На правах рукописи Савельева Екатерина Леонидовна

На правах рукописи
Савельева Екатерина Леонидовна
Механизм угнетения начальной агрегации тромбоцитов
гипохлоритом натрия и N,N-дихлортаурином.
03.01.02 – Биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва – 2011
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего
профессионального образования «Российский государственный медицинский
университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному
развитию»
Научный руководитель:
доктор медицинских наук
Давыдов Борис Васильевич
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук,
профессор
Потапенко Александр Яковлевич
доктор физико-математических
наук
Пантелеев Михаил Александрович
Ведущая организация:
Московский Государственный Университет им. М. В. Ломоносова
Защита состоится «12» сентября 2011 года в 14.00 часов на заседании
диссертационного совета Д 208.072.01 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по
адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава
по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1
Автореферат разослан «8» июля 2011 года
Ученый секретарь диссертационного совета:
доктор медицинских наук, профессор
Н. Г. Потешкина
-1ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. При ряде заболеваний повышенная агрегационная активность тромбоцитов становится причиной тромбозов [Weyrich A.,
2007; Troxler M., 2007], последствия которых могут оказаться крайне неблагоприятными для организма. Не менее опасна и другая крайность в функциональном состоянии тромбоцитов, их пониженная агрегационная активность,
которая может привести к внутренним кровотечениям. В связи с этим, следует
внимательно относиться к соединениям, обладающим антиагрегационными
свойствами. Среди таких соединений можно выделить гипохлорит натрия, применяемый в настоящее время внутривенно при некоторых острых интоксикациях [Sergienko V. I., 1989], и N-хлорамины, предложенные клинике как перспективные средства для борьбы с тромбозами, опосредованными тромбоцитами [Мурина М. А., Сергиенко В. И., Рощупкин Д. И., 1993, 2001]. Это естественные метаболиты организма, которые образуются в активированных нейтрофилах в результате реакции, катализируемой миелопероксидазой [Thomas E. L.,
1995], и могут изменять функциональную активность тромбоцитов в крови.
Антиагрегационное действие их на тромбоциты проявляется благодаря «активному» хлору [Мурина М. А., 2000], который способен модифицировать различные химические группы компонентов крови. Однако, механизм этого
действия до сих пор остается невыясненным. Его расшифровка должна
существенно облегчить решение проблемы о возможности клинического применения этих соединений. Здесь, в первую очередь, актуален вопрос о безопасности их взаимодействия с плазмой. Угнетение активности тромбоцитов при
введении в кровь гипохлорита натрия или N-хлораминов может быть результатом первоначальной модификации ими плазмы с образованием продукта,
обладающего антитромбоцитарными свойствами. Очевидно, что в этом случае
возникает необходимость изучать воздействие этого продукта и на другие
клетки, поскольку при его появлении в крови возможны негативные последствия для организма. Иначе говоря, нежелательное влияние гипохлорита натрия и
-2N-хлораминов на клетки крови и организм в целом может не ограничиваться их
прямым действием. Во-вторых, разработка нового антитромбоцитарного лекарственного препарата на основе N-хлораминов и внутривенное применение
гипохлорита натрия в качестве детоксицирующего средства требует теоретического обоснования их фармакологического лечебного (N-хлорамины) и побочного (гипохлорит натрия) действия на тромбоциты.
Для понимания механизма антиагрегационного действия исследуемых соединений на тромбоциты и оценки его эффективности необходимо изучать начальную агрегацию тромбоцитов (образование мелких агрегатов - Fromjovic M. M.,
1983). К сожалению, в большинстве работ по изучению антитромбоцитарного
действия потенциально возможных антиагрегантов в качестве критерия агрегационной активности тромбоцитов выбирается только конечная агрегация (образование крупных агрегатов - Born, G. V. R., 1962). Используемые в клинике
препараты, включая такие известные антиагреганты как производные тиенопиридиновые основания (тиклопидин, клопидогрель) и аспирин, не обладают способностью разрушать мелкие тромбоцитарные агрегаты [Hechler, B., 1998;
Matsuno H., 1999], наличие которых в кровеносном русле приводит к развитию
тромбообразования [Bologna E., 1990]. В настоящей работе исследовалось
влияние на начальную агрегацию тромбоцитов гипохлорита натрия и N,Nдихлортаурина. Последний вызывает особый интерес в ряду N-хлораминов изза его значительной собственной устойчивости. Кроме того, нами изучалось
действие на тромбоциты и некоторых других N-хлорпроизводных: N-хлораланина, N-фенилхлораланина и N-хлортаурина.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение
закономерностей действия гипохлорита натрия (ГХН) и N,N-дихлортаурина
(ДХТ) на начальную агрегацию тромбоцитов и выяснение молекулярного
механизма этого действия. В соответствии с этой целью были поставлены
следующие задачи:
1) Исследовать влияние ГХН и ДХТ на начальную агрегацию тромбоцитов в
составе обогащенной тромбоцитами плазме (ОТП) и изолированном виде;
-32) Изучить модификацию сульфгидрильных групп тромбоцитов как основного молекулярного механизма их инактивации под действием ГХН или ДХТ;
3) Исследовать влияние ГХН и ДХТ на начальную агрегацию активированных изолированных тромбоцитов.
Научная новизна исследования. Установлено, что гипохлорит натрия и
N,N-дихлортаурин, введенные в обогащенную тромбоцитами плазму, в диапазоне концентраций 500 – 2500 мкМ угнетают начальную агрегацию в результате прямого действия на клетки; образующиеся при этом продукты модификации плазмы неактивны, не обладают выраженным антиагрегационным
свойством. Показанные на изолированных тромбоцитах эффекты угнетения
этими соединениями начальной агрегации проявляются в пределах концентрации, в которой они могут локально образовываться в крови в естественных условиях (около 100 мкМ).
Первичным механизмом действия гипохлорита натрия и N-хлораминов на
тромбоциты является модификация сульфгидрильных групп их поверхности.
Инактивация тромбоцитов, модифицированных гипохлоритом натрия и N,Nдихлортаурином, происходит в результате первоначального повреждения белков (а не липидов) их плазматических мембран вследствие прямого действия на
сульфгидрильные группы поверхностных белков клеток с образованием кислородсодержащих продуктов необратимого окисления тиолов сульфеновой и
сульфоновой кислот. При концентрации 50 мкМ, вызывающей модификацию
тиолов поверхности тромбоцитов, гипохлорит натрия и N,N-дихлортаурин не
модифицируют кальциевых каналов тромбоцитов.
Обнаружено, что гипохлорит натрия и N-хлорамины угнетают начальную
агрегацию при действии на изолированные тромбоциты уже после их активации. N-хлораланин при концентрации 100 мкМ вызывает практически полный распад тромбоцитарных агрегатов.
Практическое значение работы. Во-первых, отсутствие у модифицированной N,N-дихлортаурином плазмы при его введении в ОТП признака биологической активности (антитромбоцитарного действия) снимает необходи-
-4мость в дальнейшем исследовать ее влияние на другие клетки. То же самое
можно сказать и относительно действия в крови гипохлорита натрия, который
уже давно применяется при некоторых острых интоксикациях. Разрушение
сульфгидрильных групп тромбоцитов как возможный первичный механизм
антиагрегационного действия исследуемых соединений говорит в пользу безопасности их применения для борьбы с тромбозами, опосредованными тромбоцитами: продукты таких реакций безвредны, поскольку образуются в организме
и в естественных условиях (при метаболизме цистеина и других SH-содержащих соединений). Во-вторых, выявленные у N,N-дихлортаурина и гипохлорита
натрия механизмы модифицирующего действия позволяют теоретически обосновать их лечебный эффект как антитромбоцитарного препарата (ДХТ) и
побочное действие на тромбоциты при применении в целях детоксикации
(ГХН). В-третьих, важнейшим достоинством N-хлораминов как антитромбоцитарных средств является их способность угнетать агрегационную активность
тромбоцитов в составе уже образованных мелких агрегатов. Обнаруженное
дезагрегационное свойство N-хлораланина, проявляющееся в полной мере при
концентрации, в которой он может локально вырабатываться при определенных
условиях в организме (100 мкМ), характеризует его как перспективное антиагрегантное средство.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на II Международном симпозиуме «Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов», Воронеж, июль 1998 г., на V Международной конференции «Биоантиоксидант», Москва, ноябрь, 1998 г., на II Съезде биофизиков
России, Москва, август 1999 г., на IV Съезде Белорусского общественного
объединения фотобиологов и биофизиков «Молекулярно-клеточные основы
функционирования биосистем», Минск, июнь 2000 г., на Российском национальном конгрессе кардиологов «Кардиология, основанная на доказательствах», Москва, октябрь 2000 г., на II Российском конгрессе по патофизиологии
«Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы»,
Москва, октябрь 2000 г., на IV Всероссийском конгрессе «Профессия и здо-
-5ровье», Москва, октябрь 2005 г., на II Международной конференции «Молекулярная медицина и безопасность», Москва, октябрь 2005 г.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 147 страницах,
содержит 28 рисунков и 6 таблиц, состоит из введения, обзора литературы,
материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения,
выводов и списка литературы (225 наименований).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Реактивы. В работе использовались соли марок ЧДА и ХЧ, 5,5’-дитио-бис-2нитробензойная кислота (фирм “Serva” и “Sigma”), дитиотреитол (фирмы
“Serva”), N-этилмалеимид (фирмы “Sigma”), коммерческий препарат ионола
(институт химической физики РАН), восстановленный глутатион (фирмы
“Sigma”), аденозиндифосфат (фирм “Serva” и “Sigma”), таурин и аминокислоты (фирмы “Reanal” и “Реахим”).
Получение гипохлорита натрия и N-хлораминопроизводных. ГХН получали
путем электролиза 0,9 % хлористого натрия на аппарате ЭДО-34 [Мартынов А.
К., 1985]. Для приготовления ДХТ cухую навеску таурина добавляли в раствор
ГХН при интенсивном перемешивании в соотношении конечных концентраций
2 : 1 (рН раствора ДХТ доводили до 7). N-хлораланин, N-хлорфенилаланин и
N-хлортаурин получали смешиванием растворов аминокислоты или таурина и
ГХН (молярная концентрация амина превышала концентрацию ГХН на 10%).
Образование N-хлораминов контролировали спектрофотометрически на спектрофотометре СФ-46 (Россия) по наличию в спектре поглощения максимума 300
нм для дихлортаурина и 250-255 нм для монохлорпроизводных [Мурина М. А.,
1998]. Концентрации ГХН и N-хлораминопроизводных определяли методом
йодометрического титрования; концентрация ДХТ рассчитана по активному
хлору.
Получение тромбоцитов. Исследования проводили на тромбоцитах кролика в
изолированном виде и в составе реконструированной обогащенной тромбо-
-6цитами плазмы (ОТП) крови; последний образец получали смешиванием изолированных клеток и плазмы. Для получения исходной ОТП кровь из краевой
вены уха кролика стабилизировали цитратом натрия (3,8% трехзамещенного
цитрата натрия; 0,139 мМ NaCl; pH = 7,36), центрифугировали при 460 g в
течение 25 мин. Плазму получали центрифугированием ОТП при 7400 g в течение 15 мин. Для выделения изолированных тромбоцитов в ОТП добавляли 1мМ
ЭДТА и центрифугировали при 1850 g в течение 7 мин. Осажденные тромбоциты ресуспендировали в 2 мл фосфатного буфера ( 137 мМ NaCl; 2,7 мM КСl;
4,7 мМ Na2HpO4; 1,47 мМ КН2РО4; 1 мМ Мg2SO4 х 12 Н2О; 5 мМ глюкозы; pH =
7,4) с ЭДТА в конечной концентрации 0,25 мМ. Способность ЭДТА связывать
двухвалентные ионы металлов подтверждали с помощью орто-фенантролинового теста [Babizhayev M. A., Savel’yeva E. L., 2005]. Полученную суспензию
тромбоцитов отмывали при 1850 g в течение 6 мин. Концентрацию клеток
доводили до 2,3  10 8 клеток в 1 мл. Процедуру выделения клеток проводили
при комнатной температуре.
Определение сульфгидрильных групп тромбоцитов. Уровень SH-групп
тромбоцитов, модифицированных ГХН или ДХТ, изучали с помощью 5,5`дитио-бис-2-нитробензойной кислоты (ДТНБ) спектрофотометрическим методом. Концентрацию аниона тионитробензойной кислоты (продукта реакции
тиолов и ДТНБ), соответствующую концентрации определяемых SH-групп,
рассчитывали, исходя из его оптической плотности при длине волны 412 нм
(пик поглощения) с коэффициентом молярной экстинкции 13600 М -1. см-1
[Ellman G. L., 1959].
Для постановки реакции ДТНБ добавляли при интенсивном перемешивании
в реакционную смесь, содержащую 1мл суспензии тромбоцитов в фосфатном
буфере и 2 мл трис-НСl-буфера (0,4М); рН=8,9, который считается оптимальным [Торчинский Ю. М., 1977]. После 10 мин инкубации при комнатной температуре пробы центрифугировали при 1850 g в течение 10 мин. Затем отбирали супернатант и измеряли максимальную оптическую плотность аниона
тионитробензойной кислоты на СФ-46.
-7Определение количества активного хлора. Для определения количества
активного хлора в плазме и фосфатном буфере после введения в них ГХН или
ДХТ применяли йодометрический метод. Молекулярный йод, образующийся
при окислении ГХН или ДХТ йодида калия, выявляли с помощью крахмала, и
измеряли его уровень спектрофотометрически на СФ-18 с использованием
интегрирующей сферы Ульбрехта по оптической плотности йодо-крахмального
комплекса при длине волны 590 нм (максимум поглощения) - [Рощупкин Д.И.,
Мурина М.А., 1998]. Концентрация йодида калия составляла 7,7 мМ; содержание крахмала 0,13 %. Работа проводилась в присутствии 1Н серной кислоты.
Регистрация начальной агрегации тромбоцитов. Начальную агрегацию
тромбоцитов исследовали нефелометрическим методом на кинетическом нефелометре-агрегометре [Рощупкин Д. И., Соколов А. Ю., 1996]. Регистрировали
возрастание интенсивности света (I, отн. ед.), рассеянного в пределах малых
углов (0,5 – 7о), отражающее процесс образования микроагрегатов (начальную
агрегацию) – (рис.1).
↑
Рис. 1. Типичные кинетические кривые изменения интенсивности расеянного света (I, отн. ед.) при агрегации тромбоцитов, стимулированных
АДФ.
1 и 2 – в контроле и после инкубации с ДХТ (1 мМ по активному хлору).
Стрелки a и б – моменты введения
СаСl2 (180 - 230 мкМ) и АДФ (10
мкМ).
I
Действие исследуемых соединений на нативные клетки оценивали по изменению отношения  I /  I К, где  I и  I К - максимальное изменение интенсивности рассеянного света (степень агрегации) в опыте и контроле.
-8Клетки активировали введением АДФ либо ионов кальция в высокой концентрации (5 мМ). Перед активацией (за 20 – 30 сек до введения индуктора
агрегации) к клеткам добавляли ионы кальция в низкой конечной концентрации
(180 – 230 мкМ).
Статистическая обработка результатов. Оценка достоверности полученных
данных проводилась по параметрическому t-критерию Стъюдента и непараметрическим Т-критерию Вилконсона, U-критерию Вилконсона – Манна – Уитни и
G-критерию знаков.
Результаты и их обсуждение
1.Антиагрегационное действие гипохлорита натрия и N,N-дихлортаурина
на тромбоциты.
Судя по данным изучения чистых соединений [Prutz W. A., 1996], продукты
миелопероксидазной реакции способны модифицировать многие химические
группы, находящиеся в тромбоцитах и плазме. В ОТП объемная доля тромбоцитов (около 108 клеток в 1 мл) составляет примерно 0,3 %; в связи с этим
при введении в ОТП исследуемых соединений основная их масса должна расходоваться в реакциях с плазмой, суммарная концентрация химических групп в
которой очень высока. Способность продуктов миелопероксидазной реакции
оказывать эффективное антиагрегационное действие на тромбоциты при введении в ОТП в сравнительно низкой конечной концентрации [Рощупкин Д.И.,
Мурина М.А., 1998] вызывает особый интерес в плане изучения их молекулярно-клеточного механизма действия.
1. 1. Угнетение гипохлоритом натрия и N,N-дихлортаурином начальной
агрегации тромбоцитов в составе обогащенной тромбоцитами плазме.
Влияние ГХН и ДХТ на начальную агрегацию тромбоцитов в обогащенной
тромбоцитами плазме (ОТП) изучали при двух вариантах их введения: в заранее реконструированную ОТП (смесь тромбоцитов и плазмы) и в плазму с
последующей (через 5 – 10 мин) реконструкцией ОТП. Сравнительный анализ
антиагрегационных эффектов исследуемого соединения при этих двух вариан-
-9тах введения позволяет выяснить прямое или косвенное (путем первоначального взаимодействия с плазмой) его действие на тромбоциты в ОТП определяет
угнетение их агрегационной активности.
ДХТ и ГХН при действии непосредственно на реконструированную ОТП
подавляют начальную агрегацию клеток на 50 % при значении их концентрации (С50) соответственно приблизительно 750 (по активному хлору) и 2000
мкМ (рис. 2, кривые 2 и 4). В такой концентрации ДХТ эффективен при внутривенном введении в опытах in vivo [Мурина М.А., 2002].
Как видно из рис.2, угнетение агрегации тромбоцитов в этих условиях сильно зависит от варианта введения исследуемого соединения. Степень агрегации
при их введении в реконструированную ОТП в умеренной концентрации снижается значительно сильнее, чем при введении в плазму. Это говорит о том, что
подавление ДХТ и ГХН начальной агрегации тромбоцитов в составе ОТП есть
результат преимущественно прямого действия активного хлора на клетки.
I / Iк , %
100
1
75
2
50
3
4
25
0
500
1000
1500
2000
2500
Концентрация исследуемого соединения, мкМ
Рис. 2. Концентрационные зависимости действия гипохлорита натрия (1, 2) и N,N-дихлортаурина (3, 4)
на начальную агрегацию тромбоцитов, регистрируемую в составе реконструированной ОТП.
1, 3 – введение исследуемых соединений в плазму с последующей (через 5-10 мин) реконструкцией ОТП;
2, 4 – введение в заранее реконструированную ОТП.
I и Ik – степень агрегации в опытном и контрольном образцах.
Эффекты, полученные при концентрациях исследуемого соединения с
разбросом 2 - 20 %, обрабатывались
вместе и представлены как один результат (среднее значение при числе
независимых опытов n = 4 – 21).
По данным йодометрического определения уровня активного хлора, в
плазме за 5 мин ее инкубации с ГХН или ДХТ в конечной концентрации 1500
мкМ происходит расходование основной массы исследуемого соединения: его
остаток не превышает 3 % от введенного количества иследуемого соединения.
- 10 В случае введения в плазму ДХТ, оптическая плотность йодо-крахмального
комплекса при длине волны 590 нм (D590), составила 0,263 ± 0,027, что достоверно не отличалось от величины D590 , полученной на образце фосфатного
буфера при концентрации этого соединения 50 мкМ (0,368 ± 0,11).
1. 2. Угнетение гипохлоритом натрия и N,N-дихлортаурином начальной
агрегации тромбоцитов в изолированном виде. Исследование зависимости
величины I/IК (степень агрегации) от концентрации исследуемого соединения показало, что ГХН и ДХТ в этих условиях дозозависимо подавляют начальную агрегацию тромбоцитов при концентрациях на 1- 2 порядка ниже, чем в
случае ОТП. При их введении в суспензию клеток в диапазоне концентраций
10 – 50 мкМ наблюдалось дозозависимое угнетение агрегационной активности
клеток в ответ на АДФ (10 мкМ): при концентрации 50 мкМ оба соединения
снижали степень агрегации более чем на 50 % по сравнению с контролем
(рис. 3А). Величины С50 для ГХН и ДХТ составляют соответственно около 15 и
35 мкМ по активному хлору.
Если тромбоциты, модифицированные ГХН (15 мкМ) или ДХТ (35 – 40
мкМ), активировать ионами кальция (5 мМ), то их начальная агрегация угнетается также, как и при действии АДФ – примерно на 50 % по сравнению с
контролем (рис. 3Б). Как известно, механизм активации тромбоцитов ионами
кальция существенно отличается от механизма АДФ-активации: требует поступления внутрь клеток ионов кальция из внешней среды, вызывает активацию
циклоксигеназы и индуцирует секрецию плотных гранул (мощная активация)
– [Han P., 1983; Miyamae T., 1995]. Исходя из этого, можно было ожидать, что
угнетение агрегации исследуемыми соединениями при их активации ионами
кальция происходит в ином диапазоне концентраций, нежели при действии
АДФ. Совпадение обсуждаемых антиагрегационных эффектов ГХН (15 мкМ) и
ДХТ (35 - 40 мкМ) говорит о том, что тромбоциты при разных механизмах
активации теряют способность к агрегации под их действием в результате
модификации одного типа.
- 11 -
А
 I / Iк , %
Б
I /Iк ,%
100
100
75
75
2
50
50
1
25
2
25
1
0
10
20
30
40
50
Концентрация исследуемого соединения, мкМ
0
10
20
30
40
50
Концентрация исследуемого соединения, мкМ
Рис. 3. Зависимость угнетения АДФ-индуцированной (А) и Са2+-индуцированной (Б)
начальной агрегации изолированных тромбоцитов от концентрации гипохлорита натрия (1) и N,N-дихлортаурина (2).
Тромбоциты (20,7 · 107 клеток в 1 мл) инкубировали с ГХН или ДХТ в течение 5 мин.
Способность ДХТ при его введении в ОТП угнетать начальную агрегацию
тромбоцитов в пределах концентрации, предлагаемой к применению in vivo,
1000 мкМ [Мурина М. А., 2002], является важным показателем его эффективности как антиагрегантного средства. Отсутствие при этом указаний на образование в результате его взамодействия с плазмой продукта, обладающего выраженными антиагрегационными свойствами, говорит в пользу безопасности
его клинического применения. Исходя из полученных данных, продукты взаимодействия ГХН и ДХТ с плазмой неактивны, и их появление в крови при
введении исследуемых соединений в качестве лекарственных средств не должно сопровождаться нежелательными последствиями для организма.
Эффективность действия ГХН и ДХТ на начальную агрегацию изолированных тромбоцитов не зависит от применяемых нами механизмов активации
(генерализованное ингибирование клеток).
- 12 2. Модификация сульфгидрильных групп тромбоцитов гипохлоритом
натрия и N-хлораминами и роль разрушения этих групп в угнетении их
начальной агрегации.
При изучении модификации сульфгидрильных групп тромбоцитов ГХН и
ДХТ как первичного механизма их действия особый интерес представляло
оценить изменение содержания поверхностных SH-групп тромбоцитов; продукты миелопероксидазной реакции очень реакционноспособны, и поэтому при
контакте с клеткой основные их взаимодействия должны происходить уже на
ее поверхности.
2. 1. Разрушение сульфгидрильных групп тромбоцитов под действием
гипохлорита натрия, N,N-дихлортаурина или N-хлортаурина. Влияние
ГХН, ДХТ, а также N-хлортаурина на содержание тиолов в тромбоцитах изучали с помощью 5,5’-дитио-бис-2-нитробензойной кислоты (ДТНБ) – абсолютно специфичного SH-реагента [Торчинский Ю. М., 1977], характеризующегося
слабой проникающей способностью (не проникает внутрь клеток и поэтому
взаимодействует с тиолами плазматических мембран, при кратковременном
воздействии, в основном, поверхностными) - [Harbury C.B., 1974]. Методика
определения тиолов с помощью ДТНБ была отработана на модели восстановленного глутатиона – полученный коэффициент молярной экстинкции
(13100 М-1  см-1) оказался близок к литературным данным (13600 М-1  см-1).
Изолированные тромбоциты инкубировали с исследуемым соединением (25 –
100 мкМ) в течение 5 мин и затем ставили реакцию ДТНБ в низкой концентрации (10 мкМ) с их тиолами при рН = 8,9 в течение 10 мин, требуемых для ее
завершения [Ellman G.L., 1959].
Обнаружено, что все исследуемые соединения снижают уровень поверхностных сульфгидрильных групп в тромбоцитах, определяемых с помощью ДТНБ
(10 мкМ) в условиях его кратковременной инкубации с клетками (рис. 4 и
табл. 1). Резкий спад уровня определяемых тиолов, отражающий модификацию
наиболее доступных из них, наблюдается уже при концентрации 50 мкМ, при
которой происходит почти полное угнетение начальной агрегации.
- 13 _
20
2
1
10
0
25
50
75
,Количество SH-групп, нмоль
Количество SH-групп, нмоль
20
15
10
3
5
0
100
5
10
15
20
Концентрация N-этилмалеимида, мкМ
Концентрация исследуемого соединения, мкМ
Рис. 4. Влияние гипохлорита натрия (2), N,N-дихлортаурина (1) и N-этилмалеимида (3)
на количество SH-групп в тромбоцитах, определяемое с помощью ДТНБ (10 мкМ).
Время инкубации клеток с N-этилмалеимидом и ДТНБ – 10 мин. Исследуемые образцы содержали 1 % этанола (растворитель N-ЭМ).
Количество SH-групп в опытах с гипохлоритом натрия и N,N-дихлортаурином приведено в расчете на 23 · 107 клеток, а в случае N-этилмалеимида – на 20,7 · 107 клеток.
Таблица 1
Влияние N-хлортаурина на количество сульфгидрильных групп тромбоцитов, определяемое с помощью ДТНБ (10 мкМ).
Концентрация
N-хлортаурина,
мкМ
Количество
определяемых
SH-групп,
нмоль
0
25
50
100
(19,3 1,78) 1, 2
(12,8 1,48) 1
(11,5 1,58) 2
10,4  3,9
Количество SH-групп приведено в расчете на 23  107 клеток.
1
- р < 0,05; 2 - р < 0,01
– по Т-критерию Вилконсона при n = 5.
Аналогичная картина была получена при применении алкилирующего соединение N-этилмалеимида (рис. 4, кривая 3), который при нейтральном рН и
умеренных концентрациях (менее 1 мМ) является специфичным SH-реагентом
[Торчинский Ю. М., 1977].
- 14 Неспособность исследуемых соединений разрушать все определяемые SHгруппы легко обьяснить тем, что постановку их реакции с тромбоцитами проводят при сравнительно невысоком значении рН (примерно 7,4); в таких условиях должны легко разрушаться те тиолы, которые имеют низкий рК, а тиолы с
высоким рК могут оказаться недоступными.
2. 2. Влияние SH-реагента N-этилмалеимида на начальную агрегацию
тромбоцитов. Сульфгидрильные группы не единственные химические группы
на поверхности тромбоцитов, с которыми могут взаимодействовать исследуемые соединения. Поэтому необходимо знать, какую роль играет их разрушение
в угнетении начальной агрегации. В следующей серии экспериментов было
изучено влияние SH-реагента N-этилмалеимида (N-ЭМ) на начальную агрегацию изолированных тромбоцитов. Постановка реакции между клетками и
N-ЭМ проводилась в тех же условиях, что и при исследовании его влияния на
уровень сульфгидрильных групп их поверхности.
Из рис. 5. видно, что N-ЭМ при действии на тромбоциты в диапазоне концентраций 2 – 20 мкМ, в котором разрушаются их поверхностные тиолы,
угнетает начальную агрегацию, индуцированную АДФ (10 мкМ) либо ионами
кальция (5 мМ); при концентрации 5 мкМ, при которой происходит резкий
спад тиолов на поверхности клеток (рис. 4, кривая 3), наблюдается более чем
I / Iк , %
Рис. 5. Зависимость угнетения
начальной агрегации изолированных тромбоцитов от концентрации N-этилмалеимида.
1 и 2 – агрегацию клеток индуцировали АДФ (10 мкМ) и ионами кальция (5мМ).
ΔI и ΔIk – степень агрегации
(изменение интенсивности рассеянного света) в опытном и
контрольном образцах.
100
75
50
2
25
1
0
5
10
15
Концентрация N-этилмалеимида,
20
мкМ
- 15 двукратное снижение степени агрегации (рис. 5). Таким образом, разрушение
сульфгидрильных групп на поверхности тромбоцитов сопровождается угнетением их начальной агрегации при любом из применяемых нами механизмов
активации. Совпадение полученных концентрационных зависимостей действия
N-ЭМ говорит при этом о том, что ингибирование клеток наступает в результате модификации одних и тех же тиолов.
2. 3. Некоторые аспекты в механизме действия гипохлорита натрия и N,Nдихлортаурина на тромбоциты. В настоящей работе экспериментально демонстрируется возможность угнетения продуктами миелопероксидазной реакции агрегационной активности тромбоцитов путем разрушения сульфгидрильных групп их поверхности. В связи с обнаруженными эффектами ГХН и ДХТ, в
первую очередь, интересно было ответить на следующие вопросы:
прямое их действие или косвеное, через образование продуктов перекисного
окисления липидов в результате первоначального повреждения липидного матрикса, определяет разрушение сульфгидрильных групп;
обратимая или необратимая модификация тиолов должна расcматриваться в
качестве возможной причины угнетения ими начальной агрегации.
Кроме того, выяснялся вопрос о том, имеет ли место расходование исследуемых соединений на модификацию кальциевых каналов.
2. 3. 1. Действие гипохлорита натрия и N,N-дихлортаурина на тромбоциты в присутствии неспецифического липидного антиоксиданта ионола.
Как выяснилось, в присутствии ионола (спиртовой раствор) эффекты снижения ГХН и ДХТ содержания сульфгидрильных групп тромбоцитов, определяемых с помощью ДТНБ, не отменяются. Количество SH-групп на фоне контрольного значения 20,4  2,04 нмоль при действии на нативные и проинкубированные в течение 20 мин с ионолом (20 мкМ) клетки ГХН (20 мкМ) составляло соответственно 15,1 ± 1,57 и 13,8 ± 1,26 нмоль, а при действии ДХТ (20
мкМ) – соответственно 15, 4  2,04 и 15,7  0,63 нмоль (для обоих соединений
сравниваемые величины достоверно не различались – p > 0,05 по Т-критерию
Вилконсона при n = 5). Во всех опытах отсутствие заметного влияния ионола
- 16 на уровень тиолов контролировалось отдельно. Таким образом, можно заключить, что модификация ГХН и ДХТ тиолов тромбоцитов имеет нерадикальную
природу.
Предварительное выдерживание изолированных тромбоцитов с ионолом (20
мкМ) в течение 20 мин не предотвращает и антиагрегационное действие исследуемых соединений. Степень агрегации клеток, активированных ионами кальция (5 мМ), при действии ГХН (n = 5) и ДХТ (n = 6) в концентрации 20 мкМ в
присутствии ионола (40 ± 21 и 50  20 %) достоверно не отличалась (p > 0,05)
от соответствующей степени агрегации в отсутствие ионола (22,5 ± 12,5 и
68  14 %). Ионол не оказывал влияния на агрегацию клеток, что контролировалось отдельно. Неспособность ионола предотвратить угнетение этими соединениями агрегации означает, что инактивация тромбоцитов при их действии
наступает вследствие первоначального повреждения белков, а не липидов,
плазматических мембран. На основании всей совокупности данных, можно
полагать, что это повреждение наступает в результате прямого действия ГХН
или ДХТ на сульфгидрильные группы.
2. 3. 2. Влияние гипохлорита натрия и N,N-дихлортаурина на уровень
ДТНБ-определяемых сульфгидрильных групп поверхности тромбоцитов
при действии в условиях блокады их кальциевых каналов. Далее было проведено сравнительное исследование эффектов снижения ГХН и ДХТ уровня
ДТНБ-определяемых поверхностных сульфгидрильных групп в тромбоцитах в
условиях блокады их кальциевых каналов и без ее применения. Кальциевые
каналы блокировали с помощью ионов никеля, которые широко используются
как Са2+-блокатор [Миронюк Е. П., 1987; Kumar S.V., 2000]. Концентрация
ионов никеля была не менее 50 мкМ, при которой обеспечивается практически
полная блокада кальциевых каналов тромбоцитов [Миронюк Е. П., 1987].
Уровни сульфгидрильных групп, определяемые в условиях кальциевой блокады (19,6  2,3 нмоль) и в ее отсутствие (21,3  3,3 нмоль), достоверно не
различались (p > 0,05 при n = 11). На таком фоне эффекты исследуемых соединений на определяемые тиолы в условиях Са2+-блокады не усиливались по
- 17 сравнению с их эффектами в ее отсутствие, как следовало ожидать в случае их
расходования в кальциевых каналах, а были примерно одинаково выражены.
Так, при применении избыточной концентрации ионов никеля (75 мкМ) уровень определяемых тиолов после действия ГХН и ДХТ в концентрации 50 мкМ
составлял соответственно 14  4,4 и 14  2,2 нмоль, оставаясь практически
таким же, как и при их действии в отсутствие ионов никеля (14,13  2,2 и
13,2  1,2 нмоль). Отсутствие достоверных различий (p > 0,05) между сравниваемыми эффектами подтверждалось с помощью Т-критерия Вилконсона
(n = 6). По-видимому, ГХН и ДХТ в пределах концентрации 50 мкМ не расходуются в их кальциевых каналов.
2. 3. 3. Влияние тиол-восстанавливающего реагента дитиотреитола на
угнетение гипохлоритом натрия или N,N-дихлортаурином начальной агрегации тромбоцитов. Продукты миелопероксидазной реакции при действии на
рядом расположенные сульфгидрильные группы (дитиолы) могут окислять их
по двум механизмам – обратимом (до дисульфидов) и необратимом (до кислород-содержащих продуктов – сульфоновые и сульфеновые кислоты) - [Prutz
W. A., 1996]. Если предположить, что обратимое окисление поверхностных
тиолов определяет угнетение ими агрегационной способности тромбоцитов,
тогда восстановление этих тиолов с помощью соединения, содержащего в своем составе дитиолы, должно отменить их антиагрегационный эффект. Для
выяснения этого вопроса мы посмотрели как влияет на начальную агрегацию
изолированных тромбоцитов, модифицированных ГХН или ДХТ, непроникающий тиосодержащий реагент дитиотреитол (восстанавливает дисульфиды до
тиолов), который популярен в аналитических исследованиях серы в белках
[Торчинский Ю. М., 1977]. Тромбоциты, модифицированные ГХН или ДХТ,
выдерживали в течение 5 мин с дитиотреитолом (15 мкМ), затем активировали
с помощью СаСl2 (5 мМ) и измеряли их начальную агрегацию.
Угнетение агрегации тромбоцитов исследуемыми соединениями не отменяется с помощью дитиотреитола: степень агрегации в присутствии и отсутствие
дитиотреитола в случае ГХН (15 мкМ) составляла соответственно 47 ± 5 и
- 18 45 ± 8 %, а в случае ДХТ (40 мкМ) – соответственно 44 ± 7 и 43 ± 10 %. Для
обоих соединений сравниваемые величины достоверно не отличались по Ткритерию Вилконсона (p > 0,05). Дитиотреитол не оказывал влияния на агрегацию клеток, что контролировалось отдельно. Отсюда ясно, что в качестве
возможного механизма генерализованного угнетения начальной агрегации
тромбоцитов под действием ГХН или ДХТ не может выступать обратимая
модификация их поверхностных тиолов.
3. Антиагрегационное действие продуктов миелопероксидазной реакции на
активированные тромбоциты.
При тромботических патологиях во многих случаях необходима блокада
продолжения агрегационного ответа; поэтому оценка эффективности действия
соединений, обладающих антиагрегационными свойствами, требует изучения
их влияния на тромбоциты после их активации.
На данном этапе работы было изучено антиагрегационное действие ГХН,
ДХТ, N-хлораланина и N-хлорфенилаланина на изолированные тромбоциты в
составе уже образовавшихся мелких агрегатов как результат разрушения
сульфгидрильных групп их плазматических мембран.
3. 1. Угнетение гипохлоритом натрия, N,N-дихлортаурином и N-хлораминокислотами начальной агрегации предварительно активированных
тромбоцитов. Действие гипохлорита натрия и N-хлораминов на активированные тромбоциты изучали следующим образом. В суспензию изолированных
клеток вводили АДФ в конечной концентрации 0,1 – 0,5 мкМ, регистрировали
изменение интенсивности рассеянного света и через 1,5 мин добавляли исследуемое соединение. Это вызывало ослабление светорассеяния, которое было
максимальным через несколько минут (рис. 6). Отношение изменения интенсивности рассеянного света (степень агрегации) в момент ее максимального
снижения (I2) к ее изменению в момент введения исследуемого соединения
(I1) сравнивали с соответствующим отношением в контроле. Это сравнение
позволяло оценивать антиагрегационное действие, включая дезагрегирующий
- 19 -
I рс , отн. ед.

физиологический раствор
АДФ

1



I1k
I2k


исследуемое соединение


АДФ


I1
I2


I
I
1,5
мин
мин
21,5
мин
2
Рис. 6. Изменение начальной агрегации изолированных тромбоцитов в
контроле (1) и при введении исследуемого соединения после активации
клеток (2).
Iрс - интенсивность рассеянного света,
отн. ед.
ΔI1 и ΔI2 ( ΔI1k и ΔI2k) – степень агрегации тромбоцитов в момент введения
исследуемого соединения (физиологического раствора) и момент ее последующего (через 2,5 – 7 мин) максимального изменения.
>
vbyvb
эффект. Отметим, что если в образце прекращается агрегация и начинается
дезагрегация, величина I2/I1 должна принимать значение меньше 1 (рис. 6,
кривая 2). В случае ингибирования только последующей агрегации без развития дезагрегации величина I2 / I1 должна быть равна 1 (остановка агрегации) либо больше 1, но меньше, чем в контроле. Величина I2 / I1 в каждом
контрольном опыте была выше 1; это свидетельствует о нарастание агрегации
(вплоть до 2 – 5 мин после активации клеток).
Все исследуемые продукты миелопероксидазной реакции ослабляли светорассеяние. Это ослабление проявлялось при сравнительно высоких их концентрациях, 100 – 300 мкМ.
ГХН и ДХТ вызывали снижение величины I2/I1 по сравнению с соответствующей величиной в контроле (1,5 ± 0,1 и 1,3 ± 0,08), свидетельствующее об
угнетении агрегационной активности клеток, при сравнительно высокой концентрации, 150 и 200 – 300 мкМ (I2/I1 была соответственно 1,16 ± 0,16 при
n = 15 и 1,05 ± 0,08 при n = 11). Различие между величинами I2/I1 в опыте
и контроле для обоих соединений статистически достоверно при высоком
уровне значимости (р < 0,01) по парному t-критерию Стъюдента.
- 20 Наиболее сильный антиагрегационный эффект был получен при применении
N-хлораминокислот (табл. 2).
Таблица 2
Изменение начальной агрегации тромбоцитов при введении N-хлораминокислот после активации клеток (через 1,5 мин после добавления АДФ).
Исследуемое
соединение
N-хлорфенилаланин
N-хлораланин
I2 / I1
При действии
N-хлораминокислот (100 мкМ)
(0,96 ± 0,15) 1
(0,15 ± 0,1) 2
Контроль
2,0 ± 0,23
ΔI1 и ΔI2 – степень агрегации тромбоцитов в момент введения исследуемого соединения и момент ее последующего (через 2,5 – 7 мин) максимального снижения.
1
- p > 0,05; 2 – p < 0,01 - при сравнении с 1 по одновыборочному t-критерию Стъюдента (n = 10).
Уже при концентрации 100 мкМ N-хлорфенилаланин останавливал агрегацию
клеток, а N-хлораланин вызывал почти полную их дезагрегацию. Зависимость
антиагрегационного действия N-хлораланина и N-хлорфенилаланина от их
структуры обусловлена разницей их молекулярных масс [Мурина М.А., 1997].
3. 2. Угнетение N-этилмалеимидом начальной агрегации предварительно
активированных тромбоцитов. При действии продуктов миелопероксидазной
реакции на клетки в повышенных концентрациях можно ожидать усиления их
взамодействия с другими химическими группами, нежели сульфгидрильными
[Мурина М. А., 1989]; такие взаимодействия могут рассматриваться как одна из
возможных причин его антиагрегационного действия при повышенных концентрациях [Мурина М. А., 1995]. Поэтому необходимо было оценить роль разрушения сульфгидрильных групп тромбоцитов на стадии продолжения их агрегационного ответа. Для этого было изучено влияние N-этилмалеимида на начальную агрегацию при его действии на изолированные тромбоциты после их
активации.
При действии N-ЭМ в концентрации 15 мкМ происходило сильное угнетение
агрегационной активности клеток: величина I2/I1 (0,63 ± 0,19) была примерно
в два раза ниже контрольной величины I2/I1 (1,38 ± 0,1). При увеличении его
- 21 концентрации до 20 мкМ наблюдался полный распад тромбоцитарных агрегатов: величина I2/I1 менее 0,12. Примечательно, что сильный антиагрегационный эффект N-ЭМ, выражающийся в двукратном снижении величины I2/I1,
проявляется при его сравнительно высокой концентрации, 15 мкМ.
Таким образом, N-этилмалеимид действует на активированные тромбоциты
по сути также, как и исследуемые продукты миелопероксидазной реакции:
угнетает их агрегационную активность, и это угнетение достигается при концентрации выше требуемой для аналогичного угнетения при его действии на
нативные клетки. Надо полагать, что при действии N-ЭМ или исследуемых соединений на активированные тромбоциты для угнетения агрегации требуется
разрушение ими тиолов, находящихся на внутренней стороне плазматической
мембраны.
В заключении необходимо выделить два аспекта. Во-первых, способность Nхлораминов угнетать агрегационную активность клеток в составе уже образованных мелких агрегатов может сыграть решающее значение при рассмотрении их как возможных антитромбоцитарных средств. В этом плане более
эффективным выглядит N-хлораланин – вызывает не только угнетение агрегации клеток, но и практически полную их дезагрегацию. В клинике особо важным показателем эффективности препаратов, применяемых при лечении ряда
сердечно-сосудистых заболеваний, служит не только их ингибирующее действие, но и способность вызывать распад уже образовавшихся агрегатов. Вовторых, такое антиагрегационное действие продуктов миелопероксидазной реакции может представлять интерес в дальнейшем для выяснения их возможной
роли в организме в поддержании тромбоцитов в покоящемся состоянии. В крови постоянно образуются мелкие тромбоцитарные агрегаты, которые в норме
быстро подвергаются распаду [Bologna E., 1990; Matsuno H., 1999]. Возможно,
что при определенных ситуациях в этом принимает участие гипохлорит натрия, локально образующийся в активированных нейтрофилах в концентрации
около 100 мкМ и почти полностью превращающийся в хлорамины [Pero R. W.,
1996].
- 22 ВЫВОДЫ.
1. Гипохлорит натрия и N,N-дихлортаурин в умеренных концентрациях
угнетают начальную агрегацию тромбоцитов в обогащенной тромбоцитами
плазме в результате прямого действия на клетки. В обогащенной тромбоцитами
плазме угнетение агрегации тромбоцитов наблюдается в диапазоне концентраций 500 – 2500 мкМ, на изолированных тромбоцитах – в диапазоне 10 – 50
мкМ.
2. Гипохлорит натрия и N,N-дихлортаурин в диапазоне концентраций 25 –
100 мкМ окисляют поверхностные сульфгидрильные группы тромбоцитов, что
является механизмом их антиагрегационного действия.
3. Липидный антиоксидант ионол не влияет на ингибирующий эффект гипохлорита натрия и N,N-дихлортаурина на начальную агрегацию тромбоцитов и
снижение уровня поверхностных тиолов, что свидетельствует о нерадикальном
характере антитромбоцитарного действия этих соединений и об их прямом
взаимодействии с поверхностными тиолами.
4. В условиях блокады Са2+-каналов уровень поверхностных тиолов тромбоцитов под влиянием гипохлорита натрия и N,N-дихлортаурина в пределах
концентрации 50 мкМ снижается в той же степени, что и без блокады, что
свидетельствует об отсутствие модификации кальциевых каналов тромбоцитов.
5. Тиол-восстанавливающий реагент дитиотреитол не влияет на угнетение
гипохлоритом натрия (15 мкМ) или N,N-дихлортаурином (40 мкМ) начальной
агрегации тромбоцитов, что исключает участие обратимой модификации (до
дисульфидов) поверхностных тиолов в ингибировании агрегации тромбоцитов
при действии этих соединений.
6. Гипохлорит натрия и N-хлорамины угнетают начальную агрегацию
активированных изолированных тромбоцитов. Выраженное антиагрегационное действие гипохлорита натрия, N,N-дихлортаурина, N-хлораланина и Nхлорфенилаланина проявляется при концентрациях 100 – 300 мкМ.
- 23 Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Мурина М. А., Савельева Е. Л., Рощупкин Д. И.. Окислительная модификация тромбоцитов гипохлоритом и биогенными хлораминами. «V международная конференция «Биоантиоксидант». М., 1998, стр. 155 – 156.
2. Мурина М. А., Аднорал Н. В., Рощупкин Д. И., Кравченко Н.Н., Савельева
Е. Л., Сергиенко В. И. О защитном действии таурина и аминокислот при окислительном повреждении клеток крови гипохлоритом натрия. В кн.: V международная конференция «Биоантиоксидант». М., 1998, стр. 154 – 155.
3. Мурина М. А., Рощупкин Д. И., Савельева Е. Л., Зверева М. В. Ингибирование агрегационной активности тромбоцитов при ковалентной модификации мембран биогенными хлораминами. В кн.: Физико-химические основы
функционирования белков и их комплексов. Воронеж. 1998; с. 162 – 166.
4. Мурина М. А., Аднорал Н. В., Савельева Е. Л., Сергиенко В. И. Противоагрегационное действие хлораминовых производных аминокислот и таурина на
тромбоциты. Материалы II Съезда Биофизиков России. М., 1999, Т. 1, стр.
260 – 261.
5. Мурина М. А., Трунилина Н. Н., Аднорал Н. В., Чудина Н. А., Савельева
Е.Л., Рощупкин Д.И. Структурная зависимость действия хлораминовых производных биогенных соединений на клетки крови. Материалы IV съезда Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков “Молекулярно-клеточные основы функционирования биосистем.” Минск, 2000, стр. 167.
6. Мурина М. А., Рощупкин Д. И., Чудина Н. А., Трунилина Н. Н., Аднорал
Н.В., Савельева Е. Л., Сергиенко В. И.
Разработка
антитромботического
средства на основе биогенных хлораминов. Материалы Российского национального конгресса кардиологов “Кардиология, основанная на доказательствах”. М., 2000, стр. 210 – 211.
7. Мурина М. А., Рощупкин Д. И., Чудина Н. А., Савельева Е. Л. Физикохимические основы противоагрегационного производного таурина и гипохлорита натрия на тромбоциты. Материалы Второго Российского конгресса по
- 24 патофизиологии “Патофизиология органов и систем. Типовые патологические
процессы.” М., 2000, стр. 96 – 97.
8. Савельева Е. Л., Рощупкин Д. И. Антиагрегантное действие биогенных
хлораминов, оцениваемое по угнетению начальной агрегации тромбоцитов.
Материалы IV Всероссийского конгресса «Профессия и здоровье». М., 2005,
стр. 584– 585.
9. Савельева Е. Л., Рощупкин Д. И. Угнетение начальной агрегации тромбоцитов гипохлоритом натрия и биогенными хлораминами. Материалы Второй
Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность».
М., 2005, стр. 233.
10. Babizhayev M. A., Semiletov Yu. A., Lul’kin Yu. A., Sakina N. L.,
Savel’yeva E. L., Alimbarova L. I., Barinskii I. F.. Free-Radical Modulating
and Immunostimulating Activities of the Novel Peptidomimetic L-GlutamylHistamine. Clinical and Experimental Immunology. 2005, 139 (3): 447 – 57.
11. Babizhayev M. A., Semiletov Yu. A., Lul’kin Yu. A., Sakina N. L.,
Savel’yeva E. L., Alimbarova L. I., Barinskii I. F.. Three-Dementional Molecular Modeles, Free-Radical Modulating and Immun Cells Signaling Activities of
the Novel Peptidomimetic L-Glutamyl-Histamine: Possible Immunostimulating
Role. Peptides. 2005, 26 (4): 551 – 63.
12. Мурина М. А., Савельева Е. Л., Рощупкин Д. И. Механизм действия
биогенных хлораминов и гипохлорита на начальную агрегацию тромбоцитов. Биофизика. 2006; 51 (2): 299 – 305.