ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «РОССИЙСКИЙ КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНО- ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ КОМПЛЕКС» МИНИСТЕРСТВА
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «РОССИЙСКИЙ КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНОПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ КОМПЛЕКС» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ На правах рукописи ПЕЛОГЕЙКИНА ЮЛИЯ АЛЕКСАНДРОВНА РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА ИШЕМИЗИРОВАННОГО СЕРДЦА СТРУКТУРНЫМИ АНАЛОГАМИ ПЕПТИДА АПЕЛИНА-12 03.01.04 – биохимия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, ПИСАРЕНКО Олег Иванович Москва – 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………….....8 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ………………………………………......14 1.1 Апелин и APJ рецептор...………………………………………………...14 1.2 Физиологическая роль системы апелин/APJ………….......…………....18 1.3 Действие апелина при патологических состояниях.…………………...22 1.4 Механизмы защитного действия апелина.…....………………………...25 1.5 Структурные аналоги апелина.………………………………………….33 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ……………...37 2.1 Пептиды апелина...……………………………………………………….37 2.2 Реактивы…………………………………………………………………..38 2.3 Животные…………………………………………………………………39 2.4 Перфузия изолированного сердца крысы……………………………....39 2.5 Региональная ишемия сердца крысы in vivo…………………………...42 2.6 Оценка размеров ИМ…………………………………..………………...45 2.7 Приготовление безбелковых экстрактов ткани сердца……..…………46 2.8 Определение метаболитов энергетического обмена…………………..46 2.9 Определение активности МВ-КК и ЛДГ в плазме крови крыс…….....49 2.10 Определение активности ЛДГ в перфузате изолированного сердца…………………………………………………………………….51 2.11 Определение активности антиоксидантных ферментов, содержания МДА и белка в сердце крысы……………….......…..……52 2.12 Оценка влияния пептидов на активность коммерческих ферментов СОД и КАТ………………………………………………….55 2.13 Регистрация активных форм кислорода в перфузате………………...55 2.14 Статистическая обработка результатов исследования………………..56 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ……………………………………………………..57 3.1 Защитное действие апелина на ишемизированное изолированное сердце крысы…………………………………………………………….57 3 3.1.1 Влияние пептида А12 на восстановление функции изолированного сердца крысы …………………………………...57 3.1.2 Влияние А12 на выведение ЛДГ в миокардиальный эффлюент…………………………………………………………...60 3.1.3 Влияние структурных аналогов пептида А12 на восстановление функции изолированного сердца крысы………............................61 3.1.4 Влияние структурных аналогов пептида А12 на активность ЛДГ в перфузате………………………………………………………….62 3.1.5 Энергетическое состояние реперфузированного сердца крысы………………………………………………………………..63 3.2 Защитное действие апелина при региональной ишемии и реперфузии сердца крысы in vivo…………………………………………………….65 3.2.1 Влияние внутривенного введения пептида А12 на размеры ИМ…………………………………………………………….…….65 3.2.2 Влияние внутривенного введения пептида А12 на гемодинамические показатели…………………………………….66 3.2.3 Влияние внутривенного введения пептида А12 на активность маркеров некроза………………………………………..................68 3.2.4 Влияние структурных аналогов пептида А12 на размеры ИМ……………………………………………………………….….69 3.2.5 Влияние структурных аналогов пептида А12 на активность маркеров некроза…………………………………………………...69 3.2.6 Влияние структурных аналогов пептида А12 на изменения гемодинамических показателей…………………………………...70 3.2.7 Эффективность защиты сердца пептидом А12 и его структурными аналогами………………………………………….71 3.2.8 Действие пептида А12 и его структурных аналогов на метаболизм ишемизированного миокарда………………………..72 3.3 Влияние L-NAME на кардиозащитное действие А12 и его структурного аналога АII……………………………………………….74 4 3.3.1 Восстановление коронарного потока и функции изолированного сердца крысы……………………………………………………….75 3.3.2 Влияние L-NAME на выход ЛДГ в перфузат...............................76 3.3.3 Энергетическое состояние реперфузированного сердца при введении L-NAME…………………………………………………77 3.3.4 Гемодинамические показатели у наркотизированных крыс in vivo при введении L-NAME……………………………………….78 3.3.5 Размеры ИМ и активность маркеров некроза при введении LNAME у крыс in vivo………………………………………………80 3.3.6 Энергетическое состояние ЗР при введении L-NAME у крыс in vivo…………………………………………………………………..82 3.4 Антиоксидантные свойства пептида А12 и его структурного аналога АII………………………………………………………………………...83 3.4.1 Влияние пептидов на активность ферментов антиоксидантной защиты и перекисное окисление липидов в изолированном перфузируемом сердце………………………………………….....84 3.4.2 Влияние пептидов на активность ферментов антиоксидантной защиты и перекисное окисление липидов в сердце крыс in vivo…………………………………………………………………..85 3.4.3 Влияние пептидов на активность коммерческих ферментов СОД и КАТ…………………………..........................…………………...86 3.4.4 Влияние пептидов на образование АФК при реперфузии изолированного сердца крысы…………………………………….88 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ………………………………..91 4.1 Биологическая активность природного пептида А12………………….91 4.2 Кардиопротекторные свойства структурных аналогов А12………......96 4.3 Механизмы действия структурных аналогов А12……………………..98 ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………….105 ВЫВОДЫ………………………………………………………………………107 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ……………………………………108 5 БЛАГОДАРНОСТИ………………………………………………………….108 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………...……109 ПРИЛОЖЕНИЯ…………………………………………………….………...127 6 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ Akt – протеин киназа B APJ – апелиновый рецептор Рразв – развиваемое левым желудочком давление, Рразв=Psys – (Pdia)min Cu/Zn СОД – медь/цинковая супероксиддисмутаза pA13 – [Pyr1] апелин-13 DAG – диацилглицерол PI3K – фосфатидилинозитол-3киназа ERK (extracellular signal-regulated kinase) – киназа, регулируемая внеклеточными сигналами PKC – протеинкиназа C IP3 – инозитол-1,4,5-трифосфат RISK (reperfusion injury salvage kinases) – защитные киназы реперфузионного повреждения JNK – c-Jun NH2-концевая киназа L-NAME – метиловый эфир NGнитро-L-аргинина L-NNA – NG-нитро-L-аргинин PLC – фосфолипаза С SR – саркоплазматический ретикулум А12 – апелин-12 MAPK (mitogen-activated protein kinase) – митоген-активируемые протеинкиназы А17 – апелин-17 NHE – Na+/H+ обменник АД – артериальное давление NCX – Na+/Ca2+ обменник ΣАН – общий пул адениннуклеотидов, ΣАН=АТФ+АДФ+АМФ NG-MMLA – NG-монометил-Lаргинин NO – оксид азота Pсист – систолическое давление Pдиаст – диастолическое давление Pперф – перфузионное давление А36 – апелин-36 АО – аортальный объем АДФ – аденозиндифосфат АМФ – аденозинмонофосфат АПФ2 – ангиотензинпревращающий фермент 2 7 АТФ – аденозинтрифосфат АФК – активные формы кислорода ГП – глутатионпероксидаза ЗР – зона риска ИМ – инфаркт миокарда ИБС – ишемическая болезнь сердца ИСФ – показатель интенсивности сократительной функции, ИСФ=Рразв×ЧСС КАТ – каталаза ΣКр – общий креатин, ΣКр=ФКр+Кр КП – коронарный поток КС – коронарное сопротивление, КС=Рперф/КП ЛЖ – левый желудочек ЛДГ – лактатдегидрогеназа МВ-КК – МВ-фракция креатинкиназы МДА – малоновый диальдегид МО – минутный объем, MO=КП+АО НАДН – никотинамидадениндинуклеотид восстановленный НАДФН – никотинамидадениндинуклеотидфо сфат восстановленный ПОЛ – перекисное окисление липидов РКХ – раствор Кребса-Хензеляйта САД – систолическое артериальное давление ТФТ – 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид УО – ударный объем, УО=МО/ЧСС ФКр – фосфокреатин цГМФ – циклический гуанозинмонофосфат цАМФ – циклический аденозинмонофосфат ЧСС – частота сердечных сокращений ЭП – энергетический потенциал, ЭП=(АТФ+0,5АДФ)/ΣАН ЯМР – ядерный магнитный резонанс. 8 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования За последние десятилетия заболевания сердечно-сосудистой системы в Российской Федерации выявлены почти у 12 миллионов человек, и их частота значительно увеличивается с возрастом. Распространение сердечнососудистой патологии требует разработки и эффективного лечения ишемической болезни сердца (ИБС) – одной из основных причин смертности и инвалидизации населения. Патофизиологической основой ИБС и таких ее тяжелых форм как инфаркт миокарда (ИМ) и сердечная недостаточность является ишемическое и реперфузионное повреждение сердца. Этот тип повреждения возникает также при трансплантации сердца и является частым осложнением при кровообращения. операциях Высокая с использованием социальная значимость искусственного ишемического и реперфузионного повреждения сердца обусловила интенсивное изучение механизмов этого синдрома и разработку средств для его лечения. Тяжесть ишемического повреждения миокарда зависит от степени нарушения кровообращения, продолжительности и интенсивности ишемии. Как известно, ишемия приводит к изменениям в энергетическом обмене кардиомиоцитов: снижению гликолиза/гликогенолиза, которые синтеза АТФ, активации сопровождаются увеличением образования НАДH и НАДФH, внутриклеточным ацидозом и нарушениями ионного гомеостаза. Последующее восстановление коронарного кровотока инициирует развитие реперфузионного повреждения. В условиях сниженного образования макроэргических фосфатов и перегрузки ионами Са2+ образование активных форм кислорода (АФК) вызывает необратимые повреждения клеточных структур – липидов, белков и ДНК, приводящие к гибели кардиомиоцитов – некрозу и апоптозу. Наряду с дисфункцией 9 миокарда и происходит развитием аритмий, структурное и при реперфузионном функциональное повреждении повреждение сосудов микроциркуляторного русла, вызванное эндотелиальной дисфункцией в артериолах и капиллярах, отеком перикапиллярных тканей и воспалительной реакцией в ответ на ишемию, обуславливающее феномен no-reflow. Интенсификация процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) мембран клеток и внутриклеточных структур сопровождается снижением активности ферментов антиоксидантной защиты. Очевидно, что для ослабления повреждения такого комплексного характера требуется одновременное воздействие на метаболизм, ионный обмен, образование АФК и антиоксидантную систему миокарда. Традиционно являются использующимися нитросоединения адреноблокаторы, ингибиторы средствами при пролонгированного ангиотензин лечении ИБС действия, - превращающего фермента (АПФ), сердечные гликозиды и их комбинации. Каждый класс этих препаратов способен оказывать побочные действия, приводящие к снижению эффективности лечения ИБС. В связи с этим принципиально важным остается создание кардиопротекторным соединений, и безопасным обладающих действием. более В выраженным последние годы распространение получили новые классы метаболически активных или цитопротекторных антиишемических препаратов. Их полезные эффекты связаны со снижением синтеза карнитина и транспорта длинноцепочечных жирных кислот в митохондриях, а также с уменьшением накопления в клетках активированных форм неокисленных жирных кислот – производных ацилкарнитина и ацилкофермента А. Наряду с этим в различных лабораториях проводится направленный поиск новых соединений, способных воздействовать на адаптационные механизмы в миокардиальных клетках в условиях изменившегося кислородного и энергетического обеспечения и таким образом уменьшать повреждение сердца. При ишемии и 10 последующей реперфузии в миокарде усиливается образование ряда присущих организму факторов – адипокинов, цитокинов и вазоактивных пептидов, инициирующих механизмы запрограммированного клеточного выживания, которые запускаются каскадами реперфузионных киназ. К таким соединениям относится адипокин апелин, являющийся лигандом сопряженного с Gi-белком APJ рецептора. Апелин активно экспрессируется различными тканями, включая эндотелиальные и гладкомышечные клетки коронарных сосудов и кардиомиоциты. Активация системы апелин/APJ оказывает мощное регуляторное действие на сердечно-сосудистую систему. Недавно было обнаружено, что С-концевые фрагменты апелина (апелин-36 и апелин-13) обладают кардиопротекторной активностью и способны защищать сердце от ишемического и реперфузионного стресса. Это указывает на целесообразность изучения возможности использования таких пептидов в качестве потенциальных лекарственных средств. Однако из-за высокой активности амино- и карбоксипептидаз период полужизни Сконцевых фрагментов апелина в биологических средах составляет несколько минут, что затрудняет их применение в клинике. В связи с этим актуальной задачей является исследование биологической активности протеолитически устойчивых фармакологических лигандов APJ рецептора. Цель работы состояла в изучении кардиопротекторного действия новых, химически модифицированных аналогов природного апелина-12 (А12) при моделировании ишемического и реперфузионного повреждения сердца. Задачи 1. Выяснить влияние структурных аналогов А12 на метаболизм ишемизированного сердца и повреждения клеточных мембран на моделях ex vivo и in vivo. 11 2. Изучить влияние внутривенного введения структурных аналогов А12 на изменения показателей гемодинамики и ограничения размеров ИМ у крыс in vivo. 3. Выяснить роль NO-синтазы в механизмах защитного действия этих пептидов. 4. Оценить влияние исследуемых пептидов на антиоксидантное состояние реперфузированного сердца и образование активных форм кислорода и продуктов перекисного окисления липидов. 5. Исследовать эффективность кардиозащиты структурными аналогами А12 с целью выбора оптимальной пептидной молекулы для создания противоишемического лекарственного средства. Научная новизна Впервые получены экспериментальные подтверждения того, что синтетические аналоги природного пептида А12 способны защищать сердце в условиях экспериментальной ишемии и реперфузии. Показано, что введение этих пептидов улучшает восстановление функции изолированного сердца крысы при реперфузии и ограничивает размеры ИМ при внутривенном введении у крыс in vivo. Выяснено, что эти эффекты сопровождаются лучшим сохранением энергетического обмена и стабильности мембран постишемических кардиомиоцитов. Обнаружено, что снижение образования АФК и уменьшение ПОЛ при реперфузии под действием структурных аналогов А12 обусловлено увеличением активности ключевых ферментов антиоксидантной защиты сердца – медь/цинковой супероксиддисмутазы (Cu/Zn СОД), каталазы (КАТ) и глутатионпероксидазы (ГП). 12 Теоретическая и практическая значимость работы. Выяснено, что механизмы действия новых синтетических аналогов A12 при экспериментальной ишемии и реперфузии сердца связаны с образованием NO и антиоксидантными свойствами пептидов. Доказана перспективность использования модифицированных С-концевых фрагментов апелина для создания лекарственных препаратов, обладающих антиишемическим действием. На основании полученных результатов выбрана оптимальная молекула пептида, обеспечивающая наиболее эффективную защиту сердца и минимальные нарушения показателей гемодинамики. Положения, выносимые на защиту 1. Структурные аналоги А12 улучшают восстановление сократительной и насосной функции сердца и уменьшают размеры ИМ при экспериментальной ишемии и реперфузии. 2. Модифицированные пептиды улучшают энергетическое состояние реперфузированного сердца и снижают повреждения мембран кардиомиоцитов. 3. Введение ингибитора NO-синтаз L-NAME ослабляет кардиозащитное действие пептидов. 4. Структурные аналоги А12 улучшают антиоксидантное состояние реперфузированного сердца, снижают образование АФК и перекисное окисление липидов. 5. Наиболее эффективные аналоги А12 целесообразно использовать для создания противоишемических лекарственных средств. 13 Структура и объем диссертации Диссертация написана по традиционному типу, содержит 135 страниц машинописного текста. Состоит из введения, списка сокращений, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка цитированной литературы и приложений. Список литературы включает в себя 144 отечественных и иностранных источника. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 18 рисунками. Приложения включают 8 таблиц. Степень достоверности и апробация результатов По теме диссертации опубликовано 14 работ, в т.ч. 9 в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, получен 1 патент РФ на изобретение. Основные результаты диссертационной работы были представлены и обсуждены на всероссийских и международных конференциях, в том числе, на VII Международной Крымской конференции “Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии” (Cудак, Украина, 22–30 сентября 2011 года), Heart Failure 2012 (Белград, Сербия, 19– 22 мая 2012 года), FEBS Congress 2013 «Mechanisms in biology» (СанктПетербург, Россия, 6–11 июля 2013 года), IX Международной Крымской конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» (Cудак, Украина, 16–25 сентября 2013 года), VI Всероссийском форуме «Неотложная кардиология-2013» (Москва, Россия, 28–29 ноября 2013 года). 14 РАЗДЕЛ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Апелин и APJ рецептор. Апелин – эндогенный лиганд Gi- белоксопряженного APJ рецептора, впервые обнаруженный в пищеварительном тракте. Открытие APJ рецептора и апелина. В 1993 году O'Dowd и соавт. сообщили о клонировании гена, кодирующего новый G-белоксопряженный рецептор класса А, расположенного в 11 хромосоме (локус 11q12). Было показано, что новый рецептор, получивший название APJ, имеет высокую гомологичность с рецептором ангиотензина II АТ1 (до 50% по гидрофобным трансмембранным областям), но не связывается с ангиотензином II [1]. APJ рецептор был идентифицирован у большого числа различных видов животных и человека. Рецептор человека состоит из 380 аминокислотных остатков и содержит 7 трансмембранных доменов. APJ мышей и крыс содержит 377 аминокислотных остатков и обладает гомологичностью с рецептором человека (91% и 89% соответственно). По причине отсутствия известного лиганда к нему, долгое время считался орфановым. В 1998 году из экстрактов бычьего желудка был выделен новый эндогенный 36аминокислотный пептид, названный апелин [2,3,4]. Было установлено, что это С-концевой фрагмент препробелка [2]. Апелин демонстрировал высокую степень связывания с APJ [5]. К настоящему времени нет никаких доказательств, что система апелин – APJ включает более одного рецептора. Молекулярные изоформы апелина. Ген апелина локализован в Х хромосоме (локус Xq25-q26.1) [5] и кодирует препробелок, состоящий из 77 аминокислотных остатков, с сигнальной последовательностью в N-концевой области. После транслокации в эндоплазматический ретикулум и отделения сигнального пептида образуется пробелок из 55 аминокислотных остатков, который затем укорачивается до активных пептидов, обозначающихся по количеству аминокислотных остатков с С-конца, например апелин-36, -17, - 15 13 и -12 (А36, А17, А13 и А12) [2,4,6]. Кроме того, А13 может подвергаться посттрансляционному пироглутаминированию на уровне N-концевого остатка глутамина (pA13). Эти короткие изоформы состоят из C-концевых фрагментов, которые могут быть ответственны за связывание с рецептором и биологическую активность апелина [4,7]. Было обнаружено, что препроапелин в нативной ткани существует как димер, стабилизированный дисульфидными мостиками остатков цистеина, а А36 и А13 являются мономерами [7]. Есть основания полагать, что эндогенный апелин имеет много изоформ [8]. Во-первых, хроматографические характеристики апелина, выделенного из экстрактов бычьего желудка были гетерогенными. Вовторых, в последовательности препробелка бычьего апелина по ходу транскрипции после секреторной сигнальной последовательности из 22 аминокислотных остатков располагается много лизиновых (например, в положении 32, 61 и 72) и аргининовых (например, в положении 40, 46, 49, 59, 60, 63, 64, 66 и 68) остатков, которые являются потенциальными сайтами протеолитического расщепления [8]. В-третьих, синтетические пептиды апелина короче А36 (например, А17, А13, pА13) проявляют очень высокую активность к взаимодействию с APJ [2]. Кроме того, в молозиве крупного рогатого скота было обнаружено присутствие 46 различных пептидов апелина: от пробелка до А12 [9]. Таким образом, само понятие «эндогенный апелин» включает в себя совокупность различных изоформ пептида. Деградация апелина. К настоящему времени схема деградации апелина полностью не изучена, однако известно, что АПФ2 отщепляет Сконцевой фенилаланин (например, у А36 и А13) [10]. Исследование активности структуры in vitro показало, что такая модификация не инактивирует пептид, поскольку без С-концевого фенилаланина он сохраняет связывание с рецептором и свою функциональную активность у крыс, однако такой фрагмент не вызывает интернализацию рецептора in vitro и приводит к потере гипотензивного эффекта у крыс in vivo [11]. Эти данные свидетельствуют о том, что укороченные действием АПФ2 фрагменты 16 вызывают конформационное состояние APJ рецептора, отличающееся от вызванного неукороченными пептидами. Кроме того, природные пептиды, циркулирующие в кровотоке активно подвергаются действию амино- и карбоксипептидаз. В опытах in vitro на плазме 10 здоровых добровольцев [12] было показано, что 80-мин. инкубация при комнатной температуре приводила к более чем 90% деградации А12, А13, А17, А36, а деградация pA13 составляла менее 50%. Большая стабильность наблюдалась при инкубации при 4°С в присутствии ингибиторов сериновых, цистеиновых и металлопротеаз, в этом случае к 80-й минуте деградация пептидов составляла менее 30%, за исключением A13 с гораздо большей степенью распада [12], при этом А13 описан как субстрат АПФ2 – металлопротеазы, которая принимает участие в деградации апелина [10]. Кроме того, апелин быстро выводится из кровотока с временем полужизни в плазме не более 8 мин. [13,14,15]. Показано, что все предсказанные изоформы апелина присутствуют in vivo, но в сердечной ткани человека преобладающей является pA13 [16], что, по-видимому, объясняется защитой N-конца пептида пироглутаматной частью от экзопептидазной деградации [17]. В плазме преобладающими изоформами являются А17, А13 и pА13 [18,19]. Активность пептидов апелина варьируется в зависимости от экспериментальной системы, однако А13 и pА13 являются наиболее мощными активаторами APJ рецептора, которые экспрессируются клеточными линиями [2,6,8]. Связывание с рецептором. Предполагается, что за диссоциацию с APJ отвечает N-концевая область апелина [4]. Данные опытов in vitro показывают, что pA13 может более эффективно связываться с APJ, чем А36, но А36 показывает более медленную диссоциацию с APJ, чем pA13, таким образом вызывая пролонгированную биологическую активность. Работы по изучению структуры и активности апелина обнаружили, что последовательности аминокислотных остатков Arg-Pro-Leu-Arg и Lys-GlyPro-Met явяляются наиболее существенными для связывания пептида A13 с 17 APJ рецептором (рис. 1), а замены Gln1, His7, Pro12 и Phe13 незначительно ухудшают сродство с рецептором [20]. Было показано, что два С-концевых фрагмента апелина N-ацетил-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe-COOH и N-ацетил-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe-COOH проявляют низкое сродство к APJ рецептору [20]. Кроме того, замена в структуре А13 Leu5 или Arg2 на Ala приводит к значительному (более чем 50-кратному) снижению способности связывания с APJ рецептором. Таким образом, последовательность Arg-ProLeu-Arg в структуре апелина играет ключевую роль для связывания с рецептором. Эта гипотеза подтверждается результатами ЯМР исследований А17 (NH2-Lys-Phe-Arg-Arg-Gln-Arg-Phe-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met- Pro-Phe-COOH), которые показали, что последовательность Arg-Pro-Leu-Arg образует четко определенный тип β-поворота в растворе [21,22], который, как полагают, играет решающую роль в узнавании и связывании эндогенных пептидов с G-белоксопряженными рецепторами [23]. Рис. 1. Структура апелина-13. Macaluso и соавт., Chem Med Chem 2010 [88]. В работе исключительная Murza важность и соавт. [24] была пространственной продемонстрирована ориентации некоторых аминокислотных остатков пептида А13, в особенности Arg2, Pro3, Arg4 и в меньшей степени Pro12. Также было изучено влияние на связывание с рецептором модификации С-концевой части молекулы, состоящей в замене Phe13 на различные типы ароматических групп. Это позволило более четко 18 определить форму С-концевого кармана связывания, демонстрируя возможность гидрофобных неароматических взаимодействий и подтверждая связь С-концевого Phe с электрон-насыщенными аминокислотными остатками кармана связывания APJ рецептора. Также была предпринята попытка модификации центральной части молекулы заменой аминокислотных остатков на различные линкеры (полиэтиленгликоль, аланин), демонстрируя важность жесткости конструкции и расстояния между двумя эпитопами [24]. Таким образом, показана исключительная важность последовательности аминокислот Arg-Pro-Leu-Arg в структуре апелина и Сконцевого фенилаланина для связывания с рецептором. Распределение в организме. мРНК апелина и APJ рецептора широко экспрессируются практически во всех тканях и органах. Особенно высоки их концентрации в мозжечке, сосудистом эндотелии, сердце, легких, почках, печени, надпочечниках и жировой ткани [2,4-7,25]. APJ рецепторы в сердце обнаруживаются в эндотелии, гладкомышечных клетках и кардиомиоцитах, сходно с рецептором AT1 [26]. Хемотаксис. В опытах in vitro на клетках яичников китайских хомячков линии CHO-A10 обнаружилось мощное хемотаксическое действие pA13 в большей степени, и А36 – в меньшей [4]. Было показано, что миграция в ответ на апелин является хемотаксическим действием, а не хемокинетическим. Секреция. Апелин секретируется жировыми клетками и относится к группе адипоцитокинов. Причем в стадии созревания этих клеток апелин секретируется в гораздо больших количествах по сравнению с дифференцированными адипоцитами [27]. Секреция апелина угнетается при голодании и вновь увеличивается при последующем приеме пищи [28]. 1.2 Физиологическая роль системы апелин/APJ. В настоящее время считается, что апелин способен действовать как юкстакринный, паракринный и аутокринный регулятор. В последние годы показана существенная роль 19 апелина в физиологии человека как регуляторного пептида в сердечнососудистой, гипоталамо-гипофизарной, желудочно-кишечной и иммунной системах [29]. Многочисленные работы показывают, что активация апелинового рецептора может быть включена в регуляцию тонуса сосудов, сердечной сократимости и водного баланса [30]. Влияние на сосудистую систему. Было продемонстрировано, что апелин влияет на сосудистый тонус in vivo, вызывая снижение артериального давления у крыс [5,7,11,31] и вазодилатацию сосудов сопротивления предплечья у человека [13]. In vitro апелин вызывает вазодилатацию висцеральной артерии человека [32] преимущественно благодаря NOзависимому механизму. Апелин может также вызывать вазоконстрикцию подкожной вены [33] и грудной артерии [16] человека in vitro прямым действием на гладкую мускулатуру сосуда. Регуляция сосудистого тонуса обеспечивается апелином, высвобожденным эндотелиальными клетками сосуда, который активирует рецепторы на поверхности эндотелиальных клеток, вызывая вазодилатацию, или на лежащих ниже гладкомышечных клеток, вызывая вазоконстрикцию. Связывание апелина с рецептором на поверхности эндотелия индуцирует высвобождение NO [31], потенциального вазодилататора, который вызывает релаксацию гладкомышечных клеток артериальной стенки. Работы, проведенные на нокаутных по гену апелинового рецептора мышах, показали присутствие баланса между сигнальным путем ангиотензина II, который повышает кровяное давление, и сигнальным путем апелина, который снижает давление. Активация рецептора обеспечивает формирование новых кровеносных сосудов (ангиогенез) [30]. Ангиогенная активность – это последствие действия апелина на пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток. Апелин является мощным ангиогенным фактором [34,35] и митогеном эндотелиальных [34,36] и гладкомышечных [37] клеток сосудов. Он активирует внутри клетки сигнальные каскады (фосфорилирование ERK, Akt и p70S6 киназ), которые приводят к пролиферации эндотелиальных клеток и 20 формированию новых кровеносных сосудов. Показано, что апелин и его рецептор необходимы для нормального развития межсегментных сосудов у эмбрионов лягушки [35]. Исследования на клетках микрососудов мозга мышей показали, что апелин действует как митогенный, хемотаксический и антиапоптотический агент для эндотелиальных клеток. Было продемонстрировано, что нокаут по гену апелина у мышей связан со снижением развития ретинальных сосудов [38], а нокаут по гену апелинового рецептора у мышей приводит к дефектам развития сердечно-сосудистой системы [39]. Подобно многим другим ангиогенным факторам экспрессия APJ возрастает в условиях гипоксии [35]. Инотропное действие. Апелиновый рецептор экспрессируется на начальных стадиях формирования сердца в эмбриональном периоде, где он регулирует миграцию прогениторных клеток, дифференцирующихся в сократительные клетки – кардиомиоциты. Экспрессия APJ также обнаружена в кардиомиоцитах взрослых животных, где апелин ведет себя как один из самых мощных стимуляторов сердечной сократимости [40-45]. Было продемонстрировано, что апелин оказывает положительное инотропное действие на сердце крыс [40-42] и мышей [43] in vivo. Исследования in vitro показали, что апелин является сильным положительным инотропным агентом благодаря прямому действию на сердце у крыс [44] и человека [45]. Это один из самых мощных стимуляторов сердечной сократимости, известных на данный момент, на изолированной сердечной ткани с полумаксимальной эффективной концентрацией EС50 от 40 до 125 пМ в ткани сердца человека [45] и 33 пМ в ткани сердца крысы [44]. Пожилые нокаутные по прогрессивное гену апелина ухудшение и APJ сердечной рецептора мыши сократимости показывают независимо от внутриклеточного транспорта ионов Ca2+: потерю способности к укорочению саркомеров и уменьшение скорости сокращения и расслабления миофибрилл [39]. 21 Регуляция жидкостного гомеостаза. Экспрессия апелина и его рецептора подобно антидиуретическому гормону – вазопрессину – происходит также в магноцеллюлярных нейронах супраоптического и паравентрикулярного ядер гипоталамуса, т.е. областей мозга, включенных в потребление пищи и воды [5]. Введение апелина увеличивает потребление воды, а также уменьшает в гипоталамусе секрецию вазопрессина. Показано, что интрацеребровентрикулярная инъекция апелина мышам ингибирует активность вазопрессиновых нейронов и высвобождение вазопрессина, уменьшая его концентрацию в плазме и усиливая диурез [18]. Обезвоживание усиливает экспрессию апелина и уменьшает экспрессию вазопрессина у крыс [46]. Этот диуретический эффект апелина вместе с его гипотензивным эффектом принимает глобальное участие в гомеостатической регуляции жидкостей тела. Апелин также обнаружен в областях мозга, контролирующих аппетит, но его действие на потребление пищи очень противоречиво. Пищеварение. Апелиновый рецептор экспрессируется в желудочных энтерохромаффиноподобных клетках, некоторых клетках поджелудочной железы, эпителиальных клетках кишечника. В желудке активация APJ рецепторов на секретируемым энтерохромаффиноподобных париетальными клетками клетках может апелином, ингибировать высвобождение энтерохромаффиноподобными клетками гистамина, который в свою очередь уменьшает секрецию кислоты париетальными клетками. В поджелудочной железе апелин ингибирует секрецию инсулина, индуцированную глюкозой. Таким образом, существует функциональная взаимозависимость между сигнальными путями апелина и инсулина на уровне адипоцитов, где инсулин стимулирует продукцию апелина [27]. Влияние на жировую ткань. Адипоциты, секретирующие апелин, являются возможными источниками плазматического апелина [27]. На экспрессию апелина в жировой ткани влияют многие факторы, в том числе голодание [27], гипоксия [28,47], инсулин [27,48]. В то время как инсулин 22 стимулирует экспрессию апелина жировой тканью [27,48], апелин ингибирует секрецию инсулина [49], демонстрируя взаимозависимость этих двух систем. Активация APJ также принимает участие в усвоении глюкозы благодаря АМФ-зависимой активации протеинкиназы С и Akt [50]. Апелин может быть также вовлечен в васкуляризацию жировой ткани [47]. 1.3 Действие апелина при патологических состояниях. Ожирение и диабет. Данные, имеющиеся в современной литературе, указывают, что плазматический апелин положительно коррелирует с индексом массы тела человека, а увеличенная экспрессия апелина в плазме и жировой ткани у пациентов с ожирением может быть снижена благодаря низкокалорийной диете, приводящей к потере веса [51]. Однако на моделях ожирения у мышей было показано, что не ожирение, а уровень инсулина является основным фактором, определяющим повышение экспрессии апелина [27]. Это означает, что экспрессия апелина увеличивается не просто при ожирении, а в ответ на гиперинсулинемию, связанную с ожирением, хотя исследование влияния плазматического апелина на сахарный диабет 2 типа дает разрозненные результаты [52,53]. Регуляция экспрессии апелина при ожирении может быть полезной при метаболическом синдроме, потому что периферийное введение апелина улучшает толерантность к глюкозе и ее утилизацию при ожирении у инсулин-резистентных мышей [50]; и наоборот, нокаутные по гену апелина мыши обладают сниженной чувствительностью к инсулину [54]. Апелин также уменьшает количество жировой ткани у мышей с ожирением, не изменяя потребление пищи, путем увеличения экспрессии разобщающих белков и расхода энергии [55]. Регуляция метаболизма апелином при ожирении может также оказать благоприятное действие на сердечно-сосудистую систему, снижая гипертензию и повышая сократимость сердца. Сердечно-сосудистые заболевания. Имеются работы, посвященные изучению работы системы апелин/APJ рецептор при сердечно-сосудистых 23 заболеваниях. В ряде исследований были отмечены изменения уровня апелина в плазме крови человека в условиях сердечной дисфункции с довольно противоречивыми результатами и очень широким диапазоном концентраций (20 – 4000 пг/мл) в зависимости от используемой модели и метода определения. плазматического В апелина основном возрастает предполагается, на ранних что стадиях уровень сердечной недостаточности [56], но возвращается к исходному уровню или снижается на более поздних стадиях [56,57,58]. Было установлено, что экспрессия мРНК APJ снижается в левом желудочке у пациентов с идиопатической дилатационной кардиомиопатией [59]. Эти данные позволяют предположить, что увеличение уровня экспрессии апелина на ранних стадиях заболевания может быть компенсаторным действием, повышающим силу сокращения сердца. Уровень экспрессии апелина и его рецептора затем может подавляться на более поздних стадиях, когда его положительные инотропное действие начнет ухудшать состояние сердца в связи с увеличением потребности в кислороде. Эти результаты согласуются с данными исследований на животных моделях сердечной недостаточности. Уровень апелина в сердце возрастает в ответ на гипоксию через гипоксияиндуцибельный фактор-1 [60]. Кроме того, уровень экспрессии апелина и его рецептора повышается при ишемической сердечной недостаточности у крыс [42,61]. Недавно было обнаружено участие системы апелин/APJ в патогенезе атеросклероза с помощью трансгенных моделей у мышей [62], хотя до сих пор неясно, несет это участие положительный или отрицательный эффект на этих моделях. У человека уровень экспрессии апелина увеличивается в атеросклеротической коронарной артерии [63]. Кроме того, уровни экспрессии апелина и APJ увеличивались при стенозе аортального клапана – процессе, который отражает некоторые признаки атеросклероза [64], демонстрируя вовлеченность апелиновой системы в атеросклероз у человека. Апелин также предотвращает образование аневризмы аорты у мышей [65]. 24 Также предполагается участие системы апелин/APJ при патофизиологическом ангиогенезе, которая способствует портосистемной коллатерализации и висцеральной неоваскуляризации у портальных гипертензивных крыс [66], неоангиогенезу при циррозе печени [67] и неоангиогенезу опухоли [68,69]. Тем не менее, ангиогенное действие апелина [70,71] может вносить серьезный вклад в восстановление сердца после ишемии. Таким образом, апелин очень важен для сохранения сердечной функции. Защитное действие апелина при ишемическом и реперфузионном повреждении сердца. Этой проблеме посвящено незначительное количество работ. Имеющиеся в современной литературе данные показывают, что под действием апелина происходит уменьшение ишемического и реперфузионного повреждения миокарда у экспериментальных животных в условиях острых опытов in vitro и in vivo [72-75]. В работе Zeng и соавт. [72] на модели изолированного сердца крысы, перфузируемого по Лангендорфу, было показано, что глобальная ишемия приводит к значительному увеличению экспрессии APJ рецептора на уровне мРНК и производства белка, а также к ухудшению сердечной функции, которая существенно улучшается после перфузии раствором, содержащим А13. Кроме того, на модели аноксии/реоксигенации неонатальных кардиомиоцитов крысы было продемонстрировано, что применение А13 уменьшает апоптоз и генерацию АФК, увеличивает активность СОД и снижает образование малонового диальдегида (МДА). Rastaldo и соавт. [73] показали снижение эффективности применения А13 до ишемии на модели изолированного сердца крысы, перфузируемого по Лангендорфу. Однако перфузия раствором, содержащим А13, по окончании периода глобальной ишемии приводила к уменьшению размеров ИМ в 2 раза по сравнению с контролем и ограничению реперфузионной контрактуры, а также к снижению активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в миокардиальном эффлюенте. Существенно, что данные эффекты отменялись в присутствии ингибитора NO-синтазы L-NNA, 25 демонстрируя NO-зависимый механизм кардиозащитного действия апелина. Кроме того, было показано, что ишемический период увеличивает экспрессию APJ рецептора на уровне белка. Simpkin и соавт. [74] провели сравнительное исследование эффективности действия двух С-концевых фрагментов апелина – А13 и А36, которое и на модели изолированного сердца крысы и на модели острого ИМ у мышей in vivo показало уменьшение размеров ИМ под действием А13 в большей степени, А36 – в меньшей. В хронических экспериментах in vivo пятидневное введение крысам пептида рА13 после окклюзии ПНА уменьшало размеры ИМ к окончанию двухнедельного периода реперфузии [75]. 1.4 Механизмы защитного действия апелина. Влияние на сократимость сердца. Апелин действует как белковый медиатор с ярко выраженной регуляторной активностью в сердце. Один из основных путей передачи сигнала от апелина зависит от взаимодействия с Giбелком, сопряженным с APJ рецептором, независимо от Ras белка, хотя и зависит от протеинкиназы протеинкиназы С C, фосфолипазы [76]. С, Действительно, Na+/Ca2+ и ингибирование Na+/H+ обменников значительно уменьшает, положительный инотропный эффект апелина. В кардиомиоцитах связывание апелина с APJ активирует (рис. 2) фосфолипазу С (PLC), которая превращает фосфатидилинозитол-4,5-бифосфат в инозитол1,4,5-трифосфат (IP3) и диацилглицерол (DAG). В то время как IP3 увеличивает концентрацию Ca2+, открывая IP3-рецепторы саркоплазматического ретикулума (SR), DAG фосфорилирует протеинкиназу С (РКС). РКС активирует Na+/H+ обменник (NHE), вызывая увеличение внутриклеточной концентрации Na+, который в свою очередь активирует Na+/Ca2+ обменник (NCX), что приводит к увеличению концентрации Ca2+ в кардиомиоцитах. Это первоначальное увеличение цитозольной концентрации Ca2+ отвечает за открытие рианодиновых рецепторов с дальнейшим высвобождением Ca2+ из саркоплазматического ретикулума. 26 Рис. 2. Внутриклеточные пути сигнализации системы апелин–APJ рецептор, ответственные за положительный инотропный эффект. Ladeiras-Lopes и соавт., Arq Bras Cardiol 2008 [76]. DAG – диацилглицерол; Gi – ингибиторный G-белок; IP3 – инозитол трифосфат; NCX – Na+/Ca2+ обменник; NHE – Na+/H+ обменник; PKC – протеинкиназа C; PLC – фосфолипаза C; SR – саркоплазматический ретикулум. Общее увеличение внутриклеточной концентрации Ca2+ приводит к увеличению сократимости миокарда. Блокирование отдельных участков этих сигнальных путей значительно уменьшает сократимость миокарда. Так введение на изолированном перфузируемом сердце крысы совместно с апелином ингибиторов PLC (U-73122), PKC (стауроспорина, GF-109203X), Na+/H+ обменника (MIA и зонипорида) или Na+/Ca2+ обменника (KB-R7943) значительно снижало положительный инотропный эффект апелина [44]. Недавно Hashimoto и соавт. [77] показали, что апелин индуцирует фосфорилирование легких цепей миозина в гладкомышечных клетках сосудов, которое имеет большое значение в инициации сокращения гладких мышц. Ингибирование протеинкиназы C, Na+/Ca2+ и Na+/H+ обменников приводит к значительному уменьшению этого эффекта. Влияние на тонус сосудов. В большом числе экспериментальных и клинических исследований было продемонстрировано, что апелин влияет на сосудистый тонус преимущественно благодаря NO-зависимому механизму 27 [5,7,11,31]. Lee и соавт. [5] впервые обнаружили кратковременное снижение систолического и диастолического давления (приблизительно на 10 мм рт.ст.) после внутривенной инфузии А13 у анестезированных крыс. Внутривенное введение pА13 здоровым добровольцам и пациентам с хронической сердечной недостаточностью вызывало артериальную вазодилатацию, которую отменяло введение ингибитора NOS NG-монометилL-аргинина (NG-MMLA) [13]. В дополнение к этому Tatemoto и соавт. [31] обнаружили, что гипотензивное действие обратно коррелирует с молекулярной массой изоформ апелина (для А12, А13 и А36), а также эффект снижения артериального давления отменялся в присутствии ингибитора NOсинтазы метилового эфира NG-нитро-L-аргинина (L-NAME). Более того, введение А12 обеспечивало временный подъем концентрации нитритов и нитратов в плазме крови от исходного уровня на 20%, что свидетельствует о том, что вазоактивные эффекты возникают посредством NO-зависимого механизма. Действительно, апелин вызывает эндотелий-зависимую вазодилатацию через увеличение фосфорилирования эндотелиальной NOсинтазы [78]. Под действием образующегося NO происходит активация растворимой гуанилатциклазы в гладкомышечных клетках, которая приводит к образованию цГМФ и расслаблению этих клеток, вызывая вазодилатацию (рис. 3). Однако, апелин может вызвать и вазоконстрикторный эффект при контакте с дисфункциональным эндотелием [33]: в этом случае он будет напрямую действовать на гладкомышечные клетки сосуда, которые также экспрессируют APJ рецептор, увеличивая концентрацию внутриклеточного Ca2+ и вызывая сокращение гладкомышечных клеток сосудов. Значение образования NO при действии апелина не столь очевидно, и многие авторы расходятся во мнении о роли NO в механизмах действия апелина. В некоторых исследованиях снижение ишемического и реперфузионного повреждения изолированного перфузируемого сердца крысы и культуры неонатальных кардиомиоцитов под действием А13 сопровождалось одновременным увеличением экспрессии эндотелиальной 28 NO-синтазы [72]. В то же время под действием А13 в изолированном сердце мыши, подвергнутом региональной ишемии и реперфузии, увеличения фосфорилирования эндотелиальной NO-синтазы обнаружено не было [74]. Рис. 3. Вазоактивное действие апелина. Ladeiras-Lopes и соавт., Arq Bras Cardiol 2008 [76]. Gi – ингибиторный G-белок; PI3K – фосфатидилинозитол-3-киназа; Akt – протеинкиназа В; eNOS – эндотелиальная NO-синтаза; sGC – растворимая гуанилатциклаза; cGMP – цГМФ; PLC – фосфолипаза C; IP3 – инозитол трифосфат; DAG – диацилглицерол; PKC – протеинкиназа C. Запуск каскада реперфузионных киназ (RISK сигнализация). Большинство исследователей полагает, что в основе кардиопротекторного действия апелина лежат механизмы запрограммированного клеточного выживания, которые запускаются фосфорилированием реперфузионных киназ (RISK) [79-83]. Существует несколько путей внутриклеточной сигнализации, которыми осуществляется регуляция метаболизма апелином. Введение апелина на реперфузии, сразу после периода ишемии приводит к активации G-белоксопряженного APJ рецептора и передаче внеклеточного сигнала вторичному мессенджеру (Gi-белку). Один из путей связан с дальнейшим фосфорилированием PI3 и Akt киназ (рис. 4). Существенно, что 29 данный путь включает компоненты киназного каскада, действие которых прямо связано с образованием NO в результате активации eNOS протеинкиназой В (Akt). Последующая активация гуанилатциклазы под действием образующегося NO приводит к образованию цикло-ГМФ, который в свою очередь активирует протеинкиназу G и ε-изоформу протеинкиназы С. Следствием этого является открытие митохондриальных АТФ-зависимых К+каналов, инициирующих закрытие МХ поры [79,81,84]. Рис. 4. Внутриклеточные пути сигнализации системы апелин/APJ рецептор. Rastaldo и соавт., Antioxid Redox Signal 2011 [79]. Gi – ингибиторный G-белок; Ras – семейство малых G-белков; MEK1/2 – киназа митоген-активируемой протеинкиназы (MAP2K); ERK1/2 – киназа, регулируемая внеклеточными сигналами; BAX/BAD – проапоптотические белки; Cyt C – цитохром C; PI3K – фосфатидилинозитол-3-киназа; Akt – протеинкиназа В; eNOS – эндотелиальная NO-синтаза; GC – гуанилатциклаза; PKG – протеинкиназа G; PKCε – ε-изоформа протеинкиназы С; mitoK+ATP – митохондриальные АТФ-зависимые К+-каналы; митохондриальная пора. GSK-3β – гликогенсинтазы киназа 3β; mPTP – 30 Кроме того, еще одной мишенью Akt может быть киназа гликогенсинтазы-3β (GSK-3β), которая отвечает за метаболизм гликогена и белков, а также фосфорилирует транскрипционные факторы, регулирующие апоптоз [82,85]. Еще один сигнальный путь связан с активацией малых ГТФазных Ras белков, приводящей к запуску митоген-активируемого протеинкиназного (MAP-киназного) каскада: фосфорилированию киназы митоген-активируемой протеинкиназы (MAP2K) MEK1/2 (рис. 4). Это в дальнейшем приводит к фосфорилированию киназы р44/42, которая является киназой, регулируемой внеклеточными сигналами (ERK1/2). Данные МАРкиназы подавляют проапоптотические белки BAX и BAD либо напрямую, либо посредством дистальных сигнальных компонентов, таких как рибосомальные p70S6 и p90RS киназы, что в свою очередь приводит к ингибированию высвобождения цитохрома С, таким образом препятствуя открытию митохондриальной поры. Кроме того, было продемонстрировано, что Akt может ингибировать высвобождение митохондриального цитохрома С и сохранять митохондриальный потенциал независимо от BAD [84]. Возможным сигнальным путем является также фосфорилирование таких МАР-киназ как p38 и JNK (c-Jun NH2-концевая киназа), стрессактивируемых протеинкиназ, участвующие в ответе на действие цитокинов [86]. JNK отличается от ERK тем, что фосфорилирует транскрипционный фактор c-Jun в N-концевом трансактивационном домене вместо С-концевого сайта, где его фосфорилирует ERK. Каскад JNK активируется разными формами клеточного стресса, такими как тепловой шок, радиации и окисление, а также связыванием лигандов с внеклеточными рецепторами, включая G-белоксопряженные. Кроме того, к цитокинам, активирующим JNK, относятся воспалительные медиаторы: фактор некроза опухоли (ФНОα) и интерлейкин-1. JNK помимо c-Jun фосфорилирует и другие транскрипционные факторы, такие как р53 и Elk-1, которые являются точкой пересечения сигнальных путей ERK, JNK и р38. Киназа р38 была определена как протеинкиназа с 49% гомологией к ERK, которая также активируется 31 клеточным стрессом и некоторыми цитокинами (в частности интерлейкином1 и ФНО-α) и фосфорилирует такие транскрипционные факторы как Elk-1 и MEF2. Активация MAP-киназных каскадов во время реперфузии связана с реперфузионным повреждением, а также нарушением сердечного ритма. Было показано, что изменения в сигнальных путях МАР-киназ у больных после кардиохирургических вмешательств, кардиоплегии и искусственного кровообращения участвуют в коронарной микроциркуляционной дисфункции с негативными последствиями для перфузии миокарда [86]. Таким образом, МАР-киназы являются важными компонентами сигнальных путей, вовлеченных во многие физиологические реакции. Запуск апелином киназных каскадов ингибирует открытие митохондриальной поры, вызывающей летальные повреждения кардиомиоцитов, которые приводят к некрозу и апоптозу. Блокирование этих сигнальных путей (рис. 4) селективными ингибиторами PI3 киназы (LY294002 или вортманнином) [72,74], также как и ингибиторами ERK1/2 (UO126 или PD098059) [36,74] или ингибитором p70S6 киназы рапамицином [36] отменяет действие апелина на митохондриальную пору и приводит к гибели кардиомиоцитов. Таким образом, запуск апелином каскада реперфузионных киназ лежит в основе его кардиопротекторного действия. Механизмы антиоксидантной защиты. Помимо ингибирования открытия митохондриальной поры и апоптоза, уменьшение реперфузионного повреждения миокарда под действием апелина может быть связано с антиоксидантными свойствами NO. Действительно, в культуре кардиомиоцитов при моделировании гипоксии и реоксигенации экзогенный А13 уменьшал образование вторичного продукта свободнорадикального окисления липидов – МДА и супероксидного анион-радикала (О2˙-), а также увеличивал экспрессию антиоксидантного фермента СОД, утилизирующей О2˙- [72]. Было показано, что при введении А13 отмечаются меньшие повреждения мембран кардиомиоцитов и снижение продукции МДА в поврежденном изопротеренолом миокарде крыс in vivo [41]. Подавление 32 окислительного стресса, индуцированного пероксидом водорода (Н2О2) в изолированных неонатальных кардиомиоцитах крысы, с помощью рА13 сопровождалось повышением уровня мРНК и активности КАТ [87]. Также у мышей in vivo под действием диеты, обогащенной рА13, снижение гипертрофии левого желудочка сопровождалось уменьшением концентрации липогидропероксидов в плазме и увеличением активности КАТ в миокарде [87]. Таким образом, действие апелина может быть связано со снижением генерирования АФК, вызванного изменением экспрессии генов СОД и КАТ и увеличением продукции NO. Однако предположение о снижении генерации АФК апелином до начала нашей работы не было подтверждено опытами, выполненных на моделях ишемического и реперфузионного повреждения сердца ex vivo и in vivo. В присутствии NO (рис. 5) О2˙- образует пероксинитрит (ONOO˙), который расщепляется на высокоактивный цитотоксичный гидроксильный радикал (˙ОН) и радикал диоксида азота (NO2˙) [79]. Наличие АФК и азота (О2˙-, ONOO˙, ˙ОН, NO2˙) приводит к дисфункции и гибели клеток. Можно предположить, что удаление избытка супероксида за счет повышения активности СОД под влиянием апелина должно уменьшать окислительный стресс. В то же время увеличение активности СОД способствует образованию Н2О2, менее токсичного соединения, но также способного инициировать повреждения миокарда [79]. Как известно, Н2О2 разлагается на воду и кислород под действием КАТ [87], активность которой может возрастать под действием апелина. Также пероксид водорода может быть трансформирован в воду под действием глутатионперосидазы (ГП) в результате окисления восстановленного глутатиона до дисульфида глутатиона. Поскольку апелин активирует эндотелиальную NO-синтазу, то образующийся вследствие этого NO способен конкурировать с СОД за супероксид-анион О 2 ˙ -. Вероятно, увеличения активности СОД под действием апелина достаточно для того, чтобы предупреждать образование 33 цитотоксичного ONOO˙и, тем самым, снижать нежелательные последствия окислительного стресса. Рис. 5. Антиоксидантное действие апелина. Rastaldo и соавт., Antioxid Redox Signal 2011 [79]. eNOS – эндотелиальная NO-синтаза; СОД – супероксиддисмутаза; КАТ – каталаза; ГП – глутатионпероксидаза; GSH – восстановленный глутатион; GSSG – дисульфид глутатиона; GSSGR – глутатионредуктаза. Этот гипотетический механизм частично объясняет, каким образом Сконцевые фрагменты апелина могут участвовать в регуляции свободнорадикального окисления и улучшать антиоксидантный потенциал ишемизированного сердца при реперфузии. 1.5 Структурные аналоги апелина. Необходимость повышения устойчивости пептидов апелина по отношению к действию амино- и карбоксипептидаз в биологических системах обусловила новое направление работ, связанных с синтезом фармакологических агонистов APJ рецептора. Было показано, что циклические аналоги апелина (рис. 6) связываются с апелиновым рецептором и обладают функциональной активностью, обусловленной запуском внутриклеточной сигнализации [88,89]. В работе 34 Macaluso и соавт. [88] по оценке возможностей конкурентного связывания с APJ циклических фрагментов А13 различной длины было выяснено, что соединения, содержащие последовательность аминокислотных остатков ArgPro-Arg-Leu, демонстрируют четко определенный β-поворот, необходимый для связывания с рецептором (рис. 6А). Циклические аналоги А12 (рис. 6Б) показали дозозависимый ингибиторный эффект по отношению к форсколининдуцированному накоплению цАМФ. Кроме того, они аналогично природному пептиду могут влиять на пути внутриклеточной сигнализации [89]. Рис. 6. Циклические аналоги А13, Macaluso и соавт., Chem Med Chem 2010 [88] (А); и А12, Hamada и соавт., Int J Mol Med 2008 [89] (Б). В работе Wang и соавт. было изучено влияние двух структурных аналогов pA13 (рис. 7) на ишемическое и реперфузионное повреждение сердца у мышей in vivo [90]. При этом наиболее оптимальная модификация пептида, включающая бромирование С-концевого фенилаланина, не приводила к ухудшению кардиопротекторных свойств по сравнению с природным pA13. Введение этой структуры уменьшало размер ИМ у мышей по сравнению с контролем более чем в два раза. Одновременно наблюдалась меньшая деградация модифицированной структуры под действием АПФ2. Влияние модификации А36 по N-концу полиэтиленгликолем (ПЭГ, 40кДа) было изучено на крысах в работе Jia и соавт. [91]. Инфузия конъюгата ПЭГ- 35 А36 в течение 20 мин поддерживала более высокий уровень А36 в плазме крови в течение 2 ч и обеспечивала увеличение фракции выброса сердца по сравнению с инфузией немодифицированного А36 после моделирования ИМ у крыс. Рис. 7. Структурные аналоги А13. Wang и соавт., J Am Heart Assoc 2013 [90]. Также впервые был синтезирован непептидный агонист апелинового рецептора Е339-3D6, который проявил себя как частичный агонист в отношении образования цАМФ и как полный агонист в отношении интернализации APJ рецептора. [92]. Это соединение более эффективно препятствало вазоконстрикции колец аорты крысы, вызванной норадреналином, по сравнению с природным А17. Результаты исследований по влиянию модификации С-концевой части молекулы апелина на связывание с APJ рецептором [7,24,93] показали, что замена или удаление С-концевого остатка фенилаланина снижает гипотензивные свойства А13 и ингибирует интернализацию апелинового рецептора. Кроме того, Iturrioz и соавт. [93] продемонстрировали наличие 36 гидрофобной полости в нижней части кармана связывания APJ рецептора, в которую вкладывается С-концевой аминокислотный остаток Phe пептидов А13 или А17 благодаря Trp152, Trp259, Phe255, которые, как было установлено с помощью методов молекулярного моделирования, являются ключевыми аминокислотными остатками для интернализации рецептора. Однако имеются данные, свидетельствующие о том, что удаление или замена Сконцевого Phe влияет только на интернализацию APJ рецептора, но не оказывает влияния на связывание апелина с рецептором или сопряжение с Gбелком [93]. Pitkin и соавт. показали, что структура, аналогичная рА13, без Сконцевого Phe обнаруживала сродство к апелиновому рецептору и проявляла активность агониста в опытах in vitro на подкожной вене человека [94]. Macaluso и соавт. удалось создать антагонист APJ рецептора со свойствами конкурентного ингибитора, состоящий из двух циклизованных последовательностей Arg-Pro-Leu-Arg, соединенных между собой линкерным участком Lys-His [95]. Работы по изучению возможности связывания соединений пептидной природы с APJ рецептором [20,24] привели к созданию ряда синтетических агонистов с более высоким сродством и устойчивостью в плазме по сравнению с природным pA13. Взятые вместе, эти данные указывают на рациональность химической модификации пептидов апелина для повышения их устойчивости в биологических средах при сохранении высокой биологической активности. Несмотря на создание широкого спектра различных аналогов апелина, физиологическое действие этих соединений к настоящему времени остается малоизученным. 37 РАЗДЕЛ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Пептиды апелина. В работе использовали синтезированный пептид А12 (С-концевой фрагмент с 12-ю аминокислотами, полностью идентичный апелину у животных различных видов и человека) и его структурные аналоги (табл. 1). Таблица 1. Апелин-12 и его структурные аналоги. Формула пептида М.в. Обозн. H-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe-OH 1422,7 A12 H-(NαMe)Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Nle-Pro-Phe-OH 1418,7 AII H-(NαMe)Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Nle-Pro-Phe-NH2 1417,7 AIII H-(NGNO2)Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Nle-Pro-Phe-NH2 1448,7 AIV H-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-dAla-OH 1346,6 AV Модификации в структуре природного пептида А12 выделены жирным шрифтом. Пептиды были получены путем автоматического твердофазного синтеза на пептидном синтезаторе фирмы Applied Biosystems 431A (Германия) с использованием Fmoc-методологии на полимере Ванга по стандартным программам [96]. Твердофазный синтез А12 проводили, исходя из 0,25 ммоль коммерческого Fmoc-Phe-полимера (Bachem, Швейцария), путем последовательного удлинения пептидной цепи с С-конца. На первой стадии синтеза с целью предотвращения побочной реакции образования дикетопиперозина из пролинсодержащего дипептидилполимера присоединяли дипептидный блок Fmoc-Met-Pro-OH. Далее цепь наращивали по одной аминокислоте. Для создания амидной связи применяли карбодиимидный метод. Конечный продукт отщепляли от полимерного носителя одновременно с удалением защитных групп боковых функций аминокислот действием трифторуксусной кислоты со скавенджерами. 38 Пептиды были очищены высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) до 98%-ной чистоты, их структура охарактеризована с помощью 1НЯМР-спектроскопии и MALDI-масс-спектрометрии (m/z 1423.5; расчетная молекулярная масса – 1422,7). Особенности синтеза пептидов отражены в патенте РФ №2457216 «Додекапептиды, обладающие кардиопротекторными свойствами» [97]. С целью повышения протеолитической устойчивости природного пептида и его стабильности при хранении были синтезированы его структурные аналоги (табл. 1). Модификация заключалась в метилировании N-концевого аргинина (пептиды AII и AIII). Показано, что введение в пептидную цепь Nα-метиламинокислот существенно повышает устойчивость этих соединений к ферментативной биодеградации, в том числе к действию аминопептидаз [98,99]. Кроме того, С-концевая часть молекулы пептидов была защищена от действия карбоксипептидаз амидной группой (пептиды AIII и AIV). Модификация AIV заключалась также во введении нитрогруппы в гуанидиновую группу остатка аргинина для увеличения продукции NO. Стабильность данных пептидов при хранении была повышена за счет замены легко окисляющегося метионина на норлейцин – природную аминокислоту небелкового происхождения, устойчивую к окислению кислородом. Пептиды AI – AIV являются оригинальными соединениями, биологическую активность которых ранее не исследовали. С целью выяснения роли Сконцевого фенилаланина в защитном действии А12 был синтезирован предполагаемый функциональный антагонист APJ рецептора – АV. Для этого С-концевой остаток фенилаланина в структуре А12 был заменен на d-аланин [100]. Синтез, очистка и идентификация химической структуры пептидов были осуществлены сотрудниками лаборатории синтеза пептидов ФГБУ «РКНПК» под руководством к.б.н. Ж.Д. Беспаловой. 2.2. Реактивы. Для синтеза пептида А12 и его структурных аналогов использовали производные аминокислот, реагенты и растворители фирм 39 Bachem и Fluka (Швейцария). В работе использовали реактивы фирмы Reanal, Венгрия (АТФ, АДФ); Serva, Германия (креатинкиназа); ICN Pharmaceuticals, США (β-НАД+, β-НАДН, НАДФ+); Sigma-Aldrich, США (Evans трифенилтетразолий Blue, триэтаноламин гидрохлорид, хлорид, нитротетразолий лактатдегидрогеназа, синий, пируваткиназа, миокиназа, фосфоенолпируват, пируват, ксантин, глюкоза, KCl, MgCl2, MgSO4, CuSO4, NaOH, Na2CO3, K2CO3, KH2PO4, гидразин, глицин, АМФ, ЭДТА). Активности ЛДГ и МВ-КК в плазме определяли, используя наборы фирмы BioSystems (Испания). 2.3. Животные. В опытах использовали взрослых самцов крыс Wistar весом 290–340 г. Животных размещали в клетках группами по трое, температурный режим поддерживали на уровне 20–30°C с естественным световым циклом и предоставляли свободный доступ к питьевой воде и стандартной гранулированной пище (Aller Petfood, Санкт-Петербург, Россия). Уход и использование животных были проведены в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (№ 123 от 18 марта 1986 года, Страсбург). 2.4. Перфузия изолированного сердца крысы. Животных гепаринизировали (внутрибрюшинно 1600 МЕ/кг веса) и наркотизировали уретаном (внутрибрюшинно 1,25 г/кг массы тела). Сердце извлекали и незамедлительно помещали в ледяной бикарбонатный раствор КребсаХензеляйта (РКХ) до остановки сокращений. Затем аорту канюлировали и перфузировали сердце ретроградно по Лангендорфу в течение 15 мин при постоянном перфузионном давлении 60 мм рт.ст. Рабочую перфузию осуществляли антеградно по модифицированному методу Нийли при постоянном давлении наполнения левого предсердия 15 мм рт. ст. и среднем перфузионном давлении в аорте 60 мм рт. ст. [101]. Для перфузии 40 использовали РКХ (состав в мМ: NaCl 118,0; KCl 4,7; CaCl2 3,0; Na2EDTA 0,5; KH2PO4 1,2; MgSO4 1,2; NaHCO3 25,0; глюкоза 11,0), насыщенный карбогеном (95% О2 и 5% СО2), рН 7,4±0,1 при 37°С и предварительно отфильтрованный (5 м фильтр Millipore, Bedford, США). Давление в аорте и левом желудочке регистрировали при помощи тензометрических датчиков Gould Statham P50, монитора SP 1405 и регистратора Gould Brush SP 2010 (Gould, США). Протокол экспериментов: исходные показатели функции сердца и коронарных сосудов регистрировали после 20 мин перфузии сердца по Нийли, исследуемые пептиды растворяли в растворе Кребса непосредственно перед экспериментом. Изолированные сердца произвольным образом делили на группы. Контроль. В контрольной группе животных после перфузии по Нийли осуществляли 5-минутную инфузию РКХ с постоянной скоростью 4 мл/мин и подвергали сердца глобальной нормотермической (37°С) ишемии в течение 35 мин. Затем следовала 5-минутная ретроградная перфузия по Лангендорфу со скоростью 4 мл/мин и реперфузия по Нийли в течение 25 мин (рис. 8). А12и. Сердца данной группы животных перед глобальной ишемией перфузировали по Лангендорфу в течение 5 мин РКХ, содержащим А12 в концентрации 35, 70, 140, 280 или 560 мкМ. Далее следовал тот же протокол, что и в контрольной группе. При выборе рабочих концентраций А12 были учтены данные Kawamata и соавт. [102] и предварительные результаты, полученные нами в опытах с пептидом A12 на перфузируемом сердцем крысы при использовании данного протокола. А12р. После периода глобальной ишемии следовала перфузия по Лангендорфу в течение 5 мин РКХ, содержащим А12 в концентрации 35, 70, 140, 280 или 560 мкМ и реперфузия по Нийли в течение 25 мин. L-NAME. Сердца данной группы животных перед глобальной ишемией перфузировали по Лангендорфу в течение 5 мин РКХ, содержащим 100 мкМ 41 L-NAME. Далее следовал тот же протокол, что и в контрольной группе. Выбранная концентрация L-NAME является достаточной для ингибирования NO-синтазы и не оказывает влияния на функцию сердца [103]. АII, АIII, АIV, АV. Сердца данной группы животных перед глобальной ишемией перфузировали по Лангендорфу в течение 5 мин раствором Кребса, содержащем 140 мкМ АII, АIII, АIV или АV. Далее следовал тот же протокол, что и в контрольной группе. A12+L-NAME, AII+L-NAME. Сердца данной группы животных перед глобальной ишемией перфузировали по Лангендорфу в течение 5 мин РКХ с 140 мкМ А12 или AII и 100 мкМ L-NAME. Далее следовал тот же протокол, что и в контрольной группе. При выборе концентрации А12 нами были приняты во внимание ранее полученные результаты [104,105], в которых было показано, что концентрация 140 мкМ А12 является оптимальной для восстановления функции сердца при использовании данной модели ишемии и реперфузии миокарда. Рис. 8. Схема проведения опытов на изолированном перфузируемом сердце крысы. РКХ – перфузия по Лангендорфу бикарбонатным раствором Кребса-Хензелейта, ЛДГ – сбор перфузата для определения активности ЛДГ. АФК – активные формы кислорода. В течение 5 мин перед ишемией (исходное состояние) и в течение первых 5 мин реперфузии в охлажденные льдом пробирки собирали оттекающий от сердца перфузат для последующего определения активности ЛДГ (рис. 8). В некоторых опытах в течение 20-й мин исходного состояния и 42 1-й, 3-й и 5-й мин реперфузии в охлажденные льдом пробирки собирали оттекающий от сердца перфузат для дальнейшей регистрации АФК. В конце реперфузии или перед ишемией (исходное состояние) сердца замораживали охлажденными в жидком азоте щипцами Волленбергера для последующего определения метаболитов или активности антиоксидантных ферментов. Перфузию сердец проводили совместно со с.н.с. лаб. метаболизма сердца В.С. Шульженко. 2.5. Региональная ишемия сердца крысы in vivo. У наркотизированных 20% уретаном животных (1200 мг/кг веса внутрибрюшинно) в условиях трахеотомии осуществляли искусственную вентиляцию легких воздухом при 22–25°С с помощью дыхательного аппарата KTR-5 (Hugo Sacks Electronik). Яремную вену катетеризировали для введения пептидов и 2% раствора Evans Blue в конце опыта. Сонную артерию катетеризировали для регистрации артериального давления. Грудную клетку вскрывали продольным рассечением грудины и освобождали сердце от перикарда. Для создания региональной атравматической ишемии иглой миокарда 5-0 под левый левым желудочек ушком в прошивали направлении, перпендикулярном большой оси сердца. Затягивание лигатуры на передней нисходящей коронарной артерии (ПНА), находящейся в толще прошитого миокарда, прекращало кровоснабжение участка миокарда; ослабление лигатуры приводило к восстановлению коронарного кровотока [106]. Гемодинамические показатели регистрировали в ходе всего опыта в режиме on-line. Артериальное давление и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряли тензометрическим датчиком, присоединенным к катетеру, с помощью полиграфа Biograph-4 (Cанкт-Петербургский госуниверситет аэрокосмического приборостроения). Для подтверждения моделирования региональной ишемии, вызванной окклюзией ПНА, использовали показания ЭКГ в отведении, соответствующем II. Запись показателей на компьютер 43 выполнена с помощью аналого-цифрового преобразователя USB 6210 и специальной программы в системе LabView 7 (National Instruments, США). Протокол животного экспериментов. следовал 30-мин После период окончания препарирования стабилизации гемодинамических показателей (исходное состояние). Животные произвольным образом были распределены на экспериментальные группы. Контроль. После периода стабилизации следовала ишемия в течение 40 мин, продолжительность реперфузии составляла 60 мин (Рис. 9). В начале реперфузии крысам внутривенно болюсно вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме 0,5 мл. Апелин-12 (А12). После периода стабилизации и 40-мин окклюзии ПНА болюсно внутривенно вводили А12 в дозе 35, 70, 350 или 700 нмоль/кг веса крысы, затем следовал 60-мин период реперфузии. L-NAME. После периода стабилизации следовала окклюзия ПНА в течение 40 мин. За 10 мин до окончания ишемии внутривенно болюсно вводили растворенный в физиологическом растворе ингибитор NO-синтазы L-NAME в дозе 10 мг/кг веса крысы. После окончания периода окклюзии внутривенно болюсно вводили физиологический раствор, затем следовал 60мин период реперфузии. Режим введения и доза L-NAME обеспечивали ингибирование NO-синтазы во время реперфузии, что было подтверждено результатами работы [107]. АII, АIII, АIV, АV. После периода стабилизации и 40-мин окклюзии ПНА болюсно внутривенно вводили пептиды АII (в дозе 35, 70, 350 или 700 нмоль/кг веса крысы), АIII (в дозе 70, 350 или 700 нмоль/кг), АIV (в дозе 35, 70 или 350 нмоль/кг) или АV (в дозе 350 нмоль/кг), затем следовал 60-мин период реперфузии. A12+L-NAME, АII+L-NAME. После периода стабилизации следовала окклюзия ПНА в течение 40 мин. За 10 мин до окончания ишемии внутривенно болюсно вводили растворенный в физиологическом растворе 44 ингибитор NOS L-NAME в дозе 10 мг/кг веса крысы. После окончания периода окклюзии внутривенно болюсно вводили А12 или AII в дозе 350 нмоль/кг веса, затем следовал 60-мин период реперфузии. При выборе рабочей дозы А12 нами были приняты во внимание ранее полученные результаты работы [108], в которой было показано, что доза 350 нмоль/кг веса является оптимальной для защиты сердца при использовании данной модели ишемии и реперфузии сердца. Рис. 9. Схема проведения опытов на модели региональной ишемии и реперфузии сердца крысы in vivo. ЛДГ – лактатдегидрогеназа, МВ-КК – МВ-фракция креатинкиназы, АО – антиоксидантный. В конце опыта для идентификации зоны риска (ЗР) и интактной области миокарда реокклюдировали ПНА и в яремную вену вводили болюсом 2,0 мл 2% раствора Evans Blue. Затем вырезали сердце и выделяли левый желудочек (ЛЖ) для последующего определения размеров ИМ. Для определения активности ферментов МВ-КК и ЛДГ в исходном состоянии (перед окклюзией ПНА) и после часа реперфузии собирали около 0,5 мл крови из венозного катетера в гепаринизированные пробирки. В отдельных сериях опытов перед окклюзией ПНА (в исходном состоянии) или в конце опыта из ЛЖ выделяли ЗР, ткань замораживали в жидком азоте для последующего анализа метаболитов или активности антиоксидантных 45 ферментов. Опыты на модели региональной ишемии сердца in vivo выполнялись в лаб. метаболизма сердца совместно с в.н.с. Л.И. Серебряковой и ст.н.с. О.В. Цкитишквили. 2.6. Оценка размеров ИМ. Использовали метод гистохимической локализации ЗР и ИМ при окрашивании ткани 2,3,5-трифенилтетразолий хлоридом (ТФТ) [106]. Он основан на образовании нерастворимого пигмента красного цвета – формазана при восстановлении ТФТ под действием окислительных ферментов – дегидрогеназ, связанных с коферментами НАД+ и НАДФ+. Из ЛЖ готовили поперечные срезы толщиной около 1,5–2 мм, которые затем инкубировали 10 мин в 1% растворе ТФТ (Sigma, США) в 0,1М фосфатном буфере (рН 7,4 при 37°С). В результате интактная область ЛЖ была окрашена в синий цвет, неповрежденная область ЗР – в кирпичнокрасный, а зона ИМ оставалась неокрашенной (телесного цвета) (Рис. 10). Полученные образцы сканировали c обеих сторон на сканере Epson Perfection 2480 (Япония). После этого срезы взвешивали для определения массы ЛЖ (весы Highland HCB123, ADAM Equipment, Англия). Рис. 10. Сканированные изображения срезов ЛЖ сердца крысы после инкубации с ТФТ. Площади ИМ и ЗР определяли методом компьютерной планиметрии, используя программу Imagecal. При этом определяли в пикселях площади зон срезов: общую площадь среза, площадь зоны риска и площадь зоны инфаркта миокарда. С учетом нормировки на вес среза в каждой группе 46 рассчитывали отношения зоны риска к весу левого желудочка (ЗР/ЛЖ) и зоны инфаркта миокарда к зоне риска (ИМ/ЗР) в % [109]. 2.7. Приготовление безбелковых экстрактов ткани сердца. Замороженную ткань гомогенизировали в холодной 6% HClO4 (10 мл/г ткани) в гомогенизаторе Ultra-Turrax T25 (IKA-Labortechnik, Германия). Белки осаждали центрифугированием (центрифуга Sorvall RT1, Thermo Fisher Scientific, США) при 2800×g в течение 10 минут при 4°С. Супернатанты нейтрализовали 5 М К2СО3 до рН 7,4. Осадок KСlO4 отделяли центрифугированием в тех же условиях. Безбелковые экстракты хранили при –20°С до определения метаболитов. Сухой вес гомогенизированной ткани определяли после высушивания образцов в течение суток при 110°С [109]. 2.8. Определение метаболитов энергетического обмена. Содержание метаболитов в безбелковых экстрактах изолированного сердца или ЗР сердца крыс определяли энзиматическими методами на спектрофотометре Shimadzu UV-1800 (Япония) и выражали в мкмоль/г сухого веса. Определение аденозинтрифосфата и фосфокреатина. АТФ и ФКр в тканевых экстрактах определяли в одной кювете по скорости образования НАДФН при λ=340 нм [110], используя глюкозо-6фосфатдегидрогеназу (Г6ФДГ), гексокиназу (ГК) и креатинкиназу (КК). Принцип метода: КК 1) ФКр + АДФ Кр + АТФ ГК 2) АТФ + Глюкоза Глюкоза-6-фосфат + АДФ Г6ФДГ 3) Глюкоза-6-фосфат + НАДФ + H2O + 6-Фосфоглюконовая к-та + НАДФН + Н+ В раствор, содержащий 1,65 мл буфера (50 мМ триэтаноламин гидрохлорид, pH 7,5-7,6); 75 мкл 10 мМ НАДФ+; 150 мкл 100 мМ магния 47 хлорид ; 225 мкл 500 мМ глюкозы и 15 мкл 22 мМ АДФ вносили 150 мкл тканевого экстракта, добавляли 15 мкл Г6ФДГ (≥ 140 ед/мг), быстро перемешивали и фиксировали значение экстинкции Е1. Затем в кювету добавляли 15 мкл ГК (≥ 140 ед/мг), перемешивали и через 45 мин регистрировали экстинкцию Е2. Затем добавляли 15 мкл КК (≥ 18 ед/мг), перемешивали и через 60 мин записывали показатели экстинкции Е3. Концентрации АТФ и ФКр определяли по предварительно построенному в линейной области калибровочному графику С(ΔЕ), используя в качестве ΔЕ разницу экстинкций: ΔЕАТФ= Е2–Е1, ΔЕФКр= Е3–Е2. Определение аденозиндифосфата и аденозинмонофосфата. АДФ и АМФ в тканевых экстрактах определяли в одной кювете по уменьшению оптической плотности НАДН при λ=340 нм [111], используя миокиназу (МК), пируваткиназу (ПК) и лактатдегидрогеназу (ЛДГ). Принцип метода: МК 1) АМФ + АТФ 2 АДФ ПК 2) 2 АДФ + 2 Фосфоенолпируват 2 АТФ + 2 Пируват ЛДГ 3) 2 Пируват + 2 НАДН + 2 Н+ 2 Лактат + 2 НАД+ В раствор, содержащий 600 мкл буфера (0,43 М триэтаноламин гидрохлорид; 0,55 М К2СО3); 75 мкл фосфоенолпирувата (14 мМ фосфоенолпируват; 0,5 М MgSO4; 1,8 M KCl); 20 мкл 14 мМ НАДН и 400 мкл тканевого экстракта, добавляли 10 мкл ЛДГ (≥ 550 ед/мг), перемешивали и через 5 мин фиксировали значение экстинкции Е1. Затем в кювету добавляли 10 мкл ПК (≥ 200 ед/мг) и через 15 мин регистрировали экстинкцию Е2. Затем добавляли 10 мкл МК (≥ 360 ед/мг), перемешивали и через 30 мин записывали показатели экстинкции Е3. Концентрации АДФ и АМФ определяли по предварительно построенному в линейной области 48 калибровочному графику С(ΔЕ), используя в качестве ΔЕ разницу экстинкций: ΔЕАДФ= Е1–Е2, ΔЕАМФ= Е2–Е3. Определение креатина. Креатин в тканевых экстрактах определяли в одной кювете по уменьшению оптической плотности НАДН при λ=340 нм [112], используя креатинкиназу (КК), пируваткиназу (ПК) и лактатдегидрогеназу (ЛДГ). Принцип метода: КК 1) Креатин + АТФ Креатинфосфат + АДФ ПК 2) АДФ + Фосфоенолпируват АТФ + Пируват ЛДГ 3) Пируват + НАДН + Н+ Лактат + НАД+ В раствор, содержащий 250 мкл триэтаноламинового буфера (0,21 М триэтаноламин гидрохлорид; 1,16 М К2СО3, pH 8-9); 75 мкл фосфоенолпирувата (10 мМ фосфоенолпируват; 0,4 М MgCl2); 50 мкл НАДН/АТФ (10мМ β-НАДН; 25мМ АТФ) и 750 мкл тканевого экстракта, добавляли 25 мкл ЛДГ/ПК (ЛДГ ≥ 550 ед/мг, ПК ≥ 200 ед/мг), перемешивали и через 15 мин фиксировали значение экстинкции Е1. Затем в кювету добавляли 10 мкл КК (≥ 25 ед/мг), перемешивали и через 30 мин записывали показатели экстинкции Е2. Концентрацию креатина определяли по предварительно построенному в линейной области калибровочному графику С(ΔЕ), используя в качестве ΔЕ разницу экстинкций: ΔЕКр= Е1–Е2. Определение лактата. Лактат определяли по изменению оптической плотности НАДН при λ=340 нм [113], используя лактатдегидрогеназу (ЛДГ). Принцип метода: ЛДГ L-Лактат + НАД + Пируват + НАДН + Н+ 49 В раствор, содержащий 1,25 мл гидразин-глицинового буфера (0,4 М гидразин; 0,5 М глицин, pH 9,0) и 100 мкл 40 мМ β-НАД добавляли 100 мкл тканевого экстракта, быстро перемешивали и фиксировали значение экстинкции Е1. Затем добавляли 10 мкл ЛДГ (≥ 550 ед/мг), перемешивали и через 60 мин регистрировали показатели экстинкции Е2. Концентрацию лактата определяли по предварительно построенному в линейной области калибровочному графику С(ΔЕ), используя в качестве ΔЕ разницу экстинкций: ΔЕлакт= Е2–Е1. 2.9. Определение активности MB-КK и ЛДГ в плазме крови крыс. Повреждение мембран кардиомиоцитов при региональной ишемии и реперфузии сердца крыс in vivo оценивали по увеличению активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и МВ-фракции креатинкиназы (MB-КK) в плазме крови. Около 0,5 мл крови собирали в гепаринизированные пробирки из венозного катетера в исходном состоянии (перед окклюзией ПНА) и после часа реперфузии. Плазму отделяли центрифугированием (центрифуга Sorvall RT1, Thermo Fisher Scientific, США) при 1600×g и 10°С в течение 10 мин, хранили при -20°С до последующего определения. В образцах плазмы с гемолизом активность ферментов не оценивали из-за их высокого содержания в эритроцитах. В каждом образце определяли гематокрит, используя гематокритную центрифугу СМ-70 (ELMI laboratory equipment, Латвия). Среднее значение этой величины составляло 45% и находилось в пределах физиологической нормы у крыс. Активность ЛДГ определяли энзиматически на спектрофотометре Shimadzu UV-1800 (Япония) по скорости уменьшения оптической плотности НАДH при нм и 25°С [115]. Принцип метода: ЛДГ Пируват + НАДН + Н+ L-Лактат + НАД+. Использовали наборы фирмы BioSystems (Испания) с пируватом в качестве субстрата. Состав рабочего 50 реагента А: 100мМ трис, 2,75мМ пируват натрия, 222 мМ хлорид натрия, рН 7,2. Состав реагента Б: 1,55мМ НАДН, азид натрия 9,5 г/л. Перед определением реагент А и Б смешивали в соотношении 4:1. В кювету вносили 1 мл полученного раствора, добавляли 20 мкл плазмы, перемешивали и помещали в измерительную ячейку спектрофотометра. Через 30 сек измеряли абсорбцию; измерение повторяли через 3 мин. Вычисляли среднюю разницу абсорбции за 1 мин (мин). Активность ЛДГ в образце вычисляли по формуле: мин × Vt×106/×l×Vs = МЕ/л, где коэффициент молярной абсорбции () НАДН при 340 нм составляет 6300, длина оптического пути (l) - 1 см, общий реакционный объем (Vt) равен 1,02, объем образца (Vs) - 0,02 и активность 1 МЕ/л ЛДГ составляет 0,0166мккат/л. Для расчета активности фермента использовали следующий фактор: мин × 8095 = МЕ/л. Метод позволяет определять активность ЛДГ в диапазоне от 4,7 до 1250 МЕ/л плазмы. Для измерения более высоких значений активности образец разбавляли физиологическим раствором. Активность МВ-КК в плазме венозной крови определяли методом иммуноингибирования на спектрофотометре Shimadzu UV-1800 (Япония) по скорости уменьшения оптической плотности НАДФН, измеряемой при 340 нм и 37°С [116], в сопряженных реакциях с глюкозо-6- фосфатдегидрогеназой и гексокиназой, с креатинфосфатом в качестве субстрата. Использовали наборы фирмы BioSystems (Испания). Состав рабочего реагента А: имидазол125 мМ, ЭДТА 2 мМ, ацетат магния 12,5 мМ, D-глюкоза 25 мМ, N-ацетилцистеин 25 мМ, гексокиназа 6800 Ед/л, НАДФН 2,4 мМ, рН 6,1. Состав реагента Б: креатинфосфат 250 мМ, АДФ 15,2 мМ, АМФ 25 мМ, P1,P5-ди(аденозин-5'-)пентафосфат 103 мкМ, глюкозо-6фосфат дегидрогеназа 8800 МЕ/л. Перед определением реагент А и Б смешивали в соотношении 4:1. В кювету вносили 1 мл полученного раствора, добавляли 40 мкл плазмы, перемешивали и помещали в измерительную 51 ячейку спектрофотометра. Через 5 мин. измеряли абсорбцию; измерение повторяли через 10 мин. Активность МВ-КК в образце вычисляли по формуле: (А10-А5)× Vt×106×2/×l×Vs×5 мин=МЕ/л, где коэффициент молярной абсорбции () НАДФН при 340 нм составляет 6300, длина оптического пути (l) - 1 см, общий реакционный объем (Vt) равен 1,04, объем образца (Vs) - 0,04 и активность 1 МЕ/л МВ-КК составляет 0,01667 мккат/л. Для расчета активности фермента использовали фактор: (А10-А5) × 1651 = МЕ/л. Метод использовали для определения активности МВ-КК в диапазоне от 3 до 600 МЕ/л плазмы. При более высоких значениях активности образец разбавляли физиологическим раствором. 2.10. Определение активности ЛДГ в перфузате изолированного сердца. Повреждение мембран кардиомиоцитов изолированного сердца крысы оценивали по увеличению активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в оттекающем от сердца перфузате, который собирали в охлажденные льдом пробирки в течение 5 мин перед ишемией (исходное состояние) и в течение первых 5 мин реперфузии. Активность ЛДГ определяли на спектрофотометре Shimadzu UV-1800 (Япония) в эффлуенте по скорости уменьшения оптической плотности НАДH при нм и 25°С [115], используя в качестве субстрата пируват. Принцип метода: ЛДГ Пируват + НАДН + Н + L-Лактат + НАД+. В реакционную смесь, содержащую 1 мл фосфатно-пируватного раствора (50 мМ , 0,63мМ пируват, pH 7,5) и 25 мкл 11,3 мМ β-НАДН вносили 500 мкл перфузата, перемешивали, через 30 сек записывали показатели экстинкции E1, через 3 мин – E2. Затем вычисляли ΔЕ= (Е1–Е2)/3 за 1 мин; по предварительно построенному в линейной области калибровочному графику U(ΔЕ) определяли активность в МЕ/л и, зная общий объем перфузата, получали активность ЛДГ в МЕ в пробе за 5 мин перфузии. В каждом опыте определяли сухой вес перфузируемого сердца, и результаты выражали в 52 МЕ/г сух веса. Работа проводилась совместно с в.н.с. лаб. метаболизма сердца к.б.н. И.М. Студневой. 2.11. Определение активности антиоксидантных ферментов, содержания МДА и белка в сердце крысы. Приготовление гомогената сердца. Раствор для гомогенизации содержал 0,1% Triton X-100 (Koch-Light Laboratories Ltd, Великобритания); 0,15 М KCl; 2мМ ЭДТА и 2 мкМ бутилгидрокситолуола (ионол) (Sigma, США) Образец миокардиальной ткани, хранившийся до исследования в жидком азоте, быстро размораживали и гомогенизировали 5–7 сек в 200 мкл охлажденного раствора для гомогенизации, используя гомогенизатор Ultra Turrax (США) до образования однородной суспензии. Пестик гомогенизатора обрабатывали 100 мкл раствора и объединяли смыв с гомогенатом. Затем полученную суспензию центрифугировали при 1000×g и 4°С в течение 15 мин на центрифуге Joan MR-23 (Франция), отбирали супернатант, разливали на аликвоты, замораживали и хранили при –33°С до последующих измерений. Активности антиоксидантных ферментов и содержание МДА определяли в супернатанте гомогенатов изолированного сердца или ЗР сердец крыс in vivo. Работа проводилась совместно с сотрудником лаб. биохимии свободнорадикальных процессов Г.Г. Коноваловой. Определение концентрации белка. Содержание белка в супернатанте определяли по методу Лоури [117]. Для калибровки использовали раствор бычьего сывороточного альбумина с концентрацией 1мг белка/мл. Калибровочную кривую получали в диапазоне 10–250 мкг белка в измерительной кювете. К 10 мкл супернатанта добавляли 200 мкл H2O, перемешивали; добавляли 2 мл реактива, полученного смешиванием 50:1 непосредственно перед измерением 2% Na 2CO3 в 0,1 М NaOH и 0,5% CuSO4·5H2O в 1% растворе тартрата натрия; перемешивали, оставляли при комнатной температуре на 10 минут. При постоянном 53 перемешивании добавляли 200 мкл реактива Фолина-Чиокалтеу 1н (Folin and Ciocalteu’s Phenol reagent, Sigma, США), перемешивали, выдерживали в течение 30 минут при комнатной температуре (20-22°С). Оптическую плотность раствора измеряли при λ=750 нм на спектрофотометре Hitachi 557 (Япония) против нулевой пробы, в которую было добавлено 10 мкл раствора для гомогенизации. Определение активности Cu/Zn супероксиддисмутазы. Активность Cu/Zn СОД определяли по подавлению скорости восстановления нитротетразолия синего супероксидным анион-радикалом, генерируемым в системе ксантин-ксантиноксидаза, определяя кинетику образования формазана при λ=560 нм согласно методу [118]. Реакционная смесь (1,95 мл), инкубируемая при 25°С, содержала: 50 мМ K,Na-фосфатный буфер (pH 7,8); 0,1 мМ ЭДТА; 0,1 мМ ксантин; 25 мкМ нитротетразолий синий. Настройку скорости ксантиноксидазной реакции производили путем варьирования концентраций вносимой ксантиноксидазы и добивались установления скорости изменения оптической плотности при λ=560 нм равной 0,025 ед/мин. При измерении активности Cu/Zn СОД в пробу последовательно вносили несколько аликвот супернатанта, измеряя скорость восстановления нитротетразолия синего для каждой аликвоты в течение 1 мин. Строили калибровочную прямую зависимости процента ингибирования начальной скорости восстановления нитротетразолия синего от количества внесенного в пробу белка. За единицу активности Cu/Zn СОД принимали количество фермента, необходимое для 50% подавления восстановления нитротетразолия синего в указанных условиях проведения реакции. Активность выражали в единицах активности на 1 мг белка. Определение активности каталазы. Активность каталазы определяли по скорости расходования пероксида водорода при λ=240 нм и 20 °С в течение 1 мин [119]. В 30 мМ раствор H2O2 54 в 50 мМ К,Na-фосфатном буфере (pH 7,0) вносили образец и немедленно начинали запись кинетической кривой светопоглащения при λ=240 нм на спектрофотометре Hitachi 557 (Япония); принимая коэффициент молярной экстинкции H2O2 равным 43,6 М-1.см-1, рассчитывали активность каталазы в гомогенате миокардиальной ткани. За единицу активности принимали количество фермента, необходимое для утилизации 1 мкмоля Н2О2 в 1 мин на 1 мг белка. Активность выражали в мкмоль/мин/мг белка. Определение активности Se-содержащей глутатионпероксидазы. Активность ГП определяли по скорости окисления НАДФH при λ=340 нм в сопряженной глутатион-глутатионредуктазной системе с гидропероксидом третбутила в качестве субстрата по методу [120] в модификации В.З. Ланкина [121]. Реакционная смесь, инкубируемая при 30°С, содержала: 50 мМ К,Na-фосфатного буфера (pH=7,4); 1 мМ ЭДТА; 0,12 мМ НАДФН; 0,85 мМ восстановленного глутатиона (GSH); 0,5 ед/мл глутатионредуктазы из дрожжей; 0,2 мМ гидропероксида третбутила и супернатант гомогената ткани. Реакцию запускали добавлением гидроперекиси третбутила в свежеприготовленную многокомпонентную смесь, содержащую супернатант. Скорость окисления НАДФН измеряли в термостатируемой кювете при 30°С и длине волны λ=340 нм на химическом анализаторе ФП-901 (Финляндия) в объеме 760 мкл в режиме непрерывной регистрации в течение 3 минут и определяли среднее значение. При расчете начальной скорости вводили поправку на неферментативное окисление глутатиона за время реакции. За единицу активности ГП принимали количество фермента, необходимое для окисления 1 мкмоля GSH в 1 мин в условиях определения. Активность выражали в единицах активности на 1 мг белка. Определение содержания малонового диальдегида. Содержание вторичных продуктов свободнорадикального окисления липидов (преимущественно МДА) в гомогенате сердца крысы определяли по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой в кислой среде, анализируя 55 количество образовавшегося триметинового комплекса по методу Ohkawa [122] с небольшими модификациями [123]. Реакционную смесь, содержащую 100 мкл гомогената, 1 мл 0,67% раствора тиобарбитуровой кислоты и 1мл 10% трихлоруксусной кислоты, перемешивали и выдерживали 30 мин в кипящей водяной бане; охлаждали, центрифугировали при 3000g в течение 15 мин и в супернатанте измеряли поглощение света на cпектрофотометре Hitachi 557 (Япония) при λ=532 нм и λ=580 нм. Концентрацию МДА вычисляли по разности оптических плотностей для света с λ=532 нм и λ=580 нм, используя коэффициент молярной экстинкции для комплекса МДА-ТБК ε=1,56·105 М-1см-1. Содержание МДА выражали в нмолях на 1 мг белка гомогената. 2.12. Оценка влияния пептидов на активность коммерческих ферментов СОД и КАТ. Коммерческие препараты СОД из бычьих эритроцитов и КАТ из бычьей печени (Sigma-Aldrich, США) растворяли в 50 мМ фосфатном буфере рН 7,4 в концентрации 250 мкг белка/мл (активность ферментов составляла 163 ед/мл и 463 ед/мл соответственно). В раствор, содержащий ферменты, вводили пептиды А12 или АII в 50 мМ фосфатном буфере рН 7,4 до конечных концентраций 0,01мМ, 0,1мМ и 1 мМ и инкубировали полученные смеси при 4°С в течение 24 часов. После окончания инкубации активность СОД и КАТ определяли приведенными выше методами. 2.13. Регистрация активных форм кислорода в перфузате. Оттекающий от перфузируемого сердца крысы перфузат собирали в течение 20-й мин исходного состояния и 1-й, 3-й и 5-й мин реперфузии в охлажденные льдом пробирки. После добавления к аликвотам перфузатов спиновой ловушки 5,5диметил-1-пирролин-N-оксид (ДМПО) до конечной концентрации 100 мМ, их замораживали и хранили в жидком азоте до регистрации спектров электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). Спектры ЭПР 56 регистрировали на спектрометре Х-диапазона типа Е-109Е фирмы “Varian” (США) на уровне СВЧ-мощности 10 мВт; частота СВЧ-поля спектрометра составляла 9,15 ГГц. Сканирование магнитного поля осуществляли в области g=2,0028 [124]. Для количественного определения содержания ДМПО-OH в образцах проводили двойное интегрирование ЭПР спектров перфузата. Полученные значения сравнивали с аналогичными величинами сигналов водных растворов спиновых зондов ТЕМПО и ТЕМПОЛ. Запись и обработка ЭПР спектров выполнена совместно со с.н.с. лаб. физико-химических методов исследования д.б.н. А.А.Тимошиным. 2.14. Статистическая обработка результатов исследования. Использован пакет программ SigmaPlot 11.2 (SysStat, США). Значения выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего значения (M ± m). Различия между группами подтверждали статистически, применяя дисперсионный анализ (ANOVA), методом множественных сравнений с помощью критерия Ньюмена-Кейлса. При сравнении нескольких групп с контролем использовали t-критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони [125]. Статистически значимыми эти отличия считали при p<0,05. Для оценки эффективности защиты сердца от ишемического и реперфузионного повреждения исследуемыми пептидами был использован непараметрический критерий – ранг [126]. 57 РАЗДЕЛ 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 3.1 Защитное действие апелина на ишемизированное изолированное сердце крысы. Целью этого этапа работы было тестирование природного А12 и его структурных аналогов подвергнутого на глобальной модели ишемии изолированного и сердца реперфузии. крысы, Критериями эффективности кардиозащиты пептидами служили: восстановление функции сердца и коронарного потока при реперфузии; влияние пептидов на метаболическое состояние реперфузированного сердца; способность этих соединений снижать повреждение мембран кардиомиоцитов на стадии ранней реперфузии. 3.1.1 Влияние пептида А12 на восстановление функции изолированного сердца крысы. Инфузия в течение 5 мин. РКХ, содержащего А12, до (группа А12и) или после (группа А12р) периода глобальной ишемии улучшала восстановление насосной функции сердца при реперфузии. На рис. 11А показано восстановление минутного объема (МО) в конце реперфузии в опытах с различным режимом введения А12 в диапазоне концентраций от 35 до 560 мкМ в перфузате. Достоверное увеличение восстановления МО по сравнению с контролем было отмечено при инфузии 70 мкМ А12 в обеих группах. При дальнейшем увеличении концентрации А12 различия между восстановлением МО в группах А12 и контролем возрастали. При инфузии 140 мкМ А12 после ишемии (группа А12р) скорость восстановления МО заметно снижалась, а при использовании 280 и 560 мкМ А12 дальнейших значимых изменений в восстановлении МО в обеих группах не наблюдалось. Во всем диапазоне концентраций введение пептида до ишемии было более эффективно, чем после ишемии. Так, максимальное восстановление МО 58 после инфузии 560 мкМ в группе А12и и А12р составляло 86±9% и 59±6% от исходного значения, соответственно, по сравнению с 32±2% в контроле (p<0,02). А 1 * 80 *# 60 * * # 100 * * *# 2 # 40 3 ИСФ, % от исходного МО, % от исходного 100 35 70 280 140 * * 1 90 * 80 *# *# 70 * 2 *# 60 50 40 20 Б 560 3 35 70 280 140 560 А12, мкМ А12, мкМ Рис. 11. Влияние концентрации пептида А12 в РКХ на восстановление минутного объема (МО) (А) и показателя интенсивности сократительной функции (ИСФ) (Б) изолированного сердца крысы к 30-й минуте реперфузии. 1– инфузия пептида перед глобальной ишемией (А12и); 2 – инфузия пептида в начале реперфузии (А12р); 3 – контроль (инфузия РКХ). Достоверно отличается (p<0,05) от: * – контроля, # – А12и. ИСФ=Рразв×ЧСС. Сходные результаты были получены для восстановления интенсивности сократительной функции (ИСФ) при реперфузии (Рис. 11Б). Исходя их этих данных, концентрацию А12 140 мкМ в дальнейшем использовали как оптимальную. В табл. 2 сопоставлено восстановление показателей насосной и сократительнойфункции, а также функции коронарных сосудов при введении 140 мкМ А12 до и после ишемии. Видно, что восстановление таких показателей насосной функции как аортальный объем (АО) и ударный объем (УО) также было более высоким в группе А12и, чем в группе А12р и в контроле. Особенно существенные различия между группами отмечены для АО, степень восстановления которого в группе А12и была вдвое больше, чем в А12р и в 20 раз выше контрольной. Более эффективное улучшение 59 насосной функции под действием А12 сопровождалось увеличением восстановления показателя ИСФ (Рис. 11Б), что обеспечивалось хорошим восстановлением ЧСС и, в большей степени, более высоким Рразв. Увеличение Рразв было вызвано снижением возрастания Рдиаст. (рис. 12) в левом желудочке во время реперфузии, что указывало на уменьшение реперфузионной контрактуры под действием А12. Таблица 2. Влияние 5-мин. инфузии РКХ с 140 мкМ пептидом А12 до или после глобальной ишемии на восстановление показателей сократительной, насосной и коронарной функции изолированного сердца в конце реперфузии. Параметр восстановления функции Контроль (n=12) А12р (n=12) А12и (n=12) КП, 18±2 мл/мин 77 ± 1 83 ± 2 90 ± 1 aб Pперф, 63±1 мм рт. ст. 93 ± 1 95 ± 1 97 ± 1 a Pсист, 99±3 мм рт. ст. 71 ± 1 79 ± 1 a 87 ± 1 aб Pдиаст, -3±1 мм рт. ст. 9 ± 1* 6 ± 1* а 2 ± 1* aб Рразв, 60 ± 1 70 ± 2 a 82 ± 1 aб ЧСС, 304±1 уд/мин 80 ± 1 85 ± 1 a 91 ± 1 aб ИСФ, 31231±347 мм рт. ст./мин 48 ± 1 60 ± 2 a 75 ± 1 aб АО, 26±3 мл/мин 3±1 29 ± 3 a 57 ± 1 aб МО, 44±3 мл 32 ± 1 50 ± 3 a 70 ± 1 aб УО, 145±5 мкл 40 ± 1 59 ± 3 a 73 ± 1 aб 103±3 мм рт. ст. Достоверно отличается (p< 0,05) от: а – контроля, б – А12р. * – мм рт. ст. В первом столбце приведены исходные значения показателей, в последующих – восстановление показателя в % по отношению к исходному значению. В группе А12р была отмечена тенденция к увеличению коронарного потока (КП) по сравнению с контролем (табл. 2, прил.1). При введении А12 до ишемии, этот показатель восстанавливался достоверно лучше, чем в 60 контроле. Такой вазодилатационный ответ коронарной системы косвенно указывал на увеличение образования NO в сердце под действием пептида. Р диаст , мм рт.ст. 12 12 Контроль * 8 8 * * *# 4 А12р *# 0 4 *# 0 А12и Реперфузия Ишемия -4 0 10 40 50 60 70 -4 80 Время, мин Рис. 12. Влияние 5-мин. инфузии РКХ с 140 мкМ А12 до или после глобальной ишемии на диастолическое давление в ЛЖ (Pдиаст) во время реперфузии. Достоверно отличается (p<0,05) от: * – контроля, # – А12р. 3.1.2 Влияние А12 на выведение ЛДГ в миокардиальный эффлюент. Способность А12 влиять на повреждение клеточных мембран оценивали по изменению активности ЛДГ в перфузате до и после глобальной ишемии в группе А12и (табл. 3). В течение 5-мин инфузии 140 мкМ А12 до ишемии выход ЛДГ из миокарда в перфузат был таким же, как в контроле при инфузии РКХ. Таким образом, инфузия А12 не вызывала повреждения сарколеммы кардиомиоцитов неповрежденного сердца. В течение 5-мин периода после ишемии выведение ЛДГ в контрольной группе увеличивалось в среднем в 2,2 раза по сравнению с этим показателем до ишемии, указывая на повреждение мембран. Инфузия 140 мкМ А12 перед ишемией снижала активность ЛДГ в перфузате в 1,7 раза по сравнению с контролем. Это свидетельствовало о меньших дефектах мембран постишемических 61 кардиомиоцитов, определяющих выведение цитоплазматической ЛДГ из миокарда. Таблица 3. Влияние 5-мин. инфузии А12 перед ишемией на выведение ЛДГ из сердца в перфузат до и после ишемии. Выход ЛДГ, МЕ/г сух веса за 5 минут Группа до ишемии после ишемии Контроль 5,48 ± 0,77 13,74 ± 0,42 а А12и (140 мкМ) 5,89 ± 0,71 7,04 ± 1,20 б Данные представлены как М ± m для серии из 6–8 опытов. Достоверно отличается (p<0,05) от: а – исходного состояния, б – контроля. 3.1.3 Влияние структурных аналогов пептида А12 на восстановление функции изолированного сердца крысы. В серии предварительных опытов было оценено дозозависимое действие структурных аналогов апелина на восстановление фунции сердца после периода глобальной ишемии. В дальнейшем в опытах использовали оптимальную концентрацию пептидов в РКХ – 140 мкМ. Защищенные от деградации амино- и карбоксипептидазами пептиды AII, АIII и АIV значительно улучшали восстановление коронарной, насосной и сократительной функции сердца по сравнению с контролем (прил.1) при их введении перед ишемией. При этом восстановление большинства показателей для структурных аналогов практически не отличалось от таковых в группе А12. Однако при использовании пептидов АIII и АIV восстановление Рразв, АО и УО было достоверно выше по сравнению с природным пептидом. В группах АIII и АIV Pдиаст снижалось при реперфузии в достоверно большей степени, чем в контроле, также как при использовании пептида А12. Напротив, инфузия предполагаемого функционального антагониста APJ рецептора – аналога AV – приводила к меньшему 62 восстановлению функции сердца и коронарного потока. В этом случае величины большинства показателей были значительно ниже, чем после применения A12 или его аналогов, хотя восстанавливались лучше, чем в контроле. Таким образом, замена С-концевого остатка Phe, являющегося структурным элементом эпитопа, ответственного за связывание апелина с APJ рецептором, ослабляла кардиопротекторное действие апелина. 3.1.4 Влияние структурных аналогов пептида А12 на активность ЛДГ в перфузате. В течение 5-мин инфузии 140 мкМ АII или АIII до ишемии выход ЛДГ из сердца в оттекающий перфузат был таким же, как в контроле при инфузии РКХ (табл. 4). Таким образом, инфузия структурных аналогов АII и АIII, также как и природного пептида А12, не вызывала повреждения клеточных мембран неишемизированного сердца. Таблица 4. Влияние 5-мин. инфузии пептидов перед ишемией на выведение ЛДГ из сердца в перфузат до и после ишемии. Группа Выход ЛДГ, МЕ/г сух веса за 5 минут до ишемии после ишемии Контроль 5,48 ± 0,77 13,74 ± 0,42 а AII 4,76 ± 0,82 6,53 ± 1,08 б AIII 4,96 ± 0,77 5,94 ± 0,64 б Данные представлены как М ± m для серии из 6–8 опытов. Достоверно отличается (p<0,05) от: а – исходного состояния, б – контроля. Однако оба структурных аналога уменьшали активность ЛДГ после ишемии в перфузате в среднем 1,9 раза по сравнению с контролем. Это указывало на способность модифицированных пептидов АII и АIII снижать 63 дефекты мембран постишемических кардиомиоцитов. Уменьшение выхода ЛДГ в миокардиальный эффлюент под действием аналогов АII и АIII достоверно не отличалось от этого показателя для природного пептида (табл.4). 3.1.5 Энергетическое состояние реперфузированного сердца крысы. Изменение метаболического состояния изолированного сердца под влиянием 5-мин. инфузии перед ишемией природного пептида А12 или его структурных аналогов AII, АIII, АIV и AV к концу реперфузии представлено в таблице (прил. 2). В контроле наблюдалось значительное снижение содержания АТФ (до 34% от исходного состояния) и увеличение содержания АДФ и АМФ (в среднем в 1,7 и 5,1 раз соответственно). Общий пул адениннуклеотидов (ΣАН) и энергетический потенциал (ЭП) постишемических кардиомиоцитов были уменьшены почти на 40% от исходных значений. Кроме того, содержание ФКр в миокардиальной ткани было снижено более чем в 2 раза от исходных значений, в то время как содержание лактата было в 4 раза выше. Эти изменения отражали недостаточное восстановление аэробного метаболизма в реперфузированных сердцах. Инфузия A12 перед ишемией увеличивала восстановление AТФ в сердце в два раза, одновременно уменьшая содержание АДФ по сравнению с контролем. В результате ΣАН сохранялся значительно лучше, чем в контроле, и достоверно не отличался от значения в исходном состоянии. Это перераспределение в содержании адениннуклеотидов значительно увеличивало ЭП в группе A12 по сравнению с контролем. Инфузия природного пептида не оказывала достоверного влияния на содержание Кр и ΣКр в сердце. Однако она улучшала восстановление ФКр в 1,5 раза по сравнению с контролем. Лучшее сохранение АТФ и АН в реперфузированном миокарде под действием А12 предполагало изменения в 64 утилизации глюкозы – единственного энергетического субстрата, использующегося при перфузии сердец. В контроле содержание лактата и пирувата в миокарде было увеличено в 5 раз по сравнению с исходным значением (прил. 2), что свидетельствовало об анаэробном характере утилизации глюкозы при реперфузии. В противоположность контролю, в группе А12 накопления лактата в сердце к концу реперфузии обнаружено не было – его содержание не отличалось от исходного. Влияние аналогов АII, АIII или АIV на энергетическое состояние реперфузированных сердец было аналогично действию A12. Эти пептиды значительно улучшали восстановление АТФ и ФКр, увеличивали сохранение ΣАН и ЭП в постишемических кардиомиоцитах. Применение этих аналогов A12 снижало содержание лактата в сердце по сравнению с контролем практически до исходного значения. Содержание ΣКр в сердце после инфузии пептидов АII, АIII или АIV достоверно не отличался от этого показателя в контроле и в исходном состоянии. Таким образом, метаболическая защита, обеспеченная этими аналогами А12, была столь же эффективной как при введении природного пептида. Инфузия перед ишемией потенциального функционального антагониста APJ рецептора пептида AV также улучшала метаболическое состояние реперфузированных сердец по сравнению с контролем. Это было подтверждено лучшим сохранением АТФ, ΣАН, ЭП и ФКр и снижением содержания лактата в миокардиальной ткани по сравнению с контролем (прил. 2). Однако увеличение содержания АТФ, ΣАН и ЭП в сердце было ниже, чем после инфузии A12 или структурных аналогов АII, АIII или АIV. Исключение составлял ФКр – его содержание в сердце достоверно не отличалось от этого показателя для пептидов A12, АII и АIII. Функциональные и метаболические данные, полученные в опытах с аналогом AV, показывают, что этот пептид наименее эффективен при защите сердца от ишемического и реперфузионного повреждения. 65 Результаты опытов, выполненных на изолированном перфузируемом сердце, показали, что изученные структурные аналоги природного пептида А12 способны улучшать восстановление сократительной и насосной функции сердца при реперфузии и снижать развитие реперфузионной контрактуры. Эти эффекты сопровождаются лучшим сохранением макроэргических фосфатов (АТФ и ФКр), увеличением ЭП постишемических кардиомиоцитов и снижением накопления лактата в реперфузированном сердце. Отмечена способность структурных аналогов А12 (АII и АIII) уменьшать повреждения клеточных мембран на стадии ранней реперфузии. Из анализа приведенных данных следует, что по эффективности кардиозащиты модифицированные структурные аналоги А12 не отличались от природного пептида. 3.2. Защитное действие апелина при региональной ишемии и реперфузии сердца крысы in vivo. Целью этого этапа работы было выяснить, способны ли структурные аналоги апелина защищать сердце от ишемического и реперфузионного повреждения у наркотизированных крыс in vivo. Для этого было оценено влияние аналогов AII – AV на размеры острого ИМ, изменение гемодинамических показателей, метаболическое состояние ЗР и активность маркеров некроза в плазме в конце реперфузии. Действие этих соединений изучено при внутривенном болюсном введении в широком диапазоне доз в сравнении с эффектами природного пептида А12. 3.2.1 Влияние внутривенного введения пептида А12 на размеры ИМ. Гистохимический анализ срезов ЛЖ после реперфузии не выявил достоверных различий в ЗР между группами: эта величина составляла в среднем 38,4±1,8% от веса ЛЖ. В контроле величина инфаркта миокарда составляла 40,5±2,1% для серии опытов из 18 животных (рис. 13). Введение А12 в дозах 35 и 70 нмоль/кг достоверно снижало размеры ИМ по сравнению 66 с контролем на 24 и 26% соответственно. Наибольший эффект был обнаружен при использовании А12 в дозе 350 нмоль/кг веса крысы – такая доза уменьшала ИМ на 40% по сравнению с контролем. Увеличение дозы А12 до 700 нмоль/кг не приводило к улучшению защиты: в этом случае размеры ИМ снижались на 33% по сравнению с контролем. Хотя достоверных отличий между размерами ИМ при использовании различных доз А12 не было выявлено, в качестве наиболее эффективной в дальнейших опытах была использована доза 350 нмоль/кг. 40 ИМ/ЗР, % 35 30 25 20 0 35 70 350 700 Концентрация А12, нмоль/кг Рис. 13. Дозозависимое влияние А12 на размеры ИМ у наркотизированных крыс in vivo. Данные представлены как М ± m для серии из 10 опытов. 3.2.2 Влияние внутривенного болюсного введения пептида А12 на гемодинамические показатели. В исходном состоянии СAД было практически одинаковым во всех группах и составляло 94±1 мм рт. ст., ЧСС – 351±8 мин-1. В контроле введение физиологического раствора не приводило к изменению СAД и ЧСС при последующей реперфузии (табл. 5). Использование А12 в дозах 35 и 70 нмоль/кг после региональной ишемии недостоверно снижало САД в начале реперфузии – до 86 и 76% от исходного уровня соответственно. К окончанию 67 реперфузии САД практически полностью восстанавливалось до исходного значения. Таблица 5. Дозозависимое влияние внутривенного введения А12 на показатели гемодинамики у наркотизированных крыс in vivo. Параметр Контрольная точка Исходные значения САД, мм рт.ст. Начало реперфузии Конец реперфузии Исходные значения ЧСС, уд/мин Начало реперфузии Конец реперфузии Контроль А12(35) А12(70) А12(350) А12(700) 95 ± 2 96 ± 6 93 ± 6 90 ± 3 98 ± 8 94 ± 1 82 ± 6 76 ± 8б 54 ± 3аб 54 ± 2аб 96 ± 3 95 ± 7 96 ± 11 82 ± 4б 73 ± 5аб 365 ± 6 353 ± 7 364 ± 3 353 ± 8 320 ± 22 361 ± 4 314 ± 7аб 281 ± 28аб 224 ± 17аб 112 ± 18аб 362 ± 4 318 ± 11аб 331 ± 24 328 ± 4аб 323 ± 19б Данные представлены как М ± m для серии из 10 опытов. Достоверно (p<0,05) отличается от: а – исходного значения, б – контроля. ЧСС – частота сердечных сокращений, САД – систолическое артериальное давление. В скобках указаны дозы А12 в нмоль/кг веса. В группах А12(350) и А12(700) после введения пептида САД достоверно уменьшалось до 64% от исходного значения в начале реперфузии соответственно. К концу реперфузии этот показатель восстанавливался до 92 и 75% соответственно. Сразу после введения А12 в экспериментальных группах А12(35), А12(70), А12(350) и А12(700) одновременно с падением САД происходило кратковременное (в пределах 10 с) снижение ЧСС на 6, 17, 34 и 66% от исходного значения соответственно, и практически полное восстановление этого параметра до исходного значения в течение 5 минут. В течение последующей реперфузии наблюдалось незначительное снижение 68 этого параметра по сравнению с контролем, которое не превышало 7–10% от исходного состояния к концу реперфузии. 3.2.3 Влияние внутривенного введения пептида А12 на активность маркеров некроза. Изменения активности маркеров некроза – ЛДГ и MB-КK – в плазме крови были изучены при введении одновременно с началом реперфузии наиболее эффективной дозы А12 (350 нмоль/кг). Из данных, представленных в табл. 6, следует, что развитие ИМ в контроле сопровождалось значительным увеличением активности обоих ферментов в конце реперфузии по сравнению с исходным состоянием (до окклюзии ПНА). Под влиянием А12(350) активности ЛДГ и МВ-КК в плазме достоверно снижались на 47% (p<0,05) и 56% (p<0,001) по сравнению с контролем соответственно. Эти данные указывают на снижение повреждения мембран кардиомиоцитов ЗР под действием А12 при моделировании острого ИМ. Таблица 6. Влияние внутривенного введения пептида А12 на активности маркеров некроза в плазме у наркотизированных крыс in vivo. Маркер Исходные Конец реперфузии значения Контроль А12 MB-КK, МЕ/л 274,3 ± 27,3 2173,4 ± 71,0а 915,1 ± 131,2аб ЛДГ, МЕ/л 91,7 ± 20,5 1521,4 ± 134,4а 704,3 ± 133,5аб Данные представлены как М ± m для серии из 6 опытов. Достоверно (p<0,05) отличается от: а – исходного значения, б – контроля. Таким образом, оптимальная доза А12 (350 нмоль/кг) наиболее эффективно снижала размеры ИМ и уменьшала повреждения сарколеммы кардиомиоцитов в ЗР к окончанию реперфузии. В то же время при 69 использовании этой дозы отмечена значительная степень падения САД и ЧСС в ответ на введение пептида. 3.2.4 Влияние структурных аналогов пептида А12 на размеры ИМ. Величины ЗР и ИМ при внутривенном болюсном введении одновременно с началом реперфузии различных доз структурных аналогов А12 сопоставлены со значениями в контроле и для оптимальной дозы А12 в прил. 3. Во всех экспериментальных группах величина ЗР достоверно не отличалась от контрольной и в среднем составляла 38,7±0,6% от веса ЛЖ. Это свидетельствовало о том, что ишемическое и реперфузионное повреждение миокарда было моделировано стандартным образом во всех группах. Оценка размеров ИМ показала, что структурные аналоги AII (35, 70, 350, 700 нмоль/кг), AIII (70, 350, 700 нмоль/кг) и AIV (35, 70 нмоль/кг) достоверно ограничивали ИМ по сравнению с контролем. Введение аналогов AIV и AV в дозе 350 нмоль/кг не обеспечивало достоверного снижения величины ИМ по сравнению со значением в контроле. При этом для AII (35, 350, 700), AIII (70) и AIV (35) достоверных отличий в ограничении размеров ИМ по сравнению с оптимальной дозой природного пептида А12(350) выявлено не было. Степень уменьшения ишемического и реперфузионного повреждения сердца пептидами может быть охарактеризована непараметрическим критерием - рангом, увеличение которого отвечает снижению такой способности. По ограничению размеров ИМ эффективность защиты пептидами снижалась в ряду: AII(700)>А12(350)>AIII(70)> AIV(35)>AII (350) (прил. 3). 3.2.5 Влияние структурных аналогов пептида А12 на активность маркеров некроза. Результаты введения структурных аналогов на активность МВ-КК и ЛДГ в плазме крови наркотизированных крыс представлены в прил. 4. Под 70 действием структурных аналогов AII (70, 350, 700 нмоль/кг), AIII (70, 350 нмоль/кг), AIV (70 нмоль/кг) и AV(350) активность МВ-КК к окончанию реперфузии достоверно снижалась по сравнению с контролем. В группах AII (35), AIII (700) и AIV (35) активность данного фермента достоверно не отличалась от контроля. Для групп AII (70, 350) и AIII (350) не было обнаружено достоверных отличий в уменьшении активности МВ-КК по сравнению с оптимальной дозой природного пептида А12(350). По снижению активности МВ-КК защита пептидами уменьшалась в следующей последовательности: AIII (350)> А12(350)>AII (70)>AII (350)>AIV (70). Аналогичным способом была проведена оценка влияния пептидов на активность ЛДГ в плазме крови крыс. Способность пептидов уменьшать активность этого маркера некроза снижалась в следующем ряду: А12(350)>AII(350)>AII(35)>AIII(350)>AIII(70). 3.2.6 Влияние структурных аналогов пептида А12 на изменения гемодинамических показателей. Действие структурных аналогов пептида А12 на изменения САД и ЧСС в ходе опыта представлено в прил. 5. В исходном состоянии САД было практически одинаковым во всех экспериментальных группах и составляло в среднем 91±1 мм рт. ст. Введение всех структурных аналогов А12 приводило к падению САД на первых минутах реперфузии, также как и при введении природного пептида А12(350). Достоверное снижение САД в начале реперфузии по сравнению с исходными значениями наблюдали в большей степени в группах АIV(350) и АV(350) (на 30 и 36% соответственно) и в меньшей степени в группе AII(350) (на 13%). При введении всех доз структурных аналогов АII и АIII, а также АIV в дозах 35 и 70 нмоль/кг уменьшение САД было достоверно меньше, чем при использовании оптимальной дозы пептида А12. Во всех экспериментальных группах со структурными аналогами за исключением АIV(350) и АV(350) к концу 71 реперфузии наблюдали практически полное восстановление этого показателя до исходных значений. В исходном состоянии во всех экспериментальных группах ЧСС была в пределах физиологической нормы и составляла в среднем 354±4 мин -1. Введение всех исследованных доз структурных аналогов А12 вызывало кратковременное (до 5 с) снижение ЧСС на этапе ранней реперфузии. Однако это снижение было достоверно меньше, чем под действием природного пептида в дозе 350 нмоль/кг. В дальнейшем ЧСС быстро восстанавливалась во всех экспериментальных группах за исключением AII(700) и АV(350), в которых восстановление было снижено в той же степени, что и в группе А12(350). Таким образом, введение структурных аналогов AII, AIII и AIV вызывало существенно меньшие нарушения гемодинамики во время реперфузии, чем использование природного пептида. В группе АV(350) отмечены изменения САД и ЧСС, сопоставимые по величине с этими показателями для группы А12(350). 3.2.7 Эффективность защиты сердца пептидом А12 и его структурными аналогами. Приведенные данные по ограничению размеров ИМ и активности маркеров некроза в плазме крови позволяют оценить эффективность защиты сердца пептидом А12 и его структурными аналогами. В табл. 7 представлены суммарные ранги экспериментальных групп, учитывающие эти показатели необратимого ишемического и реперфузионного повреждения. Исходя из данных таблицы, наиболее эффективным кардиопротектором представляется природный пептид А12 в дозе 350 нмоль/кг. Однако его практическое использование нерационально из-за сильного снижения САД и ЧСС при реперфузии в ответ на его внутривенное введение. Следующими в ряду эффективности являются структурные аналоги АII и АIII в дозе 350 нмоль/кг. Эти соединения ограничивают ИМ и снижают активности МВ-КК и ЛДГ в той же степени, что и природный пептид А12 (табл. 4, 5). В то же время, их 72 использование вызывает меньшие нарушения гемодинамики по сравнению с А12(350). Группы AII(700) и AIII(70) обнаруживали такое же ограничение ИМ, как и в группе А12(350), однако для них характерна высокая активность маркеров некроза в плазме. В остальных группах более высокие ранги свидетельствовали либо о меньшем ограничении размеров ИМ, либо о высокой активности МВ-КК и ЛДГ в плазме. На основании этих результатов можно сделать заключение о том, что потенциальными кандидатами на роль лекарственного средства при остром коронарном синдроме могут быть пептиды АII и АIII. При использовании модели острого ИМ у крыс оптимальная доза для внутривенного введения этих пептидов составляет 350 нмоль/кг. Таблица 7. Оценка эффективности снижения необратимого повреждения миокарда пептидами. Группа Ранг A12 AII (350) (35) 5 21 AII AII AII (70) (350) (700) 18 11 13 AIII AIII AIII AIV AIV AIV (70) (350) (700) (35) (70) (350) (350) 26 23 16 11 31 34 AV 25 В скобках указана доза пептида в нмоль/кг веса. 3.2.8 Действие пептида А12 и его структурных аналогов на метаболизм ишемизированного миокарда. Для оценки влияния внутривенного болюсного введения пептидов одновременно сначалом реперфузии на метаболизм ЗР нами были выбраны: природный апелин А12, аналог АII, оказывающий мощное защитное действие на сердце при остром ИМ, а также аналог AV, не обладающий защитным эффектом (табл. 7). В прил. 6 сопоставлено влияние этих пептидов на содержание АН, ФКр, Кр и лактата в ЗР в конце реперфузии по сравнению с содержанием этих метаболитов в контрольной группе и в исходном состоянии. К концу реперфузии в контроле содержание АТФ и 73 АН в ЗР было снижено в 4 и 2 раза по сравнению с исходными значениями соответственно. В этой группе наблюдали сниженное до 30% восстановление ФКр, почти 40% снижение содержания Кр и значительное увеличение содержания лактата по сравнению с этими показателями до окклюзии ПНА (исходное состояние). Введение А12 не влияло на сохранение АН в ЗР по сравнению с контролем (Рис. 14А). Применение структурных аналогов AII и AV улучшало сохранение АТФ, но не влияло на содержание АДФ и АМФ по сравнению с контролем. При использовании AII в дозе 350 нмоль/кг содержание АН было значительно выше, чем в контроле. Также в этой группе наблюдали значительное увеличение ЭП постишемических кардиомиоцитов ЗР по сравнению с A12(350) (Рис. 14Б). А Исходное состояние Контроль А12 AII AV 30 мкмоль/г сух веса 25 * 20 Б 1.0 , , 0.8 * * * *# * 0.6 , 15 * #^ 0.4 , 10 * 5 0 АН ФКр *# , 0.2 , 0.0 Лактат ЭП Рис. 14. Влияние природного пептида А12 и его структурных аналогов AII и AV на содержание ΣАН, ФКр и лактата (A) и ЭП (Б) в ЗР сердца у наркотизированных крыс in vivo. Данные представлены как М±m в мкмоль/г сухого веса для серии из 10 опытов. Достоверно (p<0,05) отличается от: * – контроля, # – А12, ^ – AII. ΣАН=АТФ+АДФ+АМФ. Энергетический потенциал (ЭП) = (АТФ+0,5АДФ)/ΣАН. Введение всех пептидов значительно улучшало сохранение ФКр и Кр в ЗР по сравнению с контролем. Особенно это проявлялось при использовании структурного аналога AII в дозе 350 нмоль/кг, в этом случае 74 ФКр и Кр достоверно не отличались от исходных значений. Введение пептидов A12(350) и AII(350) значительно уменьшало накопление лактата в ЗР по сравнению с контролем. При этом его уровень в группе AII(350) был достоверно ниже, чем в группе A12(350). Применение структурного аналога AV в дозе 350 нмоль/кг не влияло на содержание лактата по сравнению с контролем. Таким образом, эффективность метаболической защиты ЗР пептидами снижается в ряду: AII(350)>A12(350)> AV(350). Из анализа результатов проведенных опытов следует, что пептиды А12, AII и AIII в дозе 350 нмоль/кг наиболее перспертивны для защиты миокарда (табл.7). Однако при использовании AIII(350) с увеличением концентрации способность ограничивать размеры ИМ снижается, в то время как при введении AII(350) она возрастает (прил. 3). Таким образом, целесообразно использовать структурный аналог AII в качестве основы для создания лекарственного препарата. Другим преимуществом AII является достоверно меньшее нарушение гемодинамических показателей по сравнению с природным пептидом (прил. 5). Кроме того, пептид АII улучшал метаболическое состояние ЗР по сравнению с контролем, а также обеспечивал больший ЭП кардиомиоцитов и значительно меньшее содержание лактата в ЗР по сравнению с пептидом А12 (рис. 14, прил. 6). Поэтому в дальнейшем для изучения механизмов действия модифицированных пептидов апелина был использован структурный аналог AII. 3.3. Влияние L-NAME на кардиозащитное действие А12 и его структурного аналога АII. Данные современной литературы указывают на включение NO-синтаз в механизмы действия С-концевых фрагментов апелина (А13 и рА13) [13,29,31,79]. Вазодилатационные эффекты природного пептида А12 и его структурных аналогов AII – AV косвенно подтверждаются результатами 75 настоящей работы. На модели изолированного перфузируемого сердца введение пептидов AIII и AIV улучшало восстановление КП по сравнению с контролем (прил. 1). Под действием внутривенного введения природного А12 и структурных аналогов AII – AV происходило снижение САД (прил. 5), указывающее на расслабление периферических сосудов. Для выяснения возможности эффектах участия NO-зависимых структурных аналогов механизмов А12 нами в кардиозащитных был использован неспецифический ингибитор NO-синтаз L-NAME. 3.3.1 Восстановление коронарного потока и функции изолированного сердца крысы. В исходном состоянии (до моделирования глобальной ишемии и реперфузии) КП перфузируемого сердца составил 18±2 мл/мин, Рразв 99±1 мм рт. ст., ЧСС 303±2 уд/мин, ИСФ 31380±560 мм рт. ст./мин, АО 26±3 мл/мин, МО 44±1 мл. Влияние ишемии и реперфузии, а также введения 140 мкМ А12 или AII и 100 мкМ L-NAME перед ишемией на восстановление основных показателей функции сердца и коронарных сосудов к окончанию реперфузии представлено на рис. 15. Инфузия 100 мкМ L-NAME (без пептидов) не оказывала достоверного влияния на восстановление функции сердца и КП при реперфузии по сравнению с контролем. Совместное введение пептидов А12 или AII с L-NAME ухудшало функциональное восстановление сердец по сравнению с действием одного пептида. В этом случае наблюдали достоверное уменьшение восстановления ИСФ и МО (в среднем на 15% и 19% соответственно). При этом показатели сократительной и насосной функции сердца – ИСФ и МО – оставались достоверно выше значений в контроле. КП в группе А12+L-NAME и AII+LNAME составлял в среднем 83±3% от исходных значений и достоверно не отличался от значений в контроле (74±3%). 76 Полученные данные демонстрируют снижение защитного действия обоих пептидов на функцию сердца крысы во время реперфузии при ингибировании образования NO L-NAME. 100 Контроль L-NAME A12 A12 + L-NAME AII AII + L-NAME а % от исходного значения Восстановление, а а а 80 аб ав а аб ав 60 40 20 0 КП ИСФ МО Рис. 15. Влияние инфузии 100мкМ L-NAME на фоне 140 мкМ пептидов А12 или AII на восстановление коронарного потока (КП), интенсивности сократительной функции (ИСФ) и минутного объема (МО) изолированного сердца крысы к 30-й минуте реперфузии. Данные приведены как среднее ± ошибка среднего для серий из 6–8 опытов. Достоверно отличается (р<0,05) от: а – контроля, б – А12, в – АII. 3.3.2 Влияние L-NAME на выход ЛДГ в перфузат. Действие L-NAME на выведение ЛДГ в перфузат из изолированного сердца на фоне 5-мин. инфузии перед ишемией пептидов А12 или его структурного аналога АII показано в табл. 8. Совместное введение пептидов с L-NAME не оказывало влияния на выведение ЛДГ до ишемии. В этом случае этот показатель достоверно не отличался от такового в контроле или при введении одних пептидов. 77 В то же время на стадии ранней реперфузии отмечено достоверное увеличение выведения ЛДГ в перфузат по сравнению с инфузией пептидов A12 или АII. При этом активность ЛДГ в перфузате не отличалась от значений в контроле. Таблица 8. Влияние инфузии пептидов A12 и AII совместно с L-NAME перед ишемией на выведение ЛДГ из сердца в перфузат до и после ишемии. Группа Выход ЛДГ, МЕ/г сух веса за 5 минут до ишемии после ишемии Контроль 5,48 ± 0,77 13,74 ± 0,42 а A12 5,89 ± 0,71 7,04 ± 1,20 б A12+L-NAME 5,78 ± 1,86 15,23 ± 2,74 ав AII 4,76 ± 0,82 6,53 ± 1,08 б AII+L-NAME 6,15 ± 1,03 13,61 ± 0,85 аг Данные представлены как М ± m для серии из 6–8 опытов. Достоверно отличается (p<0,05) от: а – исходного состояния, б – контроля, в – А12, г – AII. 3.3.3 Энергетическое состояние реперфузированного сердца при введении L-NAME. Изменения в содержании АТФ, АДФ, АМФ и АН в конце реперфузии в исследуемых группах сопоставлены с исходными уровнями этих метаболитов в сердце в прил. 7. Введение природного пептида совместно с LNAME, снижая уровень АТФ, достоверно уменьшало содержание АН в реперфузированном сердце до значения в контроле. Этому соответствовало снижение ЭП и отношения АТФ/АДФ по сравнению с этими показателями в группе А12, хотя они оставались выше, чем в контроле. Совместное введение А12 и L-NAME не оказывало статистически достоверного влияния на 78 содержание ФКр к концу реперфузии – в этом случае была отмечена лишь тенденция к снижению его уровня по сравнению с группой А12. В сердцах всех групп обнаружено повышенное содержание креатина, в среднем на 30% по сравнению с исходным, и эта величина была близка снижению содержания ФКр. В результате содержание Кр в группах в конце реперфузии достоверно не отличалось от исходного. При совместном введении А12 и L-NAME уровень лактата в реперфузированных сердцах превышал исходный в 3 раза. Совместная инфузия структурного аналога AII и L-NAME достоверно снижала содержание АТФ в реперфузированном сердце по сравнению с этим показателем при инфузии одного AII. Кроме того, в сердцах этой группы было обнаружено более низкое содержание АН, более низкое АТФ/АДФ и ЭП по сравнению с этими показателями в группе AII. При этом содержание АТФ и ЭП в группе AII+L-NAME оставались достоверно выше значений в контроле. L-NAME не оказывал влияния на содержание ФКр, Кр и Кр при инфузии AII. Содержание лактата в группе AII+L-NAME было выше, чем при инфузии без L-NAME, однако достоверных отличий между этими группами выявлено не было. Из приведенных данных видно, что совместное введение L-NAME с природным А12 или его структурным аналогом AII снижало восстановление АТФ в реперфузированном сердце крысы, что обусловливало ухудшение сохранения АН. 3.3.4 Гемодинамические показатели у наркотизированных крыс in vivo при введении L-NAME. Болюсное введение ингибитора NO-синтаз L-NAME (10 мг/кг) за 10 мин до реперфузии вызывало увеличение САД в среднем на 40% от исходного показателя, которое сохранялось до конца реперфузии (рис. 16А). Внутривенное введение природного пептида А12 (350 нмоль/кг) на фоне 79 действия L-NAME снижало САД на стадии ранней реперфузии в достоверно меньшей степени, чем при использовании одного пептида (на 22% и 36% соответственно). 160 А L-NAME (10 мг/кг) 140 САД, % 120 Kонтроль L-NAME A12 A12+L-NAME AII AII+L-NAME 100 80 60 Апелин (350 нмоль/кг) 40 Реперфузия Ишемия 20 0 20 40 60 80 100 Время, мин 120 Б L-NAME (10 мг/кг) 100 ЧСС, % 80 60 40 Апелин (350 нмоль/кг) 20 Реперфузия Ишемия 0 0 20 40 60 80 100 Время, мин Рис. 16. Влияние внутривенного введения пептидов А12 и АII на фоне L-NAME на динамику САД (А) и ЧСС (Б) при региональной ишемии и реперфузии сердца у наркотизированных крыс. Данные приведены как среднее ± ошибка среднего для серий из 10 опытов. К окончанию реперфузии в группе A12+L-NAME САД восстанавливалось на 10% выше исходного значения, в то время как в группе 80 А12 САД было ниже исходного, достоверно от него не отличаясь. Аналогичный, но более выраженный, эффект наблюдали и при применении структурного аналога AII (350 нмоль/кг). На стадии ранней реперфузии внутривенное введение AII приводило к снижению САД на 13%, однако на фоне L-NAME САД снижалось на 10% от максимального значения к началу реперфузии, при этом оставаясь выше исходного значения на 11%. К концу реперфузии в группе AII+L-NAME САД превышало исходное САД на 17%, в то время как в отсутствии ингибитора САД достоверно не отличалось от значения в контроле. При введении L-NAME происходило недостоверное снижение ЧСС (рис. 16Б) на 3% к началу реперфузии. Введение А12 на фоне блокирования NO-синтаз вызывало резкое снижение ЧСС (до 40% от исходного значения), которое сопровождалось практически полным его восстановлением в течение 5 минут. Использование AII после введения LNAME незначительно урежало ЧСС (до 90% от исходного значения), однако это падение достоверно не отличалось от такового при введении одного лишь структурного аналога. Таким образом, оба пептида оказывали сходное влияние на динамику САД и ЧСС при совместном введении с L-NAME – снижение обоих показателей. Однако эти изменения проявлялись в меньшей степени, чем в отсутствии ингибитора NO-синтаз. При введении структурного аналога AII влияние L-NAME на изменение параметров гемодинамики было выражено гораздо слабее, чем при использовании природного пептида А12. 3.3.5 Размеры ИМ и активность маркеров некроза при введении LNAME у крыс in vivo. Гистохимический анализ срезов ЛЖ показал, что внутривенное болюсное введение L-NAME в дозе 10 мг/кг не влияло на величину ИМ по сравнению с контролем (табл. 9). В то же время последовательное введение L-NAME и А12 (350 нмоль/кг) достоверно уменьшало способность пептида ограничивать размер ИМ. В этом случае размер ИМ был на 26% больше, чем 81 при введении одного А12, хотя и оставался на 25% меньше контрольных значений. Таблица 9. Влияние внутривенного введения А12 или его структурного аналога АII на фоне введения L-NAME на размеры инфаркта миокарда у наркотизированных крыс. Группа ЗР/ЛЖ, % ИМ/ЗР,% Контроль 38,6±1,6 40,5±2,1 L-NAME 35,5±0,8 41,0±3,5 А12 41,5±2,7 24,2±1,9 ав А12 + L–NAME 41,7±3,0 30,4±2,1 абв АII 37,1±1,4 29,6±1,8 ав АII + L–NAME 38,0±1,5 35,9±1,9 бг Данные представлены как М±m для серии из 10 опытов. Достоверно (p<0,05) отличается от: а – контроля, б – А12, в – L-NAME, г – AII. Аналогично зона ИМ при внутривенном введении структурного аналога AII (350 нмоль/кг) после введения L-NAME была достоверно больше на 21% по сравнению с применением одного пептида и не отличалась от контрольных значений. Ухудшение кардиопротекторных свойств природного А12 и его структурного аналога AII в присутствии L-NAME, которые проявлялись в значительном снижении ограничения размеров ИМ, сопровождалось увеличением активности маркеров некроза в плазме по сравнению с использованием одних пептидов (табл. 10). Так активности МВ-КК и ЛДГ были в 1,8 и 1,5 раза выше в группе А12+L-NAME, чем в группе А12 соответственно. Аналогичное увеличение активностей этих ферментов в плазме наблюдали при последовательном внутривенном введении AII и LNAME по сравнению с применением одного пептида: в 1,4 раза и 1,6 раза для МВ-КК и ЛДГ соответственно. 82 Таблица 10. Влияние внутривенного введения А12 и его структурного аналога АII на фоне L-NAME на активность маркеров некроза в плазме крови у наркотизированных крыс. Группа МВ-КК, МЕ/л Исходное состояние ЛДГ, МЕ/л 274,3 ± 27,3 91,7 ± 20,5 Конец реперфузии Контроль 2173,4 ± 71,0а 1521,4 ± 134,4а A12 915,1 ± 131,2аб 704,3 ± 133,5аб AII 1078,1 ± 53,5аб 718,3 ± 103,4аб A12 + L-NAME 1633,3 ± 205,5абв 1053,9 ± 311,1а AII + L-NAME 1518,9 ± 133,0абвг 1172,6 ± 84,0абвг Данные представлены как М ± m для серии из 6 опытов. Достоверно (p<0,05) отличается от: а – исходного состояния, б – контроля, в - А12, г – AII. 3.3.6 Энергетическое состояние ЗР при введении L-NAME у крыс in vivo. Влияние совместного введения L-NAME и AII на энергетическое состояние ЗР сердца крысы в конце реперфузии приведено в прил.8. Под действием L-NAME содержание АТФ в ЗР достоверно снижалось по сравнению со значением при введении одного пептида AII и достоверно не отличалось от контроля. Одновременно отмечена тенденция к снижению содержания АН и ЭП по сравнению со значениями этих показателей, наблюдавшимися при введении AII. В этом случае значения АН и ЭП не отличались от контрольных. Совместное введение L-NAME и AII ухудшало восстановление ФКр и сохранение Кр в ЗР к окончанию реперфузии по сравнению с этими показателями в группе AII. Низкое сохранение внутриклеточного содержания Кр хорошо соответствовало большему повреждению сарколеммы кардиомиоцитов, на которое указывало 83 достоверное увеличение активности обоих маркеров некроза (МВ-КК и ЛДГ) в плазме крови при совместном введении L-NAME и AII (Табл. 10). Ухудшение энергетического состояния ЗР сопровождалось значительным увеличением содержания лактата в ЗР, которое было существенно выше, чем при использовании одного пептида AII. Данные, полученные на модели региональной ишемии и реперфузии сердца in vivo, свидетельствуют о том, что ингибирование NO-синтаз LNAME приводило к существенному ослаблению защитного действия природного пептида А12 и его структурного аналога AII. L-NAME оказывал комплексное воздействие на кардиопротекторный потенциал этих пептидов: снижал их вазодилатационную способность, уменьшал ограничение размеров ИМ, увеличивал активность маркеров некроза в плазме крови и ухудшал восстановление энергетического состояния ЗР при реперфузии. Таким образом, результаты опытов, выполненных на обеих моделях ишемического и реперфузионного повреждения сердца, однозначно свидетельствуют о NO-зависимой природе защитного действия природного С-концевого фрагмента апелина и его химически модифицированного структурного аналога. 3.4. Антиоксидантные свойства пептида А12 и его структурного аналога АII. Для понимания кардиопротекторного действия пептидов, которое было описано выше, было изучено антиоксидантное действие А12 и AII на изолированном перфузированном сердце крыс, подвергнутом глобальной ишемии и реперфузии, и при региональной ишемии и реперфузии миокарда у крыс in vivo. На этих моделях было сопоставлено действие природного апелина и его структурного аналога на активность ключевых антиоксидантных ферментов Cu/Zn СОД, КАТ и ГП, образование продукта ПОЛ – МДА и генерацию АФК при реперфузии. 84 3.4.1 Влияние пептидов на активность ферментов антиоксидантной защиты и перекисное окисление липидов в изолированном перфузируемом сердце. Действие пептидов на изменение активности Cu/Zn СОД, КАТ и ГП, а также содержание МДА в ткани сердца крысы показано в табл. 11. В контроле глобальная ишемия и последующая реперфузия приводили к достоверному и одновременному снижению активности Cu/Zn СОД, КАТ и ГП, а также к достоверному накоплению МДА в реперфузированном сердце к концу реперфузии по сравнению с этими показателями в исходном состоянии. Таблица 11. Влияние 5-мин. инфузии 140 мкМ пептида А12 или его структурного аналога АII перед ишемией на активность антиоксидантных ферментов и содержание МДА в изолированном сердце крысы в конце реперфузии. Группа Cu/Zn СОД, ед/мг белка Каталаза, мкмоль/мин/мг белка ГП, ед/мг белка МДА, нмоль/мг белка Исходное состояние 23,79±1,17 11,37±0,39 0,82±0,02 0,31±0,01 Конец реперфузии Контроль 15,08±0,45 а 8,14±0,32 а 0,71±0,02 а 0,55±0,03 а A12 21,52±1,49 б 15,86±0,74 аб 0,78±0,04 0,54±0,02 а AII 20,88±1,20 б 10,73±0,49 бв 0,71±0,02 а 0,35±0,03 бв Данные представлены как М ± m для серии из 10 опытов. Достоверно (p<0,05) отличается от: а – исходного состояния, б – контроля, в - А12. Инфузия в течение 5 мин. 140 мкМ пептида А12 перед ишемией увеличивала активности Cu/Zn СОД и КАТ в сердце к окончанию 85 реперфузии в 1,4 и 1,9 раза по сравнению с контролем соответственно, но не влияла на активность ГП. В серии опытов с А12 не было отмечено достоверного снижения МДА в миокарде в конце реперфузии по сравнению с контролем. Инфузия в течение 5 мин. 140 мкМ АII перед ишемией также увеличивала активности СОД и КАТ в среднем в 1,4 раза и не влияла на активность ГП, однако достоверно снижала содержание МДА до исходного состояния. Из этих опытов следует, что инфузия пептидов А12 и AII перед ишемией способна предупреждать снижение активности Cu/Zn СОД и КАТ и уменьшать перекисное окисление липидов в реперфузированном сердце. 3.4.2 Влияние пептидов на активность ферментов антиоксидантной защиты и перекисное окисление липидов в сердце крыс in vivo. В контроле под действием региональной ишемии и реперфузии в ЗР достоверно увеличивалось содержание МДА и снижалась активность Cu/Zn СОД и ГП по сравнению с этими показателями в исходном состоянии (табл. 12). Достоверных изменений активности КАТ в конце реперфузии по сравнению с исходным состоянием не наблюдали, была отмечена лишь тенденция к снижению ее активности. Внутривенное болюсное введение А12 (350 нмоль/кг) после периода региональной ишемии достоверно увеличивало активность СОД, КАТ и ГП в 1,6, 1,7 и 1,3 раза по сравнению с контролем соответственно. Этот эффект сопровождался снижением содержания МДА в ЗР до величины в исходном состоянии. Аналогично внутривенное введение АII (350 нмоль/кг) после периода региональной ишемии достоверно увеличивало активность изученных антиоксидантных ферментов в конце реперфузии по сравнению с контролем, хотя в этом случае достоверного снижения содержание МДА в ЗР не наблюдали. 86 Таблица 12. Влияние А12 и его структурного аналога АII на активность антиоксидантных ферментов и содержание МДА в ЗР сердца крыс in vivo. Группа Cu,Zn СОД, ед/мг белка КАТ, мкмоль/мин/мг белка ГП, ед/мг белка МДА, нмоль/мг белка Исходное состояние 20,52±1,02 13,16±0,88 0,64±0,01 0,26±0,02 Конец реперфузии Контроль 14,61±0,59 а 11,63±0,70 0,46±0,02 а 0,36±0,02 а A12 22,96±1,80 б 19,57±1,84 б 0,60±0,02 б 0,28±0,02 б AII 20,97±0,72 б 16,44±1,43 б 0,57±0,02 аб 0,32±0,02 Данные представлены как М ± m для серии из 10 опытов. Достоверно (p<0,05) отличается от: а – исходного состояния, б – контроля. Таким образом, на обеих моделях ишемического и реперфузионного повреждения сердца было обнаружено сходное антиоксидантное действие природного пептида А12 и его структурного аналога AII. Из приведенных данных следует, что химическое модифицирование пептида А12 не ухудшает его антиоксидантного действия. Также как и природный пептид AII способен уменьшать снижение активности Cu/Zn СОД, КАТ и ГП, что приводит к уменьшению перекисного окислению липидов. 3.4.3 Влияние пептидов А12 и AII на активность коммерческих ферментов СОД и КАТ. Как известно, ишемическое и реперфузионное повреждение сердца способно вызывать повреждения и разрывы сарколеммы кардиомиоцитов [127]. При этом не исключено прямое взаимодействие экзогенно вводимых пептидов А12 и AII с внутриклеточными антиоксидантными ферментами. 87 Для изучения этой возможности были выполнены модельные опыты по инкубации различных концентраций пептидов с коммерческими препаратами ферментов СОД и КАТ, активность которых увеличивалась наиболее заметно на обеих экспериментальных моделях (табл. 11, 12). Пептид А12 в исследованном диапазоне концентраций 0,01–1 мМ не влиял на активность СОД и КАТ (табл. 13) при совместной инкубации с ферментами в течение 24 часов при температуре 4С по сравнению с контролем (инкубации ферментов в отсутствии пептида). Таблица 13. Влияние пептидов А12 и АII на активность коммерческих препаратов СОД и КАТ при совместной инкубации. Активность ферментов Концентрация Группа пептидов, СОД, КАТ, мМ ед/мл ед/мл Контроль A12 AII 0,0 162,7 ± 1,98 463,1 ± 3,77 0,01 160,7 ± 2,08 476,1 ± 6,52 0,1 155,9 ± 2,54 456,5 ± 7,53 1,0 155,6 ± 5,18 459,8 ± 6,24 0,01 158,9 ± 1,85 476,1 ± 6,52 0,1 161,5 ± 0,78 450,0 ± 19,6 1,0 162,9 ± 5,29 440,2 ± 8,21 Данные представлены как M ± m. СОД – супероксиддисмутаза, КАТ – каталаза. Отсутствие влияния на активности СОД и КАТ было отмечено и для аналога AII при инкубации в таких же условиях. Полученные данные свидетельствуют о том, что увеличение антиоксидантной защиты, наблюдаемое на моделях ишемического и реперфузионного повреждения сердца под действием пептидов, не может быть объяснено только антиоксидантных ферментов. их прямым действием на активность 88 3.4.4 Влияние пептидов на образование АФК при реперфузии изолированного сердца крысы. Известно, что активацию перекисного окисления фосфолипидов клеточных мембран инициирует образование АФК на стадии ранней реперфузии [128]. Увеличение активности антиоксидантных ферментов и снижение образования наблюдалось при МДА введении в ишемизированном пептидов, могло сердце, также которое сопровождаться снижением генерации АФК при реперфузии. Действие пептидов на образование АФК было оценено с помощью спиновой ловушки ДМПО. Для того чтобы исключить кардиопротекторное действие ДМПО, связанное с акцептированием АФК (супероксид-аниона и гидроксильного радикала) в миокарде [129], ловушку ДМПО вводили в оттекающий от сердца перфузат. В контроле изолированное сердце крысы подвергали глобальной ишемии и реперфузии В опытных сериях перед ишемией осуществляли инфузию 140 мкМ А12 или AII. В спектрах ЭПР перфузатов регистрировали появление четырёх узких эквидистантных компонентов с соотношением интенсивностей, равным 1:2:2:1, соответствующих спиновому аддукту ДМПО-OH – соединению, образующемуся при взаимодействии молекул ДМПО и короткоживущих токсичных гидроксильных радикалов (рис. 17). Источниками последних в миокардиальном эффлюенте могли быть продукты реакций Габера-Вейса (1) и Фентона (2), а также спонтанный распад нестабильного аддукта ДМПО-ООН, образующегося взаимодействия ДМПО и супероксидных радикалов [130]: Н2О2 + О2˙– Н2О2 + Fe2+ 2+ 2+ , Fe Cu HO˙ + HO– + O2 (1) Fe3+ + HO˙ + HO– (2) в результате 89 Рис. 17. Спектр ЭПР перфузата изолированного сердца крысы после добавления ДМПО. Представлено образование спинового аддукта ДМПО-ОН, сигнал ЭПР которого характеризуется фактором спектроскопического расщепления g = 2,0028. В исходном состоянии до ишемии во всех группах наблюдалась близкая, относительно низкая, концентрация аддукта ДМПО-ОН в миокардиальном эффлюенте (рис. 18). После ишемии на первых минутах реперфузии образование ДМПО-ОН существенно возрастало – на 3-й и 5-й мин реперфузии она была в среднем в 1,6 раза выше, чем до ишемии. Введение перед ишемией A12 или AII достоверно уменьшало образование аддукта ДМПО-ОН по сравнению с контролем. В этом случае концентрация ДМПО-ОН на стадии ранней реперфузии не отличалась от значений в исходном состоянии в этих группах. Эти результаты свидетельствуют о том, что оба пептида способны снижать образование АФК при реперфузии. Данные, полученные реперфузионного природного стресса, апелина А12 на обеих моделях подтверждают и его ишемического антиоксидантые структурного аналога и свойства AII. Они свидетельствуют о том, что защита сердца этими пептидами сопровождается увеличением активности антиоксидантных ферментов СОД, КАТ и ГП и снижением свободнорадикального окисления липидов, которое может быть обусловлено реперфузии. уменьшением продукции короткоживущих АФК при 90 # ДМПО-ОН, мкМ 1.0 Контроль А12 АII # # * 0.8 * * * * * 0.6 0.4 0.2 0.0 Исходное состояние 1 мин 5 мин 3 мин РЕПЕРФУЗИЯ Рис. 18. Влияние инфузии пептидов А12 и АII на концентрацию аддукта ДМПО-ОН в миокардиальном эффлюенте. Данные приведены как среднее ± ошибка среднего для серий из 8 опытов. Достоверно (p<0,05) отличается от: # – исходного состояния, * – контроля. Таким образом, улучшение антиоксидантного статуса реперфузированного сердца является одним из принципиальных механизмов действия природных и модифицированных С-концевых фрагментов апелина. 91 РАЗДЕЛ 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 4.1 Биологическая активность природного пептида А12. В данной работе в качестве основы для создания потенциального лекарственного средства для лечения ИБС и сердечной недостаточности, был выбран природный пептид А12. Он представляет собой минимальный Сконцевой фрагмент полипептида препроапелина (66–77), который обладает высоким сродством к трансмембранному APJ рецептору, сопряженному с Giбелком, и является биологически активным соединением [131]. В отличие от более изученных пептидов А13, А17 и А36, последовательность остатков аминокислот в структуре этого апелина одинакова у человека и животных различных видов. Эндогенный A12 активно экспрессируется во многих тканях и органах, в особенности в головном мозге, надпочечниках, сосудистом эндотелии, сердце, легких и жировой ткани [2,5,6]. Действуя посредством нейроэндокринных механизмов А12 участвует в регуляции гомеостаза жидкости Внутривенное и введение в контроле экзогенного потребления А12 пищи способно [132,133]. снижать АД у анестезированных крыс in vivo в большей степени, чем введение таких же доз А13 и А36 [31]. Отмечено, что в результате этого происходит увеличение концентрации нитратов и нитритов в плазме крови животных, предполагающее образование NO. Это предположение было подтверждено отменой снижения АД в ответ на введение А12 под действием L-NAME. Гипотензивное действие А12 также было продемонстрировано в работе Lee и соавт. [5]. Этими авторами было изучено дозозависимое действие апелина на параметры гемодинамики у анестезированных крыс Wistar. Наблюдался быстрый ответ на внутривенное введение А12, который длился 3-4 мин и заключался в незначительном снижении систолического компенсаторном и увеличении диастолического ЧСС. АД и Положительное инотропное действие на сердце было обнаружено при внутрибрюшинной 92 инъекции А12 крысам in vivo [43], которое заключалось в снижении пред- и постнагрузки и увеличении ЧСС. В последние годы были получены подтверждения включения системы А12/APJ в регуляцию сердечно-сосудистой системы при различной экспериментальной патологии. Так, положительное инотропное действие на сердце крыс с сердечной недостаточностью было обнаружено Dai и соавт. [134]. Перфузия РКХ, содержащим 70 нМ А12, повышала силу сокращения трабекулы и увеличивала внутриклеточные осцилляции ионов Ca 2+, которые регистрировали с помощью флуоресцентного индикатора fura-2. Гипотензивный эффект А12 был обнаружен у спонтанно гипертензивных крыс линии SHR [7]. Инъекции А12 в дозе 15 мкг/кг веса животного снижали систолическое и диастолическое давление, приводя к достоверному снижению среднего АД. Участие А12 и APJ рецептора в регуляции сердечнососудистого гомеостаза было подтверждено у пациентов с сердечной недостаточностью [56]. С помощью иммунохимических методов эти авторы продемонстрировали увеличение уровня А12 в плазме больных на начальных стадиях сердечной недостаточности. В дополнение к этому ими было показано, что вспомогательного при использовании кровообращения левожелудочкового содержание пептида в аппарата эндотелии коронарных артерий и сердечной мыщце увеличивается. В недавнем клиническом исследовании, проведенном на пациентах с острым ИМ, было показано, что концентрация А12 (также как и других С-концевых фрагментов апелина) значительно снижена по сравнению с этим показателем у здоровых лиц [14]. Более того, содержание А12 остается существенно меньше нормального значения в течение последующих 24 недель. Эти факты указывают на то, что А12 и APJ рецептор могут быть перспективными терапевтическими мишенями у больных с сердечно-сосудистой патологией. Результаты, полученные в настоящей работе, свидетельствуют о высокой биологической активности А12 в условиях экспериментальной ишемии и реперфузии сердца. Мы впервые показали прямое действие этого 93 пептида на функцию и коронарные сосуды изолированного перфузируемого работающего сердца крысы. Было обнаружено улучшение восстановления показателей сократительной и насосной функции сердца при реперфузии под влиянием инфузии А12 как до, так и после периода глобальной ишемии. При этом было отмечено дозозависимое действие пептида – его способность оказывать пре- и посткондиционирующее действие на сердце возрастала с увеличением концентрации в РКХ (рис. 11). На модели перфузируемого сердца крысы улучшение показателей ИСФ и насосной функции (МО и АО) было связано с уменьшением подъема Рдиаст во время реперфузии (рис. 12). Защитное действие А12 на функцию сердца сопровождалось снижением повреждения подтверждалось мембран постишемических уменьшением активности кардиомиоцитов, ЛДГ в которое миокардиальном эффлюенте при реперфузии (табл. 3). В дополнение к этому в работе впервые показано, что помимо функциональных эффектов А12 улучшал метаболизм ишемизированного миокарда. Сердца, защищенные пептидом перед глобальной ишемией, обнаруживали лучшее восстановление аэробного обмена во время реперфузии. Содержание макроэргических фосфатов (АТФ и ФКр), ΣАН и ЭП кардиомиоцитов было достоверно выше, чем в контроле. Эти сдвиги в энергетическом состоянии реперфузированного сердца сопровождались снижением содержания лактата в миокарде практически до предишемического значения (прил. 2), прямо указывая на снижение анаэробного гликолиза/гликогенолиза. Полученные данные принципиально согласуются с результатами, которые представлены в современной литературе при исследовании других С-концевых фрагментов апелина. Так, Rastaldo и соавт., используя модель глобальной ишемии на изолированном перфузируемом по Лангендорфу сердце крысы, показали, что инфузия 0,5 мкМ А13 вдвое снижает размеры ИМ по сравнению с контролем, если она выполнена в период ранней реперфузии [73]. Это посткондиционирующее действие А13 сопровождается уменьшением реперфузионной контрактуры и снижением выхода ЛДГ в 94 миокардиальный эффлюент. Сходные результаты были получены Baxter и соавт., которые показали, что введение рА13 перед реперфузией и на ее начальном этапе достоверно уменьшает размеры ИМ на модели перфузируемого сердца крысы. [80]. Принципиально важным является то, что экспрессия апелина и APJ рецептора на ишемии значительно увеличивается на уровне мРНК. Однако в противоположность экспрессии APJ, которая сохраняется на прежнем уровне при реперфузии сердца, экспрессия мРНК апелина к концу реперфузии достоверно снижается по сравнению со значением на ишемии. Из этого следует, что снижение биодоступности эндогенного апелина при реперфузии может служить основанием для использования экзогенных пептидов апелина для защиты сердца от ишемического и реперфузионного повреждения. Zeng и соавт., используя модель изолированного сердца крысы, перфузируемого по Лангендорфу, показали, что введение в перфузат А13 улучшает скорость сокращения и расслабления сердца и достоверно снижает конечное диастолическое давлене в ЛЖ при реперфузии после глобальной ишемии [72]. Кроме того, было отмечено снижение выхода ЛДГ в миокардиальный эффлюент. В параллельной серии опытов, выполненных на изолированных кардиомиоцитах крыс, инкубированных в условиях аноксии, А13 также уменьшал выход ЛДГ в инкубационную среду при последующей реоксигенации. Терапевтические эффекты А36 были изучены Jia и соавт. при сердечной недостаточности у крыс in vivo, которую моделировали инъекциями высоких доз изопротеренола [41]. Развитие сердечной недостаточности у крыс сопровождалось уменьшением содержания апелина в плазме крови и ткани сердца и снижением экспрессии генов апелина и APJ рецептора в ЛЖ. Введение А36 в дозе 5 нмоль/кг/день оказывало инотропное действие на поврежденное сердце, снижало выведение ЛДГ из сердца, а также снижало степень субэндокардиального дилатации и инфильтрации лейкоцитов. некроза, капиллярной 95 Результаты, полученные в настоящей работе, расширяют представление о действии природного А12 in vivo. Нами было показано, что влияние внутривенного введения А12 крысам после региональной ишемии имеет дозозависимый характер и сопровождается уменьшением необратимого повреждения кардиомиоцитов ЗР. Ограничение размеров ИМ под действием А12 по сравнению с контролем было подтверждено не только гистохимическим методом, но и с помощью ферментативных маркеров некроза (рис. 13, табл. 6). При использовании оптимальной дозы А12 размеры ИМ снижались почти вдвое по сравнению с контролем, а активность МВ-КК и ЛДГ в конце реперфузии была снижена в среднем в 2,2 раза. В то же время было отмечено, что увеличение дозы А12 сопровождается возрастанием падения САД сразу после болюсного введения пептида. Причем при использовании высоких доз А12 (350 и 700 нмоль/кг) не наблюдалось полного восстановления САД к окончанию реперфузии (табл. 5). Аналогичный ответ на введение высоких доз А12 наблюдали при регистрации ЧСС. Эти данные совпадают с результами ранее выполненного исследования Simpkin и соавт. на модели острого ИМ у мышей in vivo при использовании других С-концевых фрагментов апелина [74]. Этими авторами было показано, что болюсное внутривенное введение А13 вызывало большее ограничение размеров ИМ, чем введение А36 в той же дозе. В недавних работах Yang и соавт. и Tao и соавт. также была подтверждена способность А13 ограничивать размеры острого ИМ при его внутривенном введении перед реперфузией [135,136]. Целесообразность хронического введения рА13 для ограничения размеров ИМ у крыс in vivo была продемонстрирована Azizi и соавт. [75]. Пятидневное введение рА13 через сутки после окклюзии коронарной артерии приводило к двукратному снижению размеров ИМ по сравнению с контролем на 14-й день реперфузии. Уменьшение необратимого повреждения миокардиальной ткани подтверждалось постепенным 96 снижением активности ЛДГ и МВ-КК в плазме до значений у ложнооперированных животных к 7 дню эксперимента. В дополнение к этому результаты наших опытов, выполненных на модели острого ИМ у крыс in vivo, подтверждают влияние А12 на метаболическое состояние ЗР левого желудочка сердца. Улучшение энергетического обмена ЗР к концу реперфузии проявлялось в достоверном улучшении ЭП кардиомиоцитов, существенно лучшим восстановлением ФКр и снижением содержания лактата по сравнению с этими показателями в контроле (прил.6). Из анализа наших данных и результатов исследований, выполненных в других лабораториях, следует, что природный пептид А12 обладает высоким потенциалом ограничения ишемического и реперфузионного повреждения сердца в эксперименте. Этот вывод хорошо обосновывает целесообразность химической модификации этого пептида для повышения его устойчивости в кровотоке с целью разработки лекарственных средств на его основе. 4.2 Кардиопротекторные свойства структурных аналогов А12. Сравнительное изучение свойств четырех оригинальных структурных аналогов А12 было проведено на модели изолированного перфузируемого сердца крысы, подвергнутого глобальной ишемии и реперфузии в сравнении с природным пептидом А12. Для этого было использовано их введение перед ишемией в концентрации 140 мкМ, которое обеспечивало наиболее эффективное восстановление функции сердца. Под влиянием структурных аналогов AII, AIII и AIV показатели сократительной и насосной функции восстанавливались к концу реперфузии в той же степени, что и под действием природного А12 (прил. 1). В то же время восстановление большинства этих показателей при введении аналога AV было хуже, чем при использовании пептидов А12, AII, AIII и AIV. Для аналогов AII и AIII отмечено меньшее повреждение клеточных мембран в период ранней реперфузии, также как и для природного пептида А12 (табл. 3, 4). Все 97 структурные аналоги А12 обеспечивали лучшее восстановление метаболического состояния реперфузированного сердца по сравнению с контролем, которое не отличалось при этом от природного А12. Однако для аналога AV было отмечено меньшее сохранение ΣАН в сердце при реперфузии. На основании полученных данных можно заключить, что аналог AV, полученный заменой С-концевого остатка фенилаланина в структуре А12 на d-аланин, наименее эффективен, в то время как остальные пептиды защищают сердце приблизительно в равной степени. Для выявления преимуществ в кардипротекторном действии структурных аналогов была использована физиологическая модель более высокого уровня – региональная ишемии и реперфузия миокарда у наркотизированных крыс in vivo. Пептиды вводили одновременно с возобновлением коронарного кровотока в широком диапазоне доз (от 35 до 700 нмоль/кг). В основу оценки эффективности пептидов легла их способность уменьшать необратимые ишемические и реперфузионные повреждения сердца, критериями которой были ограничение размеров ИМ и снижение активности маркеров некроза в плазме. Исходя из этого, оптимальным пептидом оказался структурный аналог AII в дозе 350 нмоль/кг. Его внутривенное введение уменьшало размеры ИМ и снижало активности МВ-КК и ЛДГ в конце реперфузии по сравнению с контролем в той же степени, что и введение природного пептида А12 (прил. 3, 4). В отличие от природного А12 изменения САД и ЧСС под действием АII были незначительными и полностью восстанавливались к концу реперфузии. Одновременно под действием аналога AII было отмечено улучшение энергетического обмена в ЗР левого желудочка сердца крыс. Оно заключалось в лучшем сохранении ΣАН, ФКр и ЭП кардиомиоцитов, а также в достоверном уменьшении накопления лактата по сравнению с контролем (рис. 14). Причем изменения в ЭП и содержании лактата под влиянием AII были достоверно больше, чем при использовании А12. 98 Замена С-концевого фенилаланина на d-аланин в аналоге АV приводила к уменьшению ограничения размеров ИМ по сравнению с А12 (прил. 3), которое сочеталось с ухудшением метаболического состояния ЗР (прил. 6). Эти данные указывают на важную роль С-концевого остатка фенилаланина в связывании пептида с APJ рецептором, приводящем к запуску сигнального каскада реперфузионных киназ, обеспечивающего закрытие митохондриальной поры и, тем самым, снижение гибели кардиомиоцитов в ЗР [73,74]. Данное предположение хорошо согласуется с результатами работ [24,93], показывающими, что замена или удаление Сконцевого остатка фенилаланина снижает гипотензивные свойства А13 и ингибирует интернализацию APJ рецептора. В то же самое время, на модели региональной ишемии миокарда и реперфузии мы не наблюдали отмену гипотензивного действия пептида AV в противоположность работе Lee и соавт. [7]. В целом, его защитное действие по ограничению размеров ИМ, улучшению метаболического состояния ЗР, снижению активности маркеров некроза в плазме крови было значительно слабее, чем природного пептида А12 и структурных аналогов AI и AII (прил. 3–6). Таким образом, модифицированные аналоги природного пептида А12 являются эффективными корректорами ишемического и реперфузионного повреждения сердца, что было подтверждено на обеих экспериментальных моделях. Среди изученных пептидов AII представляется наиболее перспективным для создания лекарственных средств, направленных на уменьшение нарушений функции и метаболизма сердца, вызванных ишемией миокарда и последующей реперфузией. 4.3 Механизмы действия структурных аналогов А12. Участие NO-синтазы в кардиопротекторных механизмах действия пептидов апелина. Участие NO-синтазы в механизмах гипотензивного действия С-концевых фрагментов апелина было продемонстрировано в 99 целом ряде экспериментальных и клинических исследований. У наркотизированных крыс гипотензивный эффект А12 (в большей степени, чем А36 и А13) сопровождался увеличением содержания в плазме нитритов и нитратов и отменялся в присутствии ингибитора NO-синтаз L-NAME [31]. Дозозависимый характер снижения среднего артериального давления при инфузии А12 был подтвержден на бодрствующих крысах [137]. Снижение дисфункции эндотелия аорты у диабетических мышей под действием А13 происходило одновременно с активацией сигнального пути PI3K/Akt/NOсинтаза и сопровождалось фосфорилированием Akt по остаткам Ser473 и фосфорилированием эндотелиальной NO-синтазы по остаткам Ser1177 [138]. При этом вазодилатационный эффект апелина отменялся в присутствии LNAME и ингибитора PI3 киназы LY2940002, что подтверждает значение при диабете фосфорилирования эндотелиальной NO-синтазы, инициируемого апелином. На модели атеросклероза у нокаутных мышей без гена аполипопротеина Е пептид рА13 уменьшал образование аневризмы аорты и снижал повреждающее действие ангиотензина II благодаря уменьшению генерации АФК [139]. Ключевая роль NO-синтазы в действии пептида рА13 была подтверждена методом ЭПР с помощью спиновой ловушки NO и отменой защитного действия пептида в присутствии L-NAME. У здоровых добровольцев и пациентов с хронической сердечной недостаточностью внутривенное введение рА13 и А36 вызывало NO-зависимую артериальную вазодилатацию, которую отменяло введение ингибитора NO-синтазы NGMMLA [13,140]. Значение сигнального каскада PI3K/Akt/NO-синтаза и образования NO в кардиопротекторных эффектах апелина не столь очевидно. Так, снижение ишемического и реперфузионного повреждения, моделированного в изолированном перфузируемом сердце крысы и культуре неонатальных кардиомиоцитов, под действием А13 сопровождалось одновременным увеличением экспрессии эндотелиальной NO-синтазы и фосфорилирования Akt и ERK1/2 [72]. Об участии NO в механизмах защитного действия апелина 100 свидетельствует отмена уменьшения размеров инфаркта миокарда в изолированном перфузируемом сердце крысы при совместном введении А13 и ингибитора NO-синтазы L-NNA [73]. В тоже время, несмотря на активацию PI3/Akt и ERK1/2 киназ под действием А13 в изолированном сердце мыши, подвергнутом региональной ишемии и реперфузии, увеличения фосфорилирования эндотелиальной NO-синтазы обнаружено не было [74]. К началу выполнения данной работы в литературе отсутствовали данные об участие NO-зависимых механизмов, запускаемых апелинами, в уменьшении повреждения сердца при ишемии и реперфузии. Влияние LNAME на введение А12 или его структурного аналога AII было выяснено нами на моделях ишемического и реперфузионного повреждения сердца ex vivo и in vivo. На изолированном перфузируемом сердце было обнаружено, что метаболическое и функциональное восстановление реперфузированного миокарда и стабильность мембран постишемических кардиомиоцитов значительно снижается, если в перфузионную среду одновременно с пептидами апелина добавлен L-NAME (рис. 15, табл. 8, прил. 7). На модели регионально ишемии миокарда у крыс in vivo ограничение ИМ сопровождалось снижением САД при внутривенном введении А12 или AII (рис. 16, табл. 9). Снижение САД под действием пептидов, скорее всего, было вызвано вазодилатационными свойствами NO, образующегося в результате активации NO-синтаз этими пептидами. Это подтверждалось значительным уменьшением кардиопротекторной эффективности обоих пептидов на фоне ингибирования активности NO-синтаз L-NAME – увеличением размеров ИМ и активности МВ-КК и ЛДГ в плазме параллельно с меньшим снижением САД во время реперфузии (рис. 16, табл. 9, 10). Взятые вместе, эти результаты убедительно демонстрируют одновременное снижение метаболического и функционального влияния струтрурного аналога AII в присутствии неспецифического ингибитора NO-синтаз LNAME. Это предполагает участие NO в механизмах защитного действия AII, которые тесно связаны с восстановлением энергетического состояния 101 реперфузированного миокарда. Дальнейшее изучение кардиотропных свойств структурных аналогов апелина с помощью спиновых ловушек АФК и NO, а также селективных ингибиторов компонентов киназных каскадов и изоформ NO-синтазы дальнейшего изучения представляется механизмов практически защиты значимым сердца для этими фармакологическими лигандами APJ рецептора. Неполная отмена защиты структурным аналогом AII при ингибировании активности NO-синтазы L-NAME в наших опытах, скорее всего, связана с реперфузионными каскадами, которые запускаются этим пептидом независимо от NO. К ним, прежде всего, относится каскад MEK1/2ERK1/2, вызывающий ингибирование проапоптозных белков BAX/BAD и уменьшение выхода из митохондрий цитохрома С. Уменьшение гибели кардиомиоцитов, инициированное ингибированием открытия митохондриальной поры пептидами апелина может быть также результатом фосфорилирования киназы гликоген синтазы-3 или белков BAX/BAD протеинкиназой B (Akt) [79](рис. 4). Повидимому, пептид AII может стимулировать образование NO не только посредством активации эндотелиальной NO-синтазы, но и увеличивая синтез самого белка. Так, при инкубации ткани аорты крысы было обнаружено, что пептид А13 увеличивает продукцию эндотелиальной NOсинтазы на уровне белка в несколько раз более эффективно, чем на уровне мРНК [141]. Увеличение экспрессии гена эндотелиальной NO-синтазы под действием структурных аналогов апелина может происходить не только в сосудах, но и в миокарде. На такую возможность указывает значительное возрастание продукции эндотелиальной NO-синтазы под действием А13 при моделировании гипоксии и реоксигенации в культуре неонатальных кардиомиоцитов крысы [72]. Отметим, что для образования NO под действием NO-синтазы необходимо наличие L-аргинина, транспорт которого в клетки осуществляется с помощью переносчиков катионных аминокислот 102 [142]. Показано, что экзогенный А13 увеличивает захват аортальной тканью L-аргинина из среды инкубации одновременно с увеличением продукции мРНК переносчиков этой аминокислоты СAT-1 и CAT-2B [141]. Таким образом, стимуляция транспорта L-аргинина в клетки и увеличение экспрессии NO-синтаз под действием природных пептидов апелина являются дополнительным подтверждением возможности использования пути Lаргинин/ NO-синтаза/NO структурными аналогами А12 для защиты миокарда. Изучение этих механизмов в будущем представляется необходимым для более четкого представления кардиопротекторного действия препаратов, разработанных на основе химического модифицирования С-концевых фрагментов апелина. Механизмы антиоксидантного действия структурных аналогов А12. Структурные аналоги апелина могут снижать ишемическое и реперфузионное повреждение сердца вследствии антиоксидантных свойств NO, образующегося при активации изоферментов NO-синтазы [143,144]. Другой возможностью является влияние этих пептидов непосредственно на активность антиоксидантных ферментов сердца. Систематического изучения влияния пептидов апелина на активность ферментов антиоксидантной защиты сердца и перекисное окисление липидов к началу нашей работы проведено не было. Однако результаты работы Zeng и соавт., выполненной на культуре кардиомиоцитов крысы, предполагали такую возможность [72]. Эти авторы показали, что при моделировании гипоксии и реоксигенации экзогенный А13 уменьшал образование вторичного продукта свободнорадикального окисления липидов – МДА – и генерацию О2˙-, а также увеличивал активность СОД, утилизирующей О2˙-. В связи с этим нами была сопоставлена способность структурного аналога AII уменьшать ишемическое и реперфузионное повреждение сердца с его влиянием на активности Cu/Zn СОД, КАТ и ГП, а также на образование МДА и АФК. На обеих моделях ишемического и реперфузионного повреждения сердца под 103 действием AII эффективная защита реперфузированного миокарда сопровождалась предотвращением снижения или увеличением активности антиоксидантных ферментов по сравнению с контролем (табл. 11, 12). Повышению компенсаторных возможностей эндогенной антиоксидантной системы в сердце крыс под действием AII соответствовало снижение содержания МДА в реперфузированном средце. Эти результаты хорошо согласуются с меньшими повреждениями мембран кардиомиоцитов, которые были оценены по активности ЛДГ и МВ-КК при реперфузии (табл. 4, прил. 4). Нами впервые экспериментально подтверждена способность структурного аналога AII уменьшать образование АФК при реперфузии сердца с помощью спиновой ловушки ДМПО (рис. 18). Поскольку ДМПО вводили в миокардиальный эффлюент, полученные данные не дают однозначного представления об уменьшении генерации АФК в дыхательной цепи митохондрий, под действием ксантиноксидазной системы или в результате ПОЛ в самой миокардиальной ткани. Поэтому в дальнейшем планируется изучение влияния структурных аналогов А12 на продукцию ОН˙ и О2˙-.в ЗР сердца крыс при реперфузии методом ЭПР с помощью микродиализа. Данный подход позволит исключить артефакты, связанные с воздействием самой ловушки ДМПО на ткань сердца. Тем не менее, обнаруженное нами снижение концентрации спинового аддукта ДМПО-OH в перфузате, свидетельствует высокотоксичных о кислородных подавлении радикалов, пептидами образования вызывающих необратимые повреждения сердечной мышцы. Следует отметить, что в этих опытах в качестве дополнительного контроля был использован природный пептид А12. Было показано, что на обеих использованных нами экспериментальных моделях эффективность антиоксидантной защиты под действием структурного аналога AII не отличается от таковой для природного пептида. Таким образом, химическое 104 модифицирование природного пептида существенно не изменяет его антиоксидантного свойства. Очевидно, что снижение образования короткоживущих АФК и продукта ПОЛ МДА вследствие увеличения активности COД, КАТ и ГП в сердце при реперфузии может быть ведущим звеном в механизмах защиты миокарда природным пептидом А12 и его структурным аналогом AII. Оно могло быть активность обусловлено ферментов. непосредственным Однако отсутствие влиянием пептидов увеличения на активности коммерческих ферментов СОД и КАТ при длительной инкубации с А12 и AII практически исключает такую возможность (табл. 13). Скорее всего, наблюдаемое нами увеличение активности Cu/Zn СОД, КАТ и ГП могло быть связано с повышением экспрессии генов этих ферментов под влиянием пептидов апелина. Это можно предположить из результатов недавней работы, выполненной на гипертрофированных изолированных кардиомиоцитах крысы [87]. В присутствии пептида А13 снижение образования Н2О2 и АФК в гипертрофированных кардиомиоцитах сопровождалось увеличением экспрессии мРНК каталазы и активности фермента. Планируемое нами изучение роли структурных аналогов пептида А12 в контроле экспрессии генов, ответственных за регуляцию антиоксидантного состояния реперфузированного сердца, позволит углубить представления о механизмах действия этих пептидов при окислительном стрессе. 105 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Результаты исследований, выполненных в различных лабораториях, показали, что система апелин/APJ рецептор является важным регулятором сердечно-сосудистой системы в нормальных и патологических условиях [30]. В последние годы были предприняты попытки создания фармакологических лигандов APJ рецептора, которые обладают повышенной устойчивостью к воздействию протеолитических ферментов и стабильностью при хранении. Полагают, что такие соединения могут быть основой для создания новых лекарственных средств, применяющихся в том числе при патологиях, связанных с ишемическим и реперфузионным повреждением сердца. Наиболее перспективным подходом для создания таких лигандов является модификация С- и N-концевых остатков аминокислот в молекуле пептида и замена остатка легко окисляющегося метионина на норлейцин [96]. В отличие от работ Wang и соавт. и Jia и соавт. [90,91], в которых была проведена модификация рА13 и А36, нами в качестве основы был выбран наиболее короткий фрагмент полипептида апелина – А12, исходно обладающий высокой биологической активностью. Этот подход позволил создать устойчивые синтетические аналоги А12, оказывающие мощное действие на сердце в условиях экспериментальной ишемии и реперфузии. Полученные соединения характеризуются комплексным воздействием на поврежденный миокард. Они обеспечивают лучшее восстановление функции сердца после ишемического и реперфузионного стресса, снижают необратимые повреждения кардиомиоцитов, улучшают энергетический обмен в реперфузированном сердце, а также обладают выраженными антиоксидантными свойствами. Структурные аналоги апелина не уступают по эффективности кардиозащиты природному пептиду А12 на использованных моделях. Мы полагаем, что созданные соединения найдут применение при терапии целого ряда заболеваний, связанных с сердечной 106 патологией. Нами зарегистрирован патент РФ на изобретение додекапептидов, обладающих кардиопротекторными свойствами [97], и завершается доклиническое исследование аналога АII. При успешной доработке препарата планируется проведение 1-й фазы клинических исследований на больных с хронической сердечной недостаточностью и острым коронарным синдромом. Оптимизация терапии этих заболеваний с помощью этого нового лекарственного средства будет способствовать снижению развития сердечно-сосудистых осложнений и уменьшению материальных затрат для конкретного больного и для здравоохранения на общероссийском уровне. 107 ВЫВОДЫ 1. Инфузия структурных аналогов AII, AIII и AIV улучшает восстановление функции изолированного перфузируемого сердца крысы после сохранения глобальной энергетического ишемии, обмена повышает в миокарде эффективность и снижает повреждение мембран кардиомиоцитов при реперфузии. 2. Внутривенное введение структурных аналогов AII и AIII значительно уменьшает размеры ИМ и снижает активность МВ-КК и ЛДГ в плазме крови при моделировании региональной ишемии и реперфузии сердца у крыс in vivo. 3. Введение структурного аналога AII крысам in vivo вызывает меньшие нарушения параметров гемодинамики по сравнению с природным пептидом А12 и улучшает энергетическое состояние ЗР по сравнению с контролем. 4. Включение NO-зависимых механизмов в действие аналога AII подтверждено ухудшением функционального и метаболического восстановления сердца и увеличением необратимого повреждения кардиомиоцитов при реперфузии в присутствии L-NAME на обеих экспериментальных моделях. 5. Увеличение активности Cu/Zn СОД, КАТ и ГП под влиянием структурного аналога AII сопровождается снижением образования АФК и МДА при реперфузии сердца, что свидетельствует об антиоксидантном действии пептида. 6. Результаты указывают на перспективность использования структурных аналогов А12, в частности AII, в качестве основы для создания препаратов, направленных на лечение ИБС. 108 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Структурный аналог АII может быть использован для создания лекарственного средства, применяющегося при терапии ИБС. БЛАГОДАРНОСТИ Работа выполнена при поддержке ФЦП «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу» (Государственный контракт Минпромторга России №13411.1008799.13.071 «Доклинические исследования лекарственного средства из группы вазоактивных пептидов - апелина, улучшающего сократимость миокарда при сердечной недостаточности») и гранта РФФИ №11-04-00078а «Регуляция метаболизма ишемизированного сердца структурными аналогами лиганда APJ рецептора». 109 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. O'Dowd B.F., Heiber M., Chan A., Heng H.H., Tsui L.C. et al. A human gene that shows identity with the gene encoding the angiotensin receptor is located on chromosome 11. // Gene. 1993. V.136. P. 355–360. 2. Tatemoto K., Hosoya M., Habata Y., Fujii R., Kakegawa T. et al. Isolation and characterization of a novel endogenous peptide ligand for the human APJ receptor. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. V. 251(2). P. 471–476. 3. Tatemoto K. Search for an endogenous ligand of the orphan G proteincoupled receptor – discovery of apelin, a novel biologically active peptide. // Nihon Rinsho. 2000. V 58(3). P. 737–746. 4. Hosoya M., Kawamata Y., Fukusumi S. et al. Molecular and functional characteristics of APJ. Tissue distribution of mRNA and interaction with the endogenous ligand apelin. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275(28). P. 21061– 21067. 5. Lee D.K., Cheng R., Nguyen T. et al. Characterization of apelin, the ligand for the APJ receptor. // J. Neurochem. 2000. V. 74(1). P. 34–41. 6. Kawamata Y., Habata Y., Fukusumi S., et al. Molecular properties of apelin: tissue distribution and receptor binding. // Biochim. Biophys. Acta. 2001. V. 1538. P.162–171. 7. Lee D.K., Saldivia V.R., Nguyen T., Cheng R., George S.R., O'Dowd B.F. Modification of the terminal residue of apelin-13 antagonizes its hypotensive action. // Endocrinology. 2005. V. 146(1). P.231–236. 8. Habata Y., Fujii R., Hosoya M., Fukusumi S., KawamataY. Apelin, the natural ligand of the orphan receptor APJ, is abundantly secreted in the colostrums. // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1452(1). P. 25–35. 9. Mesmin C., Fenaille F., Becher F., Tabet J.C., Ezan E. Identification and characterization of apelin peptides in bovine colostrum and milk by liquid 110 chromatography-mass spectrometry. // J. Proteome. Res. 2011. V. 10(11). P. 5222–5231. 10. Vickers C., Hales P., Kaushik V., Dick L., Gavin J., Tang J. et al. Hydrolysis of biological peptides by human angiotensin-converting enzyme-related carboxypeptidase. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277(17). P. 14838–14843. 11. El Messari S., Iturrioz X., Fassot C., De Mota N., Roesch D., LlorensCortes C. Functional dissociation of apelin receptor signaling and endocytosis: implications for the effects of apelin on arterial blood pressure. // J. Neurochem. 2004. V. 90. P. 1290–1301. 12. Mesmin С., Dubois M., Becher F., Fenaille F., Ezan E. Liquid chromatography/tandem mass spectrometry assay for the absolute quantification of the expected circulating apelin peptides in human plasma. // Rapid. Commun. Mass. Spectrom. 2010. V. 24(19). P. 2875–2884. 13. Japp A.G., Cruden N.L., Amer D.A., Li V.K., Goudie E.B., Johnston N.R., Sharma S. et al. Vascular Effects of Apelin In Vivo in Man. // Am. Coll. Cardiol. 2008. V. 52(11). P. 908–913. 14. Weir R.A., Chong K.S., Dalzell J.R., Petrie C.J., Murphy C.A., Steedman T. et al. Plasma apelin concentration is depressed following acute myocardial infarction in man. // Eur. J. Heart. Fail. 2009. V. 11.P. 551–558. 15. Aydin S., Eren M.N., Sahin I., Aydin S. The role of apelins in the physiology of the heart. // Protein. Pept. Lett. 2014. V. 21(1). P. 2–9. 16. Maguire J.J., Kleinz M.J., Pitkin S.L., Davenport A.P. [Pyr1]apelin-13 identified as the predominant apelin isoform in the human heart: vasoactive mechanisms and inotropic action in disease. // Hypertension. 2009. V. 54. P. 598–604. 17. Van Coillie E., Proost P., Van Aelst I., Struyf S., Polfliet M. et al. Functional comparison of two human monocyte chemotactic protein-2 isoforms, role of the amino-terminal pyroglutamic acid and processing by 111 CD26/dipeptidyl peptidase IV. // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 12672– 12680. 18. De Mota N., Reaux-Le Goazigo A., El Messari S., Chartrel N., Roesch D. et al. Apelin, a potent diuretic neuropeptide counteracting vasopressin actions through inhibition of vasopressin neuron activity and vasopressin release. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 10464–10469. 19. Azizi M., Iturrioz X., Blanchard A., Peyrard S., De Mota N. et al. Reciprocal regulation of plasma apelin and vasopressin by osmotic stimuli. // J. Am. Soc. Nephrol. 2008. V. 19. P. 1015–1024. 20. Medhurst A.D., Jennings C.A., Robbins M.J., Davis R.P., Ellis C. et al. Pharmacological and immunohistochemical characterization of the APJ receptor and its endogenous ligand apelin. // J. Neurochem. 2003. V. 84(5). P. 1162–1172. 21. Langelaan D.N., Rainey J.K. Headgroup-dependent membrane catalysis of apelin-receptor interactions is likely. // J. Phys. Chem. B. 2009. V. 113(30). P. 10465–10471. 22. Langelaan D.N., Bebbington E.M., Reddy T., Rainey J.K. Structural insight into G-protein coupled receptor binding by apelin. // Biochemistry. 2009. V. 48(3). P. 537–548. 23. Tyndall J.D., Pfeiffer B., Abbenante G., Fairlie D.P. Over one hundred peptide-activated G protein-coupled receptors recognize ligands with turn structure. // Chem. Rev. 2005. V. 105(3). P. 793–826. 24. Murza A., Parent A., Besserer-Offroy E., Tremblay H. et al. Elucidation of the Structure –Activity Relationships of Apelin: Influence of Unnatural Amino Acids on Binding, Signaling, and Plasma Stability. // Chem. Med. Chem. 2012. V. 7. P. 318–325. 25. Kleinz M.J., Davenport A.P. Immunocytochemical localization of the endogenous vasoactive peptide apelin to human vascular and endocardial endothelial cells. // Regul. Pept. 2004. V. 118(3). P. 119–125. 112 26. Kleinz M.J., Skepper J.N., Davenport A.P. Immunocytochemical localisation of the apelin receptor, APJ, to human cardiomyocytes, vascular smooth muscle and endothelial cells. // Regul. Pept. 2005. V. 126(3). P. 233–240. 27. Boucher J., Masri B., Daviaud D., Gesta S., Guigne C., Mazzucotelli A., Castan-Laurell I. et al. Apelin, a newly identified adipokine up-regulated by insulin and obesity. // Endocrinology. 2005. V. 146. P. 1764–1771. 28. Glassford A.J., Yue P., Sheikh A.Y., Chun H.J., Zarafshar S., Chan D.A., Reaven G.M., Quertermous T., Tsao P.S. HIF-1 regulates hypoxia- and insulin-induced expression of apelin in adipocytes. // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2007. V. 293. P. E1590–E1596. 29. Ladeiras-Lopes R., Ferreira-Martins J., Leite-Moreira A. The Apelinergic System: The Role Played in Human Physiology and Pathology and Potential Therapeutic Applications. // Arq. Bras. Cardiol. 2008. V. 90(5). P. 343–349. 30. Pitkin S.L., Maguire J.J., Bonner T.I., Davenport A.P. International Union of Basic and Clinical Pharmacology. LXXIV. Apelin receptor nomenclature, distribution, pharmacology, and function. // Pharmacol. Rev. 2010. V. 62 (3). P. 331–342. 31. Tatemoto K., Takayama K., Zou M.X., Kumaki I., Zhang W., Kumano K., et al. The novel peptide apelin lowers blood pressure via a nitric oxidedependent mechanism. // Regul. Pept. 2001. V. 99. P. 87–92. 32. Salcedo A., Garijo J., Monge L., Fernandez N., Luis García-Villalon A., Sanchez Turrion V., Cuervas-Mons V., Dieguez G. Apelin effects in human splanchnic arteries. Role of nitric oxide and prostanoids. // Regul. Pept. 2007. V. 144. P. 50–55. 33. Katugampola S.D., Maguire J.J., Matthewson S.R., Davenport A.P. [125I](Pyr1)Apelin-13 is a novel radioligand for localizing the APJ orphan receptor in human and rat tissues with evidence for a vasoconstrictor role in 113 man. // Br. J. Pharmacol. 2001. V. 132. P. 1255–1260. 34. Kasai A., Shintani N., Oda M., Kakuda M., Hashimoto H., Matsuda T., Hinuma S., Baba A. Apelin is a novel angiogenic factor in retinal endothelial cells. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. V. 325. P. 395–400. 35. Cox C.M., D’Agostino S.L., Miller M.K., Heimark R.L., Krieg P.A. Apelin, the ligand for the endothelial G-protein-coupled receptor, APJ, is a potent angiogenic factor required for normal vascular development of the frog embryo. // Dev. Biol. 2006. V. 296. P. 177–189. 36. Masri B., Morin N., Cornu M., Knibiehler B., Audigier Y. Apelin (65–77) activates p70S6 kinase and is mitogenic for umbilical endothelial cells. // FASEB J. 2004. V. 18. P. 1909–1911. 37. Li F., Li L., Qin X., Pan W., Feng F., Chen F. et al. Apelin-induced vascular smooth muscle cell proliferation: the regulation of cyclin D1. // Front. Biosci. 2008. V. 13. P. 3786–3792. 38. Kasai A., Shintani N., Kato H., Matsuda S., Gomi F., Haba R., Hashimoto H., Kakuda M., Tano Y., Baba A. Retardation of retinal vascular development in apelin deficient mice. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2008. V. 28.P. 1717–1722. 39. Charo D.N., Ho M., Fajardo G., Kawana M., Kundu R.K., Sheikh A.Y. et al. Endogenous regulation of cardiovascular function by apelin-APJ. // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 2009. V. 297. P. H1904–1913. 40. Berry M.F., Pirolli T.J., Jayasankar V., Burdick J., Morine K.J., Gardner T.J., Woo Y.J. Apelin has in vivo inotropic effects on normal and failing hearts. // Circulation. 2004. V. 110 (11).P. II187–193. 41. Jia Y.X., Pan C.S., Zhang J., Geng B, Zhao J. et al. Apelin protects myocardial injury induced by isoproterenol in rats.// Regul. Pept. 2006. V. 133. P. 147–154. 42. Atluri P., Morine K.J., Liao G.P., Panlilio C.M, Berry M.F. et al. Ischemic 114 heart failure enhances endogenous myocardial apelin and APJ receptor expression. // Cell. Mol. Biol. Lett. 2007. V. 12. P. 127–138. 43. Ashley E.A., Powers J., Chen M., Kundu R., Finsterbach T., Caffarelli A. et al. The endogenous peptide apelin potently improves cardiac contractility and reduces cardiac loading in vivo. // Cardiovasc. Res. 2005. V. 65(1). P. 73–82. 44. Szokodi I., Tavi P., Földes G, Voutilainen-Myllylä S., Ilves M. et al. Apelin, the novel endogenous ligand of the orphan receptor APJ, regulates cardiac contractility. // Circ. Res. 2002. V. 91(5). P. 434–440. 45. Maguire J.J., Kleinz M.J., Pitkin S.L., Davenport A.P. [Pyr1]apelin-13 identified as the predominant apelin isoform in the human heart: vasoactive mechanisms and inotropic action in disease. // Hypertension. 2009. V.54. P. 598–604. 46. Reaux-Le Goazigo A., Morinville A., Burlet A., Llorens-Cortes C., Beaudet A. Dehydration-induced cross-regulation of apelin and vasopressin immunoreactivity levels in magnocellular hypothalamic neurons. // Endocrinology. 2004. V. 145. P. 4392–4400. 47. Kunduzova O., Alet N., Delesque-Touchard N., Millet L., Castan-Laurell I et al. Apelin/APJ signaling system: a potential link between adipose tissue and endothelial angiogenic processes. // FASEB J. 2008. V. 22. P.4146– 4153. 48. Wei L., Hou X., Tatemoto K. Regulation of apelin mRNA expression by insulin and glucocorticoids in mouse 3T3–L1 adipocytes. // Regul. Pept. 2005. V. 132. P. 27–32. 49. Sorhede Winzell M., Magnusson C., Ahren B. The APJ receptor is expressed in pancreatic islets and its ligand, apelin, inhibits insulin secretion in mice. // Regul. Pept. 2005. V. 131. P. 12–17. 50. Dray C., Knauf C., Daviaud D., Waget A., Boucher J., Buléon M., Cani P.D, Attané C., Guigné C., Carpéné C., Burcelin R., Castan-Laurell I., 115 Valet P. Apelin stimulates glucose utilization in normal and obese insulinresistant mice. // Cell. Metab. 2008. V. 8(5). P. 437–445. 51. Castan-Laurell I., Vítkova M., Daviaud D., Dray C., Kovacikova´ M., Kovacova Z., Hejnova J., Stich V., Valet P. Effect of hypocaloric dietinduced weight loss in obese women on plasma apelin and adipose tissue expression of apelin and APJ. // Eur. J. Endocrinol. 2008. V. 158. P. 905– 910. 52. Li L., Yang G., Li Q., Tang Y., Yang M., Yang H., Li K. Changes and relations of circulating visfatin, apelin, and resistin levels in normal, impaired glucose tolerance, and type 2 diabetic subjects. // Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 2006. V. 114. P. 544–548. 53. Castan-Laurell I., Dray C., Knauf C., Kunduzova O., Valet P. Apelin, a promising target for type 2 diabetes treatment? // Trends. Endocrinol. Metab. 2012. V. 23. P. 234–241. 54. Yue P., Jin H., Aillaud M., Deng A.C., Azuma J., Asagami T., Kundu R.K., Reaven G.M., Quertermous T., Tsao P.S. Apelin is necessary for the maintenance of insulin sensitivity. // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2010. V. 298. P. E59–E67. 55. Higuchi K., Masaki T., Gotoh K., Chiba S., Katsuragi I., Tanaka K., Kakuma T., Yoshimatsu H. Apelin, an APJ receptor ligand, regulates body adiposity and favors the messenger ribonucleic acid expression of uncoupling proteins in mice. // Endocrinology. 2007. V. 148. P. 2690–2697. 56. Chen M.M., Ashley E.A., Deng D.X., Tsalenko A., Deng A. et al. Novel role for the potent endogenous inotrope apelin in human cardiac dysfunction. // Circulation. 2003. V. 108. P. 1432–1439. 57. Chong K.S., Gardner R.S., Morton J.J., Ashley E.A., McDonagh T.A. Plasma concentrations of the novel peptide apelin are decreased in patients with chronic heart failure. // Eur. J. Heart. Fail. 2006. V. 8. P. 355–360. 58. Miettinen K.H., Magga J., Vuolteenaho O., Vanninen E.J., Punnonen K.R., 116 Ylitalo K., Tuomainen P., Peuhkurinen K.J. Utility of plasma apelin and other indices of cardiac dysfunction in the clinical assessment of patients with dilated cardiomyopathy. // Regul. Pept. 2007. V. 140. P. 178–184. 59. Foldes G., Horkay F., Szokodi I., Vuolteenaho O., Ilves M. et al. Circulating and cardiac levels of apelin, the novel ligand of the orphan receptor APJ, in patients with heart failure. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. V. 308. P. 480–485. 60. Ronkainen V.P., Ronkainen J.J., Hanninen S.L., Leskinen H., Ruas J.L. et al. Hypoxia inducible factor regulates the cardiac expression and secretion of apelin. // FASEB J. 2007. V. 21. P. 1821–1830. 61. Sheikh A.Y., Chun H.J., Glassford A.J., Kundu R.K., Kutschka I. et al. In vivo genetic profiling and cellular localization of apelin reveals a hypoxiasensitive, endothelial-centered pathway activated in ischemic heart failure. // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 2008. V. 294. P. H88–H98. 62. Hashimoto T., Kihara M., Imai N., Yoshida S., Shimoyamada H. et al. Requirement of apelin-apelin receptor system for oxidative stress-linked atherosclerosis. // Am. J. Pathol. 2007. V. 171. P. 1705–1712. 63. Pitkin S.L., Maguire J.J., Kuc R.E., Davenport A.P. Modulation of the apelin/APJ system in heart failure and atherosclerosis in man. // Br. J. Pharmacol. 2010. V. 160(7). P. 1785–1795. 64. Peltonen T., Napankangas J., Vuolteenaho O., Ohtonen P., Soini Y., Juvonen T., Satta J., Ruskoaho H., Taskinen P. Apelin and its receptor APJ in human aortic valve stenosis. // J. Heart. Valve. Dis. 2009. V. 18. P. 644– 652. 65. Leeper N.J., Tedesco M.M., Kojima Y., Schultz G.M., Kundu R.K., Ashley E.A., Tsao P.S., Dalman R.L., Quertermous T. Apelin prevents aortic aneurysm formation by inhibiting macrophage inflammation. // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 2009. V. 296. P. H1329–1335. 66. Tiani C., Garcia-Pras E., Mejias M., de Gottardi A., Berzigotti A., Bosch J., 117 Fernandez M. Apelin signaling modulates splanchnic angiogenesis and portosystemic collateral vessel formation in rats with portal hypertension. // J. Hepatol. 2009. V. 50. P. 296–305. 67. Principe A., Melgar-Lesmes P., Fernandez-Varo G., del Arbol L.R., Ros J., Morales-Ruiz M., Bernardi M., Arroyo V., Jimenez W. The hepatic apelin system: a new therapeutic target for liver disease. // Hepatology. 2008. V. 48. P. 1193–1201. 68. Kalin R.E., Kretz M.P., Meyer A.M., Kispert A., Heppner F.L., Brandli A.W. Paracrine and autocrine mechanisms of apelin signaling govern embryonic and tumor angiogenesis. // Dev. Biol. 2007. V. 305. P. 599–614. 69. Sorli S.C., Le Gonidec S., Knibiehler B., Audigier Y. Apelin is a potent activator of tumour neoangiogenesis. // Oncogene. 2007. V. 26. P. 7692– 7699. 70. Eyries M., Siegfried G., Ciumas M., Montagne K., Agrapart M., Lebrin F., Soubrier F. Hypoxia-induced apelin expression regulates endothelial cell proliferation and regenerative angiogenesis. // Circ. Res. 2008. V. 103. P. 432–440. 71. Kidoya H., Naito H., Takakura N. Apelin induces enlarged and nonleaky blood vessels for functional recovery from ischemia. // Blood. 2010. V. 115. P. 3166–3174. 72. Zeng X.J., Zhang L.K., Wang H.X. et al. Apelin protects heart against ischemia/reperfusion injury in rat. // Peptides. 2009. V. 30. P. 1144-1152. 73. Rastaldo R., Cappello S., Folino A. et al. Apelin-13 limits infarct size and improves cardiac postischemic mechanical recovery only if given after ischemia. // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 2011. V. 300(6). P. H2308–H2315. 74. Simpkin J.C., Yellon D.M., Davidson S.M. et al. Apelin-13 and apelin-36 exhibit direct cardioprotective activity against ischemia-reperfusion injury. // Basic. Res. Cardiol. 2007. V. 102. P. 518–528. 118 75. Azizi Y., Faghihi M., Imania A., Roghanib M., Nazari A. Post-infarct treatment with [Pyr1]-apelin-13 reduces myocardial damage through reduction of oxidative injury and nitric oxide enhancement in the rat model of myocardial infarction. // Peptides. 2013. V. 46. P. 76–82. 76. Ladeiras-Lopes R., Ferreira-Martins J., Leite-Moreira A.F. The apelinergic system: the role played in human physiology and pathology and potential therapeutic applications. // Arq. Bras. Cardiol. 2008. V. 90. P. 343–349. 77. Hashimoto T., Kihara M., Ishida J., Imai N., Yoshida S., Toya Y. et al. Apelin stimulates myosin light chain phosphorylation in vascular smooth muscle cells. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2006. V. 26(6). P. 1267– 1272. 78. Shultz R., Kelm M., Heusch G. Nitric oxide in myocardial ischemia/reperfusion injury. // Cardiovasc. Res. 2004. V. 61. P. 402–413. 79. Rastaldo R., Cappello S., Folino A., Losano G. Effect of Apelin-Apelin Receptor System in Postischaemic Myocardial Protection: A Pharmacological Postconditioning Tool? // Antioxid. Redox. Signal. 2011. V. 14(5). P. 909–922. 80. Kleinz M.J., Baxter G.F. Apelin reduces myocardial reperfusion injury independently of PI3K/Akt and P70S6 kinase. // Regul. Pept. 2008. V. 146(1-3). P. 271–277. 81. Smith C.C., Mocanu M.M., Bowen J., Wynne A.M., Simpkin J.C., Dixon R.A., et al. Temporal changes in myocardial salvage kinases during reperfusion following ischemia: studies involving the cardioprotective adipocytokine apelin. // Cardiovasc. Drugs. Ther. 2007. V. 21. P. 409–414. 82. Hausenloy D.J., Yellon D.M. New directions for protecting the heart against ischaemia-reperfusion injury: targeting the Reperfusion Injury Salvage Kinase (RISK)-pathway. // Cardiovasc. Res. 2004. V. 61(3). P. 448–460. 83. Smith C.C., Yellon D.M. Adipocytokines, cardiovascular pathophysiology 119 and myocardial protection. // Pharmacol. Ther. 2011. V. 129(2). P. 206– 219. 84. Kennedy S.G., Kandel E.S., Cross T.K., Hay N. Akt/Protein kinase B inhibits cell death by preventing the release of cytochrome c from mitochondria. // Mol. Cell. Biol. 1999. V. 19(8). P. 5800–5810. 85. Miura T., Tanno M., Sato T. Mitochondrial kinase signaling pathways in myocardial protection from ischaemia/reperfusion-induced necrosis. // Cardiovasc. Res. 2010. V. 88(1). P. 7–15. 86. Khan T.A., Bianchi C., Ruel M., Voisine P., Sellke F.W. Mitogen-activated protein kinase pathways and cardiac surgery. // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2004. V. 127(3). P. 806–811. 87. Foussal C., Lairez O., Calise D. et al. Activation of catalase by apelin prevents oxidative stress-linked cardiac hypertrophy. // FEBS Letters. 2010. V. 584. P. 2363–2370. 88. Macaluso N.J., Glen R.C. Exploring the ‘RPRL’ Motif of Apelin-13 through Molecular Simulation and Biological Evaluation of Cyclic Peptide Analogues. // Chem. Med. Chem. 2010. V. 5. P. 1247–1253. 89. Hamada J., Kimura J., Ishida J., Kohda T., Morishita S., Ichihara S., Fukamizu A. Evaluation of novel cyclic analogues of apelin. // Int. J. Mol. Med. 2008. V. 22. P. 547–552. 90. Wang W., McKinnie S.M., Patel V.B., Haddad G., Wang Z. at al. Loss of Apelin Exacerbates Myocardial Infarction Adverse Remodeling and Ischemia-reperfusion Injury: Therapeutic Potential of Synthetic Apelin Analogues. // J. Am. Heart. Assoc. 2013. V. 2(4). P. e000249. 91. Jia Z.Q., Hou L., Leger A., Wu I., Kudej A.B., Stefano J., Jiang C., Pan C.Q., Akita G.Y. Cardiovascular effects of a PEGylated apelin. // Peptides. 2012. V. 38(1). P. 181–188. 92. Iturrioz X., Alvear-Perez R., De Mota N., Franchet C., Guillier F. et al. Identification and pharmacological properties of E339–3D6, the first 120 nonpeptidic apelin receptor agonist. // FASEB. 2010. V. 24(5). P. 1506– 1517. 93. Iturrioz X., Gerbier R., Leroux V., Alvear-Perez R., Maigret B., LlorensCortes C. By Interacting with the C-terminal Phe of Apelin, Phe255 and Trp259 in Helix VI of the Apelin Receptor Are Critical for Internalization. // J. Biol. Chem. 2010. V. 285. P. 32627–32637. 94. Pitkin S., Macaluso N., Maguire J., Glen R., Davenport A. Role for apelin in human atherosclerosis and discovery of novel agonist for its receptor APJ. // Proc. Br. Pharm. Soc. 2009. V. 7(4). P. 027P. 95. Macaluso N.J., Pitkin S.L., Maguire J.J., Davenport A.P, Glen R.C. Discovery of a Competitive Apelin Receptor (APJ) Antagonist. // Chem. Med. Chem. 2011. V. 6(6). P. 1017–1023. 96. Сидорова М.В., Азьмуко А.А., Палькеева М.Е. и др. Синтез и изучение кардиопротекторных свойств апелина-12 и его структурных аналогов. // Биоорг. хим. 2012. Т. 38(1). С. 40–51. 97. Писаренко О.И., Шульженко В.С., Пелогейкина Ю.А., Палькеева М.Е., Сидорова М.В., Молокоедов А.С., Беспалова Ж.Д., Терещенко С.Н., Масенко кардиопротекторными В.П. Додекапептиды, свойствами. Патент обладающие РФ №2457216 (27.07.2012). 98. Филатова М.П., Крит Н.А., Комарова О.М., Орехович В.И., Рейссманн З., Лиепиня И.Т., Никифорович Г.В. Синтез и исследование конформационно ограниченных аналогов пептидных ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента. // Биоорг. хим. 1986. Т. 12(1). С. 59–71. 99. Janecka A., Kruszynski R., Fichna J., Kosson P., Janecki T. Enzymatic Degradation Studies of Endomorphin-2 and its Analogs Containing NMethylated Amino Acids. // Peptides. 2006. V. 27(1). P. 131–135. 100. Lee D.K., Saldivia V.R., Nguyen T., Cheng R., George S.R., O’Dowd 121 B.F. Modification of the Terminal Residue of Apelin-13Antagonizes Its Hypotensive Action. // Endocrinology. 2005. V. 146. P. 231–236. 101. Писаренко О.И., Студнева И.М., Шульженко В.С., Тимошин А.А. Механизмы снижения повреждений ишемизированного cердца с помощью модифицированной реперфузии. // Биомед. хим. 2007. Т. 53(3). С. 313–321. 102. Kawamata Y., Habata Y., Fukusumi S., Hosoya M., Fujii R., Hinuma S., Nishizawa N., Kitada C., Onda H., Nishimura O., Fujino M. Molecular properties of apelin: tissue distribution and receptor binding. // Biochim. Biophys. Acta. 2001. V. 1538. P. 162–171. 103. Andelová E., Barteková M., Pancza D., Styk J., Ravingerová T. The Role of NO in Ischemia/Reperfusion Injury in Isolated Rat Heart. // Gen. Physiol. Biophys. 2005. V. 24. P. 411–426. 104. Pisarenko O.I., Shulzhenko V.S., Pelogeykina Y.A., Studneva I.M., Khatri D.N: Apelin-12 improves metabolic and functional recovery of rat heart after global ischemia. // Health. 2010. V. 2. P. 927–934. 105. О.И. Писаренко, В.С. Шульженко, Ю.А. Пелогейкина, И.М. Студнева, Д.Н. Кхатри, Ж.Д. Беспалова, А.А. Азьмуко, М.В. Сидорова, М.Е. Палькеева. Влияние экзогенного пептида апелина-12 на восстановление функции и метаболизма изолированного сердца крысы после ишемии. // Кардиология. 2010. Т. 50(10). С. 44–49. 106. Kitakaze M., Takashima S., Funaya H. et al. Temporary acidosis during reperfusion limits myocardial infarct size. // Am. J. Physiol. 1997. V. 272. P. H2071–H2078. 107. Liu P., Xu B., Forman L.J., Carsia R., Hock C.E. L-NAME enhances microcirculatory congestion and cardiomyocyte apoptosis during myocardial ischemia-reperfusion in rats. // Shock. 2002. V. 17(3). P. 185– 192. 108. О.И. Писаренко, Л.И. Серебрякова, Ю.А. Пелогейкина, И.М. 122 Студнева, Д.Н. Кхатри, О.В. Цкитишвили, Ж.Д. Беспалова, А.А. Азьмуко, М.В. Сидорова, М.Е. Палькеева. Уменьшение реперфузионного повреждения сердца у крыс in vivo пептидом апелином-12. // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 2011. Т. 152. С. 79–82. 109. Писаренко О.И., Студнева И.М., Серебрякова Л.И., Цкитишвили О.В., Тимошин ингибитором А.А. Na+/H+ Защита миокарда обмена крыс и селективным ишемическим прекондиционированием. // Кардиология. 2005. Т. 45(2). С. 37–44. 110. Lamprecht W., Stein P., Heinz F., Weisser H. Creatine Phosphate. In: Methods of enzymatic analysis (H.U. Bergmeyer ed.). // Academic Press. NY. 1974. Ed. II. V. 4. P. 1777–1781. 111. Jaworek D., Gruber W., Bergmeyer H.U. Adenosine-5’-diphosphate and Adenosine-5’-monophosphate. In: Methods of enzymatic analysis (H.U. Bergmeyer ed.). // Academic Press. NY. 1974. Ed. II. V. 4. P. 2127-2131. 112. Bernt E., Bergmeyer H.U., Mollering H. Creatine. In: Methods of enzymatic analysis (H.U. Bergmeyer ed.). // Academic Press. NY. 1974. Ed. II. V. 4. P. 1772–1776. 113. Gutman I., Wahlenfeld A.W.L. L-(+)-Lactate. In: Methods of enzymatic analysis (H.U. Bergmeyer ed.). // Academic Press. NY. 1974. Ed. II. V. 3. P. 1464–1467. 114. Czok R., Lamprecht W. Pyruvate. In: Methods of enzymatic analysis (H.U. Bergmeyer ed). // Academic Press. NY. 1974. Ed. II. V. 3. P. 1446–1448. 115. Bergmeyer H. U., Bernt E. Lactate dehydrogenase. UV-assay with pyruvate and NADH. In: Methods of enzymatic analysis (H.U. Bergmeyer ed). // Academic Press. NY. 1974. Ed. II. V. 2. P. 574–579. 116. Forster G., Bernt E., Bergmeyer H.U. Creatine kinase: determination with creatine phosphate as substrate. In: Methods of Enzymatic Analysis.' (Ed. H. U. Bergmeyer.) // Academic Press. NY. 1974. Ed. II. V. 2. P. 789– 123 793. 117. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randal R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. // J. Biol. Chem. 1951. V. 193(1). P. 265–275. 118. Beauchamp C., Fridovich I. Superoxide dismutase: improved assays and an assay applicable to acrylamide gels. // Analyt. Biochem. 1971. V. 44(1). P. 276–287. 119. Beers R.F., Sizer I.W. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. // J. Biol. Chem. 1952. V. 95. P. 133–140. 120. Paglia D.E., Valentine W.N. Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase. // J. Lab. Clin. Med. 1967. V. 70(1). P. 158–167. 121. Ланкин В.З., Гуревич С.М. Ингибирование переокисления липидов и детоксикация липоперекисей системами (супероксиддисмутаза, глутатионредуктаза) при защитными ферментативными глутатионпероксидаза, экспериментальном злокачественном росте. // ДАН СССР. 1976. Т. 226(3). С. 705–708. 122. Ohkawa H., Ohidhi N., Yagi K. Assay for peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. // Anal. Biochem. 1979. V. 95. P. 351–358. 123. Ланкин В.З., Лисина М.О., Арзамасцева Н.Е. и др. Окислительный стресс при атеросклерозе и диабете. // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 2005. Т. 140. С. 41–43. 124. Pisarenko O.I., Tskitishvili O.V., Studneva I.M .et al. Metabolic and antioxidants effects of R(+)-N6-(2-phenylisopropyl)-adenosine following regional ischemia and reperfusion in canine myocardium. // Biochim. Biophys. Acta. 1997. V. 1361. P. 295–303. 125. С.Гланц. Медико-биологическая статистика. // Практика, 1998. С. 81–118. 124 126. Гланц С. Медико-биологическая статистика. // Практика, 1998. С.324–327. 127. Piper H.M., Garcia-Dorado D. The cellular basis of immediate lethal reperfusion injury. // Ischemia-Reperfusion Injury in Cardiac Surgery. Georgetown. Landes Bioscience. 2001. P. 28–40. 128. Verma S., Fedak P.W., Weisel R.D. et al. Fundamentals of reperfusion injury for the clinical cardiologist. // Circulation. 2002. V. 105. P. 2332– 2336. 129. Zuo L., Chen Y.R., Reyes L.A., Lee H.L., Chen C.L., Villamena F.A., Zweier J.L. The radical trap 5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide exerts dose-dependent protection against myocardial ischemia-reperfusion injury through preservation of mitochondrial electron transport. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2009. V. 329(2). P. 515–523. 130. Pisarenko O.I., Tskitishvili O.V., Studneva I.M .et al. Metabolic and antioxidants effects of R(+)-N6-(2-phenylisopropyl)-adenosine following regional ischemia and reperfusion in canine myocardium. // Biochim. Biophys. Acta. 1997. V. 1361. P. 295–303. 131. Lee D.K., George S.R., O'Dowd B.F. Unravelling the roles of the apelin system: prospective therapeutic applications in heart failure and obesity. // Trends. Pharmacol. Sci. 2006. V. 27(4). P. 190–194. 132. O'Shea M., Hansen M.J., Tatemoto K., Morris M.J. Inhibitory effect of apelin-12 on nocturnal food intake in the rat. // Nutr. Neurosci. 2003. V. 6(3). P. 163–167. 133. Takayama K., Iwazaki H., Hirabayashi M., Yakabi K., Ro S. Distribution of c-Fos immunoreactive neurons in the brain after intraperitoneal injection of apelin-12 in Wistar rats. // Neurosci. Lett. 2008. V. 431(3). P. 247–250. 134. Dai T., Ramirez-Correa G., Gao W.D. Apelin increases contractility in failing cardiac muscle. // Eur. J. Pharmacol. 2006. V. 553. P. 222–228. 125 135. Yang S., Tang L., Ge G., Ma J., Qiao Z., Liu H. Apelin-13 Protects Against Myocardial Ischemia-reperfusion Injury in Rat. // Exp. Clin. Cardiol. 2014. V. 20(5). P. 3167–3180. 136. Tao J., Zhu W., Li Y., Xin P., Li J., Liu M., Li J., Redington A.N., Wei M. Apelin-13 protects the heart against ischemia-reperfusion injury through inhibition of ER-dependent apoptotic pathways in a timedependent fashion. // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 2011. V. 301(4). P. H1471–1486. 137. Cheng X., Cheng X.S., Pang C.C. Venous dilator effect of apelin, an endogenous peptide ligand for the orphan APJ receptor, in conscious rats. // Eur. J. Pharmacol. 2003. V. 470(3). P. 171–175. 138. Zhong J.C., Yu X.Y., Huang Y., Yung L.M.b, Lau C.W., Lin S.G. Apelin modulates aortic vascular tone via endothelial nitric oxide synthase phosphorylation pathway in diabetic mice. // Cardiovasc. Res. 2007. V. 74. P. 388–395. 139. Chun H.J., Ali Z.A., Kojima Y., Kundu R.K., Sheikh A.Y. et al. Apelin signaling antagonizes angiotensin II effects in experimental atherosclerosis. // J. Clin. Invest. 2008. V. 118(10). P. 3343–3354 140. Japp A.G., Cruden N.L., Barnes G., van Gemeren N., Mathews J. et al. Acute сardiovascular effects of apelin in humans: potential role in patients with chronic heart failure. // Circulation. 2010. V. 121(16). P. 1818–1827. 141. Jia Y.X., Lu Z.F., Zhang J., Pan C.S., Yang J.H., Zhao J. et al. Apelin activates L-arginine/nitric oxide synthase/nitric oxide pathway in rat aortas. // Peptides. 2007. V. 28(10). P. 2023–2029. 142. Hattori Y., Kasai K., Gross S.S. Cationic amino acid transporter gene expression in cultured vascular smooth muscle cells and in rats. // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 1999. V. 276. P. H2020–H2028. 143. O’Donnell V.B., Chumley P.H., Hogg N., Bloodsworth A., Darley-Usmar 126 V.M., Freeman B.A. Nitric oxide inhibition of lipid peroxidation: kinetics of reaction with lipid peroxyl radicals and comparison with alpha tocopherol. // Biochemistry. 1997. V. 36(49). P. 15216–15223. 144. Xu Z., Park S.S., Mueller R.A., Bagnell R.C., Patterson C., Boysen P.G. Adenosine produces nitric oxide and prevents mitochondrial oxidant damage in rat сardiomyocytes. // Cardiovasc. Res. 2005. V. 65(4). P. 803–812. 127 ПРИЛОЖЕНИЯ 128 ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Влияние 5-мин. инфузии РКХ с 140 мкМ пептидом A12 или его структурными аналогами AII-V перед глобальной ишемией на восстановление функции изолированного сердца в конце реперфузии. Параметр восстан. функции Исх К А12р A12и AII AIII AIV AV n=12 n=12 n=12 n=12 n=10 n=10 n=10 n=10 КП, мл/мин 18±2 14±1 15±1 16±1 16±1 17±1 17±1 14±1 б б де Рперф, мм рт.ст. 63±1 62±1 62±1 60±1 б б а Pсист, мм рт.ст. 99±3 Pдиаст, мм рт.ст. -3±1 Рразв, мм рт.ст. 103±3 ЧСС, уд/мин 304±1 ИСФ, мм рт.ст./мин 31231 ±347 АО, мл/мин. 26±3 МО, мл 44±3 УО, мкл 145±5 61±1 61±1 59±1 60±1 а а 70±2 78±1 86±1 87±1 89±2 89±2 80±2 а абв аб аб аб аб абвгде 9±1 6±1 2±1 2±1 1±1 1±1 4±1 а абв аб аб аб аб абде 62±2 72±2 84±1 85±2 88±2 89±2 76±3 а абв аб аб аб абв абвгде 242±6 258±3 277±6 277±3 282±3 283±3 264±3 а абв аб аб аб аб абгде 14991 ±313 18739 ±625 23476 ±125 23468 ±219 24980 ±929 24987 ±937 20033 ±930 а абв аб аб аб аб абвгде 1±1 9±1 14±1 15±2 17±1 17±1 10±1 а абв аб аб абв абв абвгде 14±1 22±2 31±1 31±2 33±1 33±1 25±2 а абв аб аб аб аб абвгде 58±1 86±4 а абв 106±1 112±3 119±3 119±3 аб аб абв абв 94±5 абвгде Данные представлены как M ± m. Исх – исходное состояние, К – контроль. Достоверно отличается (p<0,05) от: а – исходного состояния, б – контроля, в – А12и (А12), г – АII, д – АIII, е – АIV. РКХ – введение раствора Кребса-Хензеляйта, А12р – введение А12 перед реперфузией, А12и – введение А12 до ишемии. 129 ПРИЛОЖЕНИЕ 2. Влияние 5-мин. инфузии РКХ с 140 мкМ пептидом A12 или его структурными аналогами AII-V перед глобальной ишемией на метаболическое состояние сердца крысы в конце реперфузии. Исходное Метаболит состояние Реперфузия Контроль А12 AII AIII AIV AV АТФ 22,42 ± 2,06 7,75 ± 0,88 а 15,66 ± 0,83 аб 16,21 ± 0,92 аб 15,93 ± 1,24 аб 14,19 ± 2,79 аб 12,90 ± 1,65 аб АДФ 2,80 ± 0,12 4,86 ± 0,28 а 6,40 ± 0,32 аб 6,00 ± 0,61 а 6,79 ± 0,46 аб 6,62 ± 0,99 аб 4,85 ± 0,24 авг АМФ 0,71 ± 0,01 3,63 ± 0,51 а 1,83 ± 0,12 аб 1,84 ± 0,29 а 2,47 ± 0,34 а 2,15 ± 0,07 аб 2,22 ± 0,38 аб ΣАН 25,93 ± 1,45 16,33 ± 0,90 а 23,24 ± 0,86 б 24,05 ± 1,42 б 25,19 ± 1,32 б 22,96 ± 3,59 б 19,96 ± 1,47 аг ЭП 0,91 ± 0,02 0,58 ± 0,04 а 0,79 ± 0,01 аб 0,80 ± 0,01 аб 0,78 ± 0,02 аб 0,75 ± 0,03 аб 0,76 ± 0,04 аб ФКр 24,30 ± 2,30 11,56 ± 1,38 а 17,08 ± 1,05 аб 16,77 ± 1,69 аб 16,50 ± 1,76 аб 16,60 ± 1,19 аб 17,84 ± 2,15 б Кр 34,96 ± 2,13 43,96 ± 4,47 45,79 ± 2,70 а 41,69 ± 3,43 50,16 ± 3,77 а 32,53 ± 4,04 вг 38,21 ± 2,62 в ΣКр 59,26 ± 1,87 55,52 ± 3,97 62,87 ± 2,44 58,46 ± 3,50 65,51 ± 3,31 49,13 ± 2,85 56,05 ± 3,37 Лактат 1,72 ± 0,19 6,50 ± 1,39 а 1,89 ± 0,41 б 1,86 ± 0,48 б 1,47 ± 0,24 б 1,39 ± 0,47 б 2,01 ± 0,38 б Данные представлены как M ± m в мкмоль/г сухого веса в серии из n=8 экспериментов. Достоверно отличается(p<0,05) от: а – исходного состояния, б – контроля; в – A12; г – AIII. ΣАН=АТФ+АДФ+АМФ. Энергетический потенциал (ЭП) = (АТФ+0,5АДФ)/ΣАН. Общий креатин (ΣКр) = ФКр+Кр. 130 ПРИЛОЖЕНИЕ 3. Влияние внутривенного болюсного введения пептида А12 и его структурных аналогов AII-V одновременно с началом реперфузии на величину ЗР и ИМ у наркотизированных крыс in vivo. Группа ЗР/ЛЖ, % ИМ/ЗР, % Ранг Контроль 38,6 ± 1,6 40,5 ± 2,1 A12 (350) 41,5 ± 2,7 24,2 ± 1,9а 2 AII (35) 37,4 ± 2,4 31,4 ± 3,5а 8 AII (70) 37,2 ± 1,5 30,7 ± 2,2аб 7 AII (350) 37,1 ± 1,4 29,6 ± 1,8а 5 AII (700) 40,1 ± 1,9 21,4 ± 1,4а 1 AIII (70) 41,1 ± 1,2 26,0 ± 2,9а 3 AIII (350) 38,3 ± 1,6 30,6 ± 1,9аб 6 AIII (700) 36,0 ± 2,8 33,3 ± 2,8аб 10 AIV (35) 40,4 ± 1,7 26,9 ± 3,3а 4 AIV (70) 40,3 ± 2,1 32,0 ± 2,6аб 9 AIV (350) 36,3 ± 5,6 41,3 ± 5,6б 12 AV (350) 38,3 ± 2,3 34,2 ± 3,6б 11 Данные представлены как М ± m для серии из 10 опытов. Достоверно (p<0,05) отличается от: а – контроля, б – А12(350). В скобках указаны дозы пептидов в нмоль/кг веса. Выделены структурные аналоги пептида А12 и использованные дозы, ограничивающие ИМ в той же степени, что и пептид А12(350). 131 ПРИЛОЖЕНИЕ 4. Влияние внутривенного болюсного введения пептида А12 и его структурных аналогов AII–V одновременно с началом реперфузии на активность маркеров некроза у наркотизированных крыс in vivo. Группа МВ-КК, МЕ/л Ранг Исходное 274,3 ± 27,3 состояние Конец реперфузии ЛДГ, МЕ/л Ранг 91,7 ± 20,5 Контроль 2173,4 ± 71,0а 1521,4 ± 134,4а A12 (350) 915,1 ± 131,2аб 2 704,3 ± 133,5аб 1 AII (35) 2221,8 ± 171,3aв 10 857,0 ± 111,9аб 3 AII (70) 935,5 ± 50,8аб 3 1035,3 ± 160,1аб 8 AII (350) 1078,1 ± 53,5аб 4 718,3 ± 103,4аб 2 AII (700) 1450,4 ± 98,6абв 6 1022,0 ± 79,3аб 6 AIII (70) 1545,2 ± 133,8абв 8 900,9 ± 68,1аб 5 AIII (350) 893,6 ± 88,6аб 1 892,1 ± 152,0аб 4 AIII (700) 1905,2 ± 107,5aв 9 1704,4 ± 216,5ав 12 AIV (35) 2296,2 ±137,4aв 11 1097,7 ± 175,9а 11 AIV (70) 1362,6 ± 150,0абв 5 1038,2 ± 55,5аб 9 AIV (350) 2845,2 ± 452,9ав 12 1072,7 ± 180,3а 10 AV (350) 1472,6 ± 101,4абв 7 1030,8 ± 117,3аб 7 Данные представлены как М ± m для серии из 6 опытов. Достоверно (p<0,05) отличается от: а – исходного состояния, б – контроля, в - А12(350). В скобках указаны дозы пептидов в нмоль/кг веса. Выделены структурные аналоги пептида А12 и использованные дозы, ограничивающие выход ферментов в той же степени, что и пептид А12(350). 132 ПРИЛОЖЕНИЕ 5. Влияние внутривенного болюсного введения пептида А12 и его структурных аналогов AII-V одновременно с началом реперфузии на показатели гемодинамики у наркотизированных крыс in vivo. САД Группа ЧСС Исх.сост., Нач.реп., Кон.реп., Исх.сост., мм рт.ст. мм рт.ст. мм рт.ст. Контроль 95 ± 2 94 ± 1 96 ± 3 365 ± 6 361 ± 4 362 ± 4 A12(350) 90 ± 3 54 ± 3аб 82 ± 4б 353 ± 8 224 ± 17аб 328 ± 4аб AII (35) 96 ± 3 91 ± 3в 98 ± 3в 339 ± 8 330 ± 9бв 331 ± 8бв AII (70) 90 ± 4 83 ± 5бв 88 ± 9 384 ± 10 375 ± 14в 383 ± 10бв AII (350) 88 ± 4 76 ± 4абв 91 ± 3 354 ± 7 328 ± 5абв 354 ± 7в AII (700) 88 ± 4 81 ± 3бв 91 ± 3 347 ± 3 334 ± 4абв 332 ± 4аб AIII (70) 91 ± 4 89 ± 4в 90 ± 3 350 ± 7 343 ± 8бв 338 ± 9б AIII(350) 87 ± 4 76 ± 4бв 89 ± 3 359 ± 11 330 ± 13бв 357 ± 10в AIII(700) 88 ± 6 83 ± 6бв 89 ± 6 359 ± 23 350 ± 26в 355 ± 22 AIV (35) 93 ± 3 91 ± 4в 97 ± 4 338 ± 9 323 ± 8бв 327 ± 12б AIV (70) 96 ± 5 90 ± 4в 93 ± 6 349 ± 14 334 ± 13бв 339 ± 16б AIV(350) 91 ± 6 63 ± 5аб 76 ± 7аб 366 ± 11 347 ± 11в 351 ± 20 AV (350) 91 ± 3 58 ± 2аб 81 ± 3аб 349 ± 6 276 ± 14абв 324 ± 6аб уд/мин Нач.реп., Кон.реп., уд/мин уд/мин Данные представлены как М ± m для серии из 10 опытов. Достоверно (p<0,05) отличается от: а – исходного состояния, б – контроля, в - А12(350). В скобках указаны дозы пептидов в нмоль/кг веса. 133 ПРИЛОЖЕНИЕ 6. Влияние внутривенного болюсного введения природного пептида А12 и его структурных аналогов AII и AV в дозе 350 нмоль/кг одновременно с началом реперфузии на метаболическое состояние ЗР сердец крыс in vivo. Метаболит АТФ АДФ АМФ АН ЭП ФКр Кр Кр Лактат Реперфузия Исходное состояние Контроль А12(350) AII(350) AV(350) 20,21 ± 5,63 ± 6,95 ± 9,41 ± 7,32 ± 1,13 0,48 а 0,61 а 0,74 аб 0,52 аб 5,63 ± 4,12 ± 4,18 ± 4,13 ± 3,86 ± 0,53 0,42а 0,36a 0,67 0,55а 1,34 ± 1,78 ± 1,76 ± 1,70 ± 1,50 ± 0,30 0,29 0,17 0,29 0,12 27,18 ± 11,53 ± 12,89 ± 14,89 ± 12,68 ± 1,19 1,12a 0,91a 0,96aб 0,43a 0,85 ± 0,67 ± 0,70 ± 0,75 ± 0,73 ± 0,02 0,01a 0,01аб 0,01абв 0,02аб 20,50 ± 6,12 ± 15,34 ± 18,92 ± 12,67 ± 1,77 1,15a 2,75б 3,05б 0,43аб 46,12 ± 35,64 ± 31,46 ± 37,83 ± 29,05 ± 3,62 3,64 1,18 a 4,86 0,73а 66,62 ± 41,75 ± 46,80 ± 56,75 ± 41,72 ± 3,29 3,51a 3,92a 2,89б 0,53aг 0,56 ± 9,52 ± 5,35 ± 3,22 ± 11,92 ± 0,10 0,83а 0,47aб 0,34aбв 1,30aвг Данные представлены как М ± m в мкмоль/г сухого веса для серии из 10 опытов. Достоверно (p<0,05) отличается от: а – исходного состояния, б – контроля, в - А12(350), г AII(350). В скобках указаны дозы пептидов в нмоль/кг веса. АН=АТФ+АДФ+АМФ. Энергетический потенциал (ЭП) = (АТФ+0,5АДФ)/АН. Общий креатин (Кр) = ФКр+Кр. 134 ПРИЛОЖЕНИЕ 7. Влияние 5-мин. инфузии РКХ, содержащего 140 мкМ пептид A12 или AII и 100 мкМ L-NAME, перед глобальной ишемией на энергетическое состояние реперфузированного миокарда. Метаболит АТФ АДФ АМФ ΣАН ATФ/АДФ ЭП ФКр Креатин ΣКр Лактат Конец реперфузии Исходное состояние А12+ AII+ Контроль А12 22,42 ± 7,75 ± 13,11 ± 9,24 ± 16,21 ± 10,82 ± 2,06 0,88а 0,69аб 2,87а 0,92аб 0,25абвг 2,80 ± 4,86 ± 5,90 ± 5,22 ± 6,00 ± 5,99 ± 0,12 0,28а 0,28а 0,86а 0,61а 0,31аб 0,71 ± 3,63 ± 1,92 ± 1,99 ± 1,84 ± 1,87 ± 0,01 0,51а 0,06аб 0,38аб 0,29а 0,28аб 25,93 ± 16,33 ± 20,94 ± 16,45 ± 24,05 ± 18,68 ± 1,45 0,90а 0,92аб 1,34ав 1,42б 1,34аг 8,00 ± 1,60± 2,23± 1,77 ± 2,70 ± 1,81 ± 0,10 0,24а 0,07а 0,09а 0,08абв 0,09авг 0,91 ± 0,58± 0,77± 0,72 ± 0,80 ± 0,73 ± 0,02 0,04а 0,01аб 0,03аб 0,01аб 0,03абг 24,30 ± 12,14 ± 14,77 ± 11,30 ± 16,77 ± 18,75 ± 2,30 2,80а 1,41а 2,73а 1,69аб 0,64абв 34,96 ± 44,51 ± 44,88 ± 45,91 ± 41,69 ± 41,15 ± 2,13 2,70а 2,14а 4,22а 3,43 5,18 59,26 ± 56,65 ± 59,65 ± 57,21 ± 58,46 ± 59,90 ± 1,87 2,34 1,56 2,84 3,50 3,54 1,72 ± 10,48 ± 2,12 ± 5,13 ± 1,89 ± 2,74 ± 0,19 3,08а 0, 48б 1,74а 0,48б 0,30аб L-NAME AII L-NAME Данные представлены как М ± m в мкмоль/г сухого веса для серии из 8 опытов. Достоверно отличается (p<0,05) от: а – исходного состояния, б – контроля, в – А12, г – AII. АН=АТФ+АДФ+АМФ. Энергетический потенциал (ЭП) = (АТФ+0,5АДФ)/АН. Общий креатин (Кр) = ФКр+Кр. 135 ПРИЛОЖЕНИЕ 8. Влияние внутривенного болюсного введения LNAME в дозе 10 мг/кг за 10 мин до реперфузии и введения структурного аналога AII в дозе 350 нмоль/кг одновременно с началом реперфузии на метаболическое состояние ЗР сердец крыс in vivo. Метаболит Реперфузия Исходное состояние Контроль AII AII+L-NAME АТФ 20,21 ± 1,13 5,63 ± 0,48 а 9,41 ± 0,74 аб 6,78 ± 0,68 ав АДФ 5,63 ± 0,53 4,12 ± 0,42а 4,13 ± 0,67 4,29 ± 0,35 АМФ 1,34 ± 0,30 1,78 ± 0,29 1,70 ± 0,29 1,19 ± 0,08 АН 27,18 ± 1,19 11,53 ± 1,12a 14,89 ± 0,96aб 12,26 ± 0,43 a ЭП 0,85 ± 0,02 0,67 ± 0,01a 0,75 ± 0,01аб 0,73 ± 0,01аб 20,50 ± 1,77 6,12 ± 1,15a 18,92 ± 3,05б 14,41 ± 1,39 аб ФКр Кр 46,12 ± 3,62 35,64 ± 3,64 37,83 ± 4,86 29,39 ± 1,47 а Кр 66,62 ± 3,29 41,75 ± 3,51a 56,75 ± 2,89б 43,55 ± 1,36 ав Лактат 0,56 ± 0,10 9,52 ± 0,83а 3,22 ± 0,34aб 15,42 ± 0,44 aбв Данные представлены как М ± m в мкмоль/г сухого веса для серии из 10 опытов. Достоверно (p<0,05) отличается от: а – исходного состояния, б – контроля, в - AII. В скобках указаны дозы пептидов в нмоль/кг веса. АН=АТФ+АДФ+АМФ. Энергетический потенциал (ЭП) = (АТФ+0,5АДФ)/АН. Общий креатин (Кр) = ФКр+Кр.
