Лабораторные методы анализа инфекционных болезней

Лабораторные методы анализа
инфекционных болезней с
неясной этиологией
Шипулин Герман Александрович –
заведующий ОМДиЭ ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии Роспотребнадзора
Факторы риска возникновения
эмерджентных случаев ИБ
• Увеличение численности населения и тенденция к
скученности
• Интенсивные миграционные процессы
• Развитие туриндустрии и глобализация мировой
экономики
• Угроза биотерроризма
• Социальные катаклизмы
• Эволюция вирусов и бактерий
• Изменение климатических условий
• Природные катаклизмы
Численность населения растет
бешенными темпами
Численность населения
млн чел
Прогноз роста численности
населения
Скорость распространения инфекционных
заболеваний резко выросла
Ежегодно из России выезжают за границу со служебной, туристической или частной
целями около 44 млн человек, въезжают в Россию около 25 млн иностранных
граждан. Всего в год границы своих государств пересекают 10 млрд человек
Москва - территория высокого риска
возникновения вспышек инфекционных
заболеваний неясной этиологии
• Ежедневно в Москве находится более 15
млн. чел. (12 млн – официальные данные)
• В Москве происходит пересечение основных
миграционных и товарных путей
• Ежегодно через Московский авиационный
узел проходит около 27 млн. чел.
• В Москве находится большое количество
эмигрантов из стран с неблагополучной
санитарно-эпидемической обстановкой
• Жители Москвы чаще посещают экзотические
страны
Самые известные возникающие
инфекции
-
1895 – Паралитический полиомиелит
1918 – Грипп Испанка *
1950е – Эбола, Марбург *
1968 – Геморрагический конъюнктивит
1980 – ВИЧ-инфекция *
1990 – Лихорадка Западного Нила *
2003 – 2013:
Атипичная пневмония *
Хантавирусный респираторный синдром *
Обезьянья оспа *
Хенипавирусная инфекция *
Птичий и свиной грипп *
Кишечная инфекция О104Н4
Коронавирусная инфекция*, птичий грипп H7N9 *,
* - передача от животных
Готовность к новым
эпидемиям ?
Проблемы при идентификации
возбудителя при ИБ неясной этиологии:
• Появление нехарактерных для данной
территории возбудителей
• Появление новых видов возбудителей
• Появление «забытых» инфекций
• Отсутствие характерной клинической картины,
стертое течение на фоне приема
лекарственных препаратов
• Отсутствие специфических диагностикумов
Данные об инфекционной заболеваемости
ОКИ в РФ
n= 782 000
64%
Неустановленные
возбудители
Сальмонеллез – 7 %
Шигеллез бактериологически
подтвержденный – 2 %
Другие ОКИ установленной
этиологии – 23 %
Вирусный гепатит А –1%
Гос.доклад «О санэпидобстановке,
2011 г.», стр.81.
Структура заболеваемости ОКИ в США
unknown
82%
viruses
67%
parasites
3%
known
agents
18%
Total Cases
bacteria
30%
Known Etiology
Из презентации Besser et al., CDC, 2012
От каких родов ждать сюрпризов?
600 патогенов – недостаточно !
1710 родов вирусов позвоночных, 135 родов бактерий,
73 рода грибов, 63 рода простейших
ICTVdB
NCBI Sequence data
(Int.Comittee on Taxonomy of Viruses) (Nat. Center for Biotechnology Information)
Pan-microbial sequence database
382,512 viruses
Viral sequence database
41,790
bacteria
382,512
4,109 fungus
2,626 parasites
Pfam database
(Protein FamiIies)
RDP
(Ribosomal Database Project)
+
NCBI
3 летальных случая, ассоциированных
с трансплантацией органов от инфицированного
неизвестным ранее аренавирусом донора
(Австралия)
Перед трансплантацией материал
Реци- Возраст
диагноз
Транспланти
Клинические проявления
День
исследован
на
Донор
мужчина
57
лет,
пиент
рованный
смерти
HEV1-8
типов,
лиссавирусы,
гриппА
орган
послеи В,
скончавшийся от
Респираторно-сенцитиальныйтранспл
вирус,
антации
геморрагического
пикорнавирусы, аденовирусы,
парагриппб, флавивирусы,
инсульта через 10 дней
1
63
Поликистоз почек.
почка альфавирусы,
Лихорадка,хантавирусы,
сепсис,
36
после
возвращения
из
Терминальная
энцефалопатия,
вирус
Крым-Конго,
стадия ХПН
некроз,
остроеРифт,
Югославии
вирустубуллярный
лихорадки
долины
отторжение трансплантата,
токсоплазму,микоплазму,
микобактерии.
рентгенографическая
доказательство
инфильтратов в грудной клетке
2
64
Гпатит Собусловленный
гепатоцеллюлярны
й рак. Цирроз в
стадии
декомпенсации
печень
Лихорадка,
спутанность
сознания,
энцефалопатия,
миоклонические
судороги,
инфильтраты в грудной клетке
30
3
44
Поликистоз почек.
Терминальная
стадия ХПН
почка
Лихорадка, реакция
отторжения трансплантата,
интраабдоминальные гематомы
и выпот
29
Подтверждение результатов молекулярных исследований с помощью
иммуногистохимических методов и электронной микроскопии.
рис1. Вирусные частицы в культуре клеток
рис.2 Вирусные частицы в аутопсийном материале от реципиентов
Вопросы в связи со случаем аренавирусной
инфекции
1. Сколькое еще таких случаев было и будет?
2. Как врачи вели таких пациентов и почему до сих пор
не было об этом сообщений?
3. Разработаны ли диагностикумы?
4. Какова доля подобных случаев в общей структуре заболеваемости
и смертности ?
5. Какие еще патогены, о которых мы ничего не знаем, циркулируют и могут
вызвать такие случаи ?
Вывод: проблема существует, проблема не изучена, требуются усилия,
направленные получение ответов на вышестоящие вопросы.
Какими ресурсами мы
располагаем?
Производство тест-систем для диагностики
инфекционных болезней в ЦНИИЭ
Ассортимент продукции – 1025
наборов реагентов, 150из которых
получили разрешения на
применение в клинической
практике и 47 ветеринарии
Производство ЦНИИЭ
сертифицировано на соответствие
требованиям стандарта ISO 9001 и
13485. В 2009 г. получена марка СЕ
на 263 набора.
От каких родов ждать сюрпризов?
600 патогенов – недостаточно !
1710 родов вирусов позвоночных, 135 родов бактерий,
73 рода грибов, 63 рода простейших
ICTVdB
NCBI Sequence data
(Int.Comittee on Taxonomy of Viruses) (Nat. Center for Biotechnology Information)
Pan-microbial sequence database
382,512 viruses
Viral sequence database
41,790
bacteria
382,512
4,109 fungus
2,626 parasites
Pfam database
(Protein FamiIies)
RDP
(Ribosomal Database Project)
+
NCBI
«Тирания больших чисел»
Алгоритм расшифровки случаев ИБ с неясной
этиологией
Микроскопия
Клинический
или патматериал
Молекулярнобиологические
методы
Микробиологические
и вирусологические
методы
ИФА
Выделение
ДНК/РНК
Выделение
ДНК/РНК
Иммуночипы
Секвенирование по Сэнгеру
Real-Time
PCR
Неспецифическая
амплификация
SISPA/VEDISCA
PCRфорез
Mass-Tag
PCR
Родоспецифичес
кая ПЦР
ДНК-чипы
Высокопроизводительное
Секвенирование. Платформы
Illumina, 454-Roche
Расширение спектра
специфических RealTime диагностикумов
Улучшение
качества рутинной
диагностики
Расширение спектра
серологических
маркеров
Вирусология:
на базе Института полиомиелита и вирусных
энцефалитов РАМН идет подготовка к проведению работ
Наша MDx-идея
Родовые
праймеры
Родовые праймеры для выявления
вирусных агентов
Работа ведется совместно с Институтом
вирусологии Боннского университета
и Институтом полиомиелита
и вирусных энцефалитов им. Чумакова
Родоспецифические тест-системы для выявления
новых вирусов
Род
Эбола, Марбург
Поксвирус
Готовые
контроли
Чувствительность
Сыворотка
Копий РНК/мл
Чувствительность
Ткань
копий РНК/г
Длина
ампликона
ДНК, РНК
10.000
50 копий/ПЦР
5*108
100 копий/ПЦР
280
ДНК
В разработке
151
Аренавирусы
Нового Света
ДНК, РНК
5.000
25 копий/ПЦР
Альфавирусы
ДНК, РНК
2000
10 копий/ПЦР
5*108
100 копий/ПЦР
223
Тоготовирусы
ДНК, РНК
2000
10 копий/ПЦР
10.000
10 копий/ПЦР
143
Ортобунья
ДНК, РНК
10 копий/ПЦР
100 копий/ПЦР
260-330
Хантавирусы
Старого Света
ДНК, РНК
В разработке
323
Лиссавирусы
ДНК, РНК
В разработке
187
Парэховирусы
Real-time
ДНК, РНК
В разработке
200
370
Результаты тестирования
Альфавирусы
2500 копий/мл сыворотки
Буньявирусы
>2500 копий/мл сыворотки
Тоготовирусы
250 копий/мл сыворотки
Быстрая индикация бактерий с помощью
групп-специфичных праймеров
Применение новых технологий к расшифровке
случаев ИБ неясной этиологии: новый
молекулярно-генетический подход
Алгоритм расшифровки случаев ИБ с неясной
этиологией
Микроскопия
Клинический
или патматериал
Молекулярнобиологические
методы
Микробиологические
и вирусологические
методы
ИФА
Выделение
ДНК/РНК
Выделение
ДНК/РНК
Иммуночипы
Секвенирование по Сэнгеру
Real-Time
PCR
Неспецифическая
амплификация
SISPA/VEDISCA
PCRфорез
Mass-Tag
PCR
Родоспецифичес
кая ПЦР
ДНК-чипы
Высокопроизводительное
Секвенирование. Платформы
Illumina, 454-Roche
Расширение спектра
специфических RealTime диагностикумов
Улучшение
качества рутинной
диагностики
Расширение спектра
серологических
маркеров
Стоимость полногеномного секвенирования начинает
приближаться к стоимости существующих
генетических тестов
Секвенирование генома
С
т
о
и
м
о
с
т
ь
р
е
г
е
н
т
о
в
$
Размах цен
Генетические тесты
MDx технологии в ЦНИИЭ
• PCR
• HMA
• PFGE
• MLST
• VNTR
• RAPD
• Microarrays
NG sequencing
Sanger sequencing
Выявление нового вирусного агента методом
неспецифической амплификации с последующим
высокопроизводительным секвенированием
Обратная транскрипция,
аплификация, лигирование
адаптеров
Эмульсионная ПЦР
Массовое секвенирование
ампликонов с последующим
Сравнением с
Последовательностями GenBank
Внедрение NGS в микробиологию –
вопрос времени
NGS сепсиса до лечения
NGS сепсиса после лечения
Colin Davenport, MDx Summit 2010, Hannover
Дендрограмма вируса Хурдун
(L-сегмент)
Вирус имеет нейротоксический и гепатотоксический эффект, персистирует в некоторых видах комаров, в
клещах, в мышах и птицах (шилохвость). До 7+1,2% образцов сыворотки человека содержат
специфические антитела (южные регионы России).
Алгоритм расшифровки случаев ИБ с
неясной этиологией
Микроскопия
Клинический
или патматериал
Молекулярнобиологические
методы
Микробиологические
и вирусологические
методы
ИФА
Выделение
ДНК/РНК
Выделение
ДНК/РНК
Иммуночипы
Секвенирование по Сэнгеру
Real-Time
PCR
Неспецифическая
амплификация
SISPA/VEDISCA
PCRфорез
Mass-Tag
PCR
Родоспецифичес
кая ПЦР
ДНК-чипы
Высокопроизводительное
Секвенирование. Платформы
Illumina, 454-Roche
Расширение спектра
специфических RealTime диагностикумов
Улучшение
качества рутинной
диагностики
Расширение спектра
серологических
маркеров
Применение новых технологий к расшифровке
случаев ИБ неясной этиологии: иммуночипы
sciFLEXARRAYER S3
(Scienion)
NanoPlotter N2
(GiSim)
«Иммуночип» – одноэтапный тест для
выявления
как антител, так и антигенов для нескольких
групп микроорганизмов,
+
=
сопоставимый (или >)
по чувствительности с ИФА,
а по специфичности с иммуноблотом
Иммуночип для детекции IgG/IgM антител к
Borrelia burgdorferi s.l.
Positive
Serum
р100
B.gar.
р100
B.afz
VlsE
B.gar.
VlsE
B.afz
p58
B.afz.
p41
B.gar
p41
B.afz
BSACy5/Cy3
р100
B.gar.
р100
B.afz
VlsE
B.gar.
VlsE
B.afz
p58
B.afz.
p41
B.gar
p41
B.afz
BSACy5/Cy3
p39
B.afz
BBK32
B.gar
BBK32
B.afz
OspC
B.afz
OspC
B.afz
p17
B.gar
p17
B.afz
BSACy5/Cy3
p39
B.afz
BBK32
B.gar
BBK32
B.afz
OspC
B.afz
OspC
B.afz
p17
B.gar
p17
B.afz
BSACy5/Cy3
internal control
internal control
internal control
internal control
BSACy5/Cy3
BSACy5/Cy3
BSACy5/Cy3
(human IgG/IgM)
BSACy5/Cy3
(human IgG/IgM)
BSACy5/Cy3
(anti- human IgG/IgM)
BSACy5/Cy3
(anti- human IgG/IgM)
BSACy5/Cy3
BSACy5/Cy3
BSACy5/Cy3
BSACy5/Cy3
BSACy5/Cy3
BSACy5/Cy3
Negative
Serum
Иммуночип для серодиагностики
TORCH-инфекций
• Одновременное выявление антител разных классов
при использовании смеси конъюгатов (анти-IgG, IgM, - IgA), меченых флуорофорами,
отличающимися по спектральным характеристикам)
• Одновременное выявление антител к разным
инфекциям на одном стекле
1 иммуночип на комплекс TORCH =
16 ИФА-тест-систем
Дизайн одного эррея для серологической диагностики
TORCH-инфекций
1
2
3
4
5
6
7
8
маркер
1
2
3
4
5
6
7
8
маркер
9
10
11
12
13
14
15
16
маркер
9
10
11
12
13
14
15
16
маркер
17
18
19
20
21
22
23
Буфер
маркер
17
18
19
20
21
22
23
Буфер
маркер
Вспомогательные контроли
(титрование IgG/анти-IgG человека)
маркер
Вспомогательные контроли в титровании
(титрование IgG/анти-IgG человека)
маркер
Вспомогательные контроли в титровании
(титрование IgM/анти-IgM человека)
маркер
Вспомогательные контроли в титровании
(титрование IgM/анти-IgM человека)
маркер
маркер
маркер
маркер
маркер
маркер
маркер
маркер
маркер
маркер
1 – GRA1 T. gondii (p24)
2 – GRA7 T.gondii (p29)
3 – MIC3 T.gondii
4 - SAG 1 T. gondii (p30)
5 – E1 Rubella virus
6 – E2 Rubella virus
7 – core Rubella virus
8 – pp 28 CMV
9 - pp 38 CMV
10 – pp 52 CMV
11 – pp 65 CMV
12 – pp 150 CMV
13 – CMV protein mosaic
14 – B19 Parvovirus
15 – MOMPCh.trachomatis
16 – pGp3 Ch. trachomatis
17 – gD1 HSV-1
18 – gG1 HSV-1
19 – gD2 HSV-2
20 – gG2 HSV-2
21 – p18 EBV
22 – p54 EBV (ENA)
23 – EBNA EBV
Пример результатов анализа на иммуночипе
для серологической диагностики TORCHинфекций
Иммуночип для индикации основных менингоэнцефалитов
и организации лабораторного мониторинга раннего обнаружения
случаев массовой заболеваемости
Пациенты с симптомами
Eastern equine; Western equine; Venezuelan equine; West
Nile; St Louis; Japanese В; Murray Valley; Tick-borne complex;
California/LaCrosse; Rift Valley; Adenovirus; Arenavirus; Rabies;
Colorado tick fever; Influenza; Mumps; Measles; Poliovirus;
Coxsackie virus; Echovirus; Herpes simplex viruses 1 and 2;
Epstein-Barr virus; Varicella-zoster virus; Cytomegalovirus
Human herpesvirus 6; HIV.
Spirochetes; MycHaemophilus influenzae;
Neisseria meningitidis; Streptococcus
pneumoniae; Staphylococcus aureus;
Staphylococcus epidermidis; Escherichia соli;
Klebsiella pneumoniae; Pseudomonas aeruginosa;
Nocardia spp.; Viridans streptococci; Enterobacter
spp.; Proteus spp.; Citrobacter spp.;
obacteria; Borrelia spp; Rickettsiae; Listeria
monocytogenes; Streptococcus agalactiae;
Flavobacterium spp.; Moraxella spp.;
Propionibacterium acnes; Enterococcus faecalis;
Salmonella spp.; Group A streptococci;
Serratia spp.; Acinetobacter spp.;
Pasteurella multocida; Aeromonas
spp.; Leptospira spp.; Brucella spp.;
Naegleria spp.; Acgnthamoeba spp.
Пациенты с сероконверсией по одному
из возбудителей, представленных в
подводной части айсберга
Раннее выявление пациентов
с IgM антителами или
сероконверсией
при обследовании
организованных коллективов
или доноров крови
Центр расшифровки случаев инфекционных
заболеваний неясной этиологии должен решать
следующие задачи:
• Расшифровка случаев инфекционных заболеваний
неясной этиологии, возникших в г. Москве и
Московской области
• Расшифровка случаев инфекционных заболеваний
неясной этиологии, возникших в прочих регионах РФ
либо за рубежом по требованию Роспотребнадзора
• Экспертное лабораторное подтверждение спорных и
сложных случаев инфекционных заболеваний
• Обеспечение молекулярно-биологической базы для
научно-практической деятельности сотрудников КИБ
г. Москвы и ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
• Сбор, депонирование уникального инфекционного
материала и культивирование штаммов
возбудителей инфекционных заболеваний
Приглашаем на охоту за новыми микробами
Качество и количество материала
– залог успеха!!!
Самокритичность – залог психического здоровья