Комелина Наталья Павловна

На правах рукописи
Комелина Наталья Павловна
ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ РАЗОБЩАЮЩИХ БЕЛКОВ (UCP)
И ДРУГИХ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ БЕЛКОВ-ПЕРЕНОСЧИКОВ
В ТЕРМОРЕГУЛЯТОРНОМ РАЗОБЩЕНИИ ДЫХАНИЯ
МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ И СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ СУСЛИКОВ
(SPERMOPHILUS UNDULATUS)
специальность 03.01.02 – биофизика
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
ПУЩИНО – 2011
1
Работа выполнена в лаборатории механизмов природных гипометаболических
состояний Учреждения Российской академии наук Института биофизики клетки
РАН
Научный руководитель:
кандидат биологических наук
Амерханов Зариф Гарриевич
Официальные оппоненты: доктор биологических наук
Бронников Геннадий Ефремович
кандидат биологических наук
Гришина Елена Владимировна
Ведущая организация:
Учреждение Российской академии наук
Институт фундаментальных проблем
биологии РАН
Защита диссертации состоится « 19 » мая 2011 г. в 15 ч 30 мин
на заседании совета Д 002.038.01 по защите докторских и кандидатских
диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте биофизики
клетки РАН по адресу: 142290, Московская обл., г. Пущино, ул. Институтская, 3,
ИБК РАН.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по
адресу: 142290, Московская обл., г. Пущино, ул. Институтская, 3.
Автореферат разослан «___» апреля 2011 г.
Ученый секретарь
Диссертационного совета
к.б.н.
Т.И. Смолихина
2
Актуальность проблемы.
Установлено, что разобщение дыхания и синтеза ATP является одним из
главных механизмов срочного образования тепла у теплокровных животных. В
бурой жировой ткани (БЖТ), специализированной на продукции тепла, такое
терморегуляторное разобщение опосредовано разобщающим белком - 1 (UCP1),
ранее именовавшимся термогенином (см. Skulachev, 1988; Nedergaard et al., 2001;
Klingenberg, 2001). Долгие годы термогенин считался уникальным белком,
присутствующим исключительно в БЖТ. Предполагалось, что в остальных тканях
такое разобщение дыхания, приводящее к дополнительному поглощению
кислорода и выделению тепла при низких температурах, помимо своей основной
транспортной функции, могут осуществлять другие митохондриальные белки анионные переносчики, такие как ATP/ADP антипортер (ANT) и
аспатрат/глутаматный переносчик, для функционирования которых в этом случае,
как и для UCP1, требуется присутствие свободных жирных кислот (Skulachev,
1998). Однако в 1997 году были открыты еще два белка, гомологичные UCP1 по
своей аминокислотной последовательности, - UCP2, был обнаружен во всех тканях
млекопитающих, кроме паренхимальных гепатоцитов (Fleury et al., 1997), и UCP3,
который оказался специфичным для скелетных мышц (Boss et al., 1997). В
экспериментах с белками, реконструированными в липосомы, было показано, что
по своим транспортным свойствам, включая способность активироваться жирными
кислотами и ингибироваться GDP, эти белки в целом аналогичны UCP-1 (Jaburek et
al., 1999; Echtay et al., 2000). Широкое распространение получило представление о
том, что именно UCP ответственны за несократительный термогенез и регуляцию
основного обмена в тканях животных. Ранее обнаруженный факт участия ANT и
других мембранных митохондриальных белков в разобщающем действии
свободных жирных кислот стал представляться скорее экспериментальным
артефактом. В настоящее время спектр обнаруженных UCP стал еще шире, и
соответствующие разобщающие белки были обнаружены даже у одноклеточных и
растений. Хотя результаты различных исследований UCP противоречивы и
свидетельствуют о возможности существования для этих белков других функций,
отличных от функций термогенина бурой жировой ткани, большинство авторов попрежнему сходятся в одном, что функция этих белков в клетке основана на их
протонофорной активности, осуществляемой при участии жирных кислот, и
связана с разобщением процессов дыхания и фосфорилирования в митохондриях.
Это являлось отправной точкой и в наших исследованиях.
У животных способных к зимней спячке (гибернации), наиболее ярко
проявляются все процессы, связанные с терморегуляцией. Ранее в нашей
лаборатории была изучена роль ANT в терморегуляторном разобщении дыхания и
фосфорилирования в препаратах митохондрий печени и скелетной мускулатуры
выходящих из состояния гибернации сусликов. Было продемонстрировано резкое
увеличение ресопрягающего действия специфического ингибитора ANT карбоксиатрактилата (cAtr), на препараты митохондрий печени и скелетных мышц
сусликов, выходящих из состояния гибернации (Брустовецкий др., 1991;
Amerkhanov et al., 1996). Однако участие аспартат/глутаматного переносчика и
UCP в терморегуляторном разобщении дыхания и фосфорилирования в препаратах
3
митохондрий печени и скелетной мускулатуры у гибернирующих животных не
исследовалось.
Цель работы: изучить вклад UCP и других белков – анионных переносчиков
внутренней мембраны митохондрий в механизм разобщающего действия жирных
кислот и реализацию терморегуляторного разобщения в митохондриях печени и
скелетных мышц гибернирующих животных в различных физиологических
состояниях.
В соответствии с целью были поставлены следующие конкретные задачи:
1. Изучить механизм ресопрягающего действия GDP на митохондрии печени и
скелетных мышц сусликов Spermophilus undulatus и дифференцировать
предполагаемые функциональные проявления UCP от проявлений активности
ANT и аспартат/глутаматного переносчика с помощью соответствующих
ингибиторов.
2. Используя описанную в литературе способность UCP-2 и UCP-3 активироваться
супероксидом, исследовать ресопрягающее действие GDP в условиях
вызванного супероксидом разобщения.
3. С помощью ингибиторов аспартат/глутаматного переносчика, ANT и
разобщающих белков (UCP) выявить вклад каждого из них в терморегуляторное
разобщение в митохондриях печени и скелетных мышц выходящих из состояния
гибернации сусликов.
4. Опираясь на описанные в литературе свойства белков UCP, обнаружить их
присутствие и функциональную активность в тканях печени и скелетных мышц
гибернирующих сусликов.
Научная новизна работы. Впервые в эксперименте, направленном на
выявление активности UCP, для исключения вклада других митохондриальных
белков, способных участвовать в транспорте анионов жирных кислот,
использованы последовательные добавки специфических ингибиторов. Впервые
показано, что ресопрягающий эффект GDP не может служить объективным тестом
для выявления функционирования UCP, и представлены доказательства
конкурентного взаимодействия GDP с ANT. Впервые в экспериментах на
интактных митохондриях печени и мышц показано отсутствие в них проводимости
для ионов хлора, характерной для митохондрий БЖТ, содержащих UCP1.
Установлено, что cAtr не способен ингибировать UCP1 из БЖТ. На основании этих
результатов сделано заключение, что гомологи UCP в печени и скелетных мышцах
не участвуют в терморегуляторном разобщении дыхания при пробуждении
животных из состояния гибернации, а также в разобщении, активируемом
супероксидом. Также нами проведены измерения уровня экспрессии мРНК UCP2 в
печени и UCP3 мышцах якутского суслика в различных сезонных состояниях.
4