Факультет молекулярной и биологической физики Московский физико-технический институт (государственный университет)

Факультет молекулярной и биологической физики
Московский физико-технический институт
(государственный университет)
ЛАБОРАТОРНАЯ
РАБОТА №3
по курсу: Физические методы исследования
в физико-химической биологии
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СКОРОСТИ ДЫХАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
ПОЛЯРОГРАФИЧЕСКИМ МЕТОДОМ АНАЛИЗА
МОСКВА 2005
СОДЕРЖАНИЕ
Введение.
1.
2.
3.
Теоретические основы полярографического метода анализа на твердых
электродах.
Экспериментальная установка.
Порядок выполнения работы и форма отчетности по заданию.
Литература.
Введение
В настоящее время для изучения биологических процессов все чаще и
шире применяются физические методы исследования. Одним из таких методов
является метод полярографического анализа на твердых электродах
(полярографический метод анализа предложен известным чешским ученым,
лауреатом Нобелевской премии Я. Гейровским). Этот метод позволяет
исследовать кинетику быстрых процессов на тканевых препаратах в условиях,
близких к условиям in vito.
Цель работы
Знакомство с методом полярографического
определения скорости дыхания микроорганизмов.
анализа
на
примере
1.ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПОЛЯРОГРАФИЧЕСКОГО МЕТОДА
АНАЛИЗА НА ТВЕРДЫХ ЭЛЕКТРОДАХ
Полярографический анализ основан на возможности электрохимического
восстановления и окисления ионов или нейтральных молекул на поверхности
электрода. Каждый вид ионов или нейтральных молекул восстанавливается
или окисляется при своем определенном потенциале. При этом скорость
электрохимического процесса на электроде определяется силой тока,
протекающего через ячейку. На рисунке 1 представлена простейшая схема,
позволяющая измерить силу тока I . Проходящего через электрическую ячейку
Я в зависимости от напряжения между электродами Е .
Любая электрохимическая реакция на электроде включает в себя три
последовательные стадии:
1. подвод частиц, вступающих на электроде в реакцию, из объема раствора
к поверхности электрода;
2. электрохимическое превращение вещества;
3. отвод продуктов реакции от поверхности рабочего электрода в объем
электролита.
В основе первой и третьей стадий лежат диффузионный или
электродиффузионные процессы. Вторая стадия связана непосредственно с
электрохимическими превращениями реагентов и называется кинетической.
Известно, что кинетика всего процесса лимитируется самой медленной стадией.
Поэтому электродный процесс в зависимости от соотношения скоростей
составляющих его стадии будут протекать либо в диффузионном режиме, либо
в кинетическом.
Полярографический метод анализа основан на использовании
диффузионного режима электродного процесса, который достигается таким
выбором потенциала электрода, что собственно электрохимическое
превращение вещества перестает быть лимитирующим.
Рассмотрим для определенности катодный процесс, т.е. процесс переноса
электронов из электрода в раствор. Скорость катодного процесса зависит от
потенциала катода и концентрации акцептора. Найдем зависимость тока,
текущего через ячейку от потенциала катода. В случае высокой
электропроводимости
электролита
и
при
условии
применения
неполяризующихся
вспомогательных
электродов
(Неполяризующие
электроды – это электроды, потенциал которых почти не изменяется при
прохождении тока малой плотности через ячейку), таких как каломельный,
водородный, хлорсеребряный большой площади, можно считать, что
практически всё приложенное внешнее напряжение затрачивается на изменение
потенциала рабочего электрода. Предположим, что на рабочем электроде
протекает процесс восстановления некоторого вещества А до продукта реакции
В. Пусть этот процесс лимитируется скоростью диффузии реагента A к
поверхности электрода. В результате превращения вещества A на электроде
его концентрация у поверхности электрода быстро падает, вследствие чего
возникает диффузионный процесс, который направлен на выравнивание
возникающей разности концентраций между объёмом электролита и в
приповерхностной области. Скорость диффузии пропорциональна градиенту
концентрации у поверхности электрода I (закон Фика)/:
Рис 1. Электрическая схема регистрации. В данной схеме элементами цепи,
обведенные пунктиром, собраны в единый прибор с автоматической разверткой
напряжения и регистрацией тока. Е – напряжение между электродами, A –
измеритель тока, Я – электрохимическая ячейка.
I = nFD A
n
– число электронов в реакции
коэффициент
(C0A − C SA )
(1)
δA
A + ne ⇔ B , F
- число Фарадея, D A –
S
диффузионного слоя, C A -
диффузии, δ A – толщина
концентрация вещества A в приповерхностном слое, I – ток, текущий через
электрохимическую ячейку. При увеличении потенциала электрода в более
катодную область, концентрации реагента А у поверхности электрода
стремится к нулю, что влечет за собой увеличение тока до максимального
значения. В предельном случае при
C AS = 0 , I = I d = nFDA Cδ
0
A
(2)
A
где I d - плотность предельного тока диффузии. Таким образом, наблюдается
пропорциональная зависимость между предельным током диффузии и
концентрацией определяемого вещества в растворе. Именно этот факт и лежит
в основе количественного полярографического анализа
При условии равновесности электрохимической реакции A + n ⋅ e ⇔ B
для потенциала рабочего электрода справедлива термодинамическая формула
Нернста:
RT C aS
ln
ϕ = ϕ0 +
(3)
nF CbS
ϕ = ϕ0 +
0.056 C aS
ln S
n
Cb
где ϕ 0 - стандартный потенциал системы,
R
– газовая постоянная,
(4)
T
–
CBS - поверхностные концентрации
соответственно реагентов A и B , F – число Фарадея. При стационарных
условиях потоки A и B одинаковы и, если в растворе C B = 0 , то
CbS
I = nFDb
(5)
δb
абсолютная
температура,
C AS ,
отсюда
CbS =
Учитывая (1) и (2) получаем
C aS =
Теперь из (2):
δb I
nFDb
δ a (I d − I )
nFDa
(6)
(7)
ϕ K = ϕ0 +
RT Dbδ a RT I d − I
ln
+
ln
nF Daδ b nF
I
(8)
I −I
RT
ln d
nF
I
(9)
или
ϕ K = ϕ1/ 2 +
где
D δ
RT
ln b a = const
nF
D aδ b
2
Уравнение (9) представляется также в виде:
ϕ1 = ϕ0 +
(9а)
−1
⎡
⎤
I = I d ⎢1 + exp( nF (ϕ K − ϕ 1 ) / RT ) ⎥
(10)
2
⎣
⎦
Это уравнение носит название уравнения Гейровского-Ильковича.
Это уравнение характеризует полярографическую волну (рис.2). Величина
предельного тока диффузии определяется механизмом подхода реагентов к
поверхности электрода. Механизм подхода может включать в себя конвекцию,
молекулярную диффузию и миграцию частиц под действием электрического
поля. Миграционный процесс полностью отсутствует при восстановлении на
рабочем электроде нейтральных молекул, таких, например, как кислород.
Вклад процесса молекулярной диффузии зависит от концентрации
исследуемого вещества, а также от коэффициента диффузии. Конвекция
определяется интенсивностью перемешивания электролита или питательной
среды. Поскольку чувствительность метода полярографического анализа
определяется величиной предельного тока диффузии, то путем перемешивания
среды и уменьшения C возможно увеличение чувствительности метода.
Рис 2. Полярографические волны восстановления.
I
a
ячейку, I d - предельный ток диффузии реагентов
A , I dc
диффузии реагентов
a
- предельный ток
c
C , I 1 , I 1 - потенциалы полуволн, ϕ k - потенциал
2
рабочего электрода.
- ток, текущий через
2
Значение
ϕ1
2
характеризует величину потенциала катода, при котором
ток достигает половины от свого максимального значения. Если диффузионные
характеристики вещества A и B мало отличаются друг от друга, так что
D B δ A ≈ D Aδ B , то второй член в выражении (9а) мал и ϕ 1 ≈ ϕ 0 . Каждая
2
окислительно
–
восстановительная
ϕ0 ,
собственным потенциалом
система
характеризуется
своим
независящим от концентрации реагентов.
Поэтому по экспериментально определяемой из полярограммы величине
ϕ1
2
можно проводить в большом числе случаев идентификацию компонент
исследуемого раствора.
При выводе формулы (10), однако предполагалось, что процесс на
электроде происходит в равновесных условиях. По отношению к твердым
электродам это не всегда так. Неизбежное загрязнение электрода продуктами
основного и побочных процессов, вклад альтернативных реакций и т.п. может
привести к существенному сдвигу суммарной полярографической кривой по
оси потенциалов, а иногда и к её деформации. Поэтому реальное значение
ϕ1
2
может отличаться от термодинамического значения (9а) на некоторую
величину, именуемую перенапряжением. Величина перенапряжения может
достигать долей вольта, но она также характерна для каждого процесса на
данном электроде и, как правило, может быть принята во внимание при анализе
результатов. Следует только при этом следить за химической чистотой
электрода и оберегать его от посторонних примесей.
Одной из важнейших катодных реакций в биологии является
восстановление кислорода, растворенного в прикатодной жидкости.
На платине процесс восстановления кислорода может протекать
различными путями:
−
+
−
+
e ,2 H
e ,2 H
O 2 ⎯ 2⎯
⎯⎯ → H 2 O 2 ⎯ 2⎯
⎯⎯ → 2 H 2 O
−
e
O 2 → 2 H 2 O ⎯ 4⎯
→ 4 OH
Перенапряжение реакций велика, около вольта.
−
+
H
⎯ 4⎯
⎯
→ 4 H 2O
(11)
(11а)
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ УСТАНОВКА
Основной
частью
экспериментальной
установки
является
электрохимическая ячейка, включенная в цепь подачи напряжения и измерения
тока. Катодом служит платиновый электрод, площадью равной 20 мм2. В
качестве электрода сравнения используется хлорсеребряный электрод. На
аноде, представляющем собой спираль из серебряной проволоки, покрытой
слоем AgCl , идет следующий процесс электрохимического взаимодействия с
раствором:
AgAgCl + Cl − ( раствор) = Ag ⋅ 2 AgCl + e − цепь.
Электродный потенциал такой системы ϕ 0 = 0,22V по водородной шкале и не
изменяется во времени. Площадь электрода сравнения много больше площади
рабочего электрода. Измерения ведутся в объеме электролита (насыщенный
KCl ),
который отделен от окружающей среды специальной пленкой,
проницаемой для кислорода: воды. Концентрация кислорода в электролите
находится в равновесии с концентрацией в окружающей среде. Конструкция
электродного блока представлена на рис.3. Такое устройство в литературе
называют электродом Кларка.
Рис 3. Кислородный электрод Кларка.
1. рабочий электрод
2. электрод сравнения
3. электролит
4. мембрана
Ячейка, в которую помещается биологический материал, выполнена из
оргстекла и имеет объем около 1 см3. Боковые отверстия служат для ввода в
объем ячейки различных биологических проб. Перемешивание среды
происходит с помощью магнитной мешалки, путем вращения в ячейке стальной
иголки, запаянной в стекло. Постоянство температуры обеспечивается
термостатом.
Напряжение на ячейку подается при помощи полярографа с автоматической
разверткой напряжения. Потенциал на рабочем электроде контролируется
вольтметром постоянного тока. Регистрация сигнала происходит с помощью
самописца с предварительным усилением. Эта часть схемы представляет собой
отдельный прибор – полярограф.
3. ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ И ФОРМА ОТЧЕТНОСТИ ПО
ЗАДАНИЮ
1. Знакомство с полярографом
Внимательно изучить описание
эксплуатации (см. Приложение).
прибора
и
инструкцию
по
его
2. Регистрация полярографической волны восстановления кислорода
Для снятия полярографической волны рабочая ячейка заполняется
дистиллированной водой. На рабочий электрод подаются потенциалы в
диапазоне от 0 до -0,9В. Плато предельного тока диффузии на кривой
восстановления кмслорода должно находиться в интервале от -0,5В до -0,8В.
Рабочая точка выбирается в первой половине плато. Приготовить питательный
раствор и заполнить им рабочую ячейку. Подать на рабочий электрод
потенциал рабочей точки и зарегистрировать при этом потенциале ток через
ячейку. Измерения проводить при температуре 37 °С . Полученное значение
тока мржет служить одной из калибровочных точек, т.к. соответствует
известной концентрации кислорода в растворе ( [O2 ] при атмосферных
условиях и T = 37°C в воде, насыщенной воздухом, равна 6,7 мг л ). Второй
калибровочной точкой служит остаточное значение тока (может оказаться
равным нулю) в растворе при полном отсутствии в нем свободного кислорода.
Она может быть получена введением в раствор какого-либо вещества, не
взаимодействующего с электродом, но легко связывающего свободный
кислород (например, Na 2 SO3 ). Но проще получить эту точку в конце
эксперимента, когда весь кислород в ячейке будет утилизирован
микроорганизмами.
3. Регистрация дыхания микроорганизмов
Ввести в ячейку при помощи микрошприца суспензию дрожжей,
предварительно инкубированных в питательной среде в течение 20 мин.
Зарегистрировать на дианрамме самописца изменение во времени предельного
тока через ячейку, которое свидетельствует об изменении концентрации
растворенного кислорода. Поскольку ячейка герметична, через некоторое время
весь кислород исчерпается, и дахание клеток прекратится. По полученной
записи можно определить скорость дыхания дрожжей.
Электродом Кларка в режиме измерения предельного тока является
удобным датчиком кислород в растворах (и в газовой атмосфере) с
электрическим выходом. Комбинируя его устройство, производящим или
расходующим кислород за счет какого-либо биологически важного вещества,
млжно сделать датчик на это вещество. Так, например, если в
непосредственной близости от электрода Кларка разместить фермент
глюкозсоксидазу, который каиализирует окисление глюкозы кислородом, то
концентрация растворенного кислорода будет падать со скоростью,
пропорциональной концентрации глюкозы. Такая система (её называют
“ферментным электродом”) способна с высокой избирательностью откликаться
на концентрацию глюкозы в исследуемой жидкости, в том числе в крови.
Изучаемая в данной работе система “электрод Кларка- дрожжи” является
так называемым “бактериальным электродом”, способным откликаться на
присутствие в пробе жидкости дыхательных ядов. Такие яды, угнетая дахание
дрожжей, изменяют наклон дыхательной полярограммы.
4. Оформление работы
После выполнения работы необходимо представить для отчета:
А). полярографическую волну восстановления кислорода на платиновом
электроде с выбранной рабочей точкой; Б). полярограмму дыхания
микроорганизмов ; В). калибровочную прямую I ([O2 ]) ; Г). расчет скорости
дыхания микроорганизмов в мкМ час. грамм дрожжей .
Литература
1.
2.
3.
Сб. “Руководство по изучению биологического окисления
полярографическим методом”, М., Наука., 1973.
Л.И. Антропов – “Теоретическая электрохимия” Высшая школа., М.,
1969. стр. 141-174, 327-348.
Б.Б. Дамаскин, О.А. Петрий – “Основы теоретической электрохимии”
Высшая школа, М., 1978. стр. 113-128, 179-184.
ПРИЛОЖЕНИЕ
1.П. Описание полярографа
В работе используется выпускаемый полярограф ОН-105 (Венгрия). Это
универсальный прибор, который позволяет проводить разнообразные
электрохимические
исследования:
регистрацию
полярограммы
с
автоматической разверткой потенциала в различных режимах – “медленной” (в
режиме постоянного тока) с записью нормальной кривой или ее производной и
“быстрой” модуляции (на переменном токе с частотой 60Гц) с регистацией на
первой и второй гармониках. Возможно включение рабочей ячейки в двух- и
трех-электродном варианте. Прибор позволяет работать с твердыми или с
ртутным капающим электродами и дает возможность компесировать емкостной
(“конденсаторный”) или активный (“диффузионный”) ток. Можно использовать
прибор также в качестве высокоомного вольтметра или чувствительного
амперметра. В соответствии с этим прибор сложное управление. В данной
работе он используется лишь в двухэлектродном варианте для записи
нормальной полярографической кривой и для регисрации кинетики изменения
тока через ячейку при фиксированном потенциале. Поэтому руски и кнопки
управления следует приводить в действие только в соответствии с необходимой
операцией.
Назначение органов управления обозначено надписями.
В данной работе используются следующие из них.
1. Включатель электропитания прибора (красная кнопка ~).
2. Клавишный пакет рода работ (“селектор”).
3. Клавишный пакет скорости развертки.
4. Клавишный блок режима регистрации.
5. Ручка установки нуля канала записи тока, снабженного подвижным пеом
шкалой с делением 100-0.
6. Цифровой индикатор потенциала на ячейке, сопряженной с механизмом
перемещения диаграмной бумаги. (полная амплитуда перемещения бумаги
на один цикл развертки всегда 400мм.).
7. Переключатель установки диапазона развертки потенциала (от -0,5 до -4В).
Текущее значение потенциала в МВ. определяется показанием счетчика
умноженным на коэффициент, установленный переключателем.
8. Ручка установки начального (“стартового” потенциала) (от 0 до 2 вольт) с
переключателем его знака + -.
Фактическое мгновенное значение потенциала электрода (клемма Д
относительно клеммы R, см. ниже) определяется алгебраической суммой
стартового потенциала и потенциала развертки.
9. Переключатель чувствительности по току (цена деления шкалы на линейке и
на диаграмме определяется как призведение цифр).
10.Переключатель демпфирования передает кривую на запись непосредственно
(положение REC) либо после фильтрации.
11.Рычаг подъемника пера позволяет экономить бумагу и ресурс пера.
Гнезды подключения ячейки выведены на лицевую панель. В данной работе
используются 2 из них: Д- для подключения основного (платинового)
электрода,
Rпротивоэлектрода
(хлор-сереьряного).
Подсоединение
электродного блока к полярографу следует осуществить до включения прибора.
2.П. Включение и эксплуатация прибора
Перед нажатием кнопки электропитания установить органы управления в
следующие положения:
Начальный потенциал – 0
Диапазон развертки – 1
Компенсация диффузионного тока 0,0
Чувствительность по току 1,0 × 3 ⋅10 −8 A
Демпфирование – 0
Селектор DC NORM
В клавишном блоке режима регистрации должна быть нажата кнопка
“POT.RESET”,
Скорость протяжки бумаги - 4 см мин
Перо поднято вверх.
После включения сети и загорания сигнальной лампочки, счетчик
потенциала автоматически устанавлмвается на 0. С помощью рычага опустить
перо на диаграмму. Нажать кнопки “CHART” и “FORW”, приводя в движение
диаграмму и развертку потенциала – “вперед”. Поймав момент, когда бумага
одной из своих поперечных линий проходит точно под пером, кнопкой “стоп”
остановить бумагу и счетчик. Нажать в блоке режима регистрации кнопку
“POT”, а в пакете “Селектор” кнопки “нормальной полярографии пост.тока”.
Затем кнопкой “FORW” включить запись полярограммы. Чувствительность по
току отрегулировать так, чтобы размах полярограммы уложился в полный
диапазон шкалы.
После прохождения цикла развертки в заданном диапазоне диаграммы и
счетчик потенциала останавливаются автоматически. После нажатия кнопки
“POT.RESET” счетчик и потенциал возвращаются в исходное положение. При
нажатии кнопки “STOP” как диаграмма, так и счетчик останавливаются в
мгновенном положении. При необходимости пройти полярограмму в обратном
направлении нужно после окончания прямой ветви, не изменяя положения
органов управления нажать вместо кнопки “FORW” кнопку “BACK”/ Этим же
приемом, но подняв перо и увеличив скорость протяжки, можно вернуть
диаграмму и счетчик в исходное положение и повторить запись в прежнем
направлении.
Следует помнить, что нормальная полярограмма на данном приборе
проходится с помощью развертки потенциала в отрицательную сторону.
Конструкция электрода Кларка.