Технология и автоматизация анализа мочи

Технология и автоматизация анализа мочи
Основные принципы цитофлуориметриии в
анализе мочи
Князева Е.С.
Представительство Sysmex Europe GmbH
Исследования мочи – общий подход
1. Метод сита:
Отрицательный
результат
Выдача
результата
Положительный
результат
Микроскопия
осадка
Тест-полоска
2. Химия мочи + исследования осадка (по
Нечипоренко)
2
Точная количественная оценка –
трудно реализуема ручным методом...
● Концентрационный фактор?
• Первичный объем?
• Эффективность седиментации?
• Остаточный объем?
● Анализируемый объем?
• Объем суспензии осадка??
• Объем на поле зрения?
● Аналитика
• Точность подсчета при малых значениях?
• Субъективность классификации?
3
«Референс-метод»–
микроскопия осадка
Источники ошибок
CV [%]
● Объем суспензии осадка
3
● Ошибка толщины поля зрения
10
● Диаметр поля зрения
1
● Ошибка счета лейкоцитов на поле зрения
17
● Ошибка остаточного объема
50
● Ошибка первоначального объема
3
● Ошибка пересчета лейкоцитов на мкл в нативной моче
32
● Ошибка эффективности центрифугирования
19
Общая ошибка подсчета лейкоцитов в нативной моче
136%
4
Анализ частиц мочи –
Первая попытка стандартизации
Идеальный образец для анализа мочи (NCCLS GP
16-A, 1995)
● 12 мл мочи
● Центрифугирование 5 минут при 1500 об/мин и радиусе ротора
15.9 см
● 11.8 мл супернатанта удаляются
● Счетная камера 22 x 22 mm покрывается стеклом,
● 20 мкл распределяются в камеру (эквивалентно 1.2 мл нативной
мочи)
● Счет/поле зрения x 4,2 = счет/мкл (площадь поля зрения 0,096 мм2)
5
Анализ частиц мочи –
Стандартизация невозможна
Потери при центрифугировании (RBC)
(мониторинг с помощью UF-100):
Нативная моча
1,428
400
17,030
45
через 5 мин
1,370
191
318
27
через 20 мин
123
45
1
19
6
Современное искусство подсчета частиц
в моче ....
7
Диагностические цели
анализа осадка мочи
• Выделение отрицательных образцов
• Разделение патологических
образцов на
•
Инфекции мочевыводящих путей
•
Гематурии
•
Почечная
•
Внепочечная
Заболевания
почек
Гематурия/
Инфекции мочевыводящих
путей
Отрицательные образцы
UF-1000i/500i: современная
технология и ее преимущества
● UF - это:
• Технологии проточной цитофлуориметрии, кондуктометрии
и гидродинамической фокусировки
• Два независимых канала: для бактерий и для частиц
осадка
• Полный подсчет с дифференцировкой в моче:
» Лейкоцитов, эритроцитов, клеток плоскоклеточного
эпителия, мелких круглых клеток (переходный и почечный
эпителий)
» Бактерий, дрожжеподобных клеток, сперматозоидов
» Кристаллов, почечных цилиндров, слизи
• Скорость 60-100 образцов в час
Основа – стандартизация обработки
образца
● Автоматическое перемешивание,
аспирация и впрыск порции мочи
● Аспирируемый объем 800µL
● Разведение и окрашивание
● Фиксированные концентрации
•
1:4 для анализа осадка
•
1:8 для подсчета бактерий
● Инкубация при определенной
температуре
Принцип измерения
Специальная система реагентов
обеспечивает:
• Обеспечение определенного уровня pH
• Предобработку клеточных мембран
• Предотвращение неспецифического окрашивания
• Ускорение специфического окрашивания
• Растворение солей
• Оптимальную температуру для окрашивания
Специальная система реагентов
обеспечивает:
● Окрашивание полиметиновым красителем, идеально
соответствующим лазерной технологии.
Полиметиновые красители:
• Привлекательны за счет интересных оптических и
фотоэлектрических свойств.
• Используются как крайне эффективные лазерные
красители
• Имеют высокую световую абсорбцию и сильный уровень
флуоресценции
• Могут обнаруживаться в крайне низких концентрациях с
использованием полупроводниковых лазеров
Полиметиновый краситель: Идеальный
партнер для лазерной технологии
• Количество метиновых групп, длина и
структура цепи определяют диапазон световой
абсорбции.
•
UF-1000i/500i: возбуждение при 635 nm;
флуоресценция свыше 660 nm
Основа подсчета – проточная
цитофлуориметрия
Искусство подсчета частиц мочи…
Детекция оптических свойств
● Окрашенный образец мочи
впрыскивается в проточную
камеру; под воздействием лазера
окрашенные клетки
флуоресцируют
● Определяется уровень и
длительность импульса
флуоресценции каждой отдельной
клетки
● Параллельно определяется
фронтальное светорассеяние –
информация о размере клетки и
боковое светорассеяние –
информация о внутренней
структуре клетки
● Оптические свойства разнятся от
частицы к частице - настоящий
уникальный «взгляд внутрь»
Результат в течение 1 минуты
UF-1000i/500i
Определяемые параметры
• Лейкоциты, эритроциты, клетки плоскоклеточного
эпителия, мелкие круглые клетки (переходный и
почечный эпителий)
• Бактерии, дрожжеподобные клетки
• Кристаллы, почечные цилиндры, патологические
цилиндры, слизь
• Сперматозоиды
• Проводимость
Результаты выдаются как в ед/мкл, так и в ед/поле зрения
20
Проточная цитофлуориметрия при
анализе мочи - результат
Дополнительная информация
 Сообщение о морфологии эритроцитов
o Появляется на основании оценки однородности
распределения клеток по размеру
 Сообщение об инфекции мочевыводящих путей
o Появляется при комбинации данных подсчета
бактерий
• и/или дрожжеподобных клеток
• лейкоцитов
•
21
UF-1000i/500i: параметры
Эритроциты
Данные эритроциты, имеющие внепочечное
происхождение, нормальны по форме и
размеру.
В проточной камере они идентифицируются за
счет комбинации их низкой флуоресценции
(отсутствие ДНК) и незначительного
фронтального светорассеяния (малый размер).
Данные дисморфные эритроциты имеют,
скорее всего, почечное происхождение.
Стрелкой показан акантоцит.
UF-1000i/500i:
Дифференциальная диагностика
гематурии
● Распространненность асимптоматической
микрогематурии в популяции взрослых мужчин
и женщин в постменопаузе составляет от 10%
до 20%.
● Гематурия может быть:
• Почечной (гломерулярной)
• Внепочечной (мочеточники, мочевой пузырь)
23
Гломерулярная гематурия
• Осадок мочи пациентов с гломерулярной гематурией
характеризуется:
• Присутствием разнообразных форм эритроцитов
• Выраженной гетерогенностью эритроцитов как
по форме, так и по размеру
• Возможным присутствием фрагментов клеток
* The (fixed) urinary sediment, a simple and useful diagnostic tool in patients with
haematuria J. Huussen*, R.A.P. Koene, L.B. Hilbrands
24
Выявление гематурии и
дополнительная информация об
эритроцитах
UF использует 2 вида
данных для получения
дополнительной
информации об
эритроцитах:
1. Размер большинства (70%)
эритроцитов
2. Степень вариации
эритроцитов по размеру
25
UF в сравнении с микроскопической
оценкой
При появлении сообщения «Isomorphic RBC», микроскопия не
обнаруживает дисморфных эритроцитов
26
UF-1000i: флаг UTI?
Подозрение на инфекцию мочевыводящих
путей
Сообщение об инфекции мочевыводящих
путей появляется при комбинации данных
подсчета
• бактерий
• и/или дрожжеподобных клеток
• лейкоцитов
27
ЛЕЙКОЦИТЫ
Лейкоциты классифицируются на основе их
уровня флуоресценции (за счет нуклеиновых
кислот) и фронтального светорассеяния
(средний размер лейкоцита ~10 µm)
Специфическое окрашивание бактерий
за счет взаимодействия реагентов
• Совместное действие дилюента и полиметинового
красителя ведет к эффективному окрашиванию
исключительно бактерий.
Клеточный дербис,
часто присутствующий
в моче, не
окрашивается
Разные типы бактерий дают разную
картину при анализе
30
UF-1000i: Возможная организация
рабочего потока
ВСЕ ОБРАЗЦЫ
Отрицательные
Положительные
образцы
WBC <или> HL
BACT <или> HL
WBC > HL
BACT >> HL
YLC положит
Посев,
включая
повев на
грибы
образцы
или
BACT > HL
Посев
Посев
ЭПИТЕЛИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ (EC)
Клетки плоскоклеточного эпителия
Эпителиальные клетки демонстрируют очень высокий
уровень флуоресценции и и высокое фронтальное
светорассеяние
SRC (мелкие круглые клетки)
Клетки переходного эпителия
UF-1000 классифицирует переходный эпителий (мочевого
пузыря и мочеточников), а также клетки почечных канальцев
как мелкие круглые клетки (SRC).
Параметры анализа мочи поступают от...
SPERM
Others
YLC
X’tal
Fsc2
EC
RBC-Fl-DWSD
PROT
RBC
NIT
WBC
HGB
WBC-M
RBC-P70Fsc
Fl
SRC
CASTS
Non-Lysed RBC
35