что требует осторожности при трактовке данных и диктует необходимость
использования в каждой серии электрофореграмм контрольного материала, содержащего
изоферменты КК в известных соотношениях.
Данный подход, как правило, не используют для экстренных исследований.
Время проведения анализа составляет 1,5–2 ч.
- Ионообменная хроматография. Изоферменты КК можно разделять с помощью
ионообменной хроматографии (размер колонки 0,5х6,0 см) с использованием слабого
анионообменника ДЭАЭ-Сефадекс A-50 и градиентной элюции изоферментов КК
растворами с различной ионной силой. Данный метод является относительно простым,
однако не всегда обеспечивает надежное разделение изоферментов, особенно при высокой
активности изофермента КК-ММ. В настоящее время данный метод определения
изоферментов КК не используется.
- Определение изоферментов креатинкиназы с использованием специфичных
антител.
11
- Иммуноингибирование. Данный метод основан на определении активности
субъединицы B в изоферменте КК-МВ после ингибирования активности обеих
субъединиц М в молекуле КК-ММ и субъединицы М в изоферменте КК-МВ антителами к
М субъединице (анти-М):
Полагают, что остаточная активность КК исследуемого образца обусловлена
субъединицей В изофермента КК-МВ. Измеренная остаточная активность, умноженная на
2, отражает активность КК-МВ. Результат выражается в единицах активности ферментов
(Ед/л, U/l, IU/l).
Основное допущение при использовании данного метода состоит в
предположении о том, что активность КК-ВВ, аденилаткиназы и других форм КК в
исследуемом образце минимальна. Присутствие в исследуемом образце неингибируемых
форм КК может явиться причиной ложноположительных результатов при определении
КК-МВ. Иммуноингибирование положено в основу многих неавтоматизированных и
автоматизированных методов определения КК-МВ.
Клиническое значение определения активности КК и ее изоферментов.
Изменение общей активности КК в крови при острых инфарктах миокарда (ОИМ).
Повышение активности КК в крови при ОИМ наблюдают через 6–8 ч после начала
заболевания и может достигать максимума через 14–48 ч. При обширных инфарктах
активность, в ряде случаев, достигает пиковых значений даже через 60 ч. Эти различия,
скорее всего, обусловлены тем, что некрозу подвергаются отдельные группы клеток в
разное время после возникновения ишемии. При ОИМ активность фермента в
периферической крови может повышаться более чем в 7 раз, при этом между степенью
истощения запасов КК в сердечной мышце и ее активностью в кровеносном русле
существует тесная взаимосвязь. Степень повышения активности КК в крови зависит от
ряда факторов: количества КК, поступившего в кровь, степени истощения запасов
фермента в поврежденном участке сердечной мышцы, скорости выведения фермента из
русла крови. Все эти параметры, в свою очередь, могут меняться.
Была отмечена тесная корреляция между продолжительностью болевого
синдрома при ОИМ, как критерия тяжести заболевания, и высвобождением КК из
сердечной мышцы.
Полагают, что уровень активности КК в крови при ОИМ может служить
критерием прогноза. В частности, было установлено, что больничная летальность среди
больных с повышением КК менее 8-кратного, по сравнению с нормой, составила 7%, а
среди больных с повышением КК более 8-кратного – 18%. В течение 1 года летальность в
этих группах составила, соответственно, 10 и 17% .
При стенокардии, кардиогенном шоке, электроимпульсной терапии, тахикардии,
застойных пороках сердца, коронарной ангиопластике было выявлено повышение общей
активности КК в сыворотке крови либо изофермента КК-МВ. В подобных случаях,
12
особенно при одновременном повышении активности КК-МВ, правомочно думать о
повреждении кардиомиоцитов и выходу из них КК.
Само по себе обнаружение КК-МВ в сыворотке не всегда указывает на
повреждение сердечной мышцы. Активность КК-МВ, превышающая 6% от общей
активности фермента в сыворотке, обнаруживают при воспалительных и дегенеративных
заболеваниях мышц, травмах, алкоголизме, гипотиреозе и у рожениц в раннем
послеродовом периоде. Активность КК в сыворотке возрастает при всех типах мышечной
дистрофии и может превышать референтные значения в 50 и более раз. При
прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшенна активность в сыворотке наиболее
высока в детском возрасте, ее повышение выявляют задолго до клинических проявлений
заболевания. При прогрессировании заболевания активность фермента постепенно
снижается в связи с уменьшением массы мышечной ткани. В сыворотке крови 50–80%
женщин – бессимптомных носителей миодистрофии Дюшенна – выявляют 3–6-кратное
повышение активности КК, хотя у некоторых она может находиться в пределах нормы
при минимальной физической активности. При миастении, рассеянном склерозе,
полиомиелите, паркинсонизме сывороточная активность КК может быть в пределах
нормы. Высокую активность КК обнаруживают у некоторых больных при развитии
злокачественной гипертермии, вызванной ингаляционными анестетиками (чаще
Фторотаном). При мышечных дистрофиях и миопатиях в сыворотке обычно
обнаруживают только изофермент КK-ММ; при высокой общей активности фермента
удается выявить изофермент КК-МВ – обычно не более 6%. При повреждении мышечной
ткани, в частности размозжении мышц, злокачественной гипертермии, тяжелой
мышечной нагрузке, пароксизмальной миоглобинурии, некоторых мышечных
энзимопатиях, вирусных заболеваниях, активность сывороточной КК может значительно
возрастать. Активность КК в сыворотке может повышаться после внутримышечных
инъекций, хирургических вмешательств, при сепсисе, повышенной чувствительности к
некоторым лекарственным препаратам и некоторых эндокринных заболеваниях. Ряд
лекарственных препаратов может приводить к повышению активности КК, иногда
резкому, особенно при передозировке Аминтриптиллина, Амфетамина, барбитуратов,
этилового спирта, Имипрамина.
Активность КК в сыворотке рожениц при неосложненных родах может
повышаться. Источником изофермента КК-ВВ, на долю которого может приходиться до
10% от общей активности фермента, является матка и плацента. Хирургическое
вмешательство в ходе родов может привести к дополнительному повышению активности
КК-ВВ в крови. Небольшие количества КК-ВВ выявляют у больных после проведения
аортокоронарного шунтирования или кардиореанимационных мероприятий, а также у
больных при гипотермии. При опухолях желудочно-кишечного тракта, легкого в
сыворотке крови может происходить повышение активности КК-ВВ. Опухоль простаты,
мочевого пузыря, яичка, почек, грудной железы, яичников, матки, центральной нервной
системы, заболевания крови могут сопровождаться увеличением активности КК-ВВ в
сыворотке. Некоторые авторы предлагали использовать изофермент КК-ВВ в качестве
маркера опухолей.
Активность КК в сыворотке может повышаться у больных с острыми
сосудистыми заболеваниями мозга или при нейрохирургических вмешательствах за счет
изофермента КК-ВВ. После травмы головы активность КК-ВВ в сыворотке обнаруживают
у многих больных данной группы, длительность повышения может коррелировать с
тяжестью повреждения и прогнозом.
13
Повышение активности КК в спинномозговой жидкости обнаруживают у
некоторых больных эпилепсией, с опухолями мозга или инсультом. Обычно уровень
активности не коррелирует с выраженностью изменений в ткани мозга. Активность КК
может увеличиваться в спинномозговой жидкости у больных менингитом. В
спинномозговой жидкости здоровых людей обнаруживают изофермент КК-ВВ. После
травмы черепа активность КК-ВВ в спинномозговой жидкости возрастает. При остро
развившемся инсульте высокая активность КК-ВВ в спинномозговой жидкости может
указывать на неблагоприятный прогноз заболевания.
Нарушение функции щитовидной железы сказывается на активности
сывороточной КК. У 60% больных гипотиреозом активность КК может повышаться более
чем в 5 раз по сравнению с верхней границей референтного интервала, у некоторых
больных может обнаруживаться и более значительное повышение. Активность КК в
сыворотке крови связана с изоферментом КК-ММ, повышение его активности указывает,
скорее, на повреждение сердечной мышцы. При гипертиреозе активность КК в сыворотке
чаще находится на нижней границе референтных значений.
Поскольку печень содержит незначительное количество КК, у больных с
различными заболеваниями печени или циррозом активность КК в сыворотке обычно не
меняется.
Методы определения активности КК. Для определения активности КК были
предложены фотометрические, флюориметрические и энзиматические методы на основе
прямой либо обратной реакции. В настоящее время методом выбора для определения
активности КК являются спектрофотометрические методы, основанные на оптическом
методе Варбурга, включающем ряд сопряженных ферментативных реакций с участием
дополнительных ферментов: гексокиназы (ГК), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6ФДГ), никотинамидаденин-динуклеотидфосфата (НАДФ) – коферментов и кофакторов,
приводящих, в конечном итоге, к образованию в инкубационной среде НАДФН2 в
количестве, эквивалентном образовавшемуся в ходе креатинкиназной реакции АТФ.
Сопряжение этих реакций осуществляется следующим образом:
КК
1. КрФ + АДФ –> Кр + АТФ.
ГК
2. АТФ + глюкоза –> Глюкозо-6-фосфат + АДФ.
Г-6-ФДГ
3. Глюкозо-6-фосфат + НФДФ –> 6-фосфоглюко-нат + НАДФН2.
Были выявлены оптимальные соотношения между компонентами инкубационной среды,
типом и значением рН буферного раствора и установлены концентрации АМФ и
диаденозинлентафосфата, способные надежно ингибировать аденилаткиназную реакцию.
Кроме того, было доказано преимущество N-ацетилцистеина как реактиватора КК по
сравнению с применявшимися ранее глутатионом, цистеином, Β-меркаптоэтанолом (табл.
1). Все это привело к тому, что «оптимизированный» кинетический метод, основанный на
обратной реакции, впервые предложенный I. Oliver (1967) и доработанный G. Szacz и
соавт. в 1976 г., получил всеобщее признание.
Таб. 1.Сравнительная характеристика методов определения активности креатинкиназы
14
Фермент аденилаткиназа (АК), содержащийся в достаточно высокой концентрации во
многих тканях, включая эритроциты, катализирует следующую реакцию:
Аденилаткиназа
2АДФ <–> АТФ + АМФ.
АТФ, образующийся по действием аденилаткиназы, служит субстратом реакции,
катализируемой КК. Это способствует завышению активности КК в образцах сыворотки
больных с высокой активностью АК. Аденилаткиназа может быть ингибирована АМФ
или диаденозинпентафосфатом (дАпФ). АМФ, являясь конкурентным ингибитором АК,
снижает активность АК печени и почек, замедляет активность АК из скелетных мышц и
эритроцитов. Присутствие в инкубационной среде АМФ (5 ммоль/л) и дАпФ (10
мкмоль/л) является обязательным условием корректного определения активности КК при
условии полного ингибирования АК сыворотки крови, источником которой могут
служить эритроциты, мышечная ткань, печень.
При высокой активности АК используют альтернативный вариант метода. Он
включает определение активности АК исследуемого образца без субстрата реакции –
КрФ. Ее величину вычитают из общей активности образца после запуска реакции
субстратом – КрФ. Несмотря на трудоемкость, данный подход гарантирует более
корректное определение активности КК в тех случаях, когда активность АК не
ингибируется полностью добавленными в среду ее ингибиторами.
15
Существенное значение имеет выбор лаг-периода – того временного интервала, в
течение которого скорость реакции после добавления субстрата или сыворотки к
инкубационной среде стабилизируется. Длительность лаг-фазы в оптимизированном
методе составляет около 110 с при 25°С, 90 с при 30°С и 60 с при 37°С. Выбор
несоответствующей температуре длительности лаг-фазы при определении активности КК
может приводить к ошибкам.
Ионы Са2+ способны ингибировать фермент, эти эффекты могут быть ослаблены
увеличением концентрации ЭДТУК и Mg2+ до 2 ммоль/л и 10 ммоль/л, соответственно.
Влияние других эндогенных ингибиторов на активность КК уменьшают путем разведения
исследуемого материала средой инкубации. Соотношение между объемом сыворотки и
объемом среды инкубации в оптимизированном методе определения КК составляет
0,0435. При разведении сыворотки с высокой активностью КК в результате нарушения
данного соотношения может происходить увеличение активности КК до 10%.
Высокой чувствительностью отличаются биолюминесцентные методы,
основанные на люциферин-люциферазной реакции. Люциферин светлячков представляет
собой карбоновую кислоту, которая активируется в ходе реакций, в которых образуется
АТР. При этом он превращается в люцифериладенилат. В присутствии кислорода воздуха
и люциферазы люцифериладенилат расщепляется и испускает свечение, интенсивность
которого регистрируется с помощью люминометра.
Определение активности КК с использованием люциферин-люциферазной
реакции осуществляется следующим образом:
КК
КрФ + АДФ –> креатин + АТФ
АТФ + люциферин+ О2 –>АМФ + оксилюциферин +ФФн + СО2 + свечение.
Интенсивность свечения пропорциональна активности КК.
Лабораторная работа № 1
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КРЕАТИНКИНАЗЫ
Креатинкиназа (АТФ: креатин-N-фосфотрансфераза, КФ 2.7.3.2) – КК –
катализирует обратимую реакцию переноса фосфорильного остатка с АТФ на
гуанидиновую группировку креатина (Кр) с образованием АТФ и креатинфосфата (КрФ):
Креатинкиназа
Креатин + АТФ <–> Креатинфосфат + АДФ.
Реакцию принято называть «прямой», когда субстратами служат креатин и АТФ
(Кр + АТФ –> КрФ + АДФ). Если субстратами являются АДФ и креатинфосфат (КрФ +
АДФ –> Кр + АТФ), реакцию обозначают как «обратная». Оптимальное значение рН для
прямой и обратной реакции составляет, соответственно, 9,0 и 6,7. Равновесие реакции
определяется рН среды: при значении, близком к нейтральному, креатинфосфат обладает
намного более высоким фосфорилирующим потенциалом, чем АТФ, что способствует
протеканию обратной реакции с образованием АТФ из КрФ. Обратная реакция протекает
в 2–6 раз быстрее, чем прямая. Ионы Mg2+ обязательно участвуют в реакции, так как
образуют комплекс АТФ–Mg2+. Оптимальная концентрация Mg2+ имеет узкий интервал,
16
избыток их может ингибировать фермент. Ионы других металлов – Mn, Cа, Zn и Cu –
замедляют ферментативную активность, также, как и соединения, связывающие SH
группы.
Принцип метода. Креатинкиназа катализирует превращение креатинина в
креатинфосфат. Ион фосфата (Рн), освобожденный при гидролизе креатинфосфата,
определяют после депротеинирования как желтый комплекс фосфорно-ванадиевомолибденовой.
Реактивы: 1.Аденозин-5-трифосфорной кислоты динатриевая соль.
2. L-цистеин.
3. Креатин.
4. Магния сульфат 7-водный.
5. Аммоний молибденовокислый 4-водный
6. Натрия сульфат безводный.
7. Натрий сернистокислый пиро (метабисульфит натрия).
8. 1-амино-2-нафтол-4-сульфокислота (эйконоген).
9. Серная кислота, 2,5 моль/л.
10. НСl, 0,1 моль/л.
11. Трис-(оксиметил)-аминометан (трис).
12. Трихлоруксусная кислота.
13. Калия фосфат однозамещенный безводный (КН2РО4) 1Мм.
Приготовление реактивов:1. Инкубационная среда, содержащая 0,02 моль/л
сульфата магния, 0,033 моль/л креатина и 0,0067 моль/л АТФ: 0,4920
г сульфата магния, 0,4326 г креатина и 0,3692 г АТФ растворяют в
70—80 мл трис-буфера (для полного растворения креатина смесь
нагревают в течение 5—10 мин на водяной бане при температуре
40—45 °С). Затем объем основной смеси реактивов доводят трисбуфером
в
мерной
колбе
до
100
мл.
2. L-цистеин, 0,024 моль/л: 2,9 мг растворяют в 1 мл воды. Готовят
раствор перед употреблением. На одну пробу требуется 0,1 мл.
3. Аммоний молибденовокислый 4-водный, 0,02 моль/л: 2,5 г
молибденовокислого аммония растворяют в мерной колбе в 70—80
мл
воды
и
доводят
объем
до
100
мл
водой.
4. Трис-буфер, 0,133 моль/л, рН 9,0: 1,61 г трис растворяют в мерной
колбе вместимостью 100 мл в 50—60 мл воды, устанавливают рН
буфера 0,1 моль/л раствором НСl и доводят водой до метки.
5. Раствор эйконогена: 15,36 г пиросернистокислого натрия, 0,512 г
сернистокислого натрия и 0,128 г эйконогена растворяют в 70—80 мл
воды, взбалтывают, доводят объем водой в мерной колбе до 100 мл и
дважды фильтруют (через 2 ч и через сутки после приготовления).
Раствор следует беречь от яркого света; в случае выпадения осадка
вновь фильтруют. Стабилен в течение 1 месяца при хранении в
холодильнике.
6. Трихлоруксусная кислота, 4,9 моль/л: 80 г ТХУ растворяют в 50—
60 мл воды и объем раствора доводят в мерной колбе до 100 мл.
7. Смесь растворов для проведения кислотного гидролиза
креатинфосфата. Смесь готовят перед употреблением, учитывая, что
на одну пробу расходуют 2 мл. Смесь состоит из 0,25 мл раствора
молибденовокислого аммония, 0,25 мл раствора серной кислоты и 1,5
17
мл
воды
(соотношение
1
:
1
:
6).
8. Калия фосфат однозамещенный безводный (для приготовления
калибровочного раствора): 0,0169 г КН2РО4 растворяют в воде и
объем раствора доводят в мерной колбе до 100 мл.
Источник фермента: гемолизат эритроцитов, сыворотка крови, гомогенат
ткани.
Подготовка проб:
1. Получение сыворотки: кровь в объеме 5 мл центрифугируем при 3000
об/мин в течение 15 мин.
2. Получение гомогенатов ткани: удаленную ткань отмываем от крови
охлажденным до + 4 С 0,9 % раствором NaCl, гомогенизируем при + 4 С с 0,9 %
раствором NaCl (в соотношении 110), содержащим 3 мМ ЭДТА.
3. Получение гемолизата эритроцитов: в центрифужную пробирку с 3,8 %
раствором цитрата натрия вносим кровь в соотношении 10:1, центрифугируем при 3000
об/мин в течение 15 мин. Плазму удаляем, а эритроциты отмываем физиологическим
раствором общепринятым методом. Для исследования используем гемолизат в
разведении 1: 40.
Ход работы. Предварительно все растворы реактивов прогреваем в течение 5
мин при температуре 37 °С.
Опытная проба: в пробирку вносим 1,5 мл инкубационной смеси реактивов, 0,1
мл раствора цистеина и 0,4 мл источника фермента. Содержимое пробирки осторожно
перемешиваем и ставим в термостат при температуре 37 °С на 30 мин. Затем прибавляем
0,2 мл раствора трихлоруксусной кислоты, перемешиваем стеклянной палочкой и
центрифугируем при скорости 3000 об./мин в течение 10 мин.
Холостую пробу ставим так же, как опытную, но источник фермента добавляем
после прибавления раствора трихлоруксусной кислоты.
Из опытной и холостой проб забираем по 1 мл надосадочной жидкости и
переносим в химические пробирки (маркированные соответствующим образом), в
которых содержится по 2 мл смеси растворов для проведения специфического гидролиза
креатинфосфата. Полученную смесь растворов перемешиваем и оставляем при комнатной
температуре на 30 мин (время гидролиза креатинфосфата). После этого в пробы
добавляем с интервалом в 1 минуту по 0,25 мл раствора эйконогена и точно через 15 мин
опытную пробу измеряем против холостой пробы при длине волны 600—700 нм (красный
светофильтр) в кювете с толщиной слоя в 0,5 см.
Содержание Рн в пробе производим по калибровочному графику.
Расчет
А =( К × Vк / V0) ×(V / t)
где
А– активность фермента в мкМ Рн / г ткани (мл сыворотки) / мин;
К – количество фосфора в пробе;
Vк - объем кюветы;
18
V0 – объем вносимой пробы;
V - объем исходного гемолизата эритроцитов или сыворотки, или гомогената 1 г
ткани;
t – время инкубации, мин.
Полученные данные занести в таблицу:
Дата____________________________________
Группы животных
АКТИВНОСТЬ КРЕАТИНКИНАЗЫ, мкМ Рн/г(мл) / мин
печень
почки
сердечная мышца
мозг
кровь
Интактные
С
экспериментальной
патологией
С коррекцией
экспериментальной
патологии
Сделать выводы:
Примечание. Посуда для определения креатинкиназы не должна содержать следы фосфатов.
Повторные внутримышечные инъекции могут вызвать значительное повышение концентрации
креатинкиназы в сыворотке крови. Если активность КК превышает 500 нмоль/(с•л), то время инкубации
сокращают до 15 или 10 мин. Разбавлять сыворотку не рекомендуется, так как активность фермента при
разведении сыворотки изменяется непропорционально.
у-Глутамилтрансфераза. В последние годы в клинической химии подобающее
место заняло определение активности у-глутамилтрансферазы (ГГТ; у-глутамилтранспептидазы, КФ 2.3.2.2).
ГГТ катализирует перенос у-глутамила на аминокислоту или пептид, на другую
молекулу субстрата или воду. ГГТ - белок, состоящий из одной полипептидной цепи с
молекулярной массой 90 кДа. Фермент содержит гидрофильный и гидрофобный
фрагменты. Активный центр расположен на гидрофильном участке полипептидной цепи.
Гидрофобная область - часть цепи, которой фермент прикреплен к мембране. Если
экстракцию фермента из тканей провести с использованием в качестве детергента
желчных кислот или тритона Х-100, ГГТ вместе с гидрофобным участком может быть
переведена в раствор. Если в экстрагирующую смесь включены только протеазы (папаин
или трипсин), гидрофобный фрагмент ГГТ остается на мембране, а в растворе оказывается
гидрофильная часть полипептида ГГТ.
Гидрофильные фрагменты ГГТ, изолированные из печени или почек,
иммунологически сходны, так же как и гидрофобные фрагменты ГГТ, изолированные из
разных органов.
ГГТ занимает важное место в метаболизме аминокислот. Комплекс
биохимических реакций реабсорбции аминокислот из первичной мочи, профильтрованной
через фильтрационный барьер почечных телец, назван глутамиловым циклом. Этот
процесс начинается с действия ГГТ, которая расположена на наружной поверхности
клеточной мембраны и связывает аминокислоту первичной мочи с клеткой эпителия
канальцев при участии естественного субстрата глутатиона, образуя тройной комплекс:
19
аминокислота-ГГТ-глутатион.
Отмечено
ингибирование
реакции
высокими
концентрациями субстратов. Как следствие связывания двух субстратов в активном
центре фермента происходит перенос глутамиловой кислоты от глутатиона к
аминокислоте. В этой фазе цикла аминокислоту переносят в клетку, где происходят
последующие реакции, в которых глутамиловая цикло-трансфераза расщепляет связь
между амино- и глутамиловой кислотой, потребляя молекулу АТФ. Присутствие ГГТ на
мембране клеток других органов (тонкая кишка, хориоидальное сплетение и др.) дает
основание предположить, что и в этих органах фермент принимает участие в транспорте
аминокислот. Роль ГГТ печени полностью не выяснена; предположительно фермент
связывает молекулы веществ, которые необходимо экскретировать.
Биологическая роль фермента связана также с регуляцией уровня глутатиона в
тканях. Именно этим можно объяснить высокий уровень глутатиона в плазме крови и
моче пациентов с генетически детерминированным отсутствием синтеза ГГТ. Регулируя
уровень глутатиона, ГГТ может влиять на синтез белка, что объясняет повышенную
удельную активность фермента в тканях с высокой скоростью метаболизма. Это же может
быть причиной повышенного уровня фермента в тканях и крови новорожденных.
ГГТ содержится в основном в мембране клеток, обладающих высокой
секреторной или адсорбционной способностью: эпителиальных клетках, выстилающих
желчные пути, печеночных канальцах, проксимальных канальцах нефрона,
панкреатической экзокринной ткани и выводных протоках, ворсинчатых клетках тонкой
кишки. В порядке снижения удельной активности ГГТ ткани располагаются в следующей
последовательности: почки, печень, поджелудочная железа, Щеточная кайма клеток
тонкой кишки. Активность ГГТ не обнаружена в скелетных мышцах и миокарде.
Наиболее частая причина повышения активности ГГТ в сыворотке крови патология печени. Слабое токсическое воздействие на печень, вызывающее жировую
инфильтрацию, прием алкоголя и лекарственных препаратов сопровождаются умеренным
увеличением активности ГГТ. Более выраженное повышение активности фермента
связано с внепеченочной и внутрипеченочной обструкцией, вторичным вовлечением
печени в онкологические процессы организма путем метастазирования. Самая высокая
активность ГГТ в сыворотке крови отмечена при закупорке желчного протока или
злокачественных опухолях, прямо или опосредованно поражающих печень.
При отсутствии желтухи определение ГГТ - чувствительный тест для выявления
патологии печени; клиническая чувствительность выше, чем у таких ферментов, как ЩФ
и 5-нуклеотидаза. При онкологических заболеваниях нормальная активность ГГТ в
сыворотке крови свидетельствует об отсутствии метастазов в печени, тогда как высокая
активность ГГТ (в 12 раз и более выше нормы) служит индикатором поражения печени
метастазами. При остром вирусном гепатите многократное исследование активности ГГТ
позволяет следить за течением болезни: постоянно увеличенная активность ГГТ указывает
на развитие хронической формы заболевания. При увеличении активности ЩФ и
трудностях определения ее изоферментов полезно определять активность ГГТ для
идентификации возможного источника гиперферментемии: активность ГГТ остается в
пределах нормы, если увеличение активности ЩФ вызвано костным изоферментом, и
увеличена, когда фермент образуется в печени. В педиатрии определение активности ГГТ
предпочтительнее, чем определение ЩФ, так как активность ГГТ не меняется с возрастом
и полученные результаты легче интерпретировать.
Высокая активность ГГТ присутствует в крови людей, злоупотребляющих
алкоголем. У 74% алкоголиков, страдающих гистологически подтвержденным
20
поражением печени, увеличение активности ГГТ было постоянным даже в периоды
абстиненции. Существуют определенные различия между активностью ГГТ в крови
алкоголика и человека, принявшего значительную дозу алкоголя. У первых наступает
увеличение активности ГГТ до 140% от нормальных значений с пиком активности через
18 ч, у вторых даже после тяжелого опьянения увеличение активности ГГТ не превышает
15% в течение 12 ч.
Развитие инфаркта миокарда сопровождается изменениями активности
ферментов сыворотки крови (КК, ЛДГ, ACT) и ГГТ, активность которой после приступа
стенокардии остается повышенной в течение длительного времени. Повышение
активности ГГТ отмечено у 50% больных стенокардией и у части пациентов с другими
заболеваниями (коронарная недостаточность, недостаточность кровообращения). При
инфаркте миокарда остаются неясными механизмы увеличения активности ГГТ,
поскольку она отсутствует в сердечной мышце.
Активность ГГТ в моче выше, чем в сыворотке крови. Присутствующая в моче
ГГТ имеет почечное происхождение: фермент выделяется в мочу из разрушенных клеток
проксимальных отделов канальцев, которые содержат ГГТ в высокой концентрации.
ГГТП располагается в основном на мембранах клеток, обладающих высокой
секреторной активностью — эпителиальных клеток, выстилающих желчные пути,
печеночные канальца, проксимальные канальца нефрона, панкреатическая экзокринная
ткань, выводные протоки, ворсинчатые клетки тонкой кишки. В порядке снижения
активности ГГТП ткани располагаются почки, печень, поджелудочная железа, щеточная
кайма клеток тонкой кишки. Предполагают, что в печени ГГТП связывает молекулы
веществ, которые необходимо экскретировать.
Повышение активности ГГТП сопровождает все заболевания печени. Наиболее
часто увеличение активности ГГТП при заболеваниях печени и желчевыводящих путей
считают результатом нарушения оттока желчи и повышения содержания ГГТП в
гепатоцитах. Регургитация желчи, поступление ее в кровоток, с одной стороны,
освобождает ГГТП из мембран эпителия, выстилающего желчные пути, с другой —
повышает активность фермента в крови.
Увеличение активности ГГТП всегда сопровождается внутри- и внепеченочной
обтурацией желчных протоков, а также вторичным вовлечением печени в онкологические
процессы организма путем метастазирования.
Желтуха всегда сопровождается увеличением активности ГГТП. Высокая
активность фермента связана с нарушением проходимости желчных протоков, менее
высокая соответствует острому гепатоцеллюлярному поражению. При остром вирусном
гепатите многократное исследование активности ГГТП позволяет следить за течением
болезни, постоянное повышение активности ГГТП свидетельствует о развитии
хронической формы заболевания.
Лабораторная работа № 2
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ γ-ГЛУТАМИЛТРАНСПЕПТИДАЗЫ (ГГТП)
21
ГГТП катализирует перенос γ-глутамила с глутатиона на аминокислоту или
пептид. Фермент занимает важное место в метаболизме аминокислот. В почках фермент
играет главную роль в реабсорбции аминокислот из первичной мочи.
Принцип метода. γ-глутамилтрансфераза (ГГТ, γ-ГТФ) переносит глутамиловый
остаток с γ-L-(+)глутамил-4-нитроанилина на дипептидный акцептор, которым является
глицилглицин, служащий одновременно и буфером. Концентрацию освобожденного 4нитроанилина измеряют фотометрически, после остановки ферментативной реакции
подкислением.
Реактивы: 1. L-γ-глутамил-n-нитроанилид.
2. Натрия хлорид.
3. Глицилглицин, 0,55 моль/л, рН 8,3.
5. Уксусная кислота ледяная.
6. n-нитроанилин.
Приготовление реактивов:1. Глицилглицин, 0,55 моль/л, рН 8,3: 3,63 г
глицилглицина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл,
доливают до метки водой и растворяют (буферный раствор).
2. Субстратно-буферный раствор: в пробирку наливают 10 мл воды,
добавляют 0,028 г L-γ-глутамил-n-нитроанилида и 0,082 г хлорида
натрия и, не переставая мешать, растворяют содержимое пробирки на
кипящей водяной бане в течение 60 сек. Затем раствор охлаждают до
температуры 37 °С и добавляют 2,5 мл буферного раствора.
Приготовленный раствор субстрата во время работы хранят в
водяной бане при 37 °С. Неиспользованный раствор субстрата можно
хранить в холодильнике в течение недели. Субстрат плохо
растворим, и при комнатной температуре выпадает в осадок.
Поэтому перед употреблением выкристаллизовавшийся субстрат
растворяют нагреванием в кипящей водяной бане. Нагревание и
растворение субстрата можно повторить не более 2 раз.
3. Уксусная кислота ледяная, раствор 100 г/л: 10 мл кислоты доводят
водой до 100 мл.
4. Основной калибровочный раствор n-нитроанилина: 0,0829 г nнитроанилина помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл,
доводят до метки водой и растворяют.
Для определения активности γ-ГТФ можно пользоваться набором
реактивов “Лахема”.
Источник фермента:
гемолизат эритроцитов, сыворотка крови, гомогенат
ткани.
Подготовка проб: Смотри лабораторную работу № 1
22
Ход работы. Опытная проба: в пробирку вносим 0,5 мл раствора субстрата и
помещаем в водяную баню при температуре 37 °С, приливаем 0,05 мл источника
фермента; содержимое перемешиваем и инкубируем точно 15 мин при температуре 37 °С.
Затем прибавляем 3 мл раствора уксусной кислоты и перемешиваем.
Холостую пробу ставим так же, как опытную, но источник фермента добавляем
после инкубации. Измеряем на спектрофотометре при длине волны 410 нм или на ФЭК
при длине волны 400—500 нм (фиолетовый или синий светофильтр) в кювете с толщиной
слоя в 1 см против холостой пробы. Окраска стабильна в течение нескольких часов.
Содержание n-нитроанилина производим по калибровочной кривой.
Расчет
А =( К × Vк / V0) ×(V / t)
где
А– активность фермента в мкМ / г ткани (мл сыворотки) / мин;
К – количество n-нитроанилина в пробе;
Vк - объем кюветы;
V0 – объем вносимой пробы;
V - объем исходного гемолизата эритроцитов или сыворотки, или гомогената 1 г
ткани;
t – время инкубации, мин.
Полученные данные занести в таблицу:
Дата____________________________________
Группы животных
АКТИВНОСТЬ ГГТП, мкМ / г ткани (мл сыворотки) / мин
печень
почки
сердечная мышца
мозг
кровь
Интактные
С
экспериментальной
патологией
С коррекцией
экспериментальной
патологии
Сделать выводы:
Аминокислоты, не использованные для синтеза белков и других производных, не
накапливаются в организме в больших количествах. Они подвергаются различным
ферментативным превращениям и, в конечном счете, распаду. Важную роль в азотистом
обмене играют процессы перехода одних аминокислот на другие, в результате
ферментативных реакций переаминирования. При этом происходит обратимый перенос
NH2 – группы от L – аминокислоты на L – кетокислоту без промежуточного образования
23
аммиака. Таким образом, в реакции переаминирования участвуют L – аминокислота как
донор и L – кетокислота как акцептор аминогруппы. Эти реакции катализируются
особыми ферментами трансаминазами (КФ 2.6). Коферментом трансаминаз является
пиридоксаль – 5‫–׳‬фосфат, который и является промежуточным переносчиком
аминогруппы от аминокислоты на кетокислоту.
Аминотрансферазы (КФ 2.6.1) —
аминогруппы с аминокислот на кетокислоты.
ферменты,
катализирующие
перенос
Наибольшее диагностическое значение имеет определение активности в
сыворотке крови аспартат- и аланин-аминотрансферазы (АсАТ ,АлАТ). Содержание АсАТ
(КФ 2.6.1.1) и АлАТ (КФ 2.6.1.2) в тканях и органах человека различно: АсАТ и АлАТ в
наибольшем количестве содержатся в печени, сердечной мышце и скелетной мускулатуре;
содержание АлАТ в печени значительно выше, чем в сердечной мышце.
Определение
активности АсАТ и АлАТ в сыворотке крови имеет важное
диагностическое значение при поражениях сердца, печени, скелетной мускулатуры.
Повышение активности аспартат- и аланин-аминотрансферазы в сыворотке крови
при инфаркте миокарда наступает через 4-6 часов, максимального уровня активность
достигает через 24-28 часов и на 4—7 день активность фермента снижается до
нормального уровня. Определение активности аспартат-аминотрансферазы в сыворотке
крови имеет большое значение для постановки раннего диагноза инфаркта миокарда.
Острый гепатит, как правило, сопровождается значительным повышением
активности АлАТ и АсАТ. При этом активность АлАТ повышается в большей степени,
чем активность АсАТ: поэтому отношение активности АсАТ / АлАТ значительно ниже 1.
Повышение активности ферментов в крови наступает уже в безжелтушном
периоде, что позволяет применять этот тест для профилактического обследования и
обследования доноров. При хроническом гепатите, вне периода обострения, значения
активности аминотрансфераз в сыворотке крови нормальные или слегка повышены.
Указанные тесты при хроническом гепатите являются важным средством наблюдения за
течением болезни н контроля лечения.
Лабораторная работа № 3
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АСПАРТАТ-АМИНОТРАНСФЕРАЗЫ И
АЛАНИН-АМИНОТРАНСФСРАЗЫ
Принцип метода. Аспартат-аминотрансфераза катализирует обратимый перенос
аминогрупп с L-аспарагиновой кислоты на α-κетоглутаровую кислоту. Аланинаминотрансфераза катализирует обратимый перенос аминогрупп с L-аланина на ακетоглутаровую кислоту.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АСТ
1. Основная реакция:
АСТ
L-аспартат + α-κетоглутарат <=> щавелевоуксусная кислота + L-глутамат .
2. Индикаторная реакция:
МДГ
Щавелевоуксусная кислота + NADH +Н+ <=> L-малат + NAD.
24
Активность фермента определяется на основе различия спектров поглощения
восстановленной и окисленной формы NAD при длине волны 340 нм.
Реактивы:
1.
Калия
фосфат
однозамещенный
(КН2РО4).
2.
Калия
фосфат
двузамещенный
(К2НРО4×3Н2О).
3. L-аспарагиновая кислота или L-аспарагиновой кислоты
натриевая соль.
4.
β-никотинамидадениндинуклеотид
восстановленный,
динатриевая соль.
5. α-κетоглутаровая кислота.
6. Малатдегидрогеназа из сердца свиньи (L-малат: NAD+
оксидоредуктаза). Суспензия в 50%-ном растворе глицерина.
Специфическая
каталитическая
активность
выше
17
ммоль/(с∙л). Примеси: АсАТ < 0,01%, ГлДГ < 0,003%, ЛДГ <
0,01%.
7. Лактатдегидрогеназа из скелетной мышцы кролика или
свиньи. Суспензия в 50%-ном растворе глицерина.
Специфическая каталитическая активность выше 8 ммоль/(с•л).
Примеси: АсАТ < 0,01%, ГлДГ < 0,003%, АлАТ < 0,01%.
8.
Натр
едкий,
5
моль/л;
1
моль/л.
9. Натрия хлорид, 154 ммоль/л (физиологический раствор).
Приготовление реактивов:
1. Фосфатный буфер 0,1 моль/л, рН 7,4: 0,16 г
однозамещенного фосфата калия и 2,07 г двузамещенного
фосфата калия трехводного растворяют в 40—160 мл воды,
проверяют рН и доводят водой в мерной колбе до 100 мл.
Стабилен
при
хранении
в
холодильнике.
2. Субстратно-буферный раствор 0,25 моль/л L-аспарагиновой
кислоты в 0,1 моль/л фосфатном буфере рН 7,4: 3,30 г Lаспарагиновой кислоты (или 3,9 г натриевой соли Lаспарагиновой кислоты) растворяют в 40—50 мл 0,1 моль/л
фосфатного буфера, проверяют рН и доводят фосфатным
буфером в мерной колбе до 100 мл. Если применяют Lacпaрагиновую кислоту, то к навеске перед растворением в
фосфатном буфере для установления рН 7,4 добавляют
примерно 20—26 мл 1 моль/л раствора едкого натра и затем
проверяют рН. Стабилен при хранении в холодильнике в
течение
месяца.
3.
β-никотинамидадениндинуклеотид
восстановленный,
динатриевая соль, 15 ммоль/л: 16 мг НАДH · Na2 · 4H2O
растворяют в 1,5 мл воды. Раствор стабилен в течение 2 недель
при хранении в темной посуде в холодильнике. Коэффициент
молярного поглощения не ниже 5,6 · 102 м2 ∙ моль–1 при 340 нм.
7. α-κетоглутаровая кислота, 0,45 моль/л: 0,2 г α-кетоглутаровой
кислоты растворяют в 2,5 мл воды и добавляют 0,5 мл 5 моль/л
раствора едкого натра. Если используют динатриевую соль αкетоглутаровой кислоты, то 0,26 г соли растворяют в 3 мл воды,
раствор стабилен в течение 2 недель при хранении в
холодильнике. α-кетоглутаровая кислота не должна содержать
примесей
пирувата
и
малата.
4. Малатдегидрогеназа из сердца свиньи (L-малат: NAD+
25
оксидоредуктаза). Для приготовления рабочего раствора к 20
мкл
суспензии
добавляют
5
мл
воды.
5. Лактатдегидрогеназа из скелетной мышцы кролика или
свиньи. Для приготовления рабочего раствора к 40 мкл
суспензии добавляют 5 мл воды. Стабилен в течение 3 месяцев
при хранении в холодильнике в хорошо укупоренной посуде.
Примечание. Для определения активности АсАТ и АлАТ по оптическому тесту используют
отечественные реактивы или импортные, например, можно использовать реактивы фирмы “Reanal”. Все
реактивы готовят на бидистиллированной воде, хранят при температуре от 0 до +4 °С. Уменьшение
стабильности может наступить за счет роста микроорганизмов. Поэтому в растворы рекомендуется
добавлять
несколько
капель
хлороформа.
Источник фермента: гемолизат эритроцитов, сыворотка крови, гомогенат
ткани.
Подготовка проб: Смотри лабораторную работу № 1
Ход работы. Перед работой можно готовить смесь реактивов, состоящую из
субстратно-буферного раствора, раствора НАДН, МДГ и ЛДГ в соотношении 60 : 1 : 1 : 1.
Определение
проводим
по
следующей
схеме.
Опытная проба: в пробирку вносим 0,5 мл источника фермента. Затем добавляем смесь
реактивов – 3,5 мл. Перемешиваем, инкубируем 10-15 мин при 30С или 37 С . После
инкубации
в
пробирку
вносим
0,1
мл
α-кетоглутаровой
кислоты.
Перемешиваем и через 60 сек. (лаг-фаза) измеряем экстинкцию и одновременно включаем
секундомер. Точно через 1, 2, 3 мин (или через более короткие, но равные промежутки
времени) измеряем экстинкцию.
Холостая проба – вместо источника фермента добавляем физ.раствор.
Расчет. Из 4-х измерений оптической плотности для опытной пробы
рассчитывают изменение ее за 1 мин (ΔΕ/Δt)оп и (ΔΕ/Δt)хол, вычитая из каждого
последующего значения оптической плотности предыдущее (результаты получаются со
знаком «минус»). Из трех значений изменения оптической плотности для каждой опытной
пробы
рассчитывают
среднюю
арифметическую
(ΔΕср/Δt)оп
и
(ΔΕср/Δt)хол
Коррегируем величину Е опытной пробы:
(ΔΕср/Δt)оп – (ΔΕср/Δt)хол = (ΔΕ/Δt)скор.
Скорректированную величину опытной пробы используем в дальнейших расчетах.
Активность, моль/(с∙м3) = нмоль/(с∙л) · 106 = Vр.с / ε · 1∙V · (ΔΕ / Δt)скор,
где Vр.с — объем реакционной смеси, мл;
V — объем источника фермента, (мг)мл;
t — время реакции, сек.;
ΔΕ / Δt — изменение экстинкции за 1 сек.;
ε — κоэффициент молярной экстинкции НАДН в м2 · моль–1;
1 — толщина слоя жидкости в кювете в метрах (1∙102).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АЛТ
26
1. Основная реакция:
АЛТ
L-ланин + α-κетоглутарат <=> пируват + L-глутамат .
2. Индикаторная реакция:
ЛДГ
Пируват + NADH +Н+ <=> L-лактат + NAD.
Активность фермента определяется на основе различия спектров поглощения
восстановленной и окисленной формы NAD при длине волны 340 нм.
Реактивы:
1.
Калия
фосфат
однозамещенный
(КН2РО4).
2.
Калия
фосфат
двузамещенный
(К2НРО4×3Н2О).
3.L-aльфа-аланин.
4. β-никотинамидадениндинуклеотид восстановленный, динатриевая
соль,
5. Натр едкий, 5 моль/л.
6. α-Κетоглутаровая кислота.
7. Лактатдегидрогеназа из скелетной мышцы кролика или свиньи,
суспензия в 50% растворе глицерина. Специфическая каталитическая
активность выше 8 ммоль/(с•л). Примеси: АсАТ < 0,01%, ГлДГ <
0,003%, АлАТ < 0,01%.
8. Натрия хлорид, 154 ммоль/л (физиологический раствор).
Приготовление реактивов:
1. Фосфатный буфер 0,1 моль/л, рН 7,4: 0,16 г однозамещенного
фосфата калия и 2,07 г двузамещенного фосфата калия трехводного
растворяют в 40—160 мл воды, проверяют рН и доводят водой в
мерной колбе до 100 мл. Стабилен при хранении в холодильнике.
2. Субстратно-буферный раствор 0,63 моль/л L-аланина в 0,1 моль/л
фосфатном буфере рН 7,4: 5,62 г L-аланина растворяют в 80 мл 0,1
моль/л фосфатного буфера, проверяют рН и доводят фосфатным
буфером в мерной колбе до 100 мл. Стабилен при хранении в
холодильнике
в
течение
месяца.
3. β-никотинамидадениндинуклеотид восстановленный, динатриевая
соль, 15 ммоль/л: 16 мг НАДH · Na2 · 4H2O растворяют в 1,5 мл воды.
Раствор стабилен в течение 2 недель при хранении в темной посуде в
холодильнике. Коэффициент молярного поглощения не ниже 5,6 · 10 2
м2 ∙ моль–1 при 340 нм.
7. α-κетоглутаровая кислота, 0,56 моль/л: 0,245 г α-кетоглутаровой
кислоты растворяют в 2,5 мл воды и добавляют 0,5 мл 5 моль/л
раствора едкого натра. Если используют динатриевую соль αкетоглутаровой кислоты, то 0,318 г соли растворяют в 3 мл воды.
4. Лактатдегидрогеназа из скелетной мышцы кролика или свиньи. Для
приготовления рабочего раствора к 40 мкл суспензии добавляют 5 мл
воды. Стабилен в течение 3 месяцев при хранении в холодильнике в
хорошо
укупоренной
посуде
Источник фермента: гемолизат эритроцитов, сыворотка крови, гомогенат
ткани.
27
Подготовка проб: Смотри лабораторную работу № 1
Ход работы. Перед работой можно готовить смесь реактивов, состоящую из
субстратно-буферного раствора, раствора НАДН и ЛДГ в соотношении 60 : 1 : 1.
Определение проводят по следующей схеме.
Опытная проба: в пробирку вносим 0,5 мл источника фермента. Затем добавляем
смесь реактивов – 3,5 мл. Перемешиваем, инкубируем 10-15 мин при 30С или 37 С .
После инкубации в пробирку вносим 0,15 мл α-кетоглутаровой кислоты.
Перемешиваем, через 60 сек. (лаг-фаза) измеряем экстинкцию и одновременно включаем
секундомер. Точно через 1, 2, 3 мин (или через более короткие, но равные промежутки
времени) измеряем экстинкцию.
Холостая проба – вместо биологического материала добавляем раствор хлорида
натрия.
Расчет. Из 4-х измерений оптической плотности для опытной пробы
рассчитывают изменение ее за 1 мин (ΔΕ/Δt)оп и (ΔΕ/Δt)хол, вычитая из каждого
последующего значения оптической плотности предыдущее (результаты получаются со
знаком «минус»). Из трех значений изменения оптической плотности для каждой опытной
пробы
рассчитывают
среднюю
арифметическую
(ΔΕср/Δt)оп
и
(ΔΕср/Δt)хол
Коррегируем величину Е опытной пробы:
(ΔΕср/Δt)оп – (ΔΕср/Δt)хол = (ΔΕ/Δt)скор.
Скорректированную величину опытной пробы используем в дальнейших расчетах.
Активность, моль/(с∙м3) = нмоль/(с∙л) · 106 = Vр.с / ε · 1∙V · (ΔΕ / Δt)скор,
где Vр.с — объем реакционной смеси, мл;
V — объем источника фермента, (г)мл;
t — время реакции, сек.;
ΔΕ / Δt — изменение экстинкции за 1 сек.;
ε — κоэффициент молярной экстинкции НАДН в м2 · моль–1;
1 — толщина слоя жидкости в кювете в метрах (1∙102).
Полученные данные занести в таблицу:
Дата____________________________________
Группы животных
АЛТ, моль/(с∙м3)
2
3
4
АСТ, моль/(с∙м3)
2
3
4
1
5
1
Интактные
С
экспериментальной
патологией
С коррекцией
экспериментальной
патологии
Примечание: 1 – печень; 2 – почки; 3 – сердечная мышца; 4 – мозг; 5 – кровь.
Сделать выводы:
28
5
Лабораторная работа № 4
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АСПАРТАТ-АМИНОТРАНСФЕРАЗЫ И
АЛАНИН-АМИНОТРАНСФСРАЗЫ ДИНИТРОФЕНИЛГИДРАЗИНОВЫМ
МЕТОДОМ (ПО РАЙТМАНУ, ФРЕНКЕЛЮ)
Принцип. В результате переаминирования, происходящего под действием
аспартатаминотрансферазы (АСТ) и
аланинаминотрансферазы (АЛТ) образуется
щавелевоуксусная и пировиноградная кислоты. Щавелевоуксусная кислота способна в
процессе ферментативной реакции превращаться в пировиноградную кислоту. При
добавлении 2,4-динитрофенилгидразина в щелочной среде образуется окрашенный
гидразон пировиноградной кислоты, интенсивность окраски которого пропорциональна
количеству образовавшейся пировиноградной кислоты.
Реактивы: 1. DL- аспарагиновая кислота.
2. DL- аланина
3. α-Кетоглутаровая кислота
4.NaОН 1н, 0,4 н.
5. Двузамещенный фосфорнокислый натрий (Na2НРО4 × 2Н2О).
6.Однозамещенный фосфорнокислый калий (КН2РО4).
7. 2,4-динитрофенилгидразин (2,4-ДНФГ).
8. HCl.
9. Пировинограднокислый натрий (CH3COCOONa).
Приготовление реактивов:
1. Раствор субстрата для определения АСТ рН = 7,4. В мерную колбу
на 100 мл вносим DL- аспарагиновой кислоты - 2,66 г; αкетоглутаровой кислоты – 29,2 мг. После растворения в небольшом
объеме дистиллированной воды, добавляем 1н раствор едкого натра –
21 мл; двузамещенного фосфорнокислого натрия (Na2НРО4 × 2Н2О) –
1,2 г; однозамещенного фосфорнокислого калия (КН2РО4) – 0,2 г.
Содержимое колбы доливаем дистиллированной водой до 2/3 ее
объма. Проверяем рН. Доводим рН до 7,4, добавляя по каплям 1н
NaОН. З атем объем колбы доводим дистиллированной водой до
метки.
2. Раствор субстрата для определения АЛТ рН = 7,4. В мерную колбу
на 100 мл вносим DL- аланина – 1,78 г; α-кетоглутаровой кислоты –
29,2 мг. После растворения в небольшом объеме дистиллированной
воды, добавляем 1н раствор едкого натра – 1 мл; двузамещенного
фосфорнокислого натрия (Na2НРО4 × 2Н2О) – 1,2 г;
однозамещенного фосфорнокислого калия (КН2РО4) – 0,2 г.
29
Содержимое колбы доливаем дистиллированной водой до 2/3 ее
объма. Проверяем рН. Доводим рН до 7,4, добавляя по каплям 1н
NaОН. З атем объем колбы доводим дистиллированной водой до
метки.
Приготовленные субстратные растворы для АСТ и АЛТ разливаем по
5-10 мл в небольшие флаконы и сохраняем в замороженном виде в
морозильной
камере
холодильника.
Перед
употреблением
замороженный раствор должен полностью оттаять.
Примечание. Если вместо DL- аспарагиновой кислоты берется L- аспарагиновая
кислота, а вместо DL- аланина - L- аланин, то навеска уменьшается вдвое.
3. Раствор 2,4-динитрофенилгидразин (2,4-ДНФГ). 19,8 мг 2,4динитрофенилгидразина растворяем в 8,5 мл концентрированной
соляной кислоты при нагревании на кипящей водяной бане под
вытяжной системой. После остывания раствора его количественно
переносят в мерную колбу на 100 мл и доводим объем
дистиллированной водой до метки. Готов к использованию на второй
день после приготовления. Хранить раствор в посуде из темного
стекла в холодильнике.
4. 0,4 р раствор едкого натра. 16 г едкого натра помещаем в
химический стакан и растворяем в небольшом количестве
дистиллированной воды. После остывания раствора его
количественно переносим в мерную колбу на 1 л и доводим объем
водой до метки.
5.
Стандартный
раствор
пировинограднокислого
натрия
(CH3COCOONa). 11 мг кристаллического пирувата натрия помещаем
в мерную колбу на 100 мл, растворяем в небольшом количестве
дистиллированной воды, а затем доводим объем раствора до метки
водой. 1 мл раствора содержит 110 мкг пирувата натрия, что
соответствует 88 мкг пировиноградной кислоты. Раствор используем
для построения калибровочного графика
Источник фермента: сыворотка крови, гомогенат ткани.
Подготовка проб: Смотри лабораторную работу № 1
Ход работы. В пробирки наливаем 0,5 мл субстрата (L – аспартат (L - аланин) 0,1
моль/л, L – кетоглутарат 2 ммоль/л, фосфатный буфер 0,1 моль/л) и 0,1 мл источника
фермента. Параллельно ставим контрольные пробы, в которые не добавляем источник
фермента. Пробы тщательно перемешиваем и инкубируем в течение 1 часа – АСТ и 30
минут – АЛТ при 37ْС на водяной бане. После этого к опытным и контрольным пробам
приливаем по 0,5 мл раствора 2,4 – ДНФГ. В пробирки с контролем только после
добавления 2,4 – ДНФГ приливаем 0,1 мл источник фермента. Через 20 минут (20-25 оС) в
пробирки приливаем по 5 мл 0,4 н раствора NaOH, хорошо перемешиваем и через 5-10
минут фотометрируем против холостой пробы в интервале длин волн 500-560 нм (opt
537нм) в кюветах толщиной 1см.
Содержание пировиноградной кислоты производим по калибровочной кривой.
30
Расчет
А =( К × Vк / V0) ×(V / t)
где
А– активность фермента в мкМ / г ткани (мл сыворотки) / мин;
К – количество пировиноградной кислоты в пробе;
Vк - объем кюветы;
V0 – объем вносимой пробы;
V - объем исходного гемолизата эритроцитов или сыворотки, или гомогената 1 г
ткани;
t – время инкубации, мин.
. Полученные данные занести в таблицу:
Дата____________________________________
Группы животных
АЛТ, мкМ / г ткани (мл
сыворотки) / мин
1
2
3
4
5
АСТ, мкМ / г ткани (мл
сыворотки) / мин
1
2
3
4
5
Интактные
С
экспериментальной
патологией
С коррекцией
экспериментальной
патологии
Примечание: 1 – печень; 2 – почки; 3 – сердечная мышца; 4 – мозг; 5 – кровь.
Сделать выводы:
Еще одним важным представителем
глутатионтрансфераза (КФ 2.5.1.18).
класса
трансаминаз
является
Глутатионтрансферазы относятся к семейству мультифункциональных белков,
которые используют ГSH для метаболизма гидрофобных веществ. Гомо- или
гетеродимеры, с молекулярной массой 43–57 кДа, каждая субъединица имеет свой
независимый активный центр, который в свою очередь содержит два субцентра G и H.
Первый взаимодействует с глутатионом (содержит SH-группу, гистидин и аргинин); H
субцентр
связывает
гидрофобный
субстрат,
в
нем
содержится
глицин.
Различают глутатионтрансферазы, которые взаимодействуют с катионами (в печени,
кишечнике, почках) и анионами (головной мозг, селезенка, легкие, плацента, эритроциты).
В зависимости от субстратной специфичности также различают глутатионтрансферазу,
которая взаимодействует с эпоксидами, алкенами, алкилами, алканами, арилами,
энтеротоксинами. Максимальная концентрация глутатионтрансферазы найдена в печени
при оптимуме рН=7,5. В основном глутатионтрансферазы локализованы в цитозоле и
эндоплазматическом ретикуллуме, но встречается в ядрах и митохондриях.
Эта группа ферментов осуществляет детоксикацию разных ксенобиотиков или их
микросомальных метаболитов путем трансформации, а также детоксикацию пероксидов.
31
Глутатионтрансферазы играют важную роль в эндогенном метаболизме: они связывают и
транспортируют лейкотриен С4, желчные кислоты, билирубин, защищают организм от
окислительного стресса путем восстановления гидропероксидов жирных кислот и
нуклеотидов. Глутатионтрансферазы принимают участие в образовании и метаболизме
гормонов
(лейкотриенов,
простагландинов,
эстрогенов).
Глутатионтрансфераза имеет 11 изоформ и осуществляет 4 основных типа реакций:
1) Присоединение к субстрату полной молекулы глутатиона:
R + ГSH = HRSГ
2) нуклеофильное замещение:
RX + ГSH = HX + SГ
3) восстановление органических пероксидов (гидропероксидов жирных кислот, кумена) до
соответствующих спиртов:
2ГSH + ROOH = ROH + ГS-SГ + H2O
Эту
активность
глутатионтрансферазы
рассматривают
как
неселеновую
глутатионпероксидазу
4)
изомеризация
(стероидов,
простагландинов)
В реакциях первого и второго типа образуются тиоэфиры (конъюгаты), а глутатион
теряется. В реакциях третьего типа образуется ГS-SГ (окисленный глутатион), который
восстанавливается глутатионредуктазой. В реакциях четвертого типу ГSH не используется
и работает как кофермент.
Лабораторная работа № 5
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ГЛУТАТИОНТРАНСФЕРАЗЫ
Принцип метода основан на определении накопления конъюгатов
восстановленного
глутатиона
с
1–хлор2,4–динитробензолом
(или
с
пнитробензилхлоридом), имеющие максимум поглощения при λ = 340 нм или 310 нм
соответственно.
Реактивы‫׃‬
1. 0,1 М К – фосфатный буфер рН 6,5 (КН2РО4 / NaOH);
2. 10 мМ Восстановленный глутатион;
3. 0,1 М 1 – Cl – 2,4 – динитробензол (ХДХД);
4. 0,1 мМ ЭДТА;
5. 250 мМ Сахароза;
6. 3,8 % Цитрат натрия;
7. 10 мМ Трис НCl буфер рН 7,4
Состав инкубационной среды‫׃‬
(на одну пробу)
1.
2.
3.
К – фосфатный буфер рН 7,0 100 мМ – 1,5мл
Г – SH – 0,2мл
Источник фермента - 0,1мл
32
4.
ХДНД - 0,02 мл
Источник фермента: гемолизат эритроцитов, сыворотка крови, гомогенат
ткани, постмитохондриальный супернатант тканей .
Подготовка проб: Смотри лабораторную работу № 1
Получение постмитохондриального супернатанта тканей: готовим гомогенаты
тканей в среде, содержащей 250 мМ сахарозу, 10 мМ трис НCl рН 7,4 и 0,1 мМ ЭДТА из
расчета 1 г ткани в 10 мл среды (1: 10). Гомогенат цинтрифугируем при 3000 об/мин в
течение 10 мин на холоду. Осадок, содержащий обломки мембран, ядра, неразрушеные
клетки – удаляем, а супернатант центрифугируем при 12000 об/мин в течение 15 минут,
осаждаем общую фракцию митохондрий, которую удаляем, а используем
постмитохондриальный супернатант для определения активности фермента.
Ход работы. В кювету спектрофотометра приливаем инкубационную среду 1,7
мл, 0,1 мл источника фермента. Реакцию запускаем 0,02 мл 0,1 М 1- Cl – 2,4 –
динитробензола (п - нитробензилхлоридом). В кювете с контрольной средой вместо
источника фермента добавляем буфер. Активность фермента ГТ определяем сразу и в
течении 3 мин при λ = 340 нм или 310 нм соответственно по накоплению конъюгатов
восстановленного глутатиона с ХДНД или с п – нитробензилхлоридом.
Расчет
При расчете активности ГТ на 1 мл гемолизата или сыворотки сначала замеряем
оптическую плотность контрольной пробы, а потом в течение 3 мин замеряем оптическую
плотность опытной пробы, определяем Δ Е :
Δ Е = Ек – Еоп
Умножаем на коэффициент – 400, так как разведение гемолизата или сыворотки
1:40, а в кювету добавляем 0,1 мл гемолизата. Выражаем активность фермента в
относительных единицах Е на мл гемолизата эритроцитов или на г ткани в минуту.
А = ΔЕ * 400
3
где
Ек – оптическая плотность контрольной пробы;
Е оп – оптическая плотность опытной пробы через 3 минуты;
З – время в минутах определения активности фермента
При расчете активности ГТ на г ткани учитываем, что в инкубационной среде
содержится в 0,1 мл супернатанта – 10 мг ткани, то есть умножаем Δ Е на коэффициент
100.
А = ΔЕ * 100
3
где
Δ Е = Ек – Еоп;
Ек – оптическая плотность контрольной пробы;
Еоп – оптическая плотность опытной пробы через 3 минуты;
3 – время в минутах определения активности фермента.
Полученные данные занести в таблицу:
Дата____________________________________
33
Группы животных
печень
АКТИВНОСТЬ ГЛУТАТИОНТРАНСФЕРАЗЫ,
от.ед. / мл (г)мин
почки
сердечная мышца
мозг
кровь
Интактные
С
экспериментальной
патологией
С коррекцией
экспериментальной
патологии
Сделать выводы:
РАЗДЕЛ 2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТОВ КЛАССА ГИДРОЛАЗ И
НЕКОТОРЫХ ЕГО ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ
Ферменты этого класса катализируют гидролиз эфирных, сложноэфирных,
пептидных, гликозильных связей, кислотных ангидридов, связей С-С, С-галоида и P-N. В
зависимости от типа гидролизуемой связи различают следующие подклассы:
3.1. Эстеразы – катализируют гидролиз сложных эфиров спиртов с органическими и
неорганическими кислотами:
OH
/
R - O - P = O + H2O --> ROH + H3PO4
\
OH
3.2. Гликозидазы – гидролизуют О-гликозильные, N-гликозильные и
S-гликозильные соединения.
3.4. Пептидгидролазы – катализируют гидролиз пептидных связей в белках и
пептидах.
Пептидгидролазы
делятся
на
подподклассы:
1. Протеиназы или пептидил-пептидгидролазы или эндопептидазы. Они гидролизуют
пептидные связи в середине белковой молекулы, разрушая ее до пептидов. Для них
характерна особенность – селективный характер действия – гидролиз пептидной связи,
образованной только определенными аминокислотами.
2. Пептидазы или экзопептидазы – отщепляют концевые аминокислоты.
аминопептидазы
–
отщепляют
N-концевые
аминокислоты;
карбоксипептидазы
отщепляют
С-концевые
аминокислоты.
3) амидазы - гидролизуют амиды кислот.
Подкласс Протеолитические ферменты (КФ 3.4)
Согласно классификации Бергмана, основанной на их механизме катализа,
подкласс пептид-гидролаз делится на две группы: эндопептидазы и экзопептидазы,
которые отличаются специфичностью действия на субстрат. Скорость гидролиза
определенной пептидной связи большинством протеаз зависит от субстратной
специфичности фермента, пространственной доступности данной пептидной связи
(особенно в случае, если субстратом является нативный, а не денатурированный белок) и
не зависит от размеров молекулы субстрата (от длины полипептидной цепи). Субстратная
34
специфичность заключается в способности данного фермента с наибольшей скоростью
гидролизовать пептидные связи между определенными аминокислотными остатками.
1) Эндопептидазы (КФ 3.4.21 — 24).
(протеиназы или пептидилпептидгидролазы) могут действовать на центральные участки пептидной связи и
расщеплять молекулу белка на более мелкие фрагменты. 2) Экзопептидазы (КФ 3.4.11 —
15) не могут гидролизовать пептидные связи, находящиеся в середине цепи и действуют,
отщепляя последовательно одну за другой концевые аминокислоты. Экзопептидазы на
- аминопептидазы - отщепляют N-концевые аминокислоты (КФ 3.4.11). Представители:
лейцинаминопептидаза,
пролинаминопептидаза;
- карбоксипептидазы (отщепляют С-концевые аминокислоты (КФ 3.4.12). Представители:
карбоксипептидазы семейства А-В, карбоксипептидазы семейства D-U).
3) Амидазы - гидролизуют амиды кислот (КФ 3.4.13). Представители: уреаза,
аспарагиназа.
Эти протеазы отличаются по чувствительности к различным ингибиторам, например,
сериновые протеазы ингибируются фенилметилсульфонилфторидом (PMSF) и
диизопропилфторфосфатом (DFP); металлопротеазы - хелатирующими агентами, такими,
как ЭДТА, ЭГТА, о-фенантролин; цистеиновые протеазы - йодоацетамидом и тяжелыми
металлами и аспарагиновые - пепстатином. Сериновые протеазы обычно имеют
слабощелочной оптимум рН, металлопротеазы - нейтральный, а цистеиновые и
аспарагиновые протеазы - кислый.
В зависимости от строения активного центра и аминокислотных остатков,
входящих в его состав, клеточные и вирусные эндопептидазы подразделяют на
цистеиновые (тиоловые), сериновые (и серино-подобные), аспартиловые и
металлопротеиназы.
При
значительной
дивергенции
последовательностей
индивидуальных протеиназ, внутри каждой группы каталитические остатки и
пространственная структура фермента являются консервативными. Все протеиназы
построены из двух глобулярных доменов (N- и С-концевого), в щели между которыми
расположены остатки, вовлечённые в формирование активного центра.
2.1. Сериновые протеиназы (КФ 3.4.21)
Сериновые протеиназы есть как у эукариотов, так и у прокариотов. Их
подразделяют на кланы по особенностям структуры, а кланы, в свою очередь, делятся на
семейства, члены которых имеют схожие последовательности.
Сериновые протеиназы обнаружены у эукариотических, прокариотических
организмов и у некоторых вирусов. Их каталитическую триаду составляют остатки
серина, гистидина и аспарагиновой кислоты. Остаток серина является нуклеофилом в
реакции протеолиза и ацилируется, атакуя карбонил гидролизуемой пептидной связи.
Протон для освободившейся NH-группы предоставляется остатком гистидина. Далее
происходит гидролиз ацильного производного серина с образованием карбоновой
кислоты и регенерация активного центра фермента. Cубстратная специфичность
варьирует у различных сериновых протеиназ. Предполагается, что в субстратсвязывающем участке ключевую роль играет остаток S1, который по размеру или заряду
"подстроен" под остаток Р1 в сайте разрезания. Часто сериновые протеиназы различного
происхождения объединяют в группы по принципу сходства с клеточными ферментами.
Большинство вирусных сериновых протеиназ родственны химотрипсину и трипсину и
35
расщепляют пептидные связи, образованные карбоксильной группировкой лизина или
аргинина. К химотрипсиновым протеиназам относятся капсидные белки альфавирусов,
обладающие автопротеиназной активностью. К трипсин-подобным протеиназам
принадлежат NS3 белок флавивирусов и Р80 пестивирусов. К серино-подобным
протеиназам относятся только ферменты вирусного происхождения. По строению и
функциональным свойствам они напоминают сериновые протеиназы, но в активном
центре вместо серина содержат цистеин. Этот класс протеиназ объединяет реликтовые
ферменты, являющиеся прародителями сериновых протеиназ. К данному классу
относятся, например, 3С и 2А протеиназы пикорнавирусов, по пространственной
структуре
напоминающие
трипсин.
Характерными
представителями
самого
многочисленного класса сериновых протеаз являются пищеварительные протеазы
млекопитающих, имеющие сходные между собой аминокислотные последовательности и
пространственные структуры, способные гидролизовать субстраты до мелких фрагментов
и различающиеся по типу расщепляемой пептидной связи. Так, химотрипсин гидролизует
пептидные связи с участием аминокислот с ароматическими боковыми цепями, трипсин положительно заряженными, эластаза - аминокислотными остатками глицина, в меньшей
степени - лейцина. Механизм наблюдаемой специфичности обусловлен различиями в
строении активных центров протеолитических ферментов. Представители: Ферменты
пищеварения: Энтеропептидаза - Трипсин - Хемотрипсин - Эластаза (Нейтрофильная,
Панкреатическая); Факторы коагуляции: Тромбин - Фактор VIIa - Фактор IXa - Фактор Xa
- Фактор XIa - Фактор XIIa - Калликреин (PSA); В системе фибринолиза: Плазмин Активатор плазминогена (Тканевой - Урокиназный); В системе комплемента: Фактор B Фактор D - Фактор I - MASP (MASP1, MASP2) - C3-конвертаза Другие, иммунная
система: Химаза - Гранзим - Триптаза - Протеиназа 3/Миелобластин; биотоксины:
Анкрод - Батроксобин.
2.2. Папаин-подобные цистеиновые (тиоловые) протеиназы (КФ 3.4.22)
Активный центр цистеиновых протеиназ образован остатками цистеина и гистидина.
Нуклеофилом является сульфгидрильная группа цистеина, а донором протона для
высвобождающейся NH-группы субстрата служит гистидин. Цистеиновые протеиназы
обнаружены у корона-подобных вирусов, а также у многих Синдбис-подобных вирусов.
2.3. Аспартиловые протеиназы (КФ 3.4.23)
Активный центр аспартиловых протеаз построен из двух остатков аспарагиновой
кислоты. Так как эти протеиназы активны при низких значениях рН, их иногда называют
"кислыми". Существует предположение о кислотно-щелочном механизме катализа этими
протеиназами, причем в данной реакции не образуется ковалентных связей между
субстратом и ферментом. Кислые протеиназы обнаружены в клетках млекопитающих и
грибов, где эти ферменты участвуют во множестве биохимических процессов, в том числе
в метаболизме белков (пепсин, гастрин и др.). Вирусные протеиназы (например,
ретровирусная и параретровирусная протеиназы) по строению и функциональным
параметрам напоминают клеточные аналоги. Между клеточными и вирусными
протеиназами есть существенные отличия. Во-первых, размеры клеточных аспартиловых
протеиназ (в среднем 325 остатков) много больше таковых у протеиназ ретровирусов (99 125 остатков). Во-вторых, клеточные аспартиловые протеиназы представляют собой
двухдоменные белки, а их вирусные аналоги - димеры, построенные из двух абсолютно
идентичных субъединиц. Существует две основных гипотезы об эволюционных
отношениях клеточных и вирусных ферментов. Согласно одной из них, вирусная форма
является более древней, а происхождение клеточных кислых протеаз объясняется
приобретением и дупликацией гена, существовавшего у вирусов. Вторая гипотеза
36
предполагает, что вирусные аспартиловые протеиназы возникли в результате делеции
клеточного гена.
2.4. Металлопротеиназы (КФ 3.4.24)
В активном центре металлопротеиназ находится двухвалентный ион металла (чаще всего
Zn2+), а также остатки гистидина и глутаминовой кислоты. Возможно, Glu играет роль
донора электрона для карбонильной группы гидролизуемой пептидной связи.
Предполагается, что каталитические остатки находятся в составе His-Glu-X-X-His (X любая аминокислота), который консервативен у всех. Металлопротеиназы вирусного
происхождения пока не были обнаружены, хотя протеиназа вируса краснухи имеет
некоторое сходство с ферментами данного класса.
Протеолитические ферменты, обладающие узкой субстратной специфичностью,
используются в молекулярной биологии в качестве инструментов для изучения первичной
структуры белков и пептидов, а также сами протеазы являются удобными объектами для
изучения структуры белков и механизмов их функционирования. Многие протеазы, такие
как трипсин, химотрипсин, папаин и другие служат активным началом многих
лекарственных средств, используются в косметологии и ветеринарии.
2.1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭСТЕРАЗ
Лабораторная работа № 6
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ
Щелочная
фосфатаза
(КФ
3.1.3.1
–
щелочная
фосфомоноэстераза,
фосфомоноэстераза, глицерофосфатаза), катализирует отщепление фосфорной кислоты от
ее органических соединений: нуклеотидов, белков и алкалоидов и катализирует реакцию
трансфосфорилирования. Оптимум рН щелочной фосфатазы (ЩФ) - 8,6-10,1.
Молекулярная масса ЩФ в среднем 89 000 Да.
Щелочная фосфатаза широко
распространена во всех тканях человека, особенно в слизистой оболочке кишечника,
остеобластах, стенках желчных протоков печени, проксимальных отделах извитых
канальцев почек, плаценте, в лактирующей молочной железе. Общая активность ЩФ в
организме человека и других млекопитающих слагается из 4 изоферментов: печеночного,
кишечного, костного, плацентарного. В норме источником ЩФ в сыворотке крови
является печень. Наличие кишечного изофермента в сыворотке крови контролируется
генетически и характерно для людей с 0 группой крови. Наличие плацентарного
изофермента в сыворотке крови контролируется генетически при беременности. Костная
ЩФ продуцируется остеобластами – одноядерными клетками, лежащими на поверхности
костного матрикса. Активатором ЩФ являются ионы магния. Активность ЩФ
ингибируется ЭДТА, цинком, медью, ртутью. Все изоферменты ЩФ млекопитающих, за
исключением плацетарных ингибируются гомоаргинином. L-фенилаланин избирательно
ингибирует кишечный изофермент и не влияет на печеночный; мочевина – сильно
ингибирует печеночный и костный изофермент и не влияет на кишечный. Инкубирование
в течение 20 мин при 70 0 С в присутствии ионов магния приводит к полной инактивации
всех изоферментов, кроме плацентарного.
Повышение активности ЩФ: повышенный метаболизм в костной ткани (заживление
переломов, гиперпаратиреоз, остеомаляция, ювенильный рахит), метастазы рака в кости,
остеогенная саркома, миеломная болезнь, лимфогранулематоз с поражением костей,
болезнь Гоше, болезнь Педжета, синдром Кушинга, уремическая остеодистрофия,
заболевания почек («почечный рахит»), заболевания печени (инфекционный мононуклеоз,
37
цитомегаловирусная инфекция у детей, холангит, гепатоцеллюлярный некроз, портальный
цирроз, гепатиты), кишечные бактериальные инфекции, тиреотоксикоз, беременность. У
детей щелочная фосфатаза повышена до периода полового созревания.
Снижение активности ЩФ: гипотиреоз, цинга, анемия, гипофосфатаземия,
пернициозная анемия.
Биохимический анализ крови на ЩФ проводят для диагностики заболеваний костной
системы, печени, желчевыводящих путей и почек.
Принцип метода основан на количественном определении комплекса фенола с 4аминофеназоном, который в присутствии периодата натрия окрашивается в красный цвет
с максимумом поглощения при λ = 560
фенилфосфат + H2O
→
фенол + фосфат
щелочная
фосфатаза
Реактивы: 1. 0,2 М фосфатный буфер, рН = 10,0 с 0,1 % 4-аминофеназоном.
Раствор стабилен при хранении в холодильнике в течение 1 месяца.
2. Субстратно-буферный раствор. 0,1 М раствор динатриевой соли фенилфосфата в
0,2 М фосфатном буфере, рН = 10,0. Либо: 1 таблетку из набора для определения
растворяют в 50,0 мл буферного раствора. Раствор готовят непосредственно перед
употреблением.
3. Окислительный раствор. 0,5 % раствор периодата натрия (NaIO4) в
дистиллированной воды. Либо: 10,0 мл концентрированного окислительного раствора из
набора для определения доводят дистиллированной водой до 100,0 мл. Раствор стабилен
при длительном хранении в холодильнике.
4. Основной стандартный раствор: 50 ммоль/л фенола - на дистиллированной водой.
Либо: содержимое ампулы с фенолом из набора для определения доводят до 50,0 мл
дистиллированной водой. Раствор стабилен в течение недели при хранении в
холодильнике.
5. Фотометр, спектрофотометр, водяная баня, секундомер.
Источник фермента: гемолизат эритроцитов, сыворотка крови, гомогенаты тканей
на 0,9 % NaCl.
Подготовка проб: смотри лабораторную работу № 1. Примечание: гомогенаты
тканей готовят без добавления ЭДТА.
Ход работы: В пробирку вносят 2,4 мл субстрата, прогревают 5 мин при при 37 ºС в
водяной бане, вносят 0,1 мл источника фермента, перемешивают, инкубируют в течение
10 минут на водяной бане при 37 ºС. По окончании инкубации к пробе добавляют 2,4 мл
окислительного раствора. Пробу выдерживают 5 мин при комнатной температуре для
развития окраски и колориметрируют при λ = 560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с
толщиной слоя 10,0 мм против дистиллированной воды.
Контроль. Готовят по схеме,
приведенной выше, но 0,1 мл источника фермента вносят после добавления
окислительного раствора. Контрольную пробу готовят для каждого источника фермента.
Расчёт. Активность щелочной фосфатазы (А) выражают в ммолях фенола,
отщепленного 1 г (мл) источника фермента за 1 час инкубации при 37 ºС:
С x n х V х 60
А = ----------------------------Vа x t
где: С – содержание фенола в молях, найденное по калибровочному графику;
n – разведение источника фермента, содержащего щелочную фосфатазу;
V – объем исходного гомогената 1 г ткани;
60 – коэффициент перевода минут в час;
Vа – объем источника фермента в пробе;
t – продолжительность инкубации в мин.
38
Построение калибровочной кривой. Для определения количества ммоль фенола,
отщепленного от фенилфосфата строят калибровочную кривую. Основной
Ак стандартный раствор фенола разводят фосфатным буфером рН 10,0 в 2, 4, 8, 16,
Гр тив 32 и 64 раза. В пробирку вносят 2,4 мл буферного раствора, прогревают 5 мин
уп нос при при 37 ºС в водяной бане, добавляют 0,1 мл разведенного раствора фенола и
пы ть 2,4 мл окислительного раствора и колориметрируют при λ = 560 нм (зеленый
жи ще светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10,0 мм против дистиллированной воды.
вот ло Определение проводят в параллелях. На миллиметровой бумаге строят график
ны чн зависимости оптической плотности раствора от концентрации фенола в пробе.
х ой
Полученные данные заносят в таблицу:
фо
Дата__________________
сф .
ата
зы
в
мм
оля
х
фе
но
ла
на
г
(мл
)в
час
печень
почки
сердеч-ная
мышца
мозг
Интактные
животные
Животные с
экспериментальной патологией
Животные с коррекцией
экспериментальной патологии
Сделать выводы:
Лабораторная работа № 7
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КИСЛОЙ ФОСФАТАЗЫ
Кислая фосфатаза (КФ 3.1.3.2 – кислая фосфомоноэстераза, фосфомоноэстераза,
глицерофосфатаза), катализирует отщепление фосфорной кислоты от ее органических
соединений: нуклеотидов, белков и алкалоидов и реакции трансфосфорилирования.
Оптимум рН кислой фосфатазы – 5,0. Молекулярная масса в среднем 100 – 120 кДа.
Кислая фосфатаза (КФ) содержится в лизосомах клеток различных тканей, в эритроцитах
и особенно много – в предстательной железе. Фермент расположен на клеточной
мембране и принимает участие в транспорте фосфата. Активатором КФ являются ионы
магния.
Активность
эритроцитарного
изофермента
ингибируется
формальдегидом>Cu>спиртом>фторидом>Fe, простатического изофермента фторидом>Lтартратом> спиртом>Fe>Cu>формальдегидом. Активность обоих изоферментов кислой
фосфатазы млекопитающих снижается в присутствии фторидов, оксалатов, этанола,
гепарина.
39
сы
Значительное повышение активности КФ: простатического изофермента – при
карциноме предстательной железы и ее метастазировании в кости. Незначительное
повышение активности КФ отмечается при: острой задержке мочи, простатитах,
гемолитической болезни, полицитемии, миэлиновой болезни, лимфобластозных лейкозах,
ксантоматозе, первичном гиперпаратиреозе, остеопетрозе, карциноме молочной железы.
Активность лизосомальной КФ повышается при массивных разрушениях клеток
вследствие некроза тканей – инфаркте миокарда, циррозе печени.
Принцип метода основан на определении количества
n-нитрофенола,
окрашивающегося в щелочной среде в желтый цвет с максимумом погощения при λ = 405:
n-нитрофенилфосфат + H2O
→
n-нитрофенол + фосфат
кислая
фосфатаза
Реактивы: 1. 1,0 М цитратно-натриевый буфер рН = 5,5. Раствор стабилен при
хранении в холодильнике в течение 1 месяца.
2. Субстратный раствор. 0,1 М раствор динатриевой соли n-нитрофенилфосфата в
1,0 М цитратно-натриевом буфере рН = 5,5.
3. Раствор ингибитора. 0,12 М калий-натрий виннокислый в 1,0 М растворе цитрата.
Раствор стабилен при длительном хранении в холодильнике.
4. Раствор А: К 80,0 мл концентрированного буферного раствора добавляют 32 мл
дистиллированной воды. В 37,0 мл этого раствора растворяют 0,09 г динатриевой соли nнитрофенилфосфата и 0,31 г хлорида натрия. Раствор стабилен в течение нескольких
недель при хранении в холодильнике в темной посуде. Субстрат предназначен для
определения общей активности кислой фосфатазы.
5. Раствор Б: К 40,0 мл концентрированного раствора ингибитора прибавляют 16,0 мл
дистиллированной воды. В 18,5 мл этой смеси растворяют 0,045 г динатриевой соли nнитрофенилфосфата и 0,155 г хлорида натрия. Раствор стабилен в течение нескольких
недель при хранении в холодильнике в темной посуде. Раствор предназначен для
определения активности простатической кислой фосфатазы.
6. Основной раствор n-нитрофенола: - 1,0 мкмоль раствор n-нитрофенола в
дистиллированной воде. Раствор стабилен в течение недели при хранении в
холодильнике.
7. 0,1 М раствор NaOH.
8. Фотометр, спектрофотометр, водяная баня, секундомер.
Источник фермента: гемолизат эритроцитов, сыворотка крови, гомогенат тканей
на 0,9 % NaCl.
Подготовка проб: смотри лабораторную работу № 1. Примечание: гомогенаты
тканей готовят без добавления ЭДТА.
Определение общей активности кислой фосфатазы. Ход работы: в пробирку вносят
0,5 мл раствора А, прогревают 5 мин при при 37 ºС в водяной бане, вносят 0,1 мл
источника фермента, перемешивают, инкубируют в течение 30 минут на водяной бане
при 37 ºС. По окончании инкубации к пробе добавляют 2,0 мл 0,1 М раствора NaOH.
Пробу выдерживают 5 мин при комнатной температуре для развития окраски и
колориметрируют при λ = 405 нм в кювете с толщиной слоя 10,0 мм против
дистиллированной воды.
Определение активности тартратстабильной кислой фосфатазы. Ход работы: в пробирку
вносят 0,5 мл раствора Б, прогревают 5 мин при при 37 ºС в водяной бане, вносят 0,1 мл
источника фермента, перемешивают, инкубируют в течение 30 минут на водяной бане
при 37 ºС. По окончании инкубации к пробе добавляют 2,4 мл 0,1 М раствора NaOH.
Пробу выдерживают 5 мин при комнатной температуре для развития окраски и
колориметрируют при λ = 405 нм в кювете с толщиной слоя 10,0 мм против
дистиллированной воды.
40
Контроль. Готовят по схеме, приведенной выше, но 0,1 мл источника фермента
вносят после добавления 2,4 мл 0,1 М раствора NaOH. Контрольную пробу готовят для
каждого источника фермента, для определения общей активности кислой фосфатазы и
активности тартратстабильной кислой фосфатазы
Расчёт. Активность общей активности кислой фосфатазы (А) выражают в мкмолях nнитрофенола, отщепленного 1 г (мл) источника фермента за 1 час инкубации при 37 ºС:
С x n х V х 60
А = ----------------------------Vа x t
где: С – содержание n-нитрофенола в мкмолях, найденное по калибровочному графику по
гидролизу раствора А;
n – разведение источника фермента, содержащего кислую фосфатазу;
V – объем исходного гомогената 1 г ткани;
60 – коэффициент перевода минут в час;
Vа – объем источника фермента в пробе;
t – продолжительность инкубации в мин.
Активность простатической (тартратстабильной) кислой фосфатазы (А) выражают в
мкмолях n-нитрофенола, отщепленного 1 г (мл) источника фермента за 1 час инкубации
при 37 ºС:
С x n х V х 60
А = ----------------------------Vа x t
где: С – содержание n-нитрофенола в молях, найденное по калибровочному графику по
гидролизу раствора Б;
n – разведение источника фермента, содержащего кислую фосфатазу;
V – объем исходного гомогената 1 г ткани;
60 – коэффициент перевода минут в час;
Vа – объем источника фермента в пробе;
t – продолжительность инкубации в мин.
Для определения активности тартратлабильной кислой фосфатазы из общей
активности кислой фосфатазы вычитают активность тартратстабильной кислой
фосфатазы.
Построение калибровочной кривой. Стандартный раствор 1,0 мкмоль раствора nнитрофенола разводят 1,0 М цитратно-натриевый буфер рН = 5,5 в 2, 4, 8, 16, 32 и 64 раза.
В пробирку вносят 0,5 мл буферного раствора, прогревают 5 мин при при 37 ºС в водяной
бане, добавляют 0,1 мл разведенного раствора n-нитрофенола и 2,4 мл 0,1 М раствора
NaOH и колориметрируют при λ = 405 нм в кювете с толщиной слоя 10,0 мм против
дистиллированной воды. Определение проводят в параллелях. На миллиметровой бумаге
строят график зависимости оптической плотности раствора от концентрации nнитрофенола в пробе.
Полученные данные заносят в таблицу:
Дата__________________
.
Общая активность кислой фосфатазы в мкмолях n-нитрофенола
Группы
на г (мл) в час
животных
печень
почки
сердечмозг сывор поджелу- кишечная
откак дочная
ник
мышца
рови железа
Интактные
животные
С
эксперименталь41
ной патологией
С коррекцией
экспериментальной патологии
Примечание:
аналогичные
таблицы
тартратлабильной форм кислой фосфатазы.
заполняют
для
тартратстабильной
и
Сделать выводы:
Лабораторная работа № 8
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЛИПАЗЫ
Липаза (КФ 3.1.3.2 – триацилглицерол-фцилгидролаза, сиеапсин, трибутираза, липаза
триглицеридов), гидролитически отщепляет жирные кислоты от триацилглицеринов,
начиная с первичных гидроксильных групп.
Липазы распространены во всех тканях млекопитающих, особенно в жировой ткани (не
лизосомная липаза), поджелудочной железе, тонком кишечнике и сыворотке крови.
Панкреатическая липаза разрушает эфирные связи триглицеридов жирных кислот в άположении. Липаза стенки тонкого кишечника гидролизует преимущественно βмоноглицериды
Тристеарин + Н2О
→
Стеариновая кислота + Глицерин-β-моностеарат
липаза
Оптимум рН липазы поджелудочной железы - 7,0 – 9,0 в
зависимости от субстрата и присутствия активаторов. Липаза особенно активна в
отношении эфиров с большой молекулярной массой.
Липаза (Л) из лизосом печени крыс обеспечивает гидролиз триглицеринов в
лизосомах, не действует на фосфолипиды. Фермент имеет молекулярную массу 58 000
кДа, оптимум рН – 4,0 4,5. Около 30 % ферментативной активности можно
солюбилизировать замораживанием и оттаиванием. Активаторами являются:
кардиолипин, фосфатидилсерин, кислые фосфолипиды, желчные кислоты ионы кальция.
Активность липазы ингибируется соединениями, блокирующими тиоловые группы, АТФ,
АДФ, пирофосфатами, сульфатом, фторидом, иодацетатом, нитратом ртути,
сульфированными гликозаминогликанами., эзерином, ди-изопропилфторфосфатом и
свободными жирными кислотами. Липаза сыворотки крови ингибируется гемоглобином.
Значительно повышается активность (Л) в сыворотке крови при: остром панкреатите,
карциноме поджелудочной железы, остром гепатите, острых и хронических заболеваниях
почек.
Принцип метода основан на количественном определении нерасщепленного
субстрата с помощью реакции Конитцера с максимумом поглощения при λ = 560 нм.
Реактивы: 1. Раствор холеиновокислого натрия. 204 мг кристаллической холевой
кислоты в 25,0 мл 0,02 н раствора едкого натра.
2. Суспензия оливкового масла в ацетоне в соотношении 1 : 49. Раствор устойчив
при хранении в холодильнике в течение 2-3 месяцев.
3. 0,02 н раствор едкого натра.
4. 3,0 М аммиачный буфер рН 8,0.
42
Раствор А: 16,04 г NH4Cl в 100,0 мл дистиллированной воды.
Раствор Б: 90,8 мл 25,7 % NH4ОН (р=0,905) довести до 200,0 мл дистиллированной
водой.
100,0 мл раствора А смешивают с 2,0 мл раствора Б. Хранить в сосуде с притертой
пробкой в холодильнике.
5. 0,05 м раствор CaCl2. При использовании 10 % ампульного раствора CaCl2
(р=1,040) 5,6 мл ампульного раствора доводят до 100,0 мл дистиллированной водой.
6. Инкубационная смесь. К 25,0 мл холеиновокислого натрия добавляют 50,0 мл 3,0 М
аммиачного буфера и 25,0 мл 0,05 М раствора хлористого кальция. Смесь необходимо
хранить в холодильнике.
7. Экстракционный реактив Доула: гептан, изопропанол и 1 н серная кислота в
соотношении 10 : 40 : 1.
8. Индикаторный раствор Конитцера: 9,0 мг метилового красного в 200,0 мл
изопропанола. К полученному раствору добавляют 0,3 мл 0,1 н раствора едкого натра до
получения светло-желтого окрашивания.
9. Стандартный раствор жирной кислоты: 1000 мкмоль жирной кислоты в хлороформе.
10. Фотометр, спектрофотометр, водяная баня, секундомер.
Источник фермента: сыворотка крови, гомогенаты тканей (включая жировую
ткань) на 0,9 % NaCl.
Подготовка проб: смотри лабораторную работу № 1. Примечание: гомогенаты
тканей готовят без добавления ЭДТА.
Ход работы: К 0,1 мл субстрата добавляют 0,3 мл инкубационной смеси,
встряхивают в течение 20 секунд, инкубируют 60 мин в термостате при 37 ºС, добавляют
0,1 мл источника фермента, перемешивают и инкубируют в течение 30 минут на водяной
бане при 37 ºС. По окончании инкубации к пробе добавляют 2,5 мл раствора Доула,
осторожно перемешивают содержимое пробирок и выдерживают 10 мин при комнатной
температуре.
К пробе добавляют 1,5 мл гептана, 1,0 мл дистиллированной воды,
энергично встряхивают 1 минуту и отстаивают 10 минут. Отбирают 1,0 мл верхнего слоя
жидкости, добавляют 1,0 мл индикатора Конитцера, перемешивают и колориметрируют
при λ = 560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 5,0 мм против
дистиллированной воды.
Контроль. Готовят по схеме, приведенной выше, но 0,1 мл источника фермента
вносят после добавления 2,5 мл раствора Доула. Контрольную пробу готовят для каждого
источника фермента.
Расчёт. Активность липазы (А) выражают в мг субстрата не расщепленного 1 г (мл)
источника фермента за 1 час инкубации при 37 ºС:
С x n х V х 60
А = ----------------------------Vа x t
где: С – содержание субстрата в мг, найденное по калибровочному графику;
n – разведение источника фермента, содержащего липазу;
V – объем исходного гомогената 1 г ткани;
60 – коэффициент перевода минут в час;
Vа – объем источника фермента в пробе;
t – продолжительность инкубации в мин.
Построение калибровочной кривой. Раствор субстрата разводят хлороформом в 2, 4,
8, 16, 32 и 64 раза. В пробирку вносят 1,0 мл раствор субстрата, добавляют 1,0 мл
индикатора Конитцера, перемешивают и колориметрируют при λ = 560 нм (зеленый
светофильтр) в кювете с толщиной слоя 5,0 мм против дистиллированной воды.
43
Определение проводят в параллелях. На миллиметровой бумаге строят график
зависимости оптической плотности раствора от концентрации жирной кислоты в пробе.
Полученные данные заносят в таблицу:
Дата__________________
.
Активность липазы в мг нерасщепленного субстрата
на г (мл) в час
печень
почки
сердечмозг сывор поджелу- кишечная
откак
дочная
ник
мышца
рови
железа
Группы
животных
Интактные
животные
С
экспериментальной патологией
С коррекцией
экспериментальной патологии
.
Выводы:
Лабораторная работа № 9
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ
Холинэстераза (КФ 3.1.1.8 – ацетилхолин-ацилгидролаза, псевдохолинэстераза,
бутирил-холинэстераза, холинэстераза II неспецифическая, бензоилхолинэстераза)
гидролитически отщепляет жирные кислоты от триацилглицеринов, начиная с первичных
гидроксильных групп.
Ацетилхолин + Н2О
→
холин + анион карбоновой кислоты
Холинэстераза
Ацетилхолинэстераза (КФ 3.1.1.7 – ацетилхолин-ацетиллгидролаза, истинная
холинэстераза, холинэстераза, холинэстераза I) гидролизует различные эфиры уксусной
кислоты.
Ацетилхолин + Н2О
→
холин + ацетат
Ацетилхолинэстераза
В тканях человека и животных ацетилхолинэстераза («истинная» холинэстераза;
ацетилхолингидролаза) содержится в эритроцитах и нервной ткани, а холинэстераза
(неспецифическая или псевдохолинэстераза, ацилхолинацилгидролаза) - во многих тканях
и в плазме крови. Действие ацетилхолина (субстрата для ацетилхолинэстеразы) связано с
изменением проницаемости нервных и мышечных волокон для ионов натрия, что
необходимо для проведения нервного импульса. В отсутствие фермента мембраны
остаются поляризованными, вследствие чего проведение импульсов невозможно.
Максимальная активность ацетилхолинэстеразы проявляется при взаимодействии с
ацетатами, в то время как холинэстераза проявляет максимум активности в присутствия
бутиратов. Ацетилхолинэстераза ингибируется избытком естественного субстрата 44
ацетилхолина, холинэстераза - нет. Молекула фермента содержит несколько активных
центров, каждый из которых состоит из двух участков: анионного, который связывается с
положительно заряженным атомом азота молекулы холина и участка, в котором
осуществляется гидролитическое действие.
Активные центры ацетилхолинэстеразы содержат два анионных участка,
холинэстеразы — только один. Гидролитический процесс включает объединение
карбоксильной группы холинового эфира с группой О-Н на поверхности фермента.
Образующийся промежуточный комплекс распадается с освобождением свободного
холина и ацилированного фермента, который затем гидролизуется с образованием
фермента в первоначальном виде.
Источниками ацетилхолинэстеразы являются серое вещество центральной нервной
системы, симпатические ганглии, двигательные нервные окончания и эритроциты.
Холинэстераза обнаружена в печени, слизистой оболочке кишечника, поджелудочной
железе, плазме и в белом вещество центральной нервной системы. Желудок, печень и
легкие, видимо, содержат оба фермента. Холинэстераза локализуется в основном в
цитоплазме клеток, ацетилхолинэстераза является в основном мембраносвязанной.
Ацетилхолинэстераза присутствует в нейроне, а холинэстераза в оболочке нерва.
Ацетилхолинэстераза связана с мембранами, поэтому необходима предварительная
обработка Тритоном Х-100. Холинэстераза стабильный, растворимый фермент, связанный
с
субклеточными
структурами.
Холинэстераза
сыворотки
крови
человека
представлена
несколькими
множественными формами. Четыре изофермента холинэстеразы контролируются
четырьмя отдельными аллельнмми генами: «обычным» геном, дибукаинрезистентным
геном, фторидрезистентным геном и «немым»
геном. Ацетилхолинэстераза мозга и эритроцитов состоит из трех электрофоретически
различных форм, молекулярные массы которых: 546, 184 и 93 кДа. Все три изофермента
обратимо
ингибируются
эзерином.
Сывороточная холинэстераза чувствительна к сукцинилдихолину, дибукаину,
неостигминбромиду.
Активность ацетилхолинэстеразы и холинэстеразы
подавляется
фосфатными
эфирами: диизопропилфосфофторидом и тетраэтилпирофосфатом, триокрезольфосфатом
(оказывает нейротоксическое действие и на аксон и на миелиновые оболочки) и эзерином.
Ацетилхолинэстеразная активность в норме превышает активность холинэстеразы, а
избыток белка оказывает ингибиторный эффект на ацетилхолинэстеразу. Активность
сывороточной и эритроцитарной холинэстеразы возрастает при отравлении
инсектицидами, фосфорорганическими соединениями. Активность сывороточной
холинэстеразы повышается при маниакальном депрессивном психозе, тревоге и
депрессивных неврозах, шизофрении,
остром менингите, рассеянном склерозе,
эпилепсии, при беременности, у больных с нефротическим синдромом, при раке молочной
железы. Холинэстеразная активность в спинномозговой жидкости значительно меньше
активности этого фермента в крови. Активность ацетилхолинэстеразы в эритроцитах
возрастает при эритробластической и серповидноклеточной анемиях, понижается при
гемоглобинурии. В сыворотке крови активность ацетилхолинэстеразы увеличивается при
сифилисе.
Снижение активности сывороточной холинэстеразы: при остром инфекционном
гепатите, токсическом гепатите, декомпенсированном циррозе, у больных с метастазами в
печени и с амебиазом печени, холецистите, холангите, желчно-каменной болезни,
панкреатите.
Колориметрические методы определения активности холинэстеразы в сыворотке
крови:
гидроксаматный - на реакции ацетилхолпна с щелочным раствором
гидроксиламина. Колориметрический метод определения активности сывороточной
псевдохолинэстеразы – по гидролизу фенилбензоата. Освобождающийся в ходе реакции
45
фенол определяют с помощью реагента Фолина. Колориметрические методы включают
использование субстратных аналогов: тиохолина, (количество отщепляемых тиолов
определяется нитропруссидной реакцией); О-карбонафтоксихолина, (свободный нафтол
взаимодействует с ди-О-анизидином).
Принцип метода основан на количественном определении уксусной кислоты при
максимуме поглощения λ = 560 нм.
Реактивы: 1. 0,9 М раствор ацетилхолинхлорида. При использовании
ампулированного ацетилхолинхлорида 2,0 г ацетилхолинхлорида растворяют в 1,2 мл
дистиллированной
воды.
2. 0,0075 М вероналовый буфер, рН = 8,4. 1,545 г натриевой соли веронала (мединала)
растворяют в 500,0 мл дистиллированной воды, добавляют 9,0 мл 0,I н раствора соляной
кислоты и 150,0 мл 0,01 % раствора индикатора — фенолового красного. Измеряют рН,
доводят дистиллированной водой до 1 литра. Хранят в холодильнике в посуде из темного
стекла. Годен в течение месяца.
3. Исходный 0,4 % раствор фенолового красного на дистиллированной воде. Из
полученного 0,4 % раствора перед употреблением готовят рабочий 0,01 % раствор
фенолового
красного
разведением
дистиллированной
водой
в
40
раз.
4.
0,I
н
раствор
соляной
кислоты.
5. 0,7 % раствор прозерина на дистиллированной воде. Хранят в посуде из темного
стекла.
6. 0,I н стандартный раствор уксусной кислоты. 0,57 мл ледяной уксусной кислоты
разбавляют дистиллированной водой до 100,0 мл в мерной колбе.
9. Фотометр, спектрофотометр, водяная баня, секундомер.
Источник фермента: сыворотка крови, гомогенаты тканей на 0,9 % NaCl.
Подготовка проб: смотри лабораторную работу № 1.
Ход работы: в пробирку вносят 0,1 мл источника фермента, 5,0 мл вероналового
буфера, 0,2 мл дистиллированной воды, перемешивают и прогревают 5 мин в термостате
при 37 ºС.
По окончании инкубации к пробе добавляют 0,2 мл раствора
ацетилхолинхлорида, перемешивают и инкубируют 30 мин в термостате при 37 ºС. По
окончании инкубации к пробе добавляют 0,2 мл раствора прозерина. Пробы охлаждают и
колориметрируют при λ = 560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 5,0 мм
против дистиллированной воды.
Контроль. Готовят по схеме, приведенной выше, но 0,1 мл источника фермента вносят
после добавления 0,2 мл раствора прозерина. Контрольную пробу готовят для каждого
источника фермента.
Расчёт. Активность холинэстеразы (А) выражают в мкмолях уксусной кислоты,
отщепленной 1 г (мл) источника фермента за 1 час инкубации при 37 ºС:
С x n х V х 60
А = ----------------------------Vа x t
где: С – содержание уксусной кислоты в мкмолях, найденное по калибровочному
графику;
n – разведение источника фермента, содержащего липазу;
V – объем исходного гомогената 1 г ткани;
60 – коэффициент перевода минут в час;
Vа – объем источника фермента в пробе;
t – продолжительность инкубации в мин.
Построение
калибровочной кривой. Стандартный раствор уксусной кислоты
разводят дистиллированной водой в 2, 4, 8, 16, 32 и 64 раза. В пробирку вносят 0,1 мл
раствора уксусной кислоты, добавляют 5,0 мл вероналового буфера, 0,2 мл
дистиллированной воды, 0, 2 мл раствора прозерина перемешивают и колориметрируют
при λ = 560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 5,0 мм против
46
дистиллированной воды. Определение проводят в параллелях. На миллиметровой бумаге
строят график зависимости оптической плотности раствора от концентрации уксусной
кислоты в пробе.
Полученные данные заносят в таблицу:
Дата__________________
.
Группы
животных
Активность холинэстеразы в мкмолях уксусной кислоты
на г (мл) в час
печень
почки
сердечмозг сывор поджелу- кишечная
откак дочная
ник
мышца
рови железа
Интактные
животные
С
экспериментальной патологией
С коррекцией
экспериментальной патологии
.
Выводы:
Лабораторная работа № 10
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ НУКЛЕАЗ
Нуклеазы, относятся к эндодеполимеразам, расщепляющим фосфодиэфирные связи с
образованием нуклеотидфосфатов различной молекулярной массы и мононуклеотидов.
Нуклеазы характеризуются строгой специфичностью в отношении типа нуклеиновой
кислоты.
ДНК-аза I (КФ 3.1.4.33, дезоксирибонуклеинат-5-олигонуклео-тидгидролаза,
эндодезоксирибонуклеаза) содержится в панкреатическом соке и во многих животных
тканей. Оптимум рН 7,0 при содержании ионов Mg2+ не ниже 0,003 М. Конечном
продуктом реакции являются ди- и тринуклеотид-5-фосфаты и олигонуклеотиды.
ДНК-аза II (КФ 3.1.4.30, дезоксирибонуклеинат-олигонуклеотидгидролаза) –
содержится во всех животных тканях. Оптимум рН 5,6 ионы Mg2+ в концентрации выше
0,003 М ингибируют фермент. Конечном продуктом реакции являются мононуклеотид-3фосфаты и олигонуклеотиды.
РНК-аза (КФ 3.1.4.22-23, рибонуклеинат 3-олигонуклеотидгидролаза, РНКаза I.)
щелочная тканевая РНКаза имеет оптимум рН 7,0 и осуществляет гидролиз РНК в 2
этапа: на первом этапе образуются циклические нуклеотид-2-3-фосфаты, которые на
втором этапе разрываются с образованием нуклеотид-3-фосфатов. Кислая тканевая
РНКаза
имеет
оптимум
рН
5,0.
Наиболее
известные
методы
определения
активности
нуклеаз:
1. Анализ растворимой фракции до и после ферментативного гидролиза нуклеиновых
кислот.
Сюда входят: а) определение фосфора (по Леккоку); б) определение содержания пентоз
(гликозидазным методом); в) измерение поглощения мононуклеотидов при 260 нм.
II.
Определение
вязкости
раствора
ДНК
в
процессе
гидролиза.
III.
Определение
гиперхромного
эффекта.
IУ. Фракционирование гидролизатов на колонках с различными адсорбентамн.
Инкубационные смеси
47
Принцип метода основан на способности азотистых оснований поглощать при λ =
260 нм. Активность нуклеазы пропорциональна степени гидролиза нуклеиновой кислоты.
Определение активности ДНКазы I.
Реактивы: 1. 0,1 % раствор ДНК на 0,06 М К-фосфатном буфере рН 7,0.
2. 0,01 М раствора MgCl2.
3. Фотометр, спектрофотометр, водяная баня, секундомер.
Источник фермента: сыворотка крови, гомогенаты тканей на 0,9 % NaCl.
Подготовка проб: смотри лабораторную работу № 1.
Ход работы: К 1,0 мл 0,1% раствора ДНК в 0,06 М К-фосфатном буфере рН 7,0
добавляют 0,8 мл 0,01 М раствора MgCl2, 0,5 мл источника фермента и общий объем
пробы
доводят
0,06
М
К-фосфатным
буфером
рН
7,0
до
4,0
мл.
Инкубируют
2
часа
при
37°
в
воздушном
термостате.
Определение активности ДНКазы I I.
Реактивы: 1. 0,1 % раствор ДНК на 0,2 М ацетатном буфере рН 5,3.
Ход работы: К 1,0 мл 0,1 % раствора ДНК в 0,2 М ацетатном буфере рН 5,3 добавляют 0,5
мл источника фермента и объем смеси доводят до 4,0 мл. Инкубируют 2 часа при 37° в
воздушном
термостате.
Определение активности РНКазы. Инкубационная смесь состоит из:
1)
субстрат
0,3
%
раствор
РНК
в
буфере;
2)
раствор
источника
фермента
в
том
же
буфере.
3) 0,1 М буфер соответствующего рН. Для определения кислой тканевой РНКазы
используют 0,2 М ацетатный буфер рН 5,6; щелочной РНКазы - 0,1 М фосфатный буфер
рН 7,8—8,0.
Ход работы: К 1,0 мл 0,3 % раствора РНК в соответствующем буфере добавляют 0,5 мл
источника фермента и объем смеси доводят до 4,0 мл буферным раствором. Инкубируют
2 часа при 37° в воздушном термостате.
При
определении
активности
всех
нуклеаз
после окончания инкубации при определении активности как РНКаз так и ДНКаз реакцию
прекращают
добавлением
0,5
мл
одного
из
осадителей:
1) 0,25 % раствор уранилацетата в 2,5 % растворе трихлоруксусной кислоты (только для
РНКазы);
2) хлорную кислоту в конечной концентрации 0,5 М (для РНКазы и ДНКазы);
3) трихлоруксусную кислоту в конечной концентрации 5,0 % (Примечание: не
использовать
при
определении
на
спектрофотометре);
4) 96 % этиловый спирт, подкисленный НСIО4 до конечной концентрации в смеси 0,25 М.
5)
0,3
М
раствор
ZnCl2
в
60
%
этиловом
спирту (для
РНК).
Пробы после осаждения выдерживают на холоду 15 минут, центрифугируют при 5000
об/мин в течение 15 мин и супернатант спектрофотометрируют при 260 нм против
дистиллированной воды. Для каждого источника фермента ставят контрольную пробу.
Контрольная проба содержит все ингредиенты, кроме фермента, и инкубируется вместе с
опытными пробами. После окончания инкубации и добавления осадителя в смесь вносят
фермент.
Активность
нуклеаз
также
определяют
колориметрически:
1)
по
содержанию
фосфора.
По
методу
Лекокка.
2)
по
содержанию
пентоз.
Расчёт. Активность нуклеазы (А) выражают в миллиграммах нуклеиновой кислоты,
гидролизованной 1 г (мл) источника фермента за 1 час инкубации при 37 ºС:
С x n х V х 60
А = ----------------------------Vа x t
48
где: С – содержание негидролизованной нуклеиновой кислоты (в мг), найденное по
калибровочному графику;
n – разведение источника фермента, содержащего нуклеазу;
V – объем исходного гомогената 1 г ткани;
60 – коэффициент перевода минут в час;
Vа – объем источника фермента в пробе;
t – продолжительность инкубации в мин.
Построение калибровочной кривой. Исходный процентный раствор ДНК или РНК
разводят соответствующим буфером в 2, 4, 8, 16, 32 и 64 раза. В пробирку вносят 1,0 мл
разведенного субстрата, добавляют 0,5 мл дистиллированной воды, прогревают 2 часа при
при 37 ºС воздушном термостате. Объём реакционной смеси доводят дистиллированной
водой до 4,0 мл и колориметрируют при λ= 260 нм в кювете с толщиной слоя 5,0 мм
против дистиллированной воды. Определение проводят в параллелях. На миллиметровой
бумаге строят график зависимости оптической плотности раствора от концентрации
нуклеиновой кислоты в пробе.
Полученные данные заносят в таблицу:
Дата__________________
.
Активность нуклеазы в мг расщепленной нуклеиновой кислоты на
г (мл) в час
печень
почки
сердечмозг
кровь поджелу- кишечная
дочная
ник
мышца
железа
Группы
животных
Интактные
животные
С
экспериментальной патологией
С коррекцией
экспериментальной патологии
Сделать выводы:
2.2. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ГЛИКОЗИДАЗ
Лабораторная работа № 11
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ γ-АМИЛАЗЫ
Различают три типа амилаз: α-амилаза, β-амилаза, γ-амилаза.
ά–амилаза (К.Ф. 3.2.1.1. А(1,4)-глюкан-4-глюканогидролаза диастаза, птиалин,
гликогеназа)– катализирует эндогидролиз 1,4-ά-глюкозидных связей в полисахаридах,
содержащих три или более остатков D-глюкозы (крахмал, гликоген, родственные
полисахариды и олигосахариды) с уменьшением вязкости и молекулярной массы
субстратов и освобождением глюкозы в α-мутамерной форме: крахмал →
эритродекстрины → ахродекстрины → альдотетроза → мальтоза → глюкоза. α-Амилаза кальций зависимый фермент, с оптимумом рН 7,1. Полное удаление кальция приводит к
инактивации фермента. Ион хлора в концентрации не ниже 10 мМ/л является
аллостерическим активатором амилазы. Фермент устойчив к воздействию протеаз, богат
тирозином и триптофаном, на 25 % состоит из глютаминовой и аспарагиновой кислот. α49
Амилаза - слабокислый, хорошо растворимый в воде одноцепочечный полипептид (мол.
масса 50 кДа), к которому присоединён олигосахарид (принцип присоединения
неизвестен). α-амилаза встречается у животных, растений и микроорганизмов катализирует образование глюкозы и декстринов.
β-амилаза (оптимум рН 6,0)- типична для высших растений (локализована в
алейроновом слое и белковых телах семян), катализирует расщепление крахмала с
образованием мальтозы и крупномолекулярных декстринов.
γ-амилаза (одна форма с оптимумом рН 3,0 локализована в лизосомах, нейтральная
– с оптимумом рН 6,0 локализована в микросомах и гиалоплазме) содержится в крови
животных, плесневых грибах, бактериях - катализирует образование глюкозы и
декстринов.
У млекопитающих, известно три вида амилаз: α-амилаза слюнных желез, β-амилаза
поджелудочной железы (оптимум рН 7,4), γ-амилаза лизосом, микросом и гиалоплазмы.
Существует 7 множественных форм амилазы слюны и 3 множественных форм амилазы
поджелудочной железы.
В норме в сыворотке крови человека активность амилазы составляет – 12-32 г/ч ∙ л,
в моче – 20-160 г/ч ∙ л, в дуоденальном содержимом – 6,10³-16,10³ г/ч ∙ л, в плевральной,
перикардиальной жидкости – 12-32 г/ч ∙ л.
Повышение активности амилаз наблюдается при перфорации пищевода, язве
желудка, гастрите, кишечной непроходимости, перитоните, ишемии и инфаркте тонкой
кишки, заболеваниях желчных путей, аппендиците, паротите, внематочной беременности,
сальпингите, аневризме аорты, ожогах, травматическом шоке, черепно-мозговой травме,
пневмонии, диабетическом кетоацидозе, простатите, уремии, при злокачественных
опухолях лёгких, поджелудочной железы, поперечноободочной кишки.
Снижение активности амилаз: при гепатитах, циррозах, сахарном диабете,
гипотиреозе, кахексии, токсикозе беременных.
Существуют методы определения активности амилаз: 1) йодометрический (см ниже), 2)
гликозидазный (с помощью фермента гликозидазы), 3) орциновый и резорциновый
Принцип йодометрического метода основан на колориметрическом определении
окрашивания комплекса негидролизованного крахмала с йодом, максимально
поглощающем при λ = 690 нм.
Реактивы: 1. 0,2 М фосфатный буфер, рН = 7,0 с 0,8 % бензойной кислотой.
Примечание: при исследовании активности лизосомальной γ-амилазы тканей используют
фосфатный буфер рН 3,0, β-амилаза панкреатической – фосфатный буфер рН 7,4.
2. Субстрат - 0,4 % раствор водорастворимого крахмала. Суспендируют
0,2 г растворимого крахмала в 20,0 мл холодной дистиллированной воды и вводят в 50,0
мл кипящей дистиллированной воды. Раствор кипятят 1 мин, охлаждают, доводят
буфером (рН 7,0) до 500,0 мл. Раствор стабилен при хранении при комнатной температуре
в течение недели.
3. 0,1 н раствор йода (основной). 30,0 г KI растворяют в 250,0 мл дистиллированной
воды, добавляют 12,7 г кристаллического йода и доводят объём дистиллированной водой
до 1000,0 мл. Полученный раствор (Люголя) можно хранить в темной посуде
продолжительное время. Либо 3,567 г йодноватокислого калия (KIO3) и 45,0 г KI
растворяют в 800,0 мл воды. Медленно при помешивании к раствору добавляют 9,0 мл
концентрированной соляной кислоты и доводят дистиллированной водой до 1000,0 мл.
4. 0,01 н рабочий раствор йода. Готовят из основного раствора (разведение 1:10).
Раствор стабилен в течение двух месяцев, при хранении в посуде из тёмного стекла в
холодильнике.
5. Фотометр, спектрофотометр, водяная баня, секундомер.
Источник фермента: гемолизат эритроцитов, сыворотка крови, моча
(профильтрованная и разведенная дистиллированной водой в соотношении 1:10), слюна,
гомогенат ткани.
50
Подготовка проб: смотри лабораторную работу № 1. Примечание: гомогенаты
тканей готовят без добавления ЭДТА.
Ход работы: В пробирку вносят 1,0 мл субстрата, прогревают 5 мин при при 37 ºС в
водяной бане, вносят 0,1 мл источника фермента, перемешивают, инкубируют при 37 ºС в
течение 15 минут на водяной бане при 37 ºС. По окончании инкубации к пробе добавляют
1,0 мл рабочего раствора йода. Объём реакционной смеси доводят дистиллированной
водой до 10,0 мл и колориметрируют при λ = 690 нм (красный светофильтр) в кювете с
толщиной слоя 10,0 мм против дистиллированной воды.
Контроль. Готовят по схеме, приведенной выше, но 0,1 мл источника фермента
вносят после добавления рабочего раствора йода. Контрольную пробу готовят для
каждого источника фермента.
Расчёт. Активность амилазы (А) выражают в миллиграммах крахмала,
гидролизованного 1 г (мл) источника фермента за 1 час инкубации при 37 ºС:
С x n х V х 60
А = ----------------------------Vа x t
где: С – содержание крахмала (в мг), найденное по калибровочному графику;
n – разведение источника фермента, содержащего α-амилазу;
V – объем исходного гомогената 1 г ткани;
60 – коэффициент перевода минут в час;
Vа – объем источника фермента в пробе;
t – продолжительность инкубации в мин.
Построение калибровочной кривой. Исходный 0,4 % раствор крахмала разводят
фосфатным буфером рН 7,1 в 2, 4, 8, 16, 32 и 64 раза. В пробирку вносят 1,0 мл
разведенного субстрата, прогревают 5 мин при при 37 ºС в водяной бане, добавляют 1,0
мл рабочего раствора йода. Объём реакционной смеси доводят дистиллированной водой
до 10,0 мл и колориметрируют при длине волны 590 – 690 нм (красный светофильтр) в
кювете с толщиной слоя 10,0 мм против дистиллированной воды. Определение проводят в
параллелях. На миллиметровой бумаге строят график зависимости оптической плотности
раствора от концентрации крахмала в пробе.
. Примечание: при исследовании активности лизосомальной γ-амилазы тканей
используют фосфатный буфер рН 3,0, β-амилазы панкреатической – фосфатный буфер рН
7,4.
Полученные данные заносят в таблицу:
Дата__________________
.
Группы
животных
Активность амилазы в мг расщепленного крахмала на
г (мл) в час
печень
почки
сердечмозг
кровь поджелу- кишечная
дочная
ник
мышца
железа
Интактные
животные
С
экспериментальной патологией
С коррекцией
экспериментальной патологии
51
Сделать выводы:
Лабораторная работа № 12
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ХИТИНАЗЫ
Хитиназа (К.Ф. 3.2.1.14, 1,4-β-поли-N-ацетилглюкозаминидаза, хитодекстриназа,
поли-β-глюкозаминидаза) фермент относится к О-гликозидным гидролазам, катализирует
эндогидролиз
хитина,
отщепляя
хитоолигосахариды
длиной
в
2-6
Nацетилглюкозаминовых остатков. Все организмы, содержащие хитин, продуцируют
хитиназы, которые необходимы им для морфогенеза клеточной стенки или экзоскелета.
Принцип метода основан на колориметрическом определении комплекса продукта
гидролиза хитина регистрируемого с помощью реактива Фолина с максимумом
поглощения при λ=750.
Реактивы: 1. 0,1 М фосфатный буфер рН 8,5.
2. Субстрат - хитин.
3. 0,15 М лимонная кислота.
4. Реактивы для определения белка по методу Лоури.
5. Спектрофотометр, фотоэлектроколориметр, секундомер.
Источник фермента: гомогенаты тканей членистоногих на 0,9 % NaCl, гемолимфа
насекомых, ракообразных, экстракты зерновых и зернобобовых культур на 0,45 % NaCl.
Подготовка проб: смотри лабораторную работу № 1. Примечание: гомогенаты тканей
готовят без добавления ЭДТА.
Ход работы: В центрифужную пластиковую пробирку вносят 20 мг хитина, 1,0 мл
0,1 М фосфатного буфера рН 8,5 и 2,0 мл источника фермента. Содержимое пробирки
перемешивают стеклянной палочкой в течение 30 мин при температуре 37 ºС. Пробу
центрифугируют 5 мин при 2500 об/мин, надосадочную жидкость сливают. К осадку
прибавляют 5,0 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 8,5, встряхивают 3 мин и
центрифугируют 5,0 мин при 2500 об/мин. Процедура повторяют еще 2 раза. К
полученному осадку прибавляют 2,0 мл 0, 15 М лимонной кислоты, встряхивают 5 мин,
центрифугируют 5,0 мин при 2500 об/мин. В стеклянную пробирку отбирают 1,0 мл
надосадочной жидкости, добавляют 4,0 мл реактива С (из набора реактивов для
определения белка по Лоури), перемешивают, через 10 мин добавляют 1,0 мл реактива
Фолина, разведенного 1: 1. Через 30 мин пробу спектрофотометрируют при λ=750 нм
(красный светофильтр) против
раствора на реактив, содержащего: в кювету
спектрофотометра вносят 3,0 мл субстрата, добавляют 1,0 мл 0, 15 М лимонной кислоты,
4,0 мл реактива С и 1,0 мл реактива Фолина, разведенного 1: 1.
Расчёт. Активность хитиназы (А) выражают в мг хитина, гидролизованного 1,0 г (мл)
источника фермента за 1 час инкубации при 37 ºС:
С x n х V х 60
А = ----------------------------Vа x t
где: С – содержание хитина (в мг), найденное по калибровочному графику;
n – разведение источника фермента, содержащего хитин;
V – объем исходного гомогената 1 г ткани;
60 – коэффициент перевода минут в час;
Vа – объем источника фермента в пробе;
t – продолжительность инкубации в мин.
Построение калибровочной кривой. В центрифужные пластиковые пробирки вносят
40, 20, 10, 5, 2, 1 мг хитина 1,0 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 8,5 и 2,0 мл
дистиллированной воды. Далее пробы готовят по схеме, приведенной выше. Определение
проводят в параллелях. На миллиметровой бумаге строят график зависимости оптической
плотности раствора от концентрации хитина в пробе.
52
Полученные данные заносят в таблицу:
Дата__________________
.
Группы животных
Активность хитиназы в мг хитина, гидролизованного 1,0 г
(мл) источника фермента за 1 час
Интактные животные
С экспериментальной
патологией
С коррекцией
экспериментальной
патологии
Сделать выводы:
Лабораторная работа № 13
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЛИЗОЦИМА
Лизоцим (К.Ф. 3.2.1.17, мукопептид-N-ацетилмурамоилгидролаза, мурамидаза,
мукопептид-гликогидролаза), относится к О-гликозидным гидролазам, катализирующим
эндогидролиз мукополисахаридов и мукопептидов, расщепляя 1,4-β связи между
остатками N-ацетилмурамовой кислоты и 2-ацетамидо-2-дезокси-D-глюкозы. Фермент
является основным (катионным) белком с изоэлектрической точкой при рН 10,5, стабилен
в нейтральных и кислых средах, выдерживает нагревание до 100 ºС. Фермент имеет
молекулярную массу 14,6 – 15,0 кДа, состоит из одной полипептидной цепи из 129
аминокислотных кислотных остатков с 4 дисульфидными связями. Молекула фермента
имеет форму эллипсоида с осями 4,5 х 3,0 нм. Между двумя половинами находится
«щель», стенки которой образованы боковыми цепями неполярных ам. к-т, в которой
способен разместиться олигосахарид, состоящий из 6 моносахаридов. Активный центр
фермента облазован Глу-35, карбоксильная группа которой является донором протона для
гликозидного атома кислорода и Асп-52 – карбоксилатная группа которого стабилизирует
образовавшийся в результате реакции карбокатион. Протон с молекулы воды переходит
на Глу-35, а ОН- группа – к углеродному атому первого сахара. У животных основным
источником лизоцима являются: слюна (околоушные железы, подчелюстные и большие
подъязычные железы), железы тонкой и толстой кишки, железы дыхательных путей,
лейкоциты (1 г лейкоцитарной массы содержит 5000 мкг лизоцима), грудное молоко,
сыворотка крови, моча. В клетке, после синтеза накапливается в специальных малых
гранулах и азурофильных гранулах, совместно с пероксидазой и лизосомальными
ферментами. Активируется: in vitro - катионными ПАВ, in vivo – катионными белками:
куринного яйца - авидином, гистонами, протаминами, фосфолипазой А. Ингибируется
ингибитором Кунитца-Нортропа. Обладает широким спектром
действия:
бактериологическим по отношению к Грамм положительным микрококкам, сарцинам,
бациллам, вибрионам, кокцидиям; бактериостатическим – снижает устойчивость грамм
положительных
бактерий
к
комплексонам,
детергентам,
галогенам;
иммуномоделирующим – стимулирует развитие иммунного ответа на различные
антигены, осуществляет инактивацию токсинов липополисахаридной природы;
регуляторным – стимулирует in vivo биосинтез IgA иммуноглобулинов.
Методы определения активности фермента основаны:
1. На бактериолитической способности лизоцима гидролизовать в качестве
субстрата клеточные стенки грамположительных бактерий.
53
На сродстве фермента к хитину (полисахариду из панциря членистоногих), с
которым фермент легко соединяется без расщепления гликозидной связи (см.
метод определения активности хитиназы).
Принцип метода основан на спектрофотометрическом определении изменения
оптической плотности бактериальной суспензии с максимумом поглощения при λ=570 нм.
Реактивы: 1. 0,1 М бикарбонатный буфер рН 6,2.
2. Ацетоновый порошок бактерий Micrococcus.
3. Субстрат: 10,0 мг ацетонового порошка бактерий суспендируют в 50,0 мл 0,1 М
фосфатного буфера рН 6,2 в гомогенизаторе при 2500 об/мин в течение 2 мин.
4. Спектрофотометр или фотоэлектроколориметр.
5. Секундомер
Источник фермента: гомогенаты тканей животных на 0,9 % NaCl, сыворотка
крови, слюна, слезная жидкость, грудное молоко, моча.
Подготовка проб: смотри лабораторную работу № 1. Примечание: гомогенаты
тканей готовят без добавления ЭДТА.
Ход работы: В кювету спектрофотометра вносят 3,0 мл субстрата, добавляют 0,1
мл источника фермента и по секундомеру замеряют оптическую плотность при λ=570 нм
на 1 и 5 минуте инкубации.
Расчёт. Активность лизоцима (А) выражают в мг субстрата, гидролизованного 1
мг (мл) источника фермента за 1 час инкубации при 37 ºС:
С х V х n х 60
А = ----------------------------Vа х t
где: С – содержание субстрата (в мг), найденное по калибровочному графику по разности
оптической плотности опытной пробы на 1 и 5 минуте;
n – разведение источника фермента, содержащего лизоцим;
V – объем исходного гомогената 1 г ткани;
60 – коэффициент перевода минут в часы;
Vа – объем источника фермента в пробе;
t – продолжительность инкубации в мин.
Построение калибровочной кривой. В пробирки вносят 3,0 мл бактериальной
суспензии, разведенной в 2, 4, 8, 16 раз и 0,1 мл дистиллированной воды. Далее пробы
готовят по схеме, приведенной выше. Определение проводят в параллелях. На
миллиметровой бумаге строят график зависимости оптической плотности раствора от
концентрации суспензии бактерий в пробе.
Полученные данные заносят в таблицу:
Дата__________________
.
Активность лизоцима в мг бактериальной суспензии на
Группы
г (мл) в час
животных
печень
почки
сердечмозг
кровь поджелуслюна
ная
дочная
мышца
железа
Интактные
животные
С
экспериментальной патологией
С коррекцией
экспериментальной патологии
2.
54
Сделать выводы:
Лабораторная работа № 14
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ НЕЙРАМИНИДАЗЫ
Нейраминидаза (К.Ф. 3.2.1.18, N-ацилнейраминидатгликогидролаза, экзо-αсиалидаза, ацилнейраминилгидролаза), относится к О-гликозидным гидролазам.
Гидролизует 2,3-, 2,6- и 2,8-кетозидные связи, соединяющие концевые нередуцирующие
остатки
N- или О-ацилнейраминовой кислоты с остатками галактозы, Nацетилгексозамина или N- или О-ацилнейраминовой кислоты в олигосахаридах,
гликопротеидах и гликолипидах. Фермент седиментирует в области 8 - 10S, имеет
относительную молекулярную массу 200 - 250 кДа, состоит из 535 аминокислот. Это
тетрамер-гликопротеид с 5,7 остатками глюкозамина. В активный центр входят тирозин,
гистидин и триптофан. Оптимальное рН для нейраминидазы вируса гриппа зависит от
штамма вируса и используемого субстрата. Для нейраминидаз бактерий и млекопитающих
оптимума рН ниже 5,0, для нейраминидазы вирусов гриппа - 6,4—7,0. Оптимум рН
зависит от вида связи, расщепляемой ферментом: 2-3 при рН 6,5, и 2 - 6 при рН 4,5.
Активность фермента конкурентно ингибируется продуктом нейраминидазной реакции —
N-ацетилнейраминовой кислотой, полианионами, рибо- и дезоксирибонуклеиновыми
кислотами, сульфатом декстрана, муцином подчелюстных желез свиньи, гепарином,
сульфгидри льными препаратами: тиогликолатом, глютатионом, цистеином, мертиолатом
и Hg. Фермент термостабилен при нагревании в течение 1 ч при 45 °С, и в присутствие
ионов Са. Фермент гидролизуя нейраминовую кислоту муцинов, способствует
проникновению вируса в клетку, высвобождению из клетки вновь синтезированного
вируса, предотвращает агрегацию образовавшихся вирусных частиц.
Повышение активности нейраминидазы - при инфаркте миокарда, опухолях
головного мозга, туберкулезе, ревматизме, лимфогрануломатозе, нефрозе, остеомиэлите.
Снижение активности нейраминидазы – при анемии, болезни Вильсона,
дегенеративных процессах в центральной нервной системе.
Принцип метода основан на колориметрическом определении сиаловых кислот,
которые образуют окрашенные соединения при нагревании с уксусно-сернокислым
реактивом с максимумом поглощения при λ=560 нм.
Реактивы: 1. 10 % раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ).
2. 0,1 М фосфатный буфер рН 7,0.
3. Субстрат. 1,0 % гидролизат эритроцитов на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,0.
4. Уксусно-сернокислый реактив. К 95,0 мл ледяной уксусной кислоты добавляют
при тщательном перемешивании 5,0 мл концентрированной серной кислоты. Реактив
готовят на ледяной бане.
5. 2,0 мкмоль раствор N-ацилнейраминовой кислоты.
6. Спектрофотометр или фотоэлектроколориметр.
7. Секундомер, водяная баня.
Источник фермента: гомогенаты тканей животных на 0,9 % NaCl.
Подготовка проб: смотри лабораторную работу № 1. Примечание: гомогенаты
тканей готовят без добавления ЭДТА.
Ход работы: В пробирку вносят 1,0 мл субстрата, 1,0 мл источника фермента и
инкубируют 30 мин при при 37 ºС в термостате. Инкубацию прекращают внесением 1,0
мл 10 %-ной ТХУ. Пробы центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об/мин. Отбирают
0,5 мл центрифугата, добавляют 5,0 мл уксусно-сернокислого реактива, укупоривают и
55
кипятят в кипящей бане 15 мин. Пробы охлаждают и колориметрируют при зеленом
светофильтре (λ=560 нм) против холостой пробы.
Контрольная проба. Готовят по схеме, приведенной выше, но 1,0 мл источника
фермента вносят после 1,0 мл 10 %-ной ТХУ. Контрольную пробу готовят для каждого
источника фермента.
Расчёт. Активность нейраминидазы (А) выражают в мкмолях
Nацилнейраминовой кислоты, отщепленной от сиалогликопротеина 1 мг (мл) источника
фермента за 1 час инкубации при 37 ºС:
С х V х n х 60
А = ----------------------------Vа х t
где: С –
содержание N-ацилнейраминовой кислоты (в мкмолях), найденное по
калибровочному графику;
n – разведение источника фермента, содержащего нейраминидазу;
V – объем исходного гомогената 1 г ткани;
60 – коэффициент перевода минут в часы;
Vа – объем источника фермента в пробе;
t – продолжительность инкубации в мин.
Построение калибровочной кривой. Для определения количества мкмолей Nацилнейраминовой кислоты, отщепленной от сиалогликопротеина нейраминидазой строят
калибровочную кривую. В пробирки вносят 0,5 мл стандартного раствора Nацилнейраминовой кислоты, разведенного в 2, 4, 8, 16 дистиллированной водою. Далее
пробы готовят по схеме, приведенной выше. Определение проводят в параллелях. На
миллиметровой бумаге строят график зависимости экстинкции раствора от концентрации
N-ацилнейраминовой кислоты.
Полученные данные заносят в таблицу:
Дата__________________
.
Активность нейраминидазы в мкмолях N-ацилнейраминовой
Группы
кислоты / г (мл) в час
животных
печень
почки
сердечмозг
кровь поджелу- мышца
ная
дочная
бедра
мышца
железа
Интактные
животные
С
экспериментальной патологией
С коррекцией
экспериментальной патологии
Сделать выводы:
2.3. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПЕПТИДГИДРОЛАЗ
Лабораторная работа№ 15
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПЕПСИНА
IIепсин (К.Ф.3.4.4.1)). Пепсин (основной фермент желудочного сока) секретируется в
виде неактивного предшественника — пепсиногена клетками фундального и
пилорического отдела желудка. Пепсин (мол. масса 34 000 Да) и пепсиноген (мол. масса
42 500 Да) существенно различаются, что доказывается значительной устойчивостью
56
пепсиногена к действию тепла и щелочей. Пепсиноген лишь частично денатурирует при
температуре 70 - 100° С, выдерживает кратковременное кипячение в бессолевом растворе,
но при рН 9,0 он обратимо денатурирует. Пепсин быстро разрушается при нагревании до
70° С и значениях рН среды больше 7,0. При рН ниже 6,0 пепсиноген происходит
активирование фермента, с отщеплением 6 пептидов, состоящих из 42 аминокислот,
которое продолжается аутокаталитически в присутствии пепсина. Оптимум рН пепсина
имеет два пика и наблюдается в интервале значений рН от 1,5 до 4,0. Пепсиноген широко
распространен в тканях тела. Он содержится в большинстве биологических жидкостей:
сыворотке крови, моче, спинномозговой жидкости, поте и сперме. За исключением
лейкоцитов и спермы, тканевое происхождение пепсиногена изучено мало и источником
пепсиногена, содержащегося во всех биологических жидкостях, тела является слизистая
оболочка желудка, так как активность этого фермента в сыворотке и моче сильно
снижается после гастроэктомии. Благодаря относительно небольшой молекулярной массе
пепсиноген легко фильтруется в клубочках почек и появляется в моче.
Существование двух рН-оптимумов предполагает наличие множественных форм
пепсина: пепсин 1- оптимум рН 1,9, м. м. 43 800 Да, инактивация при рН>6,0; пепсин 2 –
м.м. 39 950 Да, оптимум рН 2,1; пепсин 3 – м.м. 37 150 Да, оптимум рН 2,4-2,8; пепсин 3а
– более электрофоретически подвижен, чем пепсин 3; пепсин 4 – нестабилен при рН ниже
3,5; пепсин 5 – м.м. 34 600 Да, оптимум рН 2,8-3,6. Пепсин 1, 2, 3, 4 – образуются в
фундальной части желудка, пепсин 5 – в пилорической. Стимуляция секреции пепсина
осуществляется через блуждающий нерв за счет инсулина, пентагастрина и при введении
Са. Пепсин представляет собой протеолитический фермент, действующий в основном на
пептидные связи в середине пептидной молекулы, образованные ароматическими
аминокислотами, доступность которых возрастает в результате денатурации белковой
молекулы при рН 1,5—4,5.
Белок + Н2О → аромаолигопептид + олигопептид
пепсин
У женщин активность пепсина в сыворотке крови, моче и желудочном соке ниже, чем
у мужчин. В диагностических целях активность активного пепсина измеряют в
желудочном соке, плазме или сыворотке и в моче.
В сыворотке крови активность пепсина повышается при синдроме ЗоллингераЭллисона, гипервентиляции, травмах головы, высоком внутричерепном давлении, при
доуденальной язве желудка, язве двенадцатиперстной кишки. В моче активность пепсина
повышается при кровоточащей доуденальной язве желудка.
В сыворотке крови активность пепсина снижается при гастритах, злокачественной
анемии, после тотальной гастрэктомии, возрастных атрофических изменениях слизистой
оболочки желудка, злокачественных опухолях желудка.
Большинство методов определения пепсина или его предшественника в желудочном
соке, сыворотке крови или в моче основано на оценке количества гидролизуемых
пептидных связей при взаимодействии фермента с белковым субстратом: гемоглобином
(количество свободных тирозиновых остатков определяют при помощи реактива Фолина),
альбумином плазмы крови человека (по поглощению свободных ароматических
аминокислот при 275 им). Фермент также гидролизует некоторые синтетические
дипептиды, но при более высоких значениях рН.
Принцип метода основан на определении количества свободных ароматических
аминокислот, с максимумом поглощения при λ=275 нм.
Реактивы: 1. 0,2 М уксусно-ацетатный буфер рН 3,5. Хранят в холодильнике в
течение месяца.
2.
10,0
%
ТХУ.
3. 1,0 % раствор сывороточного альбумина человека в уксусно-ацетатном буфере
рН 3,5. Хранят в холодильнике в течение недели с 1-2 каплями толуола.
57
7. Стандартный 10,0 мкмоль раствор тирозина или фенилаланина в 0,2 М уксусноацетатном буфере рН 3,5.
8. Спектрофотометр, фотоэлектроколориметр, секундомер, термостат.
Источник фермента: гомогенаты тканей животных на 0,9 % NaCl, сыворотка
крови.
Подготовка проб: смотри лабораторную работу № 1. Примечание: гомогенаты
тканей готовят без добавления ЭДТА.
Ход работы: В пробирку вносят 0,5 мл источника фермента, 4,0 мл раствора
субстрата и инкубируют 60 мин (или более мин) при 37 ºС в термостате. Инкубацию
прекращают внесением 0,5 мл 10 % ТХУ, центрифугируют 15 мин при 5 000 об/мин,
отбирают 3,0 надосадочной жидкости и колориметрируют при λ= 275 нм против 10 %
раствора ТХУ.
Контрольная проба. Готовят по схеме, приведенной выше, но 0,5 мл источника
фермента вносят после внесения 0,5 мл 10 % ТХУ. Контрольную пробу готовят для
каждого источника фермента.
Расчёт. Активность пепсина (А) выражают в мкмолях
тирозина или
фенилаланина, отщепленного от албумина 1 мг (мл) источника фермента за 1 час
инкубации при 37 ºС:
С х V х n х 60
А = ----------------------------Vа х t
где: С –
содержание тирозина или фенилаланина (в мкмолях), найденное по
калибровочному графику;
n – разведение источника фермента, содержащего пепсин;
V – объем исходного гомогената 1 г ткани;
60 – коэффициент перевода минут в часы;
Vа – объем источника фермента в пробе;
t – продолжительность инкубации в мин.
Примечание: время инкубации подбирают экспериментально. При необходимости вносят
изменения в формулу расчета.
Построение калибровочной кривой. В пробирки вносят 3,0 мл стандартного раствора
тирозина или фенилаланина, разведенного в 2, 4, 8, 16 дистиллированной водою и
колориметрируют при λ= 275 нм против дистиллированной воды. Определение проводят
в параллелях. На миллиметровой бумаге строят график зависимости экстинкции раствора
от концентрации тирозина или фенилаланина.
Полученные данные заносят в таблицу:
Дата__________________
.
Активность пепсина в мкмолях тирозина или фенилаланина
Группы
/ г (мл) в час
животных
печень
почки
сердеч- моча
кровь поджелу- слизисная
дочная
тая
мышца
железа
желудка
Интактные
животные
С
экспериментальной патологией
С коррекцией
экспериментальной патологии
58
Сделать выводы:
Лабораторная работа № 16
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ТРИПСИНА
Трипсин (К.Ф.3.4.21.4). Трипсин у животных секретируется в поджелудочной железе
виде неактивного предшественника — трипсиногена, состоящего из одной полипептидной
цепи с молекулярной массой 24 400 Да. Трипсиноген активируется энтерокиназой тощей
кишки, в результате чего образуется активный трипсин, который обеспечивает
дальнейшую активацию аутокаталитически. Процесс активации, включает отщепление
гексапептида от трипсиногена и образование активного трипсина, состоящего из одной
полипептидной цепи с молекулярной массой 23 800 Да. Активный центр содержит
остаток серина и два гистидиновых остатка в петле, образуемой дисульфиднымя связями
между двумя цистеиновыми остатками. Механизм действия: начальным этапом гидролиза
пептидной связи является образование водородной связи между амидо-группой субстрата
и карбонильной группой серинового остатка в активном центре фермента.
Белок + Н2О → аргинилолигопептид + олигопептид
трипсин
Трипсин стабилен в кислых растворах, быстро разрушается при действии щелочей, а
оптимум рН равен 7,8. Фермент активируются ионами тяжелых металлов, солями Са,
альбумином сыворотки крови и тиоловыми реагентами: р-хлоромеркурийбензоатом.
Трипсин ингибируется фосфорорганическими соединениями и белковыми ингибиторами
ά1-антитрипсином и ά2-макроглобулином сыворотки крови, а также ингибиторами из
бобовых растений – лимских бобов, сои, фасоли, гороха. Установлено существование
множественных форм фермента: трех «кислых» форм и пяти «щелочных» форм трипсина.
Наиболее чувствительны к действию трипсина пептидные связи, которые включают
карбоксильную труппу лизина и аргинина или амиды и эфиры этих аминокислот.
Активность трипсина в сыворотке крови увеличивается при хроническом и остром
панкреатите, панкреанекрозе, колитах.
Снижение активности фермента наблюдается при карциноме поджелудочной железы,
муковисцедозе.
Методы определения активности трипсина основаны на гидролизе синтетических
субстратов: бензоил-аргининамида, бензоил- и р-толуолсульфонильных производных
эфиров аргининметила и аргининэтила, и белковых субстратов: гемоглобина, казеина,
альбумина.
Принцип метода основан на
определении количества пара-нитроанилина,
окрашенного в желтый цвет с максимумом поглощения при λ= 410.
Реактивы: 1. 0,2 М фосфатный буфер рН 8,2. Хранят в холодильнике в течение
месяца.
2. 0,5 н HCl.
3. Концентрированный раствор N,L-диметилформамида.
4. 0,02 % раствор D,L-аргинин-р-нитроанилида в фосфатном буфере рН 8,2. 2,0 мг
БАПНА растворяют в 0,1 мл N, L-диметилформамида при нагревании на водяной бане и
доводят фосфатным буфером рН 8,2 до 10,0 мл. Готовят непосредственно перед
употреблением.
5. 0,85 % раствор NaCl.
6. 0,5 н раствор HCl.
7. Стандартный 100,0 мкмолярный раствор пара-нитроанилина.
8. Спектрофотометр, фотоэлектроколориметр, секундомер, термостат.
Источник фермента: гомогенаты тканей животных на 0,9 % NaCl, сыворотка
крови.
59
Подготовка проб: смотри лабораторную работу № 1. Примечание: гомогенаты
тканей готовят без добавления ЭДТА.
Ход работы: В пробирку вносят 0,5 мл источника фермента, 4,0 мл рабочего
раствора БАПНА и инкубируют 60 мин при при 37 ºС в термостате. Инкубацию
прекращают внесением 0,5 мл 0,5 н HCl и колориметрируют при λ= 410 нм против
дистиллированной воды. Контрольная проба. Готовят по схеме, приведенной выше, но 0,5
мл источника фермента вносят после внесения 5,0 мл 0,5 н HCl.
Контроль готовят для
каждого источника фермента.
Расчёт. Активность трипсина (А) выражают в мкмолях пара-нитроанилина
отщепленного от БАПНА 1 мг (мл) источника фермента за 1 час инкубации при 37 ºС:
С х V х n х 60
А = ----------------------------Vа х t
где: С – содержание пара-нитроанилина (в мкмолях), найденное по калибровочному
графику;
n – разведение источника фермента, содержащего трипсин;
V – объем исходного гомогената 1 г ткани;
60 – коэффициент перевода минут в часы;
Vа – объем источника фермента в пробе;
t – продолжительность инкубации в мин.
Примечание: время инкубации подбирают экспериментально, по развитию окрашивания.
При необходимости вносят изменения в формулу расчета.
Построение калибровочной кривой. В пробирки вносят 0,7 мл стандартного раствора
пара-нитроанилина, разведенного в 2, 4, 8, 16 дистиллированной водою, добавляют 5,0 мл
0,5 н HCl и колориметрируют при λ= 410 нм против дистиллированной воды.
Определение проводят в параллелях. На миллиметровой бумаге строят график
зависимости экстинкции раствора от концентрации пара-нитроанилина.
Полученные данные заносят в таблицу:
Дата__________________
.
Активность трипсина в мкмолях пара-нитроанилина
Группы
/ г (мл) в час
животных
печень
почки
сердечмозг
кровь поджелу- мышца
ная
дочная
бедра
мышца
железа
Интактные
животные
С
экспериментальной патологией
С коррекцией
экспериментальной патологии
Сделать выводы:
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЭКЗОПЕПТИДАЗ
Лабораторная работа № 17
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЛЕЙЦИНАМИНОПЕПТИДАЗЫ
Лейцинаминопептидаза (К.Ф.З.4.11.1 – ά-аминоацилпептид-гидролаза цитозоля) гидролизует большинство L-пептидов, отщепляя N-концевую аминокислоту.
60
Лейцинаминопептидаза особенно эффективна, если N-концевой аминокислотой является
L-лейцин, но также разрушает пептидные связи в случае N -концевых фенилаланина,
триптофана, гистидина или тирозина. Этот фермент также отщепляет амидные группы от
различных аминокислот, особенно от лейцина, норлейцина и норвалина:
Аминоацилпептид + Н2О
→
аминокислота + пептид
Лейцинаминопептидаза
где В - Н - алкильная или арильная группа, или аминокислота, или пептидный остаток.
Лейцинаминопептидаза широко распространена в тканях человека, особенно в тонком
кишечнике, почках и печени. Это цитозольный Zn-содержащий фермент с молекулярной
массой 80 кДа и оптимумом рН 10,0. Активируется ионами кобальта, марганца, магния в
зависимости от используемого субстрата и тканевого источника фермента, ингибируется
цианидом
и
ЭДТА.
Существуют множественные формы этого фермента в сыворотке крови человека.
При гепатите обнаружены 6 множественных форм, проявляющих аминопептидазную
активность в сыворотке крови: 2 изофермента печени, изофермент почек, 2 изофермента
поджелудочной
железы,
кишечный
изофермент.
При определении активности лейдинаминопептидазы по гидролизу L -лейцил-3нафталамида
количество
отщепляющегося
L-нафтиламина
определяют
флюориметрически или колориметрически при взаимодействии с тетразотированным
диортоанзидином
или
по
гидролизу
лейцилглицина, а количество образующихся при этом лейцина и глицина измеряют с
помощью нингидриновой реакции.
Активность фермента в сыворотке крови повышается при механической желтухе,
карциноме поджелудочной железы, при метастазах в печени, при панкреатите и
холецистите, при
гепатобилиарных заболеваниях, на поздних стадиях беременности
(обусловлено появлением в сыворотке плацентарной формы фермента).
Принцип метода
основан на определении количества гидразина, который
взаимодействуя в солянокислой среде с 4-диметиламинобензальдегидом, образует
соединение оранжево-красного цвета с максимумом поглощения при λ= 450 нм.
Реактивы: 1. 200,0 ммоль этаноламиновый буфер, рН = 10,5. Хранить при
температуре + 2—8 °С.
2. 201,0 ммоль базовый раствор D,L лейцингидразида. Раствор сохраняют длительное
время
в
замороженном
состоянии
при
12
°С.
3. Субстратно-буферная смесь состоящая из
1 части базового раствора
лейцингидразида и 4 частей этаноламинового буфера. Готовят непосредственно перед
употреблением.
4. 15,8 ммоль раствор 4-диметиламинобензальдегида на 0,1 н соляной кислоты.
Устойчив
при
хранении
в
сосуде
из
темного
стекла при температуре 2—8 °С.
5.
Растворы
гидразинсульфата.
а) Базовый 3,43 ммоль раствор гидразинсульфата на дистиллированной воде.
Устойчив при хранении в сосуде из темного стекла при температуре 2—8 °С.
б) Рабочий 34,3 мкмоль раствор гидразинсульфата на дистиллированной воде.
Устойчив при хранении в сосуде из темного стекла при температуре 2—8 °С.
6. 0,I н НCl.
7. Спектрофотометр, фотоэлектроколориметр, секундомер, водяная баня.
Источник фермента: гомогенаты тканей животных на 0,9 % NaCl, сыворотка
крови.
Подготовка проб: смотри лабораторную работу № 1. Примечание: гомогенаты
тканей готовят без добавления ЭДТА.
Ход работы: В пробирку вносят 0,5 мл лейцингидразида, 0,2 мл источника
фермента и инкубируют 30 мин при при 37 ºС в водяной бане. Инкубацию прекращают
61
внесением 5,0 мл 4-диметиламинобензальдегида. Пробы инкубируют 30 мин при при 37
ºС в водяной бане для развития окраски, охлаждают и колориметрируют при λ= 450 нм
(синий светофильтр) против дистиллированной воды.
Контрольная проба. Готовят по схеме, приведенной выше, но 0,2 мл источника
фермента вносят после внесения 5,0 мл 4-диметиламинобензальдегида. Контрольную
пробу готовят для каждого источника фермента.
Расчёт. Активность лейцинаминопептидазы (А) выражают в мкмолях
гидразинсульфата расщепленного 1 мг (мл) источника фермента за 1 час инкубации при
37 ºС:
С х V х n х 60
А = ----------------------------Vа х t
где: С – содержание гидразинсульфата (в мкмолях), найденное по калибровочному
графику;
n – разведение источника фермента, содержащего лейцинаминопептидазу;
V – объем исходного гомогената 1 г ткани;
60 – коэффициент перевода минут в часы;
Vа – объем источника фермента в пробе;
t – продолжительность инкубации в мин.
Построение калибровочной кривой. В пробирки вносят 0,7 мл стандартного раствора
гидразинсульфата, разведенного в 2, 4, 8, 16 дистиллированной водою и добавляют 5,0 мл
4-диметиламинобензальдегида и колориметрируют при λ= 450 нм (синий светофильтр)
против дистиллированной воды. Определение проводят в параллелях. На миллиметровой
бумаге строят график зависимости экстинкции раствора от концентрации
гидразинсульфата.
Полученные данные заносят в таблицу:
Дата__________________
.
Активность лейцинаминопептидазы в мкмолях гидразинсульфата
Группы
/ г (мл) в час
животных
печень
почки
сердечмозг
кровь поджелу- мышца
ная
дочная
бедра
мышца
железа
Интактные
животные
С
экспериментальной патологией
С коррекцией
экспериментальной патологии
Сделать выводы:
Лабораторная работа № 18
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ А
Карбоксипептидаза
А
[КФ
3.4.17.1,
пептидил-l-гидролаза,
карбоксиполипептидаза] Zn-металлофермент, образующийся из прокарбоксипептидазы А.
Фермент обнаружен в организме человека, мыши, крысы, морской свинки, кролика,
крупного рогатого скота, свиньи.
Фермент присутствует в миелоцитах, базофилах, сыворотке крови сердце, легких,
печени, почках, железах внутренней секреции, селезенке, гортани, коже, мозге, гипофизе,
62
секреторних гранулах тучних клеток брюшины, поджелудочной железе, панкреатическом
соке, тонком кишечнике, тестикулах, яичнике, матке, молочной железе, простате.
Фермент участвует в клеточном катаболизме нормальних белков, в катаболизме
аномальних белков и токсинов, в ограниченном протеолизе предшественников
биологически активных пептидов и полипептидов, в процессинге ферментов и других
эффекторов белковой природы, в сигналинге, в активации синтеза тканевого фактора
некроза опухоли, в дифференциации фибробластов, в синтезе дипептидов и глюкагона.
Карбоксипептидаза А из различных источников имеет молекулярную массу от 31 200
Да до 36 000 Да и состоит из 307 – 330 аминокислотных остатков. Активация
прокарбоксипептидазы А происходит под действием трипсина, химотрипсина, плазмина,
субтилизина и урокиназы.
Карбоксипептидаза А обладает как пептидазной так и эстеразной активностью,
отщепляя с С-конца пептида или эфира L-ароматическую или алифатическую
аминокислоту, за исключением основных аминокислот и пролина.
Пептидил-L-аминокислота + Н2О →
пептид + L-аминокислота
Карбоксипептидаза А
Для обеспечения пептидазной активности ферменту необходимо наличие свободной
ОН-группы тирозина-248, которая входит в состав активного центра фермента и
препятствует проявлению эстеразной активности. Ацетилирование ОН-группы тирозина
приводит к полной потере пептидазной активности фермента и повышению эстеразной
активности. Аналогичное изменение активности происходит при замене ионов Zn2+ на
Cd2+.
В молекуле фермента 1 атом цинка соединен координационными связями со
свободной аминной группой N–концевого остатка аспарагина и с сульфгидрильными
группами апофермента.
Ингибируют фермент: хелатирующие препараты: 1,10-фенантролина, ЭДТА
оксихинолинсульфоната, D-пеницилламина, соли ртути, ингибитор из картофеля,
лектины.
У человека увеличение активности карбоксипептидазы А наблюдается при астме и
аллергии, доброкачественных новообразованиях молочной железы, матки, яичника,
миелопролиферативном и миелодиспластическом
синдромах, раке легкого, раке
простаты. В эксперименте на животных установлено повышение активности при
ацинарной карциноме поджелудочной железы у крыс, трансплантированной опухоли
Кирстена у мышей, при экспериментальной глюкокортикостероидной миопатии у
кроликов, при вирус-индуцированном диабете у крупного рогатого скота.
Принцип метода основан на способности фермента в кислой среде расщеплять
карбобензоксиглутамилфенилаланин с образованием фенилаланина, который дает с
нингидрином сине-фиолетовое окрашивание с максимумом поглощения при λ= 570 нм.
карбобензоксиглутамилфенилаланин + H2O = фенилаланин+ карбобензоксиглутамат
Источник фермента: гомогенаты тканей животных на 0,9 % NaCl, сыворотка крови.
Подготовка проб: смотри лабораторную работу № 1. Примечание: гомогенаты
тканей готовят без добавления ЭДТА.
Реактивы: 1. 2,0 мМ раствор карбобензоксиглутамилфенилаланина в 2,0 мМ
ацетатном буфере рН 5,2;
2. 4,0 М ацетатный буфер рН 5,4;
3. 3 % раствор нингидрина в ацетоне или метилцелозовле;
4. 50 % раствор С2Н5ОН;
5. Раствор А: равные объемы 4,0 М ацетатного буфера рН 5,4 и 3 % раствор нингидрина;
63
6. Фотометр, спектрофотометр, электроплитка, термостойкий химический стакан,
секундомер.
Ход
работы:
В
пробирку
наливают
0,4
мл
2,0
мМ
раствора
карбобензоксиглутамилфенилаланина, добавляют 0,1 мл источника фермента и
инкубируют 30 мин на водяной бане при 37 ºС. Реакцию останавливают добавлением 0,5
мл раствора А. К охлажденным пробам добавляют 2,0 мл 50 % -ного раствора С2Н5ОН.
Пробы колориметрируют при λ= 570 нм против 3,0 мл50 %-ного раствора С2Н5ОН. .
Контрольная проба. Готовят по схеме, приведенной выше, но 0,1 мл источника фермента
вносят после внесения 0,5 мл раствора А. Контрольную пробу готовят для каждого
источника фермента.
Расчёт. Активность карбоксипептидазы А (А) выражают в мкмолях фенилаланина
отщепленного от субстрата 1 мг (мл) источника фермента за 1 час инкубации при 37 ºС:
С х V х n х 60
А = ----------------------------Vа х t
где: С – содержание фенилаланина (в мкмолях), найденное по калибровочному графику;
n – разведение источника фермента, содержащегокарбоксипептидазу А;
V – объем исходного гомогената 1 г ткани;
60 – коэффициент перевода минут в часы;
Vа – объем источника фермента в пробе;
t – продолжительность инкубации в мин.
Построение калибровочной кривой. В пробирки вносят 0,4 мл стандартного раствора
фенилаланина, разведенного в 2, 4, 8, 16 дистиллированной водою, добавляют 0,5 мл
нингидринового реактива, кипятят 15 мин на кипящей водяной бане, охлаждают,
добавляют 2,0 мл этилового спирта, разведенного в 2 раза дистиллированной водой и
колориметрируют при λ= 570 нм против дистиллированной воды. Определение проводят
в параллелях. На миллиметровой бумаге строят график зависимости экстинкции раствора
от концентрации фенилаланина.
Полученные данные заносят в таблицу:
Дата__________________
.
Активность карбоксипептидазы А в мкмолях фенилаланина
Группы
/ г (мл) в час
животных
печень
почки
сердечмозг
кровь поджелу- мышца
ная
дочная
бедра
мышца
железа
Интактные
животные
С
экспериментальной патологией
С коррекцией
экспериментальной патологии
Сделать выводы:
Лабораторная работа № 19
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АРГИНАЗЫ
Аргиназа (КФ.З.5.З.1) - фермент цикла мочёвины, специфически гидролизует аргинин с
образованием орнитина и мочевины:
64
Аргинин + Н2О → орнитин + мочевина
аргиназа
Наиболее богатым источником фермента является печень, где аргиназа
обнаруживается: в ядрах, митохондриях, микросомах, и незначительно - в надосадочной
фракции и в эритроцитах (но не в нормальной сыворотке). Аргиназа имеет молекулярную
массу 140 000 Да и оптимум рН 9,0 – 9,5. Аргиназа активируется ионами Mn,
ингибируется L-лейцином и продуктом реакции - l-орнитином.
Активность аргиназы в сыворотке крови является высокоспецифичным индикатором
повреждения мембран клеток или органелл печени. Активность аргиназы повышается при
циррозе, гепатите, гепатоме и жировой инфильтрации печени. Повышение сывороточной
активности аргиназы наблюдается у детей при тифоидной лихорадке, а активности
эритроцитарной аргиназы - при мегалобластических анемиях.
Активность аргиназы определяют по количеству образующейся мочевины во время
инкубации препарата фермента с аргинином либо по избытку аргинина, остающегося в в
реакционной смеси после инкубации. При определении активности аргиназы в сыворотке
необходимо сульфатом аммония осадить мочевину, присутствующую в образце.
ЛИТЕРАТУРА
1. Горячковский А.И. Справочное пособие по клинической биохимии. - Одесса: Экология,
2005.- 607 с.
2. Tripathi L.P., Sowdhamini R. Genome-wide survey of prokaryotic serine proteases: analysis
of distribution and domain architectures of five serine protease families in prokaryotes / BMC
Genomics. – 2008. - № 9. – Р. 549 – 559.
3. Dougherty, W.G., Semler, B.L. (1993). Expression of virus-encoded proteinases: functional
and structural similarities with cellular enzymes / Microbiological Reviews. – 1993. - № 57. – Р.
781-822.
4. Schlechter, I., Berger, A. On the size of the active site in proteases. Papain. / Biochem.
Biophys. Res. Commun. – 1967. - № 27. – Р. 157-162.
5. Кольман Я., Рем К.Г. Наглядная биохимия: Пер. с нем. — М., Мир - 2000. — 469 с.
6. Пустовалова Л.М. Практикум по биохимии. – Ростов – на – Дону: Феникс - 1999. – 544
с.
7. Polgar,L. Mechanisms of protease action. CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla., 1989.
8. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. Основы биохимии: в 3 томах. Т.2. —
М., Мир - 1981. — 617 с.
65
9. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. Основы биохимии: В 3-х томах. Т.3.
Пер. с англ. — М., Мир - 1981. -726 с.
10. Bazan J.F. Fletterick R.J. Detection of a trypsin-like protease domain flaviviruses and
pestiviruses / Virology. – 1989. - № 171. – Р. 637-639.
11. Rao J.K.M., Erikson J.W., Wlodawer A. Structural and evolutionary relationships between
retroviral and eucaryotic aspartic proteinases / Biochemistry. – 1991. - № 30. – Р. 4663-4671.
12. Becker, A.B. & Roth, R.A. An unusual active site identified in a family of zink
metallopeptidases / Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1992. - № 89. – Р. 3835-3839.
13. Tang J., James M.N.J., Hsu I.N., Jenkins J.A., Blundell T.L. Structural evidence for gene
duplication in the evolution of the acid proteases /Nature. – 1978. - №. 271. – Р. 618-627.
ПРИЛОЖЕНИЕ
БУФЕРНЫЕ РАСТВОРЫ
Исходные растворы
Раствор № 1 – соляная кислота, 0,1 н (готовится из фиксанала, либо 8,26 мл HCl с
концентрацией 37,3 % и ρ = 1,185 в 1 л воды)
Раствор № 2 – цитрат натрия, о,1 М (21,014 г Н3С6Н5О7 · Н2О + 200 мл 1 н раствора NaОН
в 1 л воды)
Раствор № 3 – уксусная кислота, 1 н (57, 1 мл ледяной уксусной кислоты с концентрацией
99,9 % и ρ = 1,050 в 1 л воды )
Раствор № 4 – NaОН, 1 н ( 40,0 г NaОН в 1 л воды)
Раствор № 5 – КН2РО4, 0,06 м ( 9,073 г КН2РО4 в 1 л воды)
Раствор № 6 - Na2НРО4, 0,06 м ( 11,866 г Na2НРО4 в 1 л воды)
Раствор № 7 – трис – (оксиметил) – аминометан (24,2 г в 500 мл воды)
Раствор № 8 - соляная кислота, 1 н (готовится из фиксанала, либо 82,6 мл HCl с
концентрацией 37,3 % и ρ = 1,185 в 1 л воды)
Цитратный буфер рН = 1,1 – 4,9. Каждый из указанных ниже объемов раствора
№ 2 доводят до 100 мл раствором № 1.
рН
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
1,7
1,8
1,9
2,0
р-р № 2
4,8
11,1
15,9
19,3
22,2
24,6
26,5
28,2
29,5
30,6
рН
2,1
2,2
2,3
2,4
2,5
2,6
2,7
2,8
2,9
3,0
р-р № 2
31,7
32,6
33,6
34,5
35,4
36,4
37,3
38,3
39,3
40,3
рН
3,1
3,2
3,3
3,4
3,5
3,6
3,7
3,8
3,9
4,0
р-р № 2
41,5
42,7
44,0
45,4
46,8
48,4
50,1
51,9
53,8
56,0
рН
4,1
4,2
4,3
4,4
4,5
4,6
4,7
4,8
4,9
р-р № 2
58,5
61,1
64,3
67,9
71,9
76,9
82,2
88,0
95,6
Ацетатный буфер рН = 3,8 – 6,3. К указанному объему раствора № 3
прибавляют 50 мл раствора № 4 и разбавляют дистиллированной водой до 500 мл.
рН
р-р № 3
рН
р-р № 3
66
рН
р-р № 3
3,8
3,9
4,0
4,1
4,2
4,3
4,4
4,5
4,6
4,7
421,5
345,1
284,4
236,2
197,9
167,4
143,3
124,1
108,9
96,8
4,8
4,9
5,0
5,1
5,2
5,3
5,4
5,5
5,6
5,7
87,2
79,5
73,4
68,6
64,8
61,7
59,3
57,4
55,9
54,7
5,8
5,9
6,0
6,1
6,2
6,3
53,7
53,0
52,3
51,9
51,5
51,2
Фосфатный буфер рН = 4,8 – 8,0. Каждый из указанных ниже объемов раствора
№ 6 доводят до 100 мл раствором № 5.
рН
4,8
4,9
5,0
5,1
5,2
5,3
5,4
5,5
5,6
5,7
5,8
5,9
6,0
р-р № 6
0,35
0,60
0,95
1,35
1,80
2,30
3,00
3,90
4,90
6,20
7,90
9,8
12,1
рН
6,1
6,2
6,3
6,4
6,5
6,6
6,7
6,8
6,9
7,0
7,1
7,2
7,3
р-р № 6
15,0
18,4
22,1
26,4
31,3
37,1
43,0
49,2
55,2
61,2
67,0
72,6
77,7
рН
7,4
7,5
7,6
7,7
7,8
7,9
8,0
р-р № 6
81,8
85,2
88,5
91,2
93,6
95,5
96,9
Буферный раствор трис – (оксиметил) – аминометана (трис-буфер) рН = 7,1 –
9,2. К 500 мл раствора № 7 прибавляют указанные ниже объемы раствора № 8 и
разбавляют дистиллированной водой до 1000мл.
рН
7,1
7,2
7,4
р-р № 8
189
183
170
рН
7,8
8,1
8,3
р-р № 8
150
90
70
рН
8,5
8,7
9,2
р-р № 8
50
16,5
5,75
Плотности и концентрации некоторых продажных реактивов
Реактив
Аммиака раствор конц.
Азотная кислота «крепкая»
Азотная кислота «слабая»
Бромистоводородная кислота
Йодистоводородная кислота
Плотность
при 20 °С,
г/см3
0,901-0,907
1,372-1,405
1,337-1,367
1,486
1,50-1,55
67
Концентрация
% (масс.)
моль/л
25,0-27,0
60,7-68,0
54,0-60,0
46,85
45,3-45,8
13,32-14,28
13,28-15,16
11,41-13,02
8,60
5,31-5,55
Серная кислота
Соляная кислота
Уксусная кислота ледяная х.ч.
Уксусная кислота ч.д.а. и чист.
Фосфорная кислота ч.д.а.
Фосфорная кислота чист.
Фтористоводородная кислота ч.д.а.
Фтористоводородная кислота чист.
Хлорная кислота
1,83-1,835
1,147-1,185
≤ 1,0503
≤ 1,0549
≥ 1,719
≥1,713
≥1,128
≥1,116
1,206-1,220
93,56-95,60
35,0-38,0
≥ 99,8
≥98
≥88
≥87,5
≥40
≥35
30,0-31,61
17,46-17,88
11,27-12,38
≥17,45
≥17,21
≥15,43
≥15,29
≥22,55
≥19,52
3,60-3,84
Количество исходных веществ для приготовления процентных растворов
кислот и аммиака (в мл на 1 л процентного раствора)
ОтносиУдельный тельная
Весовой
Исходное
вес
моле%
25 %
вещество исходного кулярная исходного
вещества
масса,
вещества
1 г-м
HCl
1,19
36,47
37,23
634,8
H2SO4
1,84
98,0
95,6
167,7
HNO3
1,40
63,02
65,6
313,0
CH3COOH
1,05
60,05
99,5
247,8
1000,
NH4OH
0,91
35,04
25,0
0
68
20 %
10 %
5%
2%
1%
496,8
129,9
243,6
196,7
236,4
60,6
115,0
97,1
115,2
29,3
56,0
48,2
45,5
11,5
22,0
19,2
22,6
5,6
10,8
9,0
814,0
422,0
215,4
87,2
43,7
Составители: доц. Вовчук И.Л.
доц. Чернадчук С.С.
доц. Захариева З.Е.
доц. Федорко Н.Л.
доц. Будняк О.К.
доц. Сорокин А.В.
ст. преп. Кокошкина О.О.
проф. Петров С.А.
доц. Запорожченко О.В.
69