Исследования и разработки - Институт химической биологии и

Резюме проекта, выполняемого
в рамках ФЦП
«Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научнотехнологического комплекса России на 2014 – 2020 годы»
по этапу № 2
Номер Соглашения о предоставлении субсидии: 14.604.21.0018
Тема: «Разработка ингибиторов ферментов репарации ДНК в качестве прототипов лекарственных препаратов для социально
значимых заболеваний»
Приоритетное направление: Науки о жизни
Критическая технология: Биомедицинские и ветеринарные технологии
Период выполнения: 17.06.2014 - 31.12.2015
Плановое финансирование проекта: 10.55 млн. руб.
Бюджетные средства
9.40 млн. руб.,
Внебюджетные средства 1.15 млн. руб.
Получатель: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной
медицины Сибирского отделения Российской академии наук
Индустриальный партнер: Общество с ограниченной ответственностью "Инновационные Фармакологические Разработки"
Ключевые слова: ИНГИБИТОРЫ PARP, ИНГИБИТОРЫ Tdp1, СЕНСИБИЛИЗАТОР К ДЕЙСТВИЮ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ
ПРЕПАРАТОВ, ПОЛИ(АДФ-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗА, ТИРОЗИЛ-ДНК-ФОСФОДИЭСТЕРАЗА 1
1. Цель проекта
1) Поиск ингибиторов ключевых ферментов и факторов репарации ДНК относится к перспективным направлениям
медицинской химии и является одним из путей создания эффективной терапии сердечно-сосудистых, нейродегенеративных и
онкологических заболеваний. Перечисленные патологии связаны с нарушениями экспрессии белков репарации, в том числе их
гиперэкспрессией. Настоящий проект посвящен проблеме поиска ингибиторов трех ферментов репарации ДНК –
перспективных фармакологических мишеней: поли(АДФ-рибозо)полимераз 1 и 2 (PARP1/2) и тирозил-ДНК-фосфодиэстеразы
1 (Tdp1) и исследованию их цитотоксичности.
2) Поиск низкомолекулярных ингибиторов ключевых ферментов репарации ДНК {тирозил-ДНК-фосфодиэстераза 1 (Tdp1) и
поли(АДФ-рибозо)полимеразы 1 и 2 (PARP1/2)} и исследование активности наиболее эффективных соединений по отношению
к выделенным ферментам и в культуре клеток. Созданные на основе разрабатываемых ингибиторов ферментов репарации
ДНК препараты предположительно могут привести к разработке более эффективных и безопасных схемам лечения
онкологических и/или нейродегенеративных заболеваний.
2. Основные результаты проекта
1. Оформлен аналитический обзор научных и информационных источников по исследованию классов ингибиторов ферментов
репарации ДНК PARP1/2 и Tdр1.
2. Проведены предварительные эксперименты, в том числе:
- выделены рекомбинантные PARP1 (1,4 мг), Tdp1 (4,8 мг) и PARP2 (3.1 мг). Чистота препаратов ферментов составляет 95%;
- выделены рекомбинантные ДНК-полимераза β (10,8 мг) и апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза 1 (12.8 мг). Чистота
препаратов ферментов составляет 95%;
- проведено предварительное определение ингибиторных характеристик производных бензо[1,2,3,4,5] пентатиепина по
отношению к Tdp1. Обнаружены ингибиторы в микромолярном диапазоне, обнаружена зависимость ингибиторной
активности от структуры и липофильности соединения. Значение IC50 для соединения – лидера (дибутиламиновое
производное, рис. 1) составляет 0,22 µМ, это соединение является одним из наиболее эффективных ингибиторов этого
фермента из известных на сегодняшний день.
- проведено предварительное изучение влияния обнаруженных ингибиторов Tdp1 - производных
бензо[1,2,3,4,5]пентатиепина на культуры опухолевых клеток. Обнаружена умеренная цитотоксичность веществ этого класса.
3. Составлен план экспериментальных исследований
1
4. Созданы компьютерные библиотеки классов природных и синтетических соединений - производных усниновой и
бетулоновой кислот и адамантана - для проведения скринига потенциальных ингибиторов ферментов репарации ДНК.
5. Проведен компьютерный скрининг библиотек соединений, ряд производных усниновой кислоты и адамантана
рекомендован к синтезу.
6. Проведено обоснование выбора классов соединений
7. Разработаны методы синтеза рекомендованных соединений.
8. Проведено экспериментальное изучение влияния 7-метилгуанина на пролиферацию опухолевых клеток. Показано, что 7метилгуанин в концентрации 150 мкМ не токсичен сам по себе, но усиливает цитостатическое действие цисплатина на
опухолевые клетки. Таким образом, 7-метилгуанин способен усиливать эффективность существующих химиопрепаратов в
случае комбинированного использования.
9. Разработана и оформлена методика определения активности АРЕ1 флуоресцентным методом.
10. Проведены патентные исследования
11. Проведена экспертная оценка возможности создания лекарственных средств на основе исследуемых ингибиторов
ферментов репарации ДНК
12. Разработана методика определения ингибиторных характеристик соединений в отношении очищенного фермента Tdp1,
основанная на использовании флуоресцентного олигонуклеотида. Методика предназначена для скрининга библиотек
соединений в формате реального времени.
13. Проведен выбор модельных линий перевиваемых клеток для проверки соединений как сенсибилизаторов клеток к
действию известных противораковых препаратов.
14. Получены экспериментальные образцы потенциальных ингибиторов – производных усниновой кислоты, содержащих
различные структурные фрагменты:
i) тиазольный цикл
ii) флавоноидные фрагменты, в том числе открытоцепочечные соединения – хальконы, и гетероциклические – ауроны и
флаваноны
iii) енаминопроизводные с варьированием типа заместителя
iv) сульфидные и сульфоновые фрагменты
и производных на основе адамантана:
i) 1- и 2-аминоадамантанов
ii) диазаадамантан-6-она.
15. Обнаружены ингибиторы, подавляющие активность фермента в микромолярном диапазоне среди производных адамантана
и в субмикромолярном – среди производных усниновой кислоты. Обнаруженные ингибиторы относятся к пяти химическим
подклассам: ауроны усниновой кислоты, гидрозинотиазолы усниновой кислоты, енамины усниновой кислоты,
бензопентатиепины и адамантаны. Отобраны пять соединений-лидеров для последующих исследований.
16. Для адамантанов показана зависимость ингибиторных свойств от длины и гибкости терпеноидного заместителя. Для
производных усниновой кислоты показана зависимость ингибиторных характеристик от положения и химической природы
заместителя.
17. Обнаружено, что исследованные соединения-лидеры являются бесконкурентными ингибиторами Tdp1.
18. Показано, что все обнаруженные ингибиторы Tdp1 не влияют на активность ферментов ЭРО, либо оказывают
незначительное влияние.
19. Показано, что расчетные значения констант ингибирования хорошо согласуются с экспериментальными значениями IC50.
20. Изучена цитотоксичность 13 соединений в отношении клеток линии MCF-7; изучена цитотоксичность отдельных
соединений в отношении клеток линий HepG2, RPMI 8226 и MDA-MB-231. Для клеток MCF-7 в отношении ряда соединений
показано снижение значение СC50 в присутствии камптотецина.
1) Из 52 синтезированных соединений 20 новых, 32 известных. Структура и чистота (не менее 95%) полученных соединений
подтверждена методом ЯМР. Используемые для получения потенциальных ингибиторов методы синтеза и очистки
обеспечивают высокую чистоту получаемых целевых соединений (> 95%). Скрининг соединений проводится методом
детекции флуоресценции в режиме реального времени, позволяющим определять начальную скорость реакции с высокой
точностью.
2) Все соединения изучены в качестве ингибиторов Tdp1 и в качестве сенсибилизаторов опухолевых клеток к действию
камптотецина впервые.
3) Полученные в данном квартале результаты техническим требованиям к проекту соответствуют.
4) Известные ингибиторы Tdp1 подавляют ее активность со занчениями IC50 от 0,8 до 100 µ, то есть, обнаруженное
соединение-лидер эффективнее от 15 до 2000 раз.
3. Охраноспособные результаты интеллектуальной деятельности (РИД), полученные в рамках прикладного научного
исследования и экспериментальной разработки
Изобретение заявка № 2014139787 от 30.10.2014 «Средство для ингибирования фермента тирозил-ДНК-фосфодиэстеразы 1»,
РФ.
4. Назначение и область применения результатов проекта
1) Полученная информация может быть использована в фармакологической химии, а именно положена в основу разработки
лекарственных препаратов противоопухолевого действия.
2) Для выяснения биологической активности предполагаемых ингибиторов Tdp1 представляется целесообразным исследовать
2
влияние этих соединений на культуры клеток различного происхождения, а также животные модели различных заболеваний,
связанных с функционированием фермента. Кроме того, целесообразно будет провести направленные трансформации
соединений-лидеров с целью получения более эффективных ингибиторов.
3) Созданные на основе разрабатываемых ингибиторов ферментов репарации ДНК препараты предположительно могут
изменить структуру производства и потребления лекарственных препаратов в пользу отечественных производителей.
5. Эффекты от внедрения результатов проекта
Ожидается, что применение разрабатываемых ингибиторов Tdp1 приведет к более эффективным и безопасным схемам лечения
онкологических заболеваний.
6. Формы и объемы коммерциализации результатов проекта
1) После окончания научно-исследовательских работ необходимо проведение действий по доклиническим и клиническим
испытаниям соединения-лидера.
2) На основе полученных результатов могут быть созданы препараты для лечения онкологических заболеваний в качестве
монотерапии и/или как сенсибилизаторы существующих противораковых агентов. Исследования рынка будут возможны после
проведения клинических испытаний предполагаемых препаратов.
7. Наличие соисполнителей
1) а) Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Московского
государственного университета имени М.В.Ломоносова (НИИФХБ МГУ)
Россия, 119992, Москва, Ленинские горы, дом 1, стр 40
б) Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Новосибирский институт органической химии им. Н.Н.
Ворожцова Сибирского отделения РАН (НИОХ СО РАН)
Россия,630090, Новосибирск, пр. академика Лаврентьева 9
2) Соисполнители привлечены к работе в 2014 и 2015 годах
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Институт химической биологии и фундаментальной медицины
Сибирского отделения Российской академии наук
Заместитель директора ИХБФМ СО РАН
(должность)
(подпись)
Пышный Д.Д.
(фамилия, имя, отчество)
(подпись)
Лаврик О.И.
(фамилия, имя, отчество)
Руководитель работ по проекту
Зав. ЛБХФ ИХБФМ СО РАН
(должность)
М.П.
3