На правах рукописи Ерофеев Иван Станиславович

На правах рукописи
Ерофеев Иван Станиславович
ФОТОКОНТРОЛЬ СЕРДЕЧНОЙ ТКАНИ
И ЕГО ПРИЛОЖЕНИЯ
03.01.02 – биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
кандидата физико-математических наук
Москва – 2014
Работа выполнена в лаборатории “наноконструирования мембранно-белковых комплексов
для контроля физиологии клетки” ФГАОУ ВПО «Московский физико-технический институт (государственный университет)».
Научный руководитель
кандидат физико-математических наук
Агладзе Константин Игоревич
Официальные оппоненты
Ведущая организация
Защита диссертации состоится…
С диссертацией можно ознакомиться…
Учёный секретарь
диссертационного совета
Общая характеристика работы
Актуальность темы
Исследование автоволновых процессов в возбудимых системах является одним из
классических направлений современной биофизики 1 . Класс возбудимых систем необычайно широк2: реакционно-диффузионная среда Белоусова-Жаботинского, аксоны и дендриты нейронов, морфогенетические системы. Важнейшим примером возбудимой системы, изучаемой в рамках биофизики, является сердечная ткань1. Биофизические исследования сердца имеют фундаментальное значение, стимулируя развитие новых подходов к
лечению болезней сердечно-сосудистой системы. Ярким примером влияния биофизических подходов на практическую кардиологию является открытие механизмов возникновения сердечных аритмий в результате образования вращающихся волн или реентри3.
Новые перспективы в биофизике сердца открывает развитие методов неинвазивного,
в том числе оптического, контроля возбудимости клетки4. Помимо стремительно развивающихся методов оптогенетики представляет интерес альтернативный подход, основанный на фотосенсибилизации сердечной ткани химическими агентами5. Развитие данного
подхода и его сочетание с современной цифровой техникой для прецизионного контроля
активности сердечной ткани представляется особенно актуальным, так как позволяет эффективно манипулировать картиной возбуждения в сердце, в том числе в лечебнопрактических целях.
1
A.T. Winfree. When Time Breaks Down: The Three-Dimensional Dynamics of Electrochemical
Waves and Cardiac Arrhythmias. – Princeton University Press, 1987.
2
Г.Р. Иваницкий, В.И. Кринский, О.А. Морнев. Автоволны: новое на перекрестках наук // Ки-
бернетика живого. Биология и информация. – М.: Наука. – 1984. – С. 24-37.
3
A.S. Dhamoon, J. Jalife. The inward rectifier current (IK1) controls cardiac excitability and is in-
volved in arrhythmogenesis // Heart Rhythm. – 2005. – Т. 2. – №. 3. – С. 316-324.
4
F. Zhang et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry // Nature. – 2007. – Т. 446. –
№. 7136. – С. 633-639.
5
Magome N., Agladze K. Patterning and excitability control in cardiomyocyte tissue culture // Physi-
ca D: Nonlinear Phenomena. – 2010. – Т. 239. – №. 16. – С. 1560-1566.
3
Цели и задачи исследования
Основной целью работы являлось создание системы цифрового фотоконтроля сердечной ткани и разработка областей его применения. В соответствии с этим ставились
следующие задачи:
1. Разработка экспериментальной установки, позволяющей динамически управлять
картиной возбудимости сердечной ткани.
2. Изучение механизмов взаимодействия фотосенсибилизаторов: азотаба и C-таба –
с клетками сердечной ткани.
3. Моделирование эффекта антиаритмического препарата методом дестабилизации
спиральной волны на фотосенсибилизированной культуре сердечной ткани.
4. Исследование возможности использования цифрового контроля сердечной ткани
для неконвенциональных вычислительных систем на примере «волнового биологического диода» (системы с односторонней проводимостью волн возбуждения) и задачи о нахождении кратчайшего пути в лабиринте.
Научная новизна и практическая значимость работы
Впервые разработана экспериментальная установка для цифрового фотоконтроля
сердечной ткани. По результатам экспериментального моделирования дестабилизации
вращающихся волн был обнаружен неизвестный ранее механизм гибели спиральной волны, основанный на образовании локального сужения проводящего пути в результате понижения возбудимости в среде и диссипации волны на выходе из него. В работе впервые
осуществлена на практике возможность использования культуры возбудимых сердечных
клеток в качестве вычислительной системы.
Практическая ценность работы определяется тем, что созданная установка цифрового фотоконтроля сердечной ткани может быть использована для экспериментального моделирования и решения широкого класса задач, посвящённых исследованию распространения возбуждения в сердечной ткани. В области перспективных биомедицинских приложений метод фотосенсибилизации сердечной ткани может использоваться для системы
обратимой фотоаблации и послужить основой для разработки локальных светочувствительных анестетиков.
4
Положения, выносимые на защиту
1. Показана возможность длительного (до 24 ч) отключения возбудимости сердечных клеток с помощью С-таба в результате однократного освещения УФ.
2. При помощи разработанной установки цифрового контроля сердечной ткани обнаружен эффект возникновения локального сужения проводящих путей в
процессе дестабилизации спиральной волны, являющийся причиной гибели
спиральной волны из-за явления критической кривизны фронта.
3. При помощи установки цифрового фотоконтроля сердечной ткани показан однонаправленный блок волны возбуждения в «волновом диоде». Показана
возможность
применения
алгоритма
нахождения
пути
в
лабиринте
с
использованием автоволновых свойств сердечной ткани.
Апробация работы
Работа докладывалась на семинарах лаборатории «наноконструирования мембранно-белковых комплексов для контроля физиологии клетки» МФТИ. Отдельные главы
работы докладывались на семинаре Института теоретической и экспериментальной биофизики, Пущино, и на следующих конференциях:
1. Европейская конференция по искусственной жизни (ECAL, Париж, 2011),
2. Европейская конференция по динамическим системам (Dynamic Days Europe,
Ольденбург, 2011),
3. 1-я Международная конференция «Модели инновационного развития фармацевтической и медицинской промышленности на базе интеграции университетской
науки и индустрии» (Долгопрудный, 2011),
4. 1-я и 2-я Международная научная конференция "Нестабильности в возбудимых
сетях и возможности управления ими" (Долгопрудный 2012, 2014),
5. Международная конференция по лекарственной разработке и терапии (ICDDT,
Дубай, 2012),
6. 2-й Российский конгресс с международным участием «Молекулярные основы
клинической медицины» (Санкт-Петербург, 2012),
7. 2-я Международная конференция «Рост и регенерация сердца» (Витербо, 2014).
5
Публикации
По теме диссертации опубликовано 5 статей в реферируемых журналах, входящих в
перечень ВАК, и 7 тезисов докладов конференций.
Структура и объём диссертации
Диссертация состоит из введения, пяти разделов основного текста, заключения и
списка цитируемой литературы. Работа содержит 105 страниц, 40 рисунков, 2 таблицы.
Библиография включает 97 наименований.
Благодарности
Автор считает своим долгом выразить глубокую признательность и благодарность
к.ф.-м.н. Агладзе Константину Игоревичу за руководство работой и помощь в её выполнении. Автор благодарит к.б.н. Н.Н. Агладзе за ценные указания по работе с культурой
сердечной ткани и помощь в проведении экспериментов. Автор признателен к.б.н. К.А.
Мотовилову за помощь в разработке химического синтеза C-таба и совместную экспериментальную работу. Автор благодарит А.С. Тепленина и О.В. Галайдыча за ценные замечания и активное участие в обсуждениях на семинарах, а также А.К. Гребенко, А.В. Диброва и В.С. Горбунова за содействие в проведении экспериментальной работы по оптическому картированию. Автор выражает признательность к.ф.-м.н. К.Г. Гурии и Н.Н.
Кудряшовой за неоднократное обсуждение результатов работы и замечания по поводу
печатного варианта диссертации.
Содержание работы
В разделе 1 проводится анализ литературы, посвящённой экспериментальным моделям сердца и сердечной ткани, спиральным волнам. Подробно рассматриваются работы,
связанные с воздействием азотаба на культуру сердечной ткани. Анализируются эксперименты по созданию неконвенциональных вычислительных систем с использованием возбудимых сред, в том числе реакции Белоусова-Жаботинского. Делаются выводы о теоретической применимости фотоконтролируемой сердечной ткани для моделирования структуры проводящих путей, в том числе изменяющихся от времени, образцов сердечной ткани.
6
В разделе 2 описываются основные методики, использованные в работе, приводятся
протоколы приготовления образцов и проведения экспериментов. Подробно описываются
методы обработки результатов.
В разделе 3 описывается созданная в процессе работы экспериментальная установка, позволяющая осуществлять цифровой фотоконтроль сердечной ткани, приводятся её
технические характеристики и изображения волновых структур, полученных с её помощью. Обсуждаются физические ограничения установки и их влияние на применимость
фотоконтроля сердечной ткани в целом. Описываются основные свойства фотосенсибилизаторов: азотаба и С-таба.
Раздел 4 посвящён задаче уничтожения заякоренной спиральной волны на культуре
кардиомиоцитов путём её дестабилизации. Показано, что дестабилизация спиральной
волны может быть осуществлена понижением возбудимости ткани и приводится подробный анализ процесса отрыва спиральной волны от стабилизировавшей её неоднородности. Исследуется влияние периферийной неоднородной возбудимости на процесс дестабилизации.
В разделе 5 рассматривается практическая применимость цифрового контроля сердечной ткани для неконвенциональных вычислительных систем на примере «волнового
биологического диода» и задачи о поиске пути в лабиринте. Приводятся результаты пропускания и блокады волны, распространяющихся в разных направлениях, обсуждается
связь подобной геометрии проведения волн возбуждения с причинами возникновения
аритмий.
В заключении даётся перечень результатов, выносимых на защиту, и обсуждаются
возможные пути их практического применения.
7
Основные результаты работы
Установка фотоконтроля сердечной ткани
В настоящей работе экспериментально исследовалось влияние фотоизомеров (2-{4[(E)-2-(4-этоксифенил) диазен-1-ил] фенокси} этил) триметиламмония бромида (далее
азотаба) на первичную культуру сердечной ткани. Культура сердечной ткани получалась
согласно протоколу 6 , высаживалась на покровные стёкла, покрытые фибронектином.
Культура сердечных клеток подвергалась оптическому картированию на 3-5 день после
выделения. Оптическое картирование проводилось на флуоресцентном микроскопе
Olympus MVX-10 с полем зрения до 4 см, что позволяло наблюдать весь образец, и регистрировалось при помощи CMOS камеры Andor iXon. Образцы с культурой сердечной
ткани окрашивались в течение 35 мин Ca2+-зависимым красителем Fluo-4 AM, и при возбуждении на длине волны 490 нм, области, в которых происходил выброс Ca2+, флуоресцировали на длине волны 520 нм. Таким образом, визуализировались волны возбуждения,
распространяющиеся по культуре сердечной ткани.
Рис. 1. Структурные формулы изомеров азотаба и схема фотоизомеризации. Трансизомер (слева) блокирует распространение волны возбуждения в культуре сердечной ткани и может быть переведён в цис-форму (справа) ближним УФ светом
(365 нм), которая не блокирует распространение волны. Обратная изомеризация
происходит либо в отсутствие освещения (темновая релаксация), либо под действием синего света (450 нм).
6
A. Arutunyan et al. Localized injury in cardiomyocyte network: a new experimental model of is-
chemia-reperfusion arrhythmias //American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. –
2001. – Т. 280. – №. 4. – С. H1905-H1915.
8
Действие азотаба, как фотосенсибилизатора, на культуру сердечной ткани было открыто относительно недавно 7, вкратце его можно описать следующим образом. Азотаб
может находиться в двух формах: цис и транс (рис. 1.). Транс-изомер энергетически более
выгоден и в темновом состоянии его концентрация составляет около 2/3 от всего азотаба.
Перевести транс-азотаб в цис-состояние возможно при помощи ближнего УФ излучения
(365 нм), принудительный обратный переход достигается синим светом (450 нм). При
этом изомеры азотаба оказывают разное влияние на возбудимость сердечных клеток:
транс-изомер блокирует проведение волны возбуждения, а цис-изомер практически не
оказывает воздействия на скорость распространения волн.
Если освещать раствор азотаба одновременно УФ и синим светом, то можно получить динамически стабильную смесь двух изомеров, в частности таким образом можно
регулировать концентрацию ингибитора распространения волны возбуждения – трансазотаба. Положим 𝐸b – интенсивность синего света, 𝐸uv – интенсивность ультрафиолетового света, 𝑐0 – полная концентрация азотаба, 𝑐𝑡 – концентрация транс-изомера, 𝑘1 – скорость цис→транс фотоизомеризации, 𝑘2 – скорость транс→цис фотоизомеризации, 𝑘3 –
скорость термической цис→транс релаксации. Тогда для концентрации 𝑐t можно записать следующее дифференциальное уравнение:
𝑑𝑐𝑡
= 𝑘1 (𝑐0 − 𝑐𝑡 )𝐸𝑏 − 𝑘2 𝑐𝑡 𝐸𝑢𝑣 + 𝑘3 (𝑐0 − 𝑐𝑡 ).
𝑑𝑡
При постоянной концентрации транс-изомера 𝑑𝑐𝑡 /𝑑𝑡 = 0. Таким образом:
𝑐𝑡 = 𝑐0
𝑘1 𝐸𝑏 + 𝑘3
.
𝑘1 𝐸𝑏 + 𝑘2 𝐸𝑢𝑣 + 𝑘3
Поскольку термическая релаксация по сравнению с фотоизомеризацией при характерных интенсивностях освещения 1 мВт/см2 является медленным процессом (десятки
минут против десятков миллисекунд), то скоростью 𝑘3 можно пренебречь. Обозначив
𝑛 = 𝑘2 𝐸𝑢𝑣 /𝑘1 𝐸𝑏 , окончательно получим:
𝑐𝑡 = 𝑐0
1
.
1+𝑛
Таким образом, концентрацию транс-изомера азотаба можно регулировать соотношением интенсивностей УФ и синего света (параметр n). В настоящих экспериментах по
7
N. Magome, K. Agladze. Patterning and excitability control in cardiomyocyte tissue culture // Physi-
ca D: Nonlinear Phenomena. – 2010. – Т. 239. – №. 16. – С. 1560-1566.
9
фотоконтролю сердечной ткани синяя компонента освещения присутствует постоянно,
так как необходима для возбуждения флюоресценции красителя fluo-4 AM, поэтому концентрация транс-изомера регулируется интенсивностью УФ излучения.
Рис. 2. Принципиальная схема экспериментальной установки цифрового фотоконтроля сердечной ткани. Картина засветки при помощи вспомогательного программного обеспечения формировалась на управляющем компьютере, затем
штатными средствами операционной системы выводилась на проектор. Матрица
проектора освещалась УФ диодом, изображение с матрицы фокусировалось на образце при помощи линзы и зеркала. Образец исследовался методом оптического
картирования. Изображение распространения волн возбуждения регистрировалось
камерой.
Если культуру сердечной ткани в присутствии азотаба освещать УФ светом частично, то волны будут распространяться только в засвеченных областях. В настоящей работе
для проведения прецизионного пространственного освещения образца УФ была создана
установка на базе микроскопа Olympus MVX-10 и модифицированного проектора Taxan
KG-PL105S (рис. 2). Оптическая система установки проецировала УФ изображение на
образец, и таким образом, стало возможным управлять возбудимостью отдельных частей
культуры сердечной ткани.
10
Длина волны освещения
365 нм
Максимальная мощность освещения
12,5 мВт/см2
Размер освещаемой области
2×2 см
Приблизительное пространственное разрешение
1 мм
Динамическая контрастность
1:1200
Статическая контрастность
1:120
Среднее время восстановления возбудимости при концентрации азотаба 100 мкМ
Среднее время подавления возбудимости при концентрации
азотаба 100 мкМ
30 сек
10 сек
Таб. 1. Параметры установки цифрового фото-контроля сердечной ткани.
Рис. 3. Фотография модуля формирования изображения для цифрового фотоконтроля сердечной ткани (вид сверху). 1 – проектор, 2 – DMD матрица проектора
на штативе, обеспечивающем прецизионное позиционирование и ориентирование,
3 – УФ диод, 4 – фокусирующая линза, 5 – микроскоп с образцом (за кадром).
Измеренные технические параметры установки приведены в таб. 1. Некоторые параметры являются приблизительными, так как точное значение изменялось от образца к
11
образцу и, следовательно, зависело от выделения и посадки культуры сердечной ткани.
Фотография установки приведена на рис. 3.
Можно заметить, что характерные времена восстановления и подавления возбудимости сердечной культуры азотабом велики по сравнению с характерными временами
фотоизомеризации самого азотаба (миллисекунды против секунд). Это означает, что процесс взаимодействия азотаба с мембранными белками кардиомиоцита медленнее фотоизомеризации самого азотаба.
При помощи установки цифрового фотоконтроля сердечной ткани стало возможным
формировать УФ светом картину проводящих путей для автоволн возбуждения на сердечной ткани, ограничивая распространение волн за пределами освещённой УФ области.
В качестве экспериментов, показывающие принципиальные возможности установки, были проведены опыты с проводящими путями различной формы (рис. 4).
Рис. 4. (а) Наложение области освещённой УФ (белый) и области, в которой распространяются волны (белый и красный), для Y-образного проводящего пути. (б)
Последовательность фронтов распространения волны по кольцевому проводящему
пути. (в) Распространение волны по извилистому проводящему пути. Высота и цвет
соответствуют флюоресцентному сигналу от культуры ткани.
Исследование действия изомеров С-таба на культуру ткани
В работе было исследовано действие на культуру ткани другого фотосенсибилизатора:
2-{4-[(E)-2-(4-этоксифенил)винил]фенокси}-N,N,N-триметилэтанамина
бромида,
далее С-таба. С-таб был синтезирован как стильбеновый аналог азотаба и отличается от
12
азотаба тем, что вместо азобензеновой связи (–N=N–) содержит стильбеновую связь (–
C=C–) (рис. 5а).
Рис. 5. (а) Структурная формула С-таба. (б-в) Схема действия С-таба на культуру
ткани. (б) Если к культуре сердечной ткани, способной проводить волны возбуждения добавить раствор С-таба, то культура становится невозбудимой. При отмытии
С-таба возбудимость клеток восстанавливается. (в) Если перед заменой буфера
культура сердечной ткани с раствором С-таба была освещена УФ, то возбудимость
клеток не восстанавливается.
В работе было показано, что добавление 50-200 мкМ С-таба к культуре сердечной
ткани полностью ингибирует её возбудимость. При этом С-таб отмывается, и возбудимость клеток восстанавливается (рис. 5б). Если же культура была освещена УФ (доза облучения 100-500 мДж/см2), то после процедуры отмывки возбудимость клеток не восстанавливается (рис 5в).
Был поставлен эксперимент, иллюстрирующий найденный механизм воздействия Стаба на культуру сердечной ткани. К возбудимой культуре сердечной ткани был добавлен
100 мкМ раствор С-таба, после чего половина образца была подвергнута 30-секундному
облучению УФ интенсивности 5 мВт/см2. После замены буфера было показано, что волны
возбуждения распространяются только в необлучённой области (рис. 6).
В настоящей работе было показано, что блок активности сердечных клеток сохраняется в течение по меньшей мере 24 ч. Для этого образец с клетками подвергался процедуре частичного освещения и последующей отмывки (точно так же, как описано ранее).
13
Затем, после оптического картирования образец тщательно отмывался от остатков С-таба
и помещался в инкубатор на сутки. Через 24 часа образец повторно красился Fluo-4 и
проводилось его картирование. На рис. 7 показаны области активности образца сразу после проведения эксперимента с С-табом и через сутки. В рамках погрешности снятия и
обработки данных области активности можно считать идентичными.
Рис. 6. (а) Раскадровка распространения волны возбуждения по образцу до добавления 100 мкМ раствора С-таба. Видно, что весь образец возбудим. (б) Распространение волны возбуждения по образцу после добавления раствора С-таба, облучения
верхней половины образца УФ и последующего отмытия. Видно, что в облучённой
области активность клеток не восстановлена. Сторона изображения 2 см.
Рис. 7. Области активности образца сердечной ткани сразу после эксперимента с Стабом и через 24 часа. Из неизменности в рамках погрешности возбудимой области
можно сделать вывод, что действие С-таба сохраняется по меньшей мере на сутки.
Одно из объяснений сохранения блока возбудимости сердечных клеток после отмытия от раствора С-таба заключается в разрушении двойной связи между углеродами в Стабе в результате поглощения молекулой УФ фотона с образованием свободных радикалов. Свободные радикалы могут вступать в реакцию с двойными связями ненасыщенных
липидов мембраны, запуская реакцию сшивки. Образованные ковалентные связи между
С-табом и липидами снижает вероятность выхода С-таба из мембраны в процессе отмывки.
14
Моделирование действия антиаритмического препарата методом дестабилизации заякоренной спиральной волны
Культура сердечной ткани часто используется как экспериментальная модельная система для изучения сложного характера распространения волн возбуждения в сердце, в
частности, в культуре сердечной ткани могут распространяться спиральные волны (реентри). Существует мнение, что спиральные волны в реальном сердце редко бывают свободными: они совершают вращение вокруг какой-нибудь гетерогенности (неоднородности). Также было показано, что в то время как свободные спиральные волны достаточно
легко могут дрейфовать, дестабилизация заякоренных спиральных волн представляется
более сложной задачей.
Рис. 8. График зависимости скорости распространения волны возбуждения от интенсивности УФ освещения сердечной культуры в 100 мкМ растворе азотаба. При значениях интенсивности УФ менее 2 мВт/см2 культура либо не возбуждалась вообще, либо
фронт волны хаотически рвался, что говорило о пограничном характере возбуждения.
Поскольку транс-изомер азотаба является ингибитором волн возбуждения, то, также как и многие антиаритмические препараты (например, лидокаин), его можно использовать для дестабилизации спиральной волны. Преимуществом использования цифрового
контроля для изучения дестабилизации спиральной волны является отсутствие механиче-
15
ского движения жидкости, неизбежно возникающего при традиционном добавлении антиаритмического препарата и способного повлиять на спиральную волну.
Ранее было показано, что изменением интенсивности УФ излучения можно регулировать концентрацию транс-изомера азотаба. Если интенсивность УФ достаточно низка,
то концентрация транс-изомера оказывается высокой и происходит полное ингибирование волн возбуждения в сердечной ткани. Однако при недостаточно низких значениях
интенсивности УФ происходит неполное ингибирование возбудимости клеток, и волны
возбуждения распространяются по сердечной ткани с замедленной скоростью. На рис. 8
представлен график зависимости скорости фронта волны возбуждения от интенсивности
УФ освещения сердечной культуры в растворе азотаба.
Рис. 9. Спиральная волна, стабилизированная гетерогенностью (прикреплённая). Слева
приведена раскадровка вращения волны. Справа – карта времени активации (сторона
изображения 2 см). На карте времени активации хорошо видно центральное ядро вращающейся волны.
Схема эксперимента по дестабилизации спиральной волны заключалась в следующем. В культуре сердечной ткани в 100-200 мкМ растворе азотаба, находящейся под УФ
излучением интенсивности 6,5‒7,5 мВт/см2, вызывалась спиральная волна методом
надкритической высоко-частотной стимуляции электродом (рис. 9). Затем интенсивность
УФ излучения понижалась на 60-70%, и наблюдались изменения в поведении спиральной
волны вплоть до её исчезновения. После исчезновения спиральной волны проводился
контрольный эксперимент: без изменения интенсивности УФ освещения культура сердечной ткани стимулировалась электродом. Контроль считался положительным, если
стимуляция вызывала ответ культуры: это означало, что возбудимость сердечной ткани
подавлена не полностью и в ней могут распространяться волны возбуждения.
16
В дальнейшем рассматриваются эксперименты, в которых удавалось дестабилизировать
спиральную волну вплоть до её исчезновения при положительном контроле.
В работе установлено, что в процессе дестабилизации наблюдался рост так называемого ядра спиральной волны – области, не подвергающейся возбуждению, вокруг которой
совершает вращение спиральная волна. На рис. 10 показан рост ядра спиральной волны.
Этот эффект обусловлен зависимостью скорости волны и длительности потенциала действия от возбудимости, или, иными словами, от соотношения скорости реакции и диффузии в системах реакции-диффузии, к которым относится сердечная ткань. При понижении
возбудимости спиральная волна больше не может вращаться вокруг первоначальной неоднородности и включает в своё ядро ближайшие неоднородности.
Рис. 10. Рост ядра спиральной волны. Слева приведён график движения вершины спиральной волны, справа – увеличение площади ядра спиральной волны от времени.
В части экспериментов спиральная волна помимо вращения вокруг неоднородности
совершала вращение вокруг примыкающей к неоднородности границы: вершина спиральной волны совершала движение вдоль границы сначала в одном направлении, а затем – в
обратном. Эта граница не может быть измерена в терминах площади, так как не содержит
действительно невозбуждаемых областей, поэтому для таких ядер измерялась длина, которая также росла после понижения возбудимости (рис. 11).
Подобный рост линейной части ядра спиральной волны также может быть объяснён
зависимостью длины потенциала действия от возбудимости: при понижении возбудимости длина потенциала действия растёт и, как следствие, растёт длина зоны рефрактерности. Из-за удлинения зоны рефрактерности растёт линейная часть ядра.
17
В результате проведённых экспериментов стало возможным подробно рассмотреть
механизм исчезновения спиральной волны. В силу неоднородности сердечной ткани рост
ядра спиральной волны происходил несимметрично. Край ядра спиральной волны смещался к периферии, где оказывался поблизости либо от границы клеток, либо от периферийной неоднородности, не пропускающей волны возбуждения. Таким образом, в пути
спиральной волны возникало сужение, в котором через некоторое время происходило её
исчезновение.
Рис. 11. Справа показан график увеличения длины ядра спиральной волны от времени
(пунктиром проведена линейная регрессия). Слева – карты активации, соответствующие начальному (А) и конечному (Б) состоянию спиральной волны (длина стороны
изображения 2 см). Красным цветом выделены линейная часть ядра спиральной волны.
Поскольку сердечную ткань можно рассматривать как систему реакции-диффузии,
то перейдя к понятиям активатор-ингибитор, этот эффект «узкого места» может быть объяснён в терминах несовпадения истока и стока (source-sink mismatch) общего для многих
систем реакция-диффузия. Выходя из «узкого места» в широкое, активатору волны необходимо активировать большую площадь, и возникает несовпадение истока и стока. Если
количество активатора, приходящееся на клетку, оказывается подпороговым, то вместо
лавинообразного открытия каналов и роста активатора сигнал ингибируется и не распространяется дальше.
18
Исследование «волнового диода»
«Волновой диод» – структура в автоволновой среде, которая позволяет автоволне
распространяться в одном направлении и не даёт распространяться в обратном 8. Исследование «волновых диодов», с одной стороны, является интересным с точки зрения неконвенциональных вычислительных систем, так как «диод» представляет простой элемент, на базе которого могут быть реализованы сложные вычислительные схемы.
С другой стороны, «волновой диод», как структура нарушающая симметрию, может приводить к разрыву волн и образованию ре-ентри. Классическая модель образования реентри как раз предполагает однонаправленный блок в одном из путей проведения.
Рис. 12. (а) «Волновой диод» с геометрией треугольник-квадрат. (б-в) Схемы распространения волн в зоне контакта. (б) Стимуляция снизу. Автоволна из зоны контакта
активирует незначительно бóльшую область. (в) Стимуляция сверху. Автоволна из
зоны контакта активирует значительно бóльшую область.
Для создания «волнового диода» на поверхность клеточной культуры в растворе
азотаба УФ проектором высвечивалась асимметричная структура треугольник-квадрат
(рис. 12а). При распространении волны в узкой области контакта возникает несовпадение
стока и истока, которое оказывается различным для движения волны в одну и другую
стороны (рис. 12б-в). Если ширина контакта d оказывается немного меньше удвоенного
8
K. Agladze et al. Chemical diode // The Journal of Physical Chemistry. – 1996. – Т. 100. – №. 33. –
С. 13895-13897.
19
критического радиуса автоволны, то при распространении волны из треугольника в квадрат волна не может выйти из зоны контакта, так как активатор диффундирует сильнее,
чем нарабатывается, и волна затухает. При распространении волны в другую сторону
диффузия активатора из зоны контакта происходит в меньший угол, что способствует
наработке активатора, и волна преодолевает контакт.
Таким образом, подбором ширины контакта и угла при вершине треугольника можно добиться, чтобы «волновой диод» пропускал волну в одну сторону и не пропускал в
другую.
Рис. 13. (а) «Волновой диод», спроецированный УФ проектором. В верхней части рисунка видна тень от электрода. По обозначенной вертикальной линии бралась пространственно-временная развёртка. (б) Пространственно-временная развёртка оптического картирования. На развёртке видно, что волна, идущая сверху, не проходит через
зону контакта, а волна, идущая снизу – проходит. Горизонтальные полосы – тень от
электрода.
На рисунке 13 показаны форма спроецированного «волнового диода» и пространственно-временная развёртка оптического картирования. Видно, что волна из верхней
части диода блокируется в зоне контакта, а волна из нижней части проходит в верхнюю
часть.
Определение кратчайшего пути в лабиринте
Рассмотрим задачу о распространении автоволны в лабиринте. Будем считать, что
критический радиус автоволны много меньше характерного пространственного разреше20
ния лабиринта. Другими словами, можно пренебречь замедлением волны при поворотах и
движении вдоль непроводящей границы. Если в начальный момент автоволна инициировалась в точке A, то через время t, фронт волны покажет геометрическое место точек, которых можно достичь за время t из точки A, двигаясь со скоростью волны.
Если рассмотреть распространение автоволн сначала из точки A, а потом из точки B,
то мы получим два семейства фронтов A(t) и B(t). Рассмотрим какой-либо фронт A(t1) из
первого семейства и найдём самый ранний фронт B(tmin) из второго семейства, который
имеет общую точку с A(t) (например, касается его). Тогда их общая точка C должна лежать на кратчайшем пути, соединяющем A и B. Действительно, если предположить, что
существует путь S, который можно пройти быстрее, чем за время t1+tmin, то это бы означало, что из точки B можно достигнуть точки пересечения пути S и фронта A(t1) за время,
меньшее чем tmin, что невозможно, так как все фронты B(t), где t<tmin не имеют общих
точек с A(t1). Окончательно, совокупность всех точек C для разных времён t1 и будет являться кратчайшим путём между точками A и B.
Рис. 14. Лабиринт и найденный в нём кратчайший путь между точками A и B. Разными цветами показано распространение волн возбуждения
из точек A и B. Точка C – точка касания фронтов
из разных семейств.
Эксперимент по нахождению кратчайшего пути в лабиринте происходил следующим образом: на образце с клетками задавались границы лабиринта; выбирались точки A
и B, между которыми в дальнейшем определялся минимальный путь; после культура клеток стимулировалась электродом сначала из точки A, а затем из точки B; распространение
волн записывалось при помощи оптического картирования. Затем по точкам касаниям
фронтов из разного семейства восстанавливался искомый кратчайший путь (рис. 14).
21
Выводы
1. Разработана экспериментальная установка, позволяющая осуществлять компьютерное управление картиной возбудимости сердечной ткани.
2. Показана возможность длительного (до 24 ч) отключения возбудимости сердечных клеток с помощью С-таба в результате однократного освещения УФ.
3. Исследован процесс дестабилизации заякоренной спиральной волны при понижении возбудимости сердечной ткани. Показан рост ядра спиральной волны. Обнаружен эффект возникновения локального сужения, являющегося причиной гибели спиральной волны из-за явления критической кривизны фронта.
4. При помощи установки цифрового фотоконтроля сердечной ткани смоделированы и исследованы «волновой оптический диод» и задача о поиске пути в лабиринте. Показан однонаправленный блок автоволны в «диоде». Реализован алгоритм нахождения пути в лабиринте с использованием автоволновых свойств сердечной ткани.
Список публикаций по теме диссертации
Статьи
1. Erofeev I. S., Magome N., Agladze K. I. Digital photocontrol of the network of live
excitable cells //JETP letters. – 2011. – Т. 94. – № 6. – С. 477-480.
2. Галайдыч О. В., Ерофеев И. С., Агладзе К. И. Оптическое картирование волн
возбуждения в светочувствительной иммортализованной культуре кардиомиоцитов //Труды МФТИ. – 2013. – Т. 5. – № 1-17. – С. 94-102.
3. Тепленин A. C., Ерошенко Л. В., Ерофеев И. С., Агладзе К. И. Использование
полимерных нановолокон для исследования структурной анизотропии культуры
иммортализованных сердечных клеток //Труды МФТИ. – 2013. – Т. 5. – № 1-17. –
С. 140-149.
4. Барсков К. В., Ерофеев И. С., Агладзе К. И. Исследование влияния АзоТАБа на
фототаксис Planaria torva //Труды МФТИ. – 2013. – Т. 5. – № 1-17. – С. 84-93.
22
5. Erofeev I. S., Agladze K. I. Two models of anisotropic propagation of cardiac
excitation wave //JETP letters. – 2014. – Т. 100. – № 5. – С. 390-393.
Тезисы докладов и материалы конференций
1. Erofeev I., N. Magome, K.Agladze. Digital photo-control of cardiac tissue. // European Conference on Artificial Life. Back to the Origins of Alife, Paris, August 8-12,
2011
2. Erofeev I., Magome N., Agladze K. Digital photo-control of cardiac tissue. // XXXI
Dynamic Days Europe, Oldenburg, Germany, September 12-16, 2011
3. Erofeev I., Magome N., Agladze K. Digital photo-control of cardiac tissue. // Международная конференция «Модели инновационного развития фармацевтической и
медицинской промышленности на базе интеграции университетской науки и
индустрии», Долгопрудный, 12-13 мая, 2011.
4. Ерофеев И. С., Л.В. Ерошенко, Ю.В. Орлова, К.И. Агладзе. Фотоконтроль сконструированной сердечной ткани. // Сборник тезисов II Российского конгресса с
международным участием «Молекулярные основы клинической медицины – возможное и реальное», Санкт-Петербург. – 2012. – С. 178-179.
5. Erofeev I., L. Eroshenko, Yu. Orlova, and K. Agladze. Digital photo-control of the engineered cardiac tissue. // 5th International Conference on Drug Discovery and
Therapy, Dubai, February 18-21, 2013
6. Erofeev I. S., N. N. Kudryashova, K. I. Agladze, Applications of photo-controlled cardiac tissue. // Book of Abstracts of the International Conference “Instabilities and
Control of Excitable Networks. Focus on: Cardiac Biophysics and General Aspects of
Excitable Media Self-organization”, Dolgoprudny, 2014, – Moscow:
DPS, 2014,
p. 13.
7. Erofeev I. S., N. N. Kudryashova, K. I. Agladze, Applications of photo-controlled cardiac tissue. // Book of Abstracts of the International Conference “Cardiac Growth and
Regeneration”, Viterbo, June 22-25, 2014
23