ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «РОССИЙСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО
ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «РОССИЙСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ
ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н. И. ПИРОГОВА»
МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
На правах рукописи
Бехбудова Ламара Ханбалаловна
ВЛИЯНИЕ МИФЕПРИСТОНА НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ
РЕЦЕПТОРОВ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ В МОНОНУКЛЕАРНЫХ
КЛЕТКАХ КРОВИ ПАЦИЕНТОК С МИОМОЙ МАТКИ
14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология
Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
научный руководитель:
доктор медицинских наук, профессор
Карева Елена Николаевна
Москва 2015
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
Список сокращений
5
Введение
7
Глава 1. Обзор литературы «Мифепристон и миома матки»
15
1.1. Миома матки и ключевые детерминанты ее роста
15
1.2. Рецепторы половых стероидов в ткани миомы матки
29
1.3. Роль эстрогенов и прогестерона в стимуляции роста миомы матки
31
1.4. Лечение миомы матки
35
1.5. Мифепристон (RU-486): формула, инструкция, применение
38
1.6. Механизм антипролиферативного действия мифепристона
43
1.7. Заключение
48
Глава 2. Материалы и методы исследования
50
2.1. Материалы для исследования
50
2.1.1. Используемые реактивы
50
2.1.2. Используемое оборудование
50
2.1.3. Объекты исследования
51
2.1.4. Дизайн исследования
55
2.2. Методы исследования
56
3
2.2.1. Выделение мононуклеарной фракции клеток из
56
периферической крови
2.2.2. Выделение мРНК из клинического материала
57
2.2.3. Реакция обратной транскрипции для получения кДНК
2.2.4. Полимеразная цепная реакция в реальном времени для
57
определения уровня экспрессии генов
2.2.5. Статистическая обработка результатов
62
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение
63
3.1. Оценка клинической эффективности применения мифепристона для
63
терапии миомы матки у пациенток репродуктивного возраста
3.2. Влияние мифепристона на биохимические показатели крови
66
пациенток с миомой матки
3.2.1. Влияние мифепристона на уровень половых стероидов в
66
плазме крови пациенток с миомой матки
3.2.2. Влияние мифепристона на уровень печеночных ферментов,
68
креатинина и билирубина в плазме крови пациенток с миомой
матки
3.2.3.
Влияние
мифепристона
на
систему
гемокоагуляции
69
3.3. Влияние мифепристона на экспрессию генов рецепторов эстрогенов,
72
пациенток с миомой матки
гестагенов,
глюкокортикоидов
и
андрогенов
в
клетках
4
мононуклеарной фракции периферической крови пациенток с
миомой матки
3.4. Сравнительный анализ экспрессии генов рецепторов стероидных
73
гормонов в мононуклеарах пациенток и клинической эффективности
применения мифепристона в лечении миомы матки
3.5. Оценка частоты встречаемости железистой дилатации эндометрия у
79
пациенток в терапии миомы матки мифепристоном
3.6. Сравнительный анализ экспрессии генов рецепторов стероидных
81
гормонов в мононуклеарных клетках крови пациенток и частоты
встречаемости
мифепристон-индуцированной
железистой
дилатации эндометрия у женщин с миомой матки
Выводы
86
Список литературы
89
5
Список сокращений
AR – ядерные рецепторы андрогенов
GAPDH
–
Glyceraldehyde
3-phosphate
dehydrogenase
-
глицеральдегид-3-
фосфатдегидрогеназа
GR – ядерные рецепторы глюкокортикоидов
mER – мембранный рецептор эстрадиола
PAEC – Progesterone Receptor Modulators Associated Endometrial Changes - изменения
эндометрия, ассоциированные с терапией модуляторами рецепторов прогестерона, в
русскоязычном варианте – «Железистая дилатация эндометрия» (ЖДЭ)
PR-A – ядерный рецептор прогестерона типа А
Р4 – прогестерон
аГнРГ – агонисты гонадотропин рилизинг гормона
АЧТВ – активированное частичное тромбопластиновое время
ГНТМ – гистологически неизмененная ткань миометрия
ЖДЭ – железистая дилатация эндометрия
ИПФР – инсулиноподобный фактор роста
ИМТ – индекс массы тела
ИР – индекс резистентности кровоснабжения миоматозных узлов
КОМТ – катехол-о-метилтрансфераза
ЛММ – лейомиома
ЛС – лекарственное средство
МНФК – мононуклеарная фракция клеток крови
МПА – медроксипрогестерона ацетат
6
МУ – миоматозный узел
н.б. – недель беременности
РЭ – рецепторы эстрадиола
РП – рецепторы прогестерона
СМРП – селективные модуляторы рецепторов прогестерона
СЭФР – сосудистый эндотелиальный фактор роста
ТРФ – тромбоцитарный ростовой фактор
ТФР – трансформирующий фактор роста
УЗИ – ультразвуковое исследование
ЭФР – эпидермальный фактор роста
7
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность работы
Миома матки одно из самых распространенных заболеваний женской
репродуктивной системы. Частота возникновения миомы составляет 15–17% у
женщин старше 30 лет и 30–35% у женщин пременопаузального возраста [18], в
последние годы наблюдается «омоложение» миомы. Средний возраст выявления
заболевания составляет 32,8 ± 0,47 года, а показания к хирургическому лечению (как
правило, радикальному) появляются примерно к 45 годам [16; 8].
Вопрос об этиологии миомы матки, несмотря на длительную историю
изучения, до сих пор остается открытым [17]. Высокая встречаемость миомы у
пациенток старшего возраста наводит на мысль о том, что она является результатом
накопления мутации(й) в утеромиоцитах. В результате генетических исследований
было показано, что почти в 50% случаев клетки миомы матки имеют хромосомные
аберрации [95; 38]. Доказано, что рост опухоли является следствием нарушения
баланса клеточной пролиферацией и апоптоза [5]. Появление миомы у женщины
преимущественно после менархе и уменьшение ее размеров в постменопаузальном
периоде свидетельствует о прямом участии половых гормонов в патогенезе
заболевания.
Половые стероиды являются физиологическими регуляторами пролиферации и
апоптоза клеток-мишеней [65; 19]. В настоящее время существует устойчивое мнение
о
комплексном
эстроген-гестагенном
контроле
пролиферации
клеток
репродуктивного тракта женщины, в котором основная пролиферативная роль
отводится
гестагенному
компоненту,
тогда
как
эстрадиол
«разрешающую» функцию по отношению к своему партнеру [8].
осуществляет
8
В реализации активности половых стероидов участвуют ауто- и паракринные
факторы. Например, митогенное действие эстрогенов опосредованно увеличением
транскрипции генов местных факторов роста (TGFβ, bFGF, EGF, PDGF, VEGF, IGF)
(Рис. 1). Факторы роста, при условии достаточной экспрессии их рецепторов,
вызывают стимуляцию клеточной пролиферации, гипертрофию и увеличение объема
межклеточного матрикса [45; 67] (рис. 1).
Рисунок 1. Влияние половых стероидов на экспрессию факторов роста и
апоптоза в клетках миомы матки (Maruo T., 2004).
Базовыми в медикаментозном лечении миомы матки являются препараты,
уменьшающие действие эндогенных половых гормонов на миометрий. Снизить
эффект влияния эндогенных гормонов на ткань-мишень можно несколькими
способами. Центральная блокада секреции гонадотропинов (аГнРГ) сопровождается
тяжелым посткастрационным синдромом. Антиэстрогенный эффект можно достичь с
помощью блокаторов эстрогеновых рецепторов (прямое действие) и ингибиторов
9
ароматазы (косвенный эффект). В научной литературе недостаточно данных по
клиническому применению этих групп препаратов. Косвенный антиэстрогенный
эффект можно получить с помощью прогестинов, которые тормозят экспрессию
эстрогеновых рецепторов и стимулируют ферменты метаболизма эстрадиола.
После выявления роли прогестерона в патогенезе миомы были предложены и в
настоящее время с успехом используются препараты с антигестагенной активностью:
мифепристон, азоприснил, улипристал [16] (рис. 1).
Современные научные данные о фармакодинамических свойствах этих
препаратов позволили их отнести к селективным модуляторам рецепторов
прогестерона (СМРП) [111; 92]. Из всего спектра медикаментозных средств,
применяемых для лечения миомы матки, СМРП отличаются лучшим профилем
безопасности и высокой эффективностью [5].
В мире в подавляющем большинстве случаев в качестве СМРП уже более 30
лет применяют мифепристон. Единственным дженериком мифепристона в РФ
разрешенным для лечения миомы матки является гинестрил («STADA»).
Как и любые лекарственные препараты, селективные модуляторы рецепторов
прогестерона имеют побочные эффекты. Наряду с классическими нежелательными
явлениями – тошнота, головная боль и др., для СМРП характерно развитие в
эндометрии пациенток обратимых специфических изменений его железистого,
стромального и сосудистого компонентов. Активация пролиферативных процессов в
эндометрии на фоне лечения СМРП, как показал многолетний клинический опыт,
принципиально отличается от патологической гиперплазии эндометрия, которая
является
фоновым
состоянием
канцерогенеза.
Всемирный
Консенсус
патоморфологов, посвященный данному вопросу, в 2006 году утвердил термин–
Progesterone Receptor Modulators Associated Endometrial Changes (PAEC, изменения
эндометрия, ассоциированные с терапией модуляторами рецепторов прогестерона).
Вследствие своей уникальности и класс-специфичности РАЕС авторизованы в 2012
10
году Европейским Медицинским Агентством как самостоятельный вид обратимых
морфологических изменений эндометрия [83; 43]. Неудобный для использования
громоздкий термин РАЕС не нашел широкого применения в нашей стране.
Гинекологи
предложили
для
обозначения
этого
сопутствующего
явления
антигестагенной терапии название «железистая дилатация эндометрия». Данный
термин еще раз подчеркивает безопасность и обратимость указанного явления [23].
Эффективность лечения миомы СМРП в среднем составляет 85-95%, частота
встречаемости РАЕС – от 15 до 30% [57].
Но даже при такой высокой клинической эффективности препаратов остается
15% пациенток нечувствительных к проводимой терапии. Причинами отсутствия
эффекта лечения являются или уменьшение концентрации ЛС в крови (за счет
активации метаболизма), или нарушение чувствительности ткани (за счет снижения
плотности рецепторов или их мутации). То есть, существует материальная причина
отсутствия эффекта, которую можно использовать для персонального подбора
адекватной терапии и исключения ее отрицательного эффекта. Биологический
материал должен обеспечивать получение необходимой и достаточной информации,
при этом быть доступным для исследования (исключены биопсии тканей миомы или
печени). Мононуклеарная фракция периферической крови (МНФК) наиболее широко
используется для научных и практических целей.
Таким образом, персонализированный подход в назначении СМРП у пациенток
с миомой является резервом повышения его эффективности. Для этого необходим
анализ
данных
динамического
исследования
ключевых
молекулярно-
фармакологических и биохимических параметров мишеней половых гормонов у
пациенток в зависимости от успеха лечения, частоты проявления нежелательных
явлений с целью выявления маркера прогноза эффективности, для использования его
в индивидуальном подборе терапии для конкретной пациентки.
11
Значение иммунной системы в процессах саногенеза с одной стороны, влияние
прогестерона и СМРП на функциональную активность МНФК, как ранее было
показано на кафедре молекулярной фармакологии и радиобиологии им. академика
П.В. Сергеева [9] - с другой, свидетельствуют о том, что эндокринный и иммунный
контроли пролиферации гормон-зависимых тканей женщины тесно переплетены.
В качестве объекта исследования нами выбраны мононуклеарные клетки
периферической крови, которые в последнее время с успехом используются для
мониторинга лечения гормонозависимых заболеваний репродуктивной системы
женщины [14]. МНФК экспрессируют практически все рецепторы половых
стероидных
гормонов,
что
подтверждает
эндокринный
контроль
функции
иммунокомпетентных клеток [66]. Ранее нами показано, что в МНФК количественно
преобладает экспрессия следующих стероидных рецепторов: мембранный рецептор
эстрадиола (mER), ядерный рецептор прогестерона типа А (PR-A), ядерные
глюкокортикоидные (GR) и андрогеновые (AR) рецепторы [7].
Учитывая роль половых гормонов в патогенезе миомы матки, а также наличие и
функциональное значение рецепторов стероидов в иммунокомпетентных клетках,
нами в качестве молекулярно-фармакологических кандидатов – маркеров прогноза
эффективности и наличия сопутствующих явлений антигормональной терапии
выбран стероидно–рецепторный транскриптом клеток МНФ периферической крови
пациенток с миомой матки
Цель исследования: изучить экспрессию генов рецепторов стероидных
гормонов в мононуклеарных клетках периферической крови пациенток с миомой
матки до и после лечения мифепристоном в зависимости от показателей
эффективности терапии и наличия нежелательных явлений.
12
Задачи исследования:
1) Оценить клиническую эффективность применения мифепристона (гинестрил
50 мг/сутки внутрь ежедневно, 3 месяца) в терапии миомы матки у пациенток
репродуктивного возраста.
2) Определить
экспрессию
генов
рецепторов
эстрогенов,
гестагенов,
глюкокортикоидов и андрогенов в клетках мононуклеарной фракции
периферической крови пациенток с миомой матки на 19-21 день м.ц.
3) Исследовать влияние мифепристона (гинестрил 50 мг/сутки внутрь, 3 месяца)
на экспрессию генов рецепторов эстрогенов, гестагенов, глюкокортикоидов и
андрогенов в мононуклеарных клетках крови пациенток с миомой матки.
4) Сравнительный анализ экспрессии генов рецепторов стероидных гормонов в
клетках
мононуклеарной
фракции
крови
пациенток
и
клинической
эффективности мифепристона в лечении миомы матки.
5) Оценить частоту встречаемости мифепристон-индуцированной железистой
дилатации эндометрия у пациенток с миомой матки и возможную зависимость
ее от эффективности лечения.
6) Сравнительный анализ экспрессии генов рецепторов стероидных гормонов в
мононуклеарных
клетках
крови
пациенток
и
частоты
встречаемости
мифепристон-индуцированной железистой дилатации эндометрия у женщин с
миомой матки.
Научная новизна исследования
Впервые изучено влияние мифепристона на экспрессию генов рецепторов mER,
PR-A, GR и AR в мононуклеарах периферической крови пациенток с миомой матки.
Впервые показано ингибирующее влияние мифепристона на экспрессию гена
рецептора прогестерона типа А в клетках МНФ пациенток с миомой. Предложено
использовать стероидный транскриптом как косвенный маркер эффективности
мифепристона в терапии пациенток с миомой матки (уровень мРНК GR более 0,011).
13
Впервые обнаружены особенности рецепторного профиля в МНФК у женщин
с измененным эндометрием на фоне лечения препаратом и предложен потенциальный
маркер развития мифепристон-индуцированной железистой дилатации эндометрия у
пациенток с миомой матки. (уровень мРНК AR менее 0,028).
Практическая значимость
Результаты исследования, полученные в ходе диссертационной работы,
позволяют считать, что рецепторный профиль иммунокомпетентных клеток может
служить косвенным прогностическим признаком эффективности и целесообразности
применения мифепристона в терапии пациенток с миомой матки. Увеличение уровня
экспрессии гена GR более 0,011 (0,5-ΔCt относительно GAPDH) в мононуклеарных
клетках крови пациенток может свидетельствовать о снижения эффективности
мифепристона
в
терапии
миомы
матки
(чувствительность
маркера
78%,
специфичность - 70%). Анализ данных параметров позволит прогнозировать исход
терапии для подбора оптимального способа лечения пациентки.
Результаты диссертационной работы позволяют считать, что снижение уровня
относительной экспрессии гена AR менее 0,028 в клетках мононуклеарной фракции
крови (0,5-ΔCt относительно GAPDH) свидетельствует о высокой вероятности
развития железистой дилатации эндометрия у пациенток с миомой матки на фоне
терапии мифепристоном (чувствительность маркера 90%, специфичность –50%).
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
Выявлен новый молекулярный механизм антипролиферативного действия
мифепристона в отношении миомы матки в иммунокомпетентных клетках –
снижение экспрессии ядерного рецептора прогестерона типа А.
Экспрессия гена GR в мононуклеарах периферической крови пациенток с
миомой матки (до начала лечения) имеет отрицательную корреляционную связь с
успехом последующей терапии мифепристоном (Spearman r = -0,41, р = 0,02).
14
Уровень экспрессии гена AR может служить маркером прогноза риска развития
железистой дилатации эндометрия у пациенток с миомой матки на фоне терапии
мифепристоном.
Апробация работы состоялась на совместном заседании коллектива
сотрудников кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии им. академика
П.В. Сергеева и сотрудников научно-исследовательской лаборатории молекулярной
фармакологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова № 21 от 17 июня 2015 г.
Публикации:
Материалы работы доложены и обсуждены на Международной научной
конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы современной
медицины 2012» (Харьков, 2012), XXV Международном конгрессе с курсом
эндоскопии «Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических
заболеваний» (Москва, 2012), IV съезде фармакологов России «Инновации в
современной
фармакологии»
(Казань,
2012),
VIII
Международной
(XVII
Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции (Москва, 2013),
XXI FIGO World Congress of Gynecology and obstetrics (Ванкувер, 2015),
Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Достижения
современной фармакологической науки» (Рязань, 2015), 6-й международной
конференции
психотропным
«Биологические
средствам»
основы
(Москва,
индивидуальной
2015).
По
чувствительности
материалам
к
диссертации
опубликовано 10 печатных работ.
Структура и объем диссертации:
Диссертационная работа состоит из введения, глав, посвященных обзору
литературы, описанию методов исследования, изложению результатов работы и их
обсуждению, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 119
источников. Работа изложена на 101 странице, иллюстрирована 14 рисунками,
содержит 3 таблицы, 15 диаграмм и 2 схемы.
15
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
«МИФЕПРИСТОН И МИОМА МАТКИ»
1.1. Ключевые детерминанты роста миомы матки.
Миома матки – доброкачественная гормонозависимая опухоль, развивается из
мышечных и соединительнотканных элементов, относится к группе мезенхимальных
опухолей [2].
Миома матки имеет свои характерные особенности:
• самая распространенная опухоль у женщин переменопаузального
возраста;
• способна к росту, регрессии и даже полному исчезновению в
менопаузу;
• может долго сохранять стабильные размеры или увеличиваться в
размерах медленно, быстро и очень быстро;
• характерно многообразие клинических вариантов (симптомная и
бессимптомная);
• миома матки весьма неоднородна:
− по локализации (подбрюшинная, межмышечная, подслизистая),
имеет много промежуточных вариантов;
− по размерам (небольшие, средние, большие узлы);
− по расположению (дно, тело, перешеек, шейка матки);
− по
характеру
роста
(ложный,
обусловленный
нарушением
кровоснабжения, отеком узла, и истинный – за счет процессов
пролиферации гладкомышечных клеток);
− по
морфогистологическим
пролиферирующая,
особенностям
предсаркоматозная
и
редкие
(простая,
варианты:
16
перитонеальный лейомиоматоз, эпителиоидная, внутрисосудистая)
[22].
Вопрос об этиологии миомы матки, несмотря на длительную историю изучения,
до
сих
пор
остается
этиопатогенетическими
стероиды,
тканевые
(нерандомизированные
открытым.В
факторами
гормоны
настоящее
развития
роста
хромосомные
и
время
заболевания
генетическая
альтерации).
доказанными
являются
половые
предрасположенность
Иерархия
перечисленных
факторов активно обсуждается в научном сообществе [11].
Многочисленные литературные данные позволяют с уверенностью утверждать,
что наиболее важным фактором, контролирующим процессы гипертрофии и
гиперплазии клеток миомы матки, являются половые гормоны. В пользу участия
половых стероидов говорит тот факт, что миома определяется преимущественно в
репродуктивном возрасте и уменьшается в размерах в менопаузальном периоде.
Факторы, увеличивающие экспозицию эстрогенов в организме женщины, такие как
ожирение и раннее менархе, увеличивают частоту выявления заболевания. Тотальное
снижение уровня циркулирующих половых стероидов (введение агонистов
гонадолиберинов) тормозит рост узлов, в то время как после отмены препарата у
пациенток репродуктивного возраста в результате восстановления овариальной
функции указанный рост возобновляется, часто в опережающем темпе.
Развитие гиперпластических процессов в миометрии многие авторы связывают
с гиперэстрогенией [2], другие исследователи считают, что имеют значение не
столько абсолютные данные концентрации
эстрогенов, сколько изменение
соотношения эстрогенов и прогестинов, т. е. относительная гиперэстрогенемия [27].
С другой стороны, во многих исследованиях показано, что уровни циркулирующих
половых гормонов в плазме крови при наличии миомы находятся в пределах
референсных значений и не влияют на размеры узла [37]. Аналогичные данные
получены и нами [10]. Савицкий Г.А. и соавт. (2000) выяснили, что содержание
17
эстрадиола и прогестерона в сосудах матки выше, чем в периферической венозной
крови, на основании чего ими предложена схема патогенеза миомы матки, в которой
приобретение клетками миометрия новых биологических свойств напрямую связано
с длительными нарушениями локального гормонального гомеостаза [17]. Таким
образом, эстрогены в условиях как in vivo, так и in vitro оказывают промоторное
действие на рост предсуществующей миомы.
В то же время за последние годы накоплены данные о том, что и прогестерон
наряду с эстрогеном стимулирует рост миомы матки. Так, in vitro прогестерон
тормозит апоптоз клеток миомы, стимулируя экспрессию антиапоптотического белка
Bcl-2 [46]. В культуре клеток миомы в ответ на прогестерон повышается синтез
эпидермального фактора роста (в то время как эстрадиол увеличивает экспрессию его
рецепторов). Данный эффект в культуре неизмененных миометриальных клеток
выражен не столь значительно, как в миомных узлах (Maruo T. и соавт., 2008). Повидимому, комбинация двух половых стероидов необходима для успешной
пролиферации клеток миомы.
В литературе представлено мало исследований на животных с целью выявления
роли прогестерона в пролиферации клеток миомы.Тем не менее данные клинических
исследований показали:
• повышение митотической активности клеток миомы, особенно у
молодых женщин в лютеиновую фазу менструального цикла (высокий
прогестерон);
• у женщин, получающих мифепристон (антигестаген), происходит
снижение объема миомных узлов на 49 % через 3 месяца от начала лечения
при параллельном снижении уровня рецепторов прогестерона;
• прогестины реверсируют действие агонистов гонадолиберинов
(аГРГ) на объем миомы.
18
Последнее наблюдение наводит на мысль о приоритетной роли прогестерона в
прогрессировании миомы, т. к. аГРГ вызывают отчетливую гипоэстрогенемию,
которая не может быть преодолена введением прогестерона (он в отличие от
тестостерона не конвертирует в эстрадиол).
Существенные различия выявлены в уровне гормонов и их рецепторов в самой
ткани миомы матки. В частности, уровень эстрадиола в ткани миомы выше, чем в
гистологически неизмененной ткани миометрия. Такое различие, по-видимому,
связано с местным синтезом гормона. Клетки новооборазований экспрессируют два
фермента
синтеза
эстрогенов
in
situ
–
ароматазу
и
17β-
гидроксистероиддегидрогеназу, тогда как в неизмененных клетках миометрия (ткань
далее 2 см от капсулы миомы) подобная экспрессия отсутствует [58]. Тем не менее не
выявлено связи между уровнем мРНК ароматазы и размером узла, объемом матки и
возрастом пациенток. Лишь у пациенток старше 45 лет определена положительнвая
корреляция между экспрессией ароматазы и возрастом.
Повышению концентрации эстрадиола в ткани способствует не только
активация его синтеза, но и ингибирование процессов катаболизма. Катехол-0метилтрансфераза
(КОМТ)
катехолэстрогенов
в
их
–
фермент,
метиллированные
осуществляющий
производные.
конверсию
Концентрация
катехолэстрогенов в миомном узле достоверно ниже, чем в здоровом миометрии.
Существует несколько теорий о роли КОМТ и катехолэстрогенов в патофизиологии
ЛММ. Во-первых, КОМТ в качестве субстрата использует 2-гидроксиэстрадиол,
проявляющий антиэстрогенную активность. За счет уменьшения уровня эндогенных
антиэстрогенов усиливается эстрогенное влияние. Другими словами, повышение
активности
КОМТ
сопровождается
гиперэстрогенией,
способствующей
прогрессированию миомы. В свою очередь продукт активности КОМТ – 2метоксиэстрадиол
–
проявляет
митогенное
действие.
Установлено,
что
катехолэстрогены (субстрат КОМТ) стимулируют образование гидроксильных
19
радикалов, которые активируют тканевые металлопротеиназы, гидролизующие белки
межклеточного матрикса. Именно межклеточный матрикс является важнейшим
компонентом миоматозного узла. Поэтому активация КОМТ, приводящая к
истощению запаса катехолэстрогенов, ведет к накоплению материала межклеточного
матрикса [89].
Популяционный анализ показал, что у пациенток афроамериканской расы
наряду с более высокой частотой встречаемости ЛММ активность КОМТ в
миометрии значительно выше, чем у европейских женщин. Уровень КОМТ в
миомном узле выше, чем в окружающем миометрии. Более того, активность КОМТ в
узле коррелирует с размером узла. Не удивительно, что активность КОМТ находится
под гормональным контролем в здоровой и опухолевой ткани, при этом эстрадиол
подавляет экспрессию КОМТ, а прогестерон и глюкокортикоиды стимулируют ее.
Следовательно, КОМТ – потенциальная мишень в лечении ЛММ, а применение
антигестагенов или антиглюкокортикоидов будет сдерживать активность КОМТ в
ЛММ и, следовательно, ее пролиферацию.
Накопление активного эстрогена в клетках миомы ведет к усилению экспрессии
рецепторов эстрадиола (РЭ) и рецепторов прогестерона (РП), гиперчувствительности
к гормонам и росту миомы. С этим согласуются и данные о более высокой
способности клеток миомы к пролиферации в течение менструального цикла по
сравнению с неизмененным миометрием.
Отдельные тканевые факторы роста, апоптоза и клеточного цикла находятся
под контролем половых гормонов. Эти факторы промотируют митогенное и
фиброгенное действия в ткани миомы. Основные миом-ассоциированные факторы
роста: трансформирующий (ТФР, TGF – transforming growth factor), основной фактор
роста фибробластов (оФРФ, bFGF – basic fibroblast growth factor), эпидермальный
(ЭФР, EGF – epidermal growth factor), тромбоцитарный ростовой фактор (ТРФ,
PDGF – platelet-derived growth factor) сосудистый эндотелиальный (СЭФР,VEGF –
20
vascular endothelial growth factor), инсулиноподобные (ИПФР, IGF – insulin-growth
factor) и пролактин [45]. Многие из этих ростовых факторов оверэкспрессированы в
ткани миомы и а) увеличивают пролиферацию утеромиоцитов, б) увеличивают
синтезы ДНК, в) стимулируют синтезы компонентов межклеточного матрикса, г)
промотируют
митогенез,
д)
усиливают
ангиогенез.
Похоже,
и
другие
миомассоциированные факторы роста будут открыты, и остается ждать, какой из них
будет признан ведущим [109].
Трансформирующий фактор роста (ТФР) регулирует рост клеток, вовлечен в
процессы воспаления, апоптоза и ремоделирования ткани, играет принципиальную
роль в формировании межклеточного матрикса. В клетках миомы нарушена
экспрессия некоторых изоформданного цитокина и повышен уровень Smads, которые
являются компонентами TФР-β-сигнального пути (рис. 2). Концентрация TФР-β и его
рецепторов в ЛММ выше, чем в аутентичном миометрии, и достигает максимума в
лютеиновую
фазу
менструального
цикла
[109].
Эстрадиол
и
прогестерон
потенцируют действие TФР-β (рис. 2).
Эпидермальный фактор роста (ЭФР) оказывает митогенный эффект на ряд
репродуктивных тканей. В культуре клеток миомы прогестерон повышает его
уровень, а эстрадиол оказывает потенцирующее действие (рис. 3). Отсутствуют
данные о флуктуациях экспрессии ЭФР и его рецепторов в тканях матки в течение
менструального цикла. Данные о количестве ЭФР в фиброиде противоречивы: от
отсутствия различий с нормальной тканью до повышенной экспрессии в фиброиде
или прилегающем миометрии. Применение в модельной системе селективного
антагониста рецептора ЭФР вызывает подавление пролиферации клеток миомы,
которое не снимается половыми гормонами. Интересны данные о повышенной
чувствительности рецепторов ЭФР в ткани фиброида по сравнению с ГНТМ [90].
21
Рисунок 2. Половые стероиды и пути проведения сигнала ТФР-β в клеткемишени (адаптировано по home.inje.ac.kr/ ∼lecture).
Рисунок 3. Половые стероиды и пути проведения сигнала ЭФР в клетке-мишени
(адаптировано www.sigmaaldrich.com/Cell_signaling/Pathway).
Инсулиноподобный
фактор
22
роста. ИПФР-1
–
структурный
аналог
проинсулина – обеспечивает пролиферацию, дифференцировку и выживаемость
клеток. Рецепторы ИПФР обладают тирозинкиназной активностью, в качестве
вторичных посредников впередаче сигнала в клетку используют адапторы – IRSI/Shc, которые через IRS/PI3K/AKT в свою очередь обеспечивают выживание клетки
и через Shc/Ras/Crb2/MAP-киназы – клеточную пролиферацию (рис. 4). Многие
авторы настаивают на ведущей роли данного ростового фактора в пролиферации
миоцитов, т. к. при его недостаточности (экспериментально) не проявляют своей
митогенной активности ни ЭФР, ни ТРФ, ни инсулин. В свою очередь для проявления
митогенного эффекта ИПФР не нужны дополнительные факторы. Экспрессия ИПФР1 в ткани миосы коррелирует с уровнем эстрадиола (промотор гена данного фактора
содержит место связывания для РЭ) и в три раза выше по сравнению с прилегающим
миометрием. Оверэкспрессия самого фактора и его рецептора обнаружена как в
гладкомышечных клетках, так и в фибробластах миомы. ИПФР и его сигнальный путь
нарушены в трети изученных фиброидов. Выявлена положительная корреляция
между
оверэкспрессией
ИПФР-1
и
размерами
миомы
[91].
Прогестерон
демонстрирует сложное действие на клетки миомы, которое в конечном итоге
оборачивается митогенным эффектом [117].
Сосудистый эндотелиальный факторроста (СЭФР). Экспрессия СЭФР-A в
миоме выше, чем в здоровом миометрии. Эффект СЭФР-A сводится к стимуляции
пролиферации и миграции эндотелиальных клеток и вазодилатации за счет
высвобождения вазоактивных субстанций – нитроксида и простациклина. Эстрадиол
и прогестерон стимулируют экспрессию мРНК СЭФР-А и СЭФР-В в культуре клеток
миомы и здорового миометрия [113]. В промоторной области гена СЭФР-А выявлен
участок, потенциально способный связывать РП (прямая стероидная регуляция
экспрессии).
23
Рисунок 4. Половые стероиды и пути проведения сигнала ИПФР в клеткемишени (миоциты, фибробласты) (адаптировано по Yu L., 2008).
Ангиогенез. Скрининг экспрессии генов (более 10,5 тыс.) в миомном узле и
аутентичном миометрии, миоцитах и эндотелии был проведен Weston G. (2003) с
акцентом на гены, продукты которых участвуют в ремоделировании сосудов [110]. В
результате идентифицированы двадцать пять генов с различиями экспрессии. Среди
них – ИПФР-2, рецептор эндотелина, фактор роста соединительной ткани (ФРСТ,
CTGF – connective tissue growth factor), богатый цистеином ангиогенный индуктор 61
(CYR61) и коллаген 4α2 (COL4A2). Фактор роста соединительной ткани и CYR61
кроме способности стимулировать ангиогенез регулируют клеточную адгезию,
миграцию и продукцию компонентов внеклеточного матрикса; участвуют в
24
процессах воспаления и репарации тканей. Кроме того, их оверэкспрессия отмечена
в злокачественных опухолях молочной железы, в тканях с бурно протекающим
фиброзом (склеродермия, келоид и фиброз легких). В итоге ткань миомы
демонстрирует антиангиогенный профиль по сравнению с прилежащим миометрием,
что может быть приемлемым объяснением сниженной плотности капиллярной сети в
узлах. И действительно, во всех исследованиях показано, что в ткани миомы
редуцирован кровоток по сравнению с прилежащим миометрием и миометрием матки
без миомы [46]. Увеличение плотности сосудов отмечается в перифиброидной
области прилежащего миометрия с большим количеством мелких сосудов,
проникающих в ткань опухоли. После менопаузы плотность капиллярной сети
миометрия увеличивается, а в фиброиде не изменяется, т. е. усугубляется разница
кровоснабжения ткани в менопаузе – естественной модели регресса миомы.
Адреномедуллин – наряду с СЭФР регулирует ангиогенез, в т. ч. в ткани миомы.
Адреномедуллин относится к суперсемейству пептидов кальцитонина. Экспрессия
адреномедуллина
тесно
связана
с
плотностью
сосудов
и
пролиферацией
эндотелиальных клеток в миометрии и фибромиоме. Aдреномедуллин участвует в
карциногенезе
и
прогрессировании
многих
опухолей
через
стимуляцию
пролиферации, ангиогенеза и ингибирование апоптоза. Прогестерон стимулирует
экспрессию адреномедуллина и его рецепторов в тканях матки (Xu Q, 2006).
Фактор некроза опухоли (ФНО,TNF – tumor necrosis factor) – секретируется не
только активированными макрофагами, но и многими типами клеток женского
репродуктивного тракта, ингибирует пролиферацию и стимулирует апоптоз многих
клеток [72]. Экспрессия ФНО в ЛММ выше, чем в окружающем миометрии с
максимальными значениями в пролиферативной фазе. Уровень ФНО в аутентичном
миометрии не изменяется в ходе полового цикла. In vitro прогестерон (3,18 × 10-7
моль/л) ингибирует экспрессию ФНО в культуре клеток миомы, эстрадиол (3,67 × 108 моль/л) не влияет на уровень ФНО. Таким образом, одним из механизмов
25
пролиферативного эффекта прогестерона на клетки миомы может быть подавление
экспрессии ФНО (Kurachi O., 2001). Факторы апоптоза. В миоме выявлена
оверэкспрессия фактора апоптоза bcl-2 по сравнению с ГНТМ. В отдельных клетках
оверэкспрессия bcl-2 может промотировать клеточную репликацию, уменьшая
потребность последних в ростовых факторах. Показано, что половые стероиды,
особенно прогестерон, стимулируют экспрессию bcl-2 в клеках миомы – промоторная
область
гена
bcl-2
содержит
участки,
содержащие
специфические
гормоночувствительные элементы и потому способна связывать РП, что в конечном
итоге ведет к активации экспрессии bcl-2 [116]. Не удивительно поэтому, что
экспрессия фактора апоптоза bcl-2 в ткани миомы и ГНТМ достигает максимальных
значений в лютеиновую фазу менструального цикла. Интересно, что эстрадиол
снижает уровень bcl-2 в указанных тканях [116]. In vitro прогестерон подавляет
апоптоз и стимулирует пролиферацию миоцитов ЛММ, тогда как антагонисты
прогестерона ингибируют пролиферацию и стимулируют апоптоз в ткани ЛММ [80].
В то же время при беременности прогестерон в миометрии поддерживает уровень
проапоптотического фермента каспазы-3, тем самым обеспечивая пролиферативный
баланс ткани [61].
Таким образом, нарушение баланса между процессами пролиферации и
апоптоза занимает одну из ключевых позиций в патобиозе миомы матки. Особого
внимания заслуживает тот факт, что в отличие от нормальной ткани в лейомиоме
нарушен контроль апоптоза половыми стероидами, что открывает возможности
поиска перспективных лекарственных препаратов, способных взять под контроль
апоптоз в ЛММ.
Регуляторы
клеточного
цикла.
Пролиферация
клеток
регулируется
механизмами контроля клеточного цикла, включающего набор циклинзависимых
киназ (CDK – cyclin-dependent kinases, серин/треонин-протеинкиназы) вкупе с их
активаторами (циклинами) и ингибиторами. Функция CDK – фосфорилирование
26
протеинов, принимающих участие в митозе, таких, например, как входящий в состав
хроматина гистон H1, ламин (компонент цитоскелета), факторы транскрипции, белки
митотического веретена и ряд ферментов. Фосфорилирование перечисленных белков
запускает процесс митоза. После завершения митоза циклин подвергается
протеолизу. Далее наступает очередь фосфатаз, которые дефосфорилируют белки,
принимавшие участие в митозе, после чего клетка возвращается в состояние
интерфазы. CDK активны только в комплексе с циклинами. Циклин непрерывно
синтезируется в интерфазе клеточного цикла до достижения максимальной
концентрации в фазе М, когда запускается весь каскад фосфорилирования белков,
катализируемый
CDK.
К
окончанию
митоза
циклин
быстро
разрушается
протеиназами. Действие циклинов и ассоциированных с ними киназ блокируется
ингибиторами циклин-зависимых киназ – CKI (cyclin dependent kinase inhibitors),
представленных двумя семействами Ink4 (р16, р15, р18 – селективные ингибиторы
CDK4/6) и Cip/Kip (р21, р27, р57 (росковитин – фармацевтический препарат) –
универсальные ингибиторы CDK) (Chen B., 2005).
Ключевой точкой влияния половых стероидов является циклин D1, вернее его
транспорт в ядро (рис. 5). Известно, что принципиальной в этом транспорте циклина
является активность гликогенсинтазы киназы-3β (GSK-3β – glycogen synthase kinase3β), стимулирующая ее вход в ядро, фосфорилируя молекулу циклина D1. Эстрадиол
прямо через PI3-киназу – АКТ – GSK-3β регулирует клеточный цикл (эпителиальные
клетки эндометрия). Кроме того, эстрадиол в раннюю G1-стадию увеличивает
активность CDK4 и CDK2, стимулирует экспрессию циклина D1, а также снижает
уровень ингибиторов CDK. Уровень циклина D1 в ткани ЛММ у пациенток во все
стадии менструального цикла достоверно выше по сравнению с окружающим
миометрием [70].
27
Рисунок 5. Схема регуляции половыми стероидами клеточного цикла слизистой
матки (Chen B., 2005; Narayanan R., 2005).
Концентрация р27 – ингибитора CDK – варьируется в клетке в зависимости от
фазы клеточного цикла. Уровень ингибиторов циклинзависимых киназ резко снижен
во многих злокачественных опухолях кожи, печени, молочной железы, простаты,
эндометрия и др. Причем существует тесная корреляция между уровнем ингибитора
(р27) и степенью агрессивности опухолевого процесса. Экспрессия р27 находится под
гормональным контролем; так, эстрадиол подавляет ее, а прогестерон стимулирует в
железистых клетках эндометрия (доступных данных по миоме нет). Несмотря на
исторически сложившееся представление о р27 как об антипролиферативном
факторе, в последнее время стали появляться сообщения о возможной комбинации
про- и антиапоптотических свойств этого протеина в зависимости от клеточного и
28
тканевого контекстов [93]. Экспрессия р27 в ткани миомы ниже, чем в окружающем
миометрии.
Но более интересными нам представляются сведения о регуляции циклинами
транскрипционной активности рецепторов стероидных гормонов. В частности,
циклин A/CDK2 выступает в роли облигатного коактиватора РП, который
взаимодействует
с
циклином
А
и
рекрутирует
циклин
A/CDK2
к
прогестинувствительным промоторам, стимулируя транскрипцию прогестеронзависимых генов. По-видимому, такое взаимодействие циклинов и РП необходимо
для трасдукции гормонального сигнала, т. к. подавление CDK2 ведет к снижению
транскрипционной активности гормонрецепторного комплекса [84]. В свою очередь
циклин D1 взаимодействует с лиганд-связывающим доменом РЭ и стимулирует его
трансактивацию, а циклин А – нет [84]. Остальные рецепторы суперсемейства также
не остаются без внимания циклинов; так, циклин Е работает как коактиватор
андрогенового рецептора, а циклин D1 ингибирует андрогенную активность.
Таким образом, взаимодействие рецепторов половых стероидов и системы
регуляции клеточного цикла является многокомпонентным и разноуровневым. Если
говорить об иерархии внутриклеточных сигналов в ткани миомы, то приходится
признать, что при объективной значимости клеточного контекста (в данном случае
речь идет о циклинах и зависимых киназах как корегуляторах транскрипции)
ключевая роль в регуляции пролиферации миоцитов принадлежит обоим стероидам.
Таким образом, контроль роста миомы изучен не полностью, но наиболее
важные его детерминанты определены – это половые стероиды, тканевые
факторы роста и стероидрегулируемые протоонкогены [50].
29
1.2. Рецепторы половых стероидов в ткани миомы матки.
Уровень РЭ (обе изоформы) в миоме значительно выше, чем в аутентичной ткани
[26]. При этом на циклические изменения половых гормонов в плазме крови больше
отвечают РЭ-α, тогда как колебание концентрации РЭ-β значительно меньше. Однако
в литературе имеются данные о том, что у польских женщин детородного возраста
уровень РЭ одинаков в миоме и ГНТМ (при этом везде доминирует РЭ-α) [74], а также
о том, что в отличие от окружающего миометрия в ткани миомы уровень РЭ остается
статичным в течение всего менструального цикла (Shozu M. и соавт., 2000).
Сравнительный анализ четырех этнических групп пациенток (афроамериканок,
азиаток, испанок и представительниц белой расы) показал, что уровень РЭ-α как в
миоме,
так
и
в
ГНТМ
повышен
у
афроамериканок
по
сравнению
с
представительницами других рас. Повышенный уровень РЭ в узле определяет более
высокую его чувствительность к эстрадиолу по сравнению с неизмененной тканью.
Содержание РП в миомных узлах также значительно выше, чем в
неповрежденном миометрии и соответствует их уровню в эндометрии [20; 94], при
этом количество РП в миоме в течение менструального цикла изменяется так же, как
и в неизмененном миометрии [63]. Наибольшее количество РП в миометрии
отмечается в середине цикла; в секреторную фазу их уровень уменьшается.
Интересны данные о том, что в субмукозных узлах уровень РП может быть выше, чем
в субсерозных [34]. Эти результаты согласуются с гипотезой, что лейомиомы имеют
различную
природу:
субсерозные
узлы
развиваются
из
периваскулярных
гладкомышечных фибробластов, а субмукозные узлы – из миометриальных клеток и
по-разному реагируют на гестагенотерапию.
Многие исследователи отмечают повышение уровня обеих изоформ РП в миоме
по сравнению с ГНТМ. При этом одни авторы обнаружили равномерное повышение,
тогда как другие указывают на преимущественный рост уровня РП-А типа над РП-В
типом в миоме [87]. Прогестероновые рецепторы не ограничиваются только
30
ядерными вариантами РП-А и РП-В, описаны свойства по меньшей мере еще двух
типов РП в клетке-мишени – мембраносвязанный и θ-тип. В доступной литературе
крайне мало данных о рецепции половых стероидов на уровне плазматических
мембран клеток миомы.
На
кафедре
молекулярной
фармакологии
и
радиобиологии
медико-
биологического факультета и кафедре акушерства и гинекологии педиатрического
факультета (зав. – академик РАМН, профессор Савельева Г.М.) РГМУ проведен
сравнительный анализ не только цитозольной, но и плазмамембранной рецепции
половых стероидов в тканях матки при миоме [21]. В результате показано, что
миоматозная ткань отличается более высоким уровнем цитозольных рецепторов
половых стероидов по сравнению с ГНТМ. При этом рецепция стероидов в
плазматических мембранах клеток миомы характеризуется снижением числа
связывающих мест для прогестерона при неизмененном связывании эстрадиола
(ВmaxE2/BmaxP4 – в 2,5 раза выше во фракции плазматических мембран миомы по
сравнению с ГНТМ). Установлено, что при ЛММ изменяется липидный матрикс
мембран клеток миометрия, активность 5’-нуклеотидазы, фосфолипазы С, уровень
цГМФ
(циклического
гуанозин-3,5-монофосфата).
При
этом
наиболее
информативным критерием развития гиперпластических процессов в миометрии
является изменение плазмамембранной рецепции прогестерона [6].
Транскрипционные эффекты прогестерона широко известны, приведем лишь
один пример: в клетках ЛММ прогестерон и синтетический гестаген R5020
стимулируют AKT-путь, обеспечивающий выживание и пролиферацию клеток [56].
Таким образом, роль прогестерона в росте ЛММ не вызывает сомнений.
Поэтому не удивительно, что антигестагены: мифепристон, азоприснил и CDB-2914
(17α-acetoxy-11β-[4-N,Ndimethylaminophenyl]-19-norpregna4,9-diene-3,20-dione),
эффективно уменьшают объем миомных узлов. Агонисты гонадолиберинов также
31
уменьшают размер узлов, однако, если одновременно с аГРГ использовать гестагены,
снижения объема ЛММ не происходит.
1.3. Роль эстрогена и прогестерона в стимуляции роста миомы матки.
Высокая
встречаемость
миомы
матки
наводит
на
мысль,
что
это
результатпроявления хромосомных оберраций и/или определенных генетических
мутаций [112]. Генетические исследования клеток миомы в 50% случаевпоказали
наличие хромосомные аберраций [67]. Их фенотипическое проявление находится под
котролем овариальных гормонов. В исследованиях in vitro неоднократно было
продемонстировано стимулирующее влияние эстрогена на рост культуры клеток
миомы. В связи с этим долгое время эстроген считался ключевым митогенным
фактором [25]. В отличии от эстрогена, прогестерон способен активировать и
подавлять рост клеток в зависиомости от улословий культивирования [80]. В
эксперименте с мышами [86] и морскими свинками [78] учеными была показана
ингибирующая активность прогестерона в отношении миоматозных узлов матки,
рост которых был спровоцирован введениемэкзогенного эстрогена. Кроме того, в
исследовании с участиемкрыс зародышевой линии лини Eker (дефект в гене
комплекса туберозного склероза 2 (TSC2)) [68] спонтанный рост миомы
стимулировали за счет эстрогена, а не прогестерона [108].
Несмотря на результатымногочисленныхэкспериментов in vitro скультурами
клеток и экспериментов с участием лабороторныхживотных свидетельствующих о
превосходстве эстрогена над прогестероном в патогенезе миомы, неуклонно растет
количество биохимических, гистологических, клинических и фармакологических
исследований доказывающих ключевую роль прогестерона и его рецепторов (PR)в
росте и развитии миомы [31]. К примеру индекс включения метки маркера клеточной
пролиферации Ki67 иядерного антигена клеточной пролиферации имеет свое
максимальное значение в лютеиную фазу менструального цикла, в которой
прогестерон является доминирующим гормоном [64]. Также в сектреторную
32
прогестерон зависимую фазу цикла, одновременно с пролиферирующей активностью
клеток миомы, наблюдалось увеличение количество мРНК эпидермального фактора
роста [52].
У
женщин
постменопаузального
возраста
на
фоне
заместительной
комбинированной гормональной терапии эстрогенои с прогестероном индекс
пролиферативной активности миоцитов миометрия повышался, при монотерапии
эстрогеном данный эффект отсутствовал [75].
Использование агонистов гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ) в комбинации
с прогестинами (медроксипрогестерона ацетата, норэтистерон ) в качестве “терапии
прикрытия”приводило к ослаблению или реверсии антипролиферативного эффекта
агонистов ГнРГ [47]. Результаты многочисленных клинических исследований
четырех
различных
клиническую
антигестегнов,
демонстрирующих
эффективность,
стали
неизменно
одними
высокую
изсамых
убедительныхсовременныхаргументов в пользумитогенного эффекта прогестерона в
этиопатогенезе миомы макти [102; 36; 39; 44].
Современные ученые для исследования этиопатогенеза миомы матки в условиях
in vitro использовали модель ксенотрансплантата - фрагмент ткани миомы человека
помещали под субренальную капсулу иммунодефицитных мышей[Ishikawa H. 2010].
Это помогло сократить количество анатомофизиологических различий между
миомой матки животных и человека [117]. С удивлением было обнаружено, что рост
ксенотрансплантатов миомы зависил от комбинации эстрадиола и прогестерона, в то
время как эстрадиолу или прогестерону по отдельностине удавалось стимулировать
рост миоматозной ткани. Таким образом, сам по себе эстрадиол не является
митогеном, он необходимо для экспрессии PR, тем самым поддерживаядействие
прогестерона на клетки миомы [59; 60].
В ответ на стимуляцию клеток ксенотрансплантата миомы эстрадиолом и
прогестероном наблюдали пролиферацию клеток опухоли и сочетанное увеличение
33
экспрессии генов Ki67, ERα, PR. Ученые предполают, что эстрадиол и прогестерон
могут напрямуюстимулировать пролиферацию, гипертрофию клеток миомы, а также
активировать в ткани накопление белков внеклеточного матрикса (коллаген типов I и
III) [59; 87].
В
случае
комбинированного
применения
эстрадиола
и
прогестерона
приисходило трехкратное увеличению объема миомы ксенотрансплантатов, по
сравнению
с
результатми
монотерапии
эстрадиолом,
прогестероном
или
негормональными препаратами [59].Таким образом, миома матки может увеличить
свой размер при помощи клеточной пролиферации, клеточной гипертрофии и
накопления белков внеклеточного матрикса. Все эти функции находятся под
контролем прогестерона с разрешающей роли эстрадиола (рис. 6).
34
Рисунок 6. Экспрессия ER и PR в ткнани миомы ксенотрансплантатов.
Взаимосвязь активации ER и PR в миоматозных узлах с процессами клеточной
пролиферации (Kim J.J., 2013).
Примечание:в исследовании использовали модель ксенотрансплантата. Лечение
миомы проводили эстрадиол (Е2) + прогестерон(Р4) в течение двух недель.
Иммунофлуоресцентное окрашивание: DAPI - синий, Ki67 -красный, ERα - верхняя
панель, PR - нижния панель.
Е2 индуцирует экспрессию PR, Р4 реализует свое действие опостредованно через PR
увеличивая размер миомы матки путем накопление внеклеточного матрикса,
пролиферацию и гипертрофию фиброзных клеток.
35
1.4. Лечение миомы матки
Миома
практически
в
половине
установленных
случаев
протекают
бессимптомно. В этой ситуации лечение не показано. Появление симптомов
сигнализирует о необходимости начала лечения. Наиболее частые симптомы –
тяжелые или болезненные менструальные кровотечения, которые могут вызывать
анемию, межменструальные кровотечения, боль и чувство тяжести внизу живота, –
все это по отдельности или в совокупности значительно ухудшает качество жизни
пациенток.
В настоящее время можно выделить три основных подхода к лечению миомы
матки:
1)Хирургические методы лечения: радикальные операции (гистерэктомия,
применяемая при миоме матки больших размеров, множественной, при сочетанной
патологии
у
женщин
с
реализованной
репродуктивной
функцией)
и
органосохраняющие операции (миомэктомия, применяемая при нереализованной
репродуктивной функции).
2)Неинвазивные методы лечения: медикаментозное лечение, направленное на
контроль роста лейомиомы и развития симптомов заболевания, и фокусированная
ультразвуковая абляция миомы матки.
3)Малоинвазивные методы лечения (эмболизация маточных сосудов, миолиз
различными источниками энергии).
Патогенетически обоснованной концепцией лечения миомы
является
комбинированное воздействие – хирургическое и медикаментозное. Поэтому,
несмотря на появление новых оперативных технологий, медикаментознаяя терапия
не утратила своей значимости. Консервативное лечение должно быть комплексным и
направлено на различные звенья патологического процесса с учетом выявленных
нарушений. Базовыми препаратами патогенетического лечения миомы являются
36
препараты с антигормональной активностью. Это вполне закономерно с учетом
ведущей роли половых стероидов в патогенезе данной нозологической формы
заболевания. Снизить эффект эндогенных гормонов на ткань-мишень можно
несколькими
способами.
гонадорелина
(агонисты
Во-первых,
и
это
антагонисты
центральная
ГнРГ)
со
блокада
снижением
секреции
продукции
гонадотропинов (лютеинизирующего гормона – ЛГ, фолликулостимулирующего
гормона – ФСГ) и угнетением функции яичников. В этом случае снижается уровень
одновременно и прогестерона, и эстрадиола; эффективно снижается объем миомных
узлов и уходит негативная симптоматика.
Второй подход – дифференцированная блокада гормональных сигналов
(эстрадиола
или
использование:
1)
прогестерона).
гестагенов
и
Антиэстрогенная
андрогенов,
стратегия
проявляющих
включает
антагонизм
к
значительному числу эстрогензависимых процессов в разных тканях; 2) собственно
антиэстрогенов и селективных модуляторов рецепторов эстрадиола (только в
комбинации с аГнРГ); 3) ингибиторов синтеза активных эстрогенов. Отсутствие
показаний к монотерапии миомы антиэстрогенами еще раз подчеркивает ведущее
значение
проведения
прогестеронового
сигнала
в
клеткемишени
для
ее
появились
доказательства
участия
пролиферации.
Исторически
значительно
позже
прогестерона в патогенезе миомы, поэтому эта область является более молодой, но
чрезвычайно активно развивающейся. Антигестагенная стратегия подразумевает
использование известных и новых антигестагенов, а также селективных модуляторов
РП
(мифепристона,
азоприснила).
Сведения
о
текущей
эффективности
медикаментозной терапии миомы опубликованы в нескольких аналитических
работах [76; 95].
Опираясь на критерии доказательной медицины, авторы суммарно пришли к
следующим выводам:
37
1. Агонисты ГнРГ наиболее широко используются в лекарственной терапии
миомы. Они действительно вызывают регресс миомы, уменьшают объемы матки,
миомы, кровотечения, но не могут использоваться длительно в силу значительной
гипоэстрогении. Есть отдельные свидетельства, что присоединенная терапия
(гестаген, тиболон, комбинация эстроген/гестаген, ралоксифен) может уменьшать
симптомы
гипоэстрогении;
но
нет
достаточного
числа
исследований,
соответствующих современным требованиям доказательной медицины. Применение
аГнРГ, по крайней мере в течение 3 месяцев перед оперативным вмешательством по
поводу ЛММ, повышает концентрацию гемоглобина и гематокрит, уменьшает
выраженность миомассоциированной симптоматики. Ограничение длительности
возможного применения препаратов предопределяет ограничение в показаниях: 1)
пациенткам в пременопаузальном возрасте (в расчете на то, что после окончания
лечения функция яичников не восстановится) и 2) для подготовки к операции.
2. Антагонисты ГнРГ не вызывают начального выброса ЛГ и ФСГ, характерного
для агонистов ГнРГ, но никаких дополнительных преимуществ перед аналогами,
похоже, не имеют.
3. Антагонисты РЭ. Представлено слабое свидетельство того, что ралоксифен
может быть полезным для пациенток позднего пременопаузального возраста (с
низким уровнем системного эстрадиола). Ралоксифен доказанно эффективно
вызывает регресс миомы только у пациенток в постменопаузальном возрасте.
Аналогично селективным эстрогенным рецепторным модуляторам ингибиторы
ароматазы доказанно эффективны только у женщин после менопаузы, при этом
препараты проявляют существенные долгосрочные побочные эффекты; опять же
опыт их использования при миоме ограничен. Актуальность медикаментозной
терапии миомы у пациенток с угасшей функцией яичников не велика, т. к. в этом
возрастном периоде подавляющее большинство миом имеют обратное разитие или
торможение процесса без дополнительных вмешательств.
38
4. Левоноргестрел в составе внутриматочной системы очевидно и значимо
сокращает ежемесячные кровопотери у женщин с миомой, но до настоящего времени
не было проведено его клинических испытаний, соответствующих принципам
доказательной медицины, у пациенток с миомой.
5. Антигестагены. После выявления роли прогестерона в патогенезе миомы
были предложены и в настоящее время с успехом используются препараты с
антигестагенной активностью: мифепристон, азоприснил, улипристал [16].
Современные научные данные о фармакодинамических свойствах этих
препаратов позволили их отнести к селективным модуляторам рецепторов
прогестерона (СМРП) [110; 91]. Из всего спектра медикаментозных средств,
применяемых для лечения миомы матки, СМРП отличаются лучшим профилем
безопасности и высокой эффективностью [5]. Эффективность лечения миомы СМРП
в среднем составляет 85-95%. В мире в подавляющем большинстве случаев в качестве
СМРП уже более 30 лет применяют мифепристон. Единственным дженериком
мифепристона в РФ разрешенным для лечения миомы матки является гинестрил
(«STADA»).
1.5. Мифепристон (RU - 486): формула, инструкция, применение
Латинское название вещества Мифепристон: Mifepristonum (род. Mifepristoni)
Химическое название: (11-бета,17бета)-11-[4-(Диметиламино)фенил]-17-гидрокси17-(1-пропинил)эстра-4,9-диен-3-он (рис. 7);
Брутто-формула: C29H35NO2;
Фармакологическая группа вещества Мифепристон: Эстрогены, гестагены; их
гомологи и антагонисты;
39
Рисунок 7. Мифепристон (RU - 486).
Нозологическая классификация (МКБ-10): D25 Лейомиома матки, O04
Медицинский аборт, O62.2 Другие виды слабости родовой деятельности, Z30.0
Общие советы и консультации по контрацепции;
Характеристика
антигестагенное
вещества
средство.
Мифепристон:
Кристаллический
синтетическое
порошок
от
стероидное
светло-желтого
с
зеленоватым оттенком до желтого с зеленоватым оттенком цвета.
Фармакокинетика. Абсолютная биодоступность — 69%. После однократного
приема внутрь в дозе 600 мг Cmax в сыворотке крови — 1,98 мг/л, Tmax — 1,3 ч.
Связывание с белками плазмы (альбумином и кислым альфа1-гликопротеином) —
98%. После фазы распределения выведение происходит сначала медленно
(концентрация уменьшается в 2 раза между 12–72 ч), затем более быстро. Т1/2 — 18
ч.
40
Применение вещества Мифепристон: медикаментозное прерывание маточной
беременности на ранних сроках (до 42 дней аменореи), подтвержденной тестом на
беременность; подготовка и индукция родов при доношенной беременности;
экстренная (посткоитальная) контрацепция в течение 72 ч после незащищенного
полового акта или если примененный способ контрацепции не может считаться
надежным (таблетки 10 мг); лечение лейомиомы матки (размером до 12 недель
беременности) (таблетки 50 мг).
Противопоказания: гиперчувствительность, надпочечниковая недостаточность
и длительное лечение глюкокортикоидами, острая или хроническая почечная и/или
печеночная недостаточность, порфирия, наличие рубца на матке, воспалительные
заболевания женских половых органов, наличие тяжелой экстрагенитальной
патологии, нарушение гемостаза (в т.ч. предшествующее лечение антикоагулянтами),
анемия. Нельзя применять курящим женщинам старше 35 лет (без предварительной
консультации терапевта).
Для прерывания беременности: подозрение на внематочную беременность;
беременность, не подтвержденная клиническими исследованиями или сроком более
42 дней после прекращения менструации, беременность, возникшая на фоне
применения
внутриматочных
контрацептивных
средств
или
после
отмены
гормональной контрацепции, миома матки.
Для подготовки и индукции родов: гестоз тяжелой степени, преэклампсия,
эклампсия, недоношенная или переношенная беременность, миома матки.
Для лечения лейомиомы матки: величина лейомиомы, превышающая 12 недель
беременности, опухоли яичников и/или гиперплазия эндометрия, субмукозное
расположение миоматозных узлов, беременность и период лактации.
Ограничения к применению: с осторожностью применять у пациенток с
бронхиальной астмой и хроническими обструктивными заболеваниями легких,
сердечно-сосудистыми заболеваниями (в т.ч. артериальная гипертензия, нарушения
41
ритма сердца, хроническая сердечная недостаточность) или предрасположенностью
к ним.
Побочные действия вещества Мифепристон: чувство дискомфорта внизу
живота, слабость, головная боль, головокружение, тошнота, рвота, диарея,
гипертермия,
высыпания
на
коже.
Связанные
с
процедурой
прерывания
беременности (дополнительно): кровотечение, боль внизу живота, воспаление матки
и придатков, обострение инфекций матки и мочевыводящих путей. На фоне
комбинированного лечения с мизопростолом (дополнительно): вагинит, диспепсия,
бессонница, астения, боль в ноге, беспокойство, анемия, снижение гемоглобина (не
более чем на 2 г/дл), обморочные состояния, бели. При экстренной контрацепции
(дополнительно):
кровянистые
выделения
из
половых
путей,
нарушения
менструального цикла. При лечении лейомиомы (дополнительно): нарушения
менструального цикла, аменорея.
Взаимодействие:
следует
избегать
применения
с
НПВС
(включая
ацетилсалициловую кислоту) вследствие возможного изменения эффективности.
Передозировка: симптомы - острая надпочечниковая недостаточность.
Способ применения и дозы: Внутрь. Для прерывания беременности: 600 мг
однократно (в присутствии врача), для усиления эффекта мифепристона назначают
также мизопростол. Пациентка должна находиться под наблюдением медицинского
персонала, по крайней мере, в течение 2 ч после применения мифепристона. Через
36–48 ч после приема мифепристона необходим УЗИ-контроль. Через 8–14 дней
необходимо клиническое обследование, повторный УЗИ-контроль, определение
уровня бета-ХГ в крови (для подтверждения того, что выкидыш произошел). При
отсутствии эффекта от препарата на 14-й день (неполный аборт, продолжающаяся
беременность) проводят вакуум-аспирацию с последующим гистологическим
исследованием аспирата. Для подготовки и индукции родов: 200 мг однократно (в
присутствии врача). Через 24 ч повторный прием 200 мг. Через 48–72 ч проводится
42
оценка состояния родовых путей и по необходимости назначаются простагландин
или окситоцин. С контрацептивной целью: в течение 72 ч после незащищенного
полового акта, по 1 табл. (10 мг) в любую фазу менструального цикла. Для сохранения
контрацептивного эффекта следует воздержаться от приема пищи за 2 ч до
применения препарата и 2 ч после него. Лечение лейомиомы матки: 50 мг однократно;
курс лечения — 3 мес.
Меры предосторожности вещества Мифепристон: применение препарата для
прерывания беременности и для подготовки родов возможно только в условиях
стационара,
в
учреждениях,
которые
имеют
высококвалифицированные,
сертифицированные подготовленные врачебные кадры и необходимое оборудование,
в т.ч. реанимационное. Возникновение обильного маточного кровотечения может
потребовать немедленного хирургического вмешательства (кюретаж). Необходима
осторожность при приеме синтетических ПГ. Следует информировать пациентку, что
в случае неэффективности терапии мифепристоном необходимо будет прервать
беременность оперативным путем (возможно возникновение врожденных пороков
развития вследствие влияния препарата на плод). Применение препарата требует
проведения общих мероприятий, сопутствующих аборту, в т.ч. предупреждения
резус-аллоиммунизации.
Грудное вскармливание следует прекратить на 14 дней после применения
препарата.
Пациенткам с искусственными сердечными клапанами или инфекционным
эндокардитом при применении мифепристона следует проводить профилактическое
лечение антибиотиками. Мифепристон (таблетки 10 мг) не рекомендуется для
регулярного применения в качестве плановой постоянной контрацепции; не
защищает от заболеваний, передаваемых половым путем, и СПИДа (Справочник
лекарств РЛС).
43
1.6 Механизм антипролиферативного действия мифепристона.
В зависимости от клеточного и тканевого контекста мифепристон оказывает
агонистическое или антагонистическое прогестерону действие, поэтому он вместе с
азоприснилом и улипристалом входит в группу так называемых селективных
модуляторов рецепторов прогестерона.
Свое действие в тканях мишенях мифепристон реализует через рецепторы
прогестерона, принадлежащие к семейству ядерных рецепторов. Изоформы ядерных
рецепторов
прогестерона
представляют
собой
лиганд
–
активируемые
транскрипционные факторы и имеют схожие структуры [75; 48]. Рецепторы
прогестерона
сущесвуют
в
двух
различных
изоформах
–
PR-A,
PR-B
экспрессирующиеся одним геном (рис. 8), каждая из изоформ имее свой сайта
инициации транскрипции [61; 75].
Структурное отличие PR-B от PR-A заключается вналичии N - терминального
фрагмента 164 аминокислот. В результатеструктурных особенностей PR-B содержит
три активационных домена транскрипции (AF-1 AF-2 и AF-3) в то время как PR-A
имеет только два (AF-1 and AF-2). Обе изоформы PR активируются одним лигандом
и обладают схожей ДНК – связывающей активностью. В зависимости от локализации
рецепторов клеток промотеров целевых генов, изоформы PR проявляют различные
функции. В целом PR-B является более сильным транскрипционным активаторомчем
PR-A.
В определенных условия PR-A, как фактор транскрипции,может становится
неактивным ифункционирует как лиганд-зависимый транс-доминантный репрессор
других рецепторов стероидных гормонов включая PR-B, рецепторы эстрогена,
андрогенов, минералокортикоидов и глюкокортикоидов. В режиме репроссора PR-A
работает в ответ на связывание с агонистамиили антагонистами прогестерона [103;
105; 75].
44
Рисунок 8. Первичная структура двух изоформ рецептора прогестерона (PR) hPRA и hPRB (N. Chabbert-Buffet, 2004).
Примечание к рисунку: AF - высоковариабельный домен с функцией активации
транскрипции-1, ID – ингибирующий домен, LBD - лиганд-связывающий домен, DBD
– ДНК - связывающий домен, ATG - кодон инициации транскрипции.
Связывание прогестерона внутри клетки-мишени со своим рецептором (рис. 9)
приводит к конформационным изменениям лиганд-рецепторного комплекса,
сопровождающиеся диссоциацией белков теплового шока (HSP), димеризацией
рецептора, связыванием с ДНК в промоторной области прогестерон-зависимых генов.
Ученые считают, что взаимодействие агонист – PR активирует транскрипцию генов
непосредственно влияя на сам транскрипционный аппарат, либо через присоединение
наборовкоактиваторов (например коактиваторы стероидных рецепторов и CBP ) [106;
78; 100]. Коактиваторы направленны на повышение эффективностивзаимодействия с
аппаратом транскрипции RNA POL2 (РНК полимераза) и увеличение скорости
синтеза белка.
45
Рисунок 9. Активация рецептора прогестерона лигандом
(N. Chabbert-Buffet, 2004).
Примечание к рисунку: PR- рецептор прогестерона, PRE – HSP - белки теплового
шока, RNA POL2 - РНК-полимераза 2, SPRMs –СМРП.
46
В случае связывания PR с антагонистом в клетке - мишени, активированный
рецепторный комплекс взаимодействует с корепрессорами NcoR и SMRT.
Корепрессоры, как и коактиваторы, функцианируют в составе большого белкового
комплекса, обладают ферментативной активностью, включая гистондеацетилазную
активность.
Деацетилазы
гистонов,
изменяя
конформацию
хроматина,
играютважную роль в регуляции экспрессии генов.Взаимодействие корепрессоров с
лиганд-рецепторным комплексом - антагонист – PR приведет к отмене активации
транскрипции. Ученые предполагают, что в клетке для регуляции внутренних
биохимических
процессов
существует
баланс
между
коактиваторами
и
корепрессорами. Комплекс антагонист – PR способен смещать равновесие в сторону
корепрессоров [100].
Из литературных данных следует, что главные факторы, определяющие
агонистическую/антагонистическую
активность
СМРП
в
клетке
связаны
с
посттрансляционными изменениями белков PR и коррегуляторов [54; 100], а также
внутриклеточным взаимодействием коактиваторов/корепрессоров [78].
Предполагают,
что
антиролиферативный
эффект
СМРП
опостредован
ингибированием транскрипции гена рецептора эстрогена через PR-A [81]. Кроме
того, литературные данные свидетельствуют, что под действием СМРП происходит
атрофия спиральных артерий и снижение кровоснабжение эндометрия [118; 35],
блокада прогестерон-зависимых факторов роста, ингибирование ангиогенеза [49],
активация апоптоза через влияния на серкрецию факторов роста (например NKkB)
[99; 51], блокада клеточного цикла [53].
Установлено, что антипролиферативное действие СМРП в отношении
эндометрия ассоциировано с увеличением количества ER и PR в ткани эндометрия
[84]. Механизм действия реализуется через антагонизм с прогестероном [98; 28].
Успешное применение СМРП в терапии миомы матки объясняется способностью
этих соединений восстанавливать физиологический баланс между эстрогенными и
гестагенными сигналами, контролирующими деление клеток в ткани миомы (рис. 10).
47
Как известно, эстрадиол осуществляет разрешающее, а прогестерон – собственно
пролиферативное действие на клетки миомы. При этом, гормоны действуют в
неразрывном тандеме. В случае преобладания эстрогенных сигналов в ткани
(доминируют рецепторы эстрадиола) принято говорить об эстроген-зависимости
патологического процесса, и наоборот – преобладание гестагенных сигнальных путей
в ткани, является признаком гестагенной зависимости опухолевого роста. Уникальная
способность СМРП приспосабливаться к конкретной транскрипционной ситуации в
ткани позволяет этим препаратам оказывать антипролиферативное действие в ткани
миомы при любом варианте ее гормональной зависимости. В случае прогестеронзависимой миомы – мифепристон работает в ткани как антигестаген, в случае
эстрогенной зависимости патологического процесса – препарат проявляет свойства
гестагена, реализуя косвенное антиэстрогенное действие (рис. 10).
Рисунок
10.
Механизм
антипролиферативного
(мифепристона) на миому матки.
действия
гинестрила
48
1.7 Заключение
Вопрос об этиологии миомы матки, несмотря на длительную историю изучения,
до сих пор остается открытым. Исследования молекулярных механизмов заболевания
является актуальной задачей для мирового научного сообщества. В настоящее время
определены ключевые детерминанты этиопатогенезе миомы матки – это половые
стероиды, тканевые факторы роста и стероидрегулируемые протоонкогены.
Для лечения миомы матки существует несколько фармакологических групп
препарат, обладающих различной эффективностью и безопаностью. В настоящее
время лучшим профилем безопасности и высокой эффективностью обладают
мифепристон,
азоприснил,
улипристал.
Современные
научные
данные
о
фармакодинамических свойствах этих препаратов позволяют их отнести к
селективным модуляторам рецепторов прогестерона. В мире в подавляющем
большинстве случаев в качестве СМРП уже более 30 лет применяют мифепристон.
Эффективность лечения мифепристоном женщин с миомй матки в среднем
составляет 85-95%. Таким образом около 15% пациенток нечувствительны к
проводимой терапии. Персонализированный подход в назначении СМРП у пациенток
с миомой является резервом повышения его эффективности. В последнее время для
мониторинга лечения гормонозависимых заболеваний репродуктивной системы
женщины с успехом используют МНФК.
Значение иммунной системы в процессах саногенеза, и влияние прогестерона и
СМРП на функциональную активность МНФК, свидетельствуют о том, что
эндокринный и иммунный контроли пролиферации гормон-зависимых тканей
женщины тесно переплетены. МНФК экспрессируют практически все рецепторы
половых стероидных и являются клетками-мишенями для мифепристона. Однако, в
доступной
литературе отсутствуют
рецепторный
профиль
сведения
иммунокомпетентных
о
влиянии
клеток
мифепристона
периферической
на
крови
пациенток с миомой матки. Следовательно, необходимо продолжить изучение
49
рецепторного профиля мононуклеарных клеток периферической крови пациенток с
миомой матки для изучения роли рецепторов половых стероидов в этиопатогенезе
заболевания для решения фундаментальных и прикладных задач.
50
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы для исследования
2.1.1. Используемые реактивы
1. Физиологический
раствор,
0,9%
раствор
натрия
хлорида
(«Биосинтез», Россия);
2. Раствор фиколла, ρ=1,077 г/см3 («ПанЭко», Россия);
3. Реактивы
набора
"Рибо-преп"
(ФБУН
Центральный
НИИ
(ФБУН
Центральный
НИИ
эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия);
4. Реактивы
набора
"Реверта-L"
эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия);
5. Реактивы "Реакционная смесь 2,5х для проведения ПЦР-РВ в
присутствии SYBRGreenI" («Синтол», Россия);
6. Праймеры для полимеразной цепной реакции («Синтол», Россия);
7. Среда DMEM с глутамином и гентамицином («ПанЭко», Россия);
2.1.2. Используемое оборудование
1. Центрифуга РС-6 («ТНК Дастан», Киргизская Республика);
2. Центрифужные пробирки из полистирола на 10 мл («F.L.
Medical», Италия);
3. Камера Горяева;
4. Пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф стерильные на
1,5 и 0,2 мл;
5. Автоматические дозаторы Thermo на 1000, 200 и 10 мкл
(«Ленпипет», Россия);
6. Насадки для микропипеток на 1000, 200 и 10 мкл с/без
аэрозольного барьера;
7. Вортекс MicrospinFV-2400 («BioSan», Латвия);
8. Микроцентрифуга Eppendorfminispin («Eppendorf», Германия);
51
9. Термостат Гном («ДНК-Технология», Россия);
10. Амплификатор iCycleriQ5 real-timePCR («BioRad», Германия);
11. Ламинарный бокс («LS», Россия);
2.1.3. Объекты исследования
В обследование были включены 50 пациентокв возрасте от 33 до 45 лет с миомой
матки, соответствующей по величине от 6-недельной до 12-недельной беременности
с интерстициальной и интерстициально-субсерозной локализацией миоматозных
узлов.
Материалом
мононуклеарные
для
клетки
молекулярно-генетических
периферической
крови
исследований
пациенток.
Состав
служили
МНФК
периферической крови находился в пределах референсных значений (Т-лимфоциты
57,0 ± 3,5%; В-лимфоциты 4,7 ± 1,02%; моноциты 6,1 ± 0,8%).
Критериями исключения служили: субмукозное расположение миоматозного
узла, миома матки размером более 12 недель беременности, мено- и метроррагии,
вызывающие анемию (гемоглобин < 90 г/л), быстрый рост миомы (увеличение
размеров на 4 недели и более за 1 год), нарушение функции тазовых органов, уровень
гемоглобина < 90 г/л, беременность, лактация, тяжелые экстрагенитальные
заболевания, опухоли яичников, гиперпластические процессы эндометрия, любые
другие новообразования, помимо миомы матки, длительная кортикостероидная
терапия, прием препаратов женских половых гормонов в течение последних 30 дней,
индивидуальная
непереносимость
препарата
или
случаи
тяжелой
гиперчувствительности к лекарственным препаратам в анамнезе, надпочечниковая
недостаточность, порфирия, нарушение гемостаза (в т.ч. после предшествующего
лечения антикоагулянтами), почечная или печеночная недостаточность (как острая,
так и хроническая), участие в клиническом исследовании или прием любого
исследуемого препарата в течение последних 30 дней, любые иные заболевания или
состояния, серьезные отклонения лабораторных показателей от нормы, которые, по
мнению
врача-исследователя,
могут
искажать
результаты
исследования
и
52
ограничивать участие пациентки в исследовании.
Пациентки проходили обследование и терапевтическое лечение на базе
Московского областного научно-исследовательского института акушерства и
гинекологии (директор ГБУЗ МО МОНИИАГ Академик РАН, д.м.н., профессор
Краснопольский В. И.) и Национального медико-хирургического Центра имени Н.И.
Пирогова (презедент центра академик РАМН, профессор Шевченко Ю. Л.). Все
пациентки подписывали информированное согласие на участие в клиниколабораторном исследовании.
Пациенток, включенных в клиническое исследование, в зависимости от успеха
терапии мифепристоном и проявления железистой дилатации эндометрия разделили
на группы. Характеристика групп представлена в таблицах 1, 2.
Таблица 1.
Клинические и антропометрические характеристики пациенток в зависимости
от эффекта терапии мифепристоном миомы матки (Mean± SE).
I
Параметры
Количество пациенток
II
Положительный
Отсутствие
эффект от
эффекта от
терапии
терапии
р
43
7
Козраст пациенток
42 ± 0,7
45 ± 1,5
0,5
ИМТ пациенток
25 ± 0,7
25 ± 1,5
0,4
0
0
NA
Патология сердечнососудистой системы
0,0001*
53
продолжение таблицы 1.
Патология
щитовидной железы
1
0
1,0
0
0
NA
0
0
NA
Патология
мочевыделительной
системы
Пндивидуальная
непереносимость
препарата
Примечание: группа I - положительный эффект от терапии, группа II отсутствие эффекта, для проверки однородности групп I и II использовали
критерий хи-квадрат (р<0,05).
Таблица 2.
Клинические и антропометрические характеристики групп пациенток с
наличием железистой дилатации эндометрия и без таковой (Mean± SE).
I
Параметры
Пациентки без
ЖДЭ
II
Пациентки с ЖДЭ
р
Количество пациенток
39
11
0,0001*
Возраст пациенток
43±4,7
42±3,4
0,1
ИМТ пациенток
25±4,1
25±4,0
0,3
1
0
1,0
Экстрагенитальные
заболевания
54
продолжение таблицы 2.
Патология сердечнососудистой системы
Патология щитовидной
железы
0
0
NA
1
0
1,0
Патология
мочевыделительной
0
0
NA
0
0
NA
системы
Индивидуальная
непереносимость
препарата
Примечание:
ЖДЭ
–
железистая
дилатация
эндометрия,
для
проверки
однородности групп I и II использовали критерий хи-квадрат (р<0,05)
В процессе рутинного обследования, наряду с бимануальным исследованием,
использовали
ультразвуковое
сканирование
(трансабдоминальное
и
трансвагинальное), позволяющее оценить исходные размеры матки, величину,
расположение и структуру миоматозных узлов. С целью исключения патологии
эндометрия в ряде клинических наблюдений до лечения производили гистероскопию,
лечебно-диагностическое вы-скабливание матки, с последующим гистологическим
исследованием полученного материала. После проведенного курса лечения
мифепристоном изучали особенности восстановления менструального цикла, его
характер, оценивали общее состояние, динамику клинических симптомов, размеров
матки и миоматозных узлов. Мифепристон пациентки принимали внутрь начиная с
1-2-годня менструального цикла ежедневно, непрерывно в дозе 50 мг. Курс приема
препарата 3 месяца.У пациенток забирали кровь из локтевой вены,до и после курса
лечения мифепристоном.
55
2.1.4. Дизайн исследования.
Исследование влияния мифепристона на экспрессию генов рецепторов
стероидных гормонов в мононуклеарных клетках крови пациенток с миомой матки
проводили согласно схеме 1.
Схема 1. Последовательность экспериментов по оценки влияния мифепристона
на экспрессию генов рецепторов стероидных гормонов в мононуклеарных
клетках крови пациенток с миомой матки.
Пациентки с миомой
матки
до
терапии
мифепристоном (N=50)
Мифепристон (50 мг,
внутрь, 3 месяца)
Пациентки
матки
с
после
миомой
терапии
мифепристоном (N=50)
Периферическая кровь
Периферическая кровь
МНФК
МНФК
Экспрессия генов
Экспрессия
рецепторов (RT-PCR)
рецепторов (RT-PCR)
генов
Анализ полученных мРНК/показателей эффективности и безопасности
терапии
Алгоритм
56
2.2. Методы исследования
2.2.1. Выделение мононуклеарной фракции клеток из периферической
крови
Получение мононуклеаров из периферической крови осуществляли методом
центрифугирования в градиенте плотности фиколла(«ПанЭко», Россия) по Boyum
[29]. Кровь с гепарином (10 и 1 мл, соответственно) разводили физиологическим
раствором в объемном соотношении 1 : 1. Разведенную кровь по 5 мл наслаивали на
3 мл раствора фиколла комнатной температуры (ρ=1,077 г/см3) в полистирольной
центрифужной пробирке на 10 мл и центрифугировали 45 мин при 2000 об/мин и 40С
на приборе РС-6 («ТНК Дастан», Киргизия). Затем автоматическим дозатором
отбирали фракцию мононуклеарных клеток, находящуюся на границе плотности
(рис. 11), переносили ее в чистую центрифужную пробирку и доводили объем
физиологическим раствором до 10 мл.
Рисунок 11. Схема выделения МНФК из гепаринизированной венозной крови.
57
Далее полученную взвесь центрифугировали 15 мин при 1600 об/мин и 40С (РС6), сливали супернатант и доводили объем физиологическим раствором до 10 мл,
снова центрифугировали 15 мин при 1600 об/мин и 40С и сливали надосадочную
жидкость. Оставшийся осадок (МНФК) использовали для анализа. Подсчет и анализ
жизнеспособности клеток производили в камере Горяева под микроскопом Биолам
П2-1(«ЛОМО», Россия) в среде DMEM («ПанЭко», Россия) с помощью красителя
трипанового синего («ПанЭко», Россия).
2.2.2. Выделение мРНК из клинического материала
Выделение РНК из клеток МНФК периферической крови проводили методом
преципитации с помощью набора готовых реагентов "Рибо-преп"(ФБУН Центральный
НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции производителя.
2.2.3. Реакция обратной транскрипции для получения кДНК
Получение
кДНК
на
матрице
мРНК
осуществляли
реакцией
обратной
транскрипции с использованием комплекта готовых реагентов "Реверта-L" (ФБУН
Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции
производителя.
2.2.4. Полимеразная цепная реакция в реальном времени для определения
уровня экспрессии генов
Для реакции использовали набор реактивов для ПЦР "Реакционная смесь 2,5х для
проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBRGreenI" («Синтол», Россия) на приборе
iCycleriQ5 real-timePCR («BioRad», Германия). В качестве контрольного гена
использовали ген GAPDH.
Для постановки 12 реакций с праймерами для одного гена в 1,5 мл
микроцентрифужные пробирки добавляли 117 мкл H2Oдд, 117 мкл MIX-смеси, 13 мкл
MgCl2, перемешивали и отбирали 19 мкл полученной смеси в 200 мкл микропробирки
для первого контроля. Затем в полученную смесь вносили по 24 мкл прямого и
58
обратного праймеров (up и low), перемешивали и отбирали 23 мкл полученной смеси в
200 мкл микропробирки для второго контроля. Последовательности нуклеотидов в
используемых праймерах представлены в таблице 3 («Синтол», Россия).
Рисунок 12. Схема полимеразной цепная реакция с обратной транскриптазой.
Примечание: RNA – РНК, primers – праймеры, reverse transcriptase – обратная
транскриптаза, DNA polymerase – ДНК-полимераза, buffer reagents – буферные
реагенты, cDNA – кДНК, reverse transcription – обратная транскрипция.
59
Таблица 3.
Последовательность
экспрессии
генов
синтетических
олигонуклеотидов
стероидных
рецепторов
для
исследования
методом
RT-PCR
[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/].
Наименование
5'-3' последовательность (up/low)
mER
AGGGACAAGCTGAGGCTGTA /
GTCTACACGGCACTGCTGAA
PR-A
GGTCTACCCGCCCTATCTCA /
GGCTTGGCTTTCATTTGGAA
AR
GCCTTGCTCTCTAGCCTCAA /
TGAATGACAGCCATCTGGTC
GR
CAATCAAGTGCAAACCTGCTGT/
TTTCCTCTGAGTTACACAGGE
GAPDH
GAAGGTGAAGGTCGGAGT /
GAAGATGGTGATGGGATTTCC
Примечание: mER – мембранный рецептор эстрадиола, PR-A - рецептор прогестерона
типа А, GR - рецептор глюкокортикоидов, AR – рецептор андрогенов, GAPDH - ген
сравнения.
После приготовления готовой реакционной смеси ее вносили по 23 мкл в 200 мкл
микропробирки, добавляли по 2 мкл кДНК, тщательно перемешивали и ставили в
прибор iCycler iQ5 real-time PCR («BioRad», Германия). Затем запускали программу
амплификации и плавления (рис. 12).
60
1. Программа амплификации:
а) 1 цикл: 10:00 мин – 950С;
б) 2-40 циклы: 00:15 мин – 950С, 01:00 мин – 600С.
В результате эксперимента получали кривые амплификации которые позволяли
определить численные значения уровней экспрессии изучаемых генов (рис. 13).
Рисунок 13. Пример графиков накопления продуктов амплификации для реакций
с одинаковым начальным количеством матричной ДНК.
Примечание: Ось ординат – интенсивность флуоресценции (у.е.), ось абсцисс –
количество циклов ПЦР.
61
2. Программа плавления (рис. 14):
a) 1 цикл: 01:00 мин – 950C;
б) 2 цикл: 01:00 мин – 550С; в) 3-84 цикл: 00:10 мин – 550С
Рисунок 14. Кривые плавления ампликонов после проведения RT-PCR с
праймерами BTUB9 x BTUB2. (Мустафина Г.Р., 2010).
Примечание: Ось ординат – интенсивность флуоресценции (у.е.), ось абсцисс –
температура плавления (°С)
Для оценки числа копий мРНК применяли ΔСt-метод по формуле 1/2-∆Ct (для
выявления различий) и 2-∆∆Ct (для определения кратности разницы), где Ct –
пороговый цикл (threshold cycle), соответствующий числу циклов амплификации,
необходимых для достижения порогового значения флуоресценции, ∆Сt – разница
62
между пороговым циклом исследуемого гена и геном сравнения (GAPDH), ∆∆Сt –
сравнение значений ΔCt контрольного и опытного образцов [96].
2.2.5. Статистическая обработка результатов
Все
данные
исследования
обрабатывали
с
использованием
программ
MicrosoftOfficeExcel, GraphPad Prism. Результаты представили в виде среднего
значения (М), медианы (Me) и стандартной ошибки (SE).
Для проверки гипотезы о принадлежности наблюдаемой выборки нормальному
закону распределения использовали критерий Колмогорова-Смирнова. Проверку
однородности исследуемых групп осуществляли при помощи критерия хи-квадрат,
оценку достоверности различий между исследуемыми признаками проводили с
использованием непараметрических методов статистики с использованием W –
критерия Вилкоксона,U – критерия Манна-Уитни. При проведении корреляционного
анализа связи между параметрами внутри одной выборки использовали коэффициент
ранговой корреляции Спирмена. Для выявления характеристик потенциального маркера
использовали ROC-анализ. Разница между значениями сравниваемых показателей
считалась вероятной при р≤0,05.
63
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Оценка клинической эффективности применения мифепристона для
терапии миомы матки у пациенток репродуктивного возраста.
В качестве основного параметра эффективности терапии использовали
уменьшение объема опухоли от первоначальных значений в процентах. Показано, что
эффективность терапии мифепристоном в дозе 50 мг ежедневно, внутрь в течение 3
месяцев у пациенток в возрасте от 33 до 45 лет с миомой матки соответствующей по
величине 6-12 недельной беременности с интерстициальной или интерстициальносубсерозной локализацией миоматозных узловсоставила 86% (43/50). Не получено
положительного эффекта от лечения у 14% (7/50) пациенток, из них у одной (2%)
объем миоматозных узлов не изменился, у 12% (6/45) объем миоматозных узлов
увеличился.
Таким образом, мифепристон вызывает существенный регресс опухоли, что
совпадает с данными отечественных и международных клинических исследований
[18; 24; 41; 42; 70].
Эффективность лечения пациенток с миомой матки также оценивают при
помощи допплеровского исследования сосудов МУ. Допплерография дает важную
дополнительную информацию о васкуляризации миоматозных узлов. Позволяет
оценивать особенности локализации сосудов, состояние артерий, снабжающих
миоматозные узлы кровью, резистентность маточных артерий, и внутриопухолевых
сосудов.
В литературе встречаются данные о корреляционной связи между визуализацией
внутриопухолевых сосудов, особенностью гистологического строения МУ, степенью
их пролиферации и возможностью прогноза интенсивности роста опухоли [15; 12;
13].
Нами
было
изучено
влияние
64
мифепристона
на
показатели
индекса
резистентности кровоснабжения миоматозных узлов (ИР) пациенток с миомой матки.
Для этого женщинам до начала лечения и после на базе Московского областного НИИ
акушерства и гинекологии и Национального медико-хирургического Центра имени
Н.И. Пирогова проводили допплерографию с определением показателей ИР.
Полученные результаты представлены на диаг. 1.
Диаграмма 1. Индекс резистентности кровоснабжения миоматозных узлов (ИР)
до и после лечения мифепристоном.
До лечения мифепристоном
После лечения мифепристоном
Р=0,2
ИР
Примечание: ИР – индекс резистентности кровоснабжения миоматозных узлов, для
проверки различий между двумя выборками парных измерений использовали
критерий Вилкоксона.
65
Из диаграммы видно, что после терапии мифепристоном у пациенток
наблюдается тенденция к увеличения индекса резистентности кровоснабжения
миоматозных узлов. В литературе встречаеются данные, что увиеличение ИР
свидетельсвуют о замедлении пролиферативных процессов в узлах миомы матки [13].
Достоверное снижение индекса периферического сопротивления у женщин с миомой
матки свидетельствует о большей интенсивности кровотока в МУ, которое может
быть обусловлено действием эстрогенов, гестагенов и их рецепторов в миоматозных
узлах.
Впервые о применении допплерографии для оценки кровотока в маточных
артериях у 8 пациенток с миомой матки на фоне терапии аГнРГ сообщили W. Matta и
соавт. После 4 мес приема аГнРГ они отметили значительное увеличение сосудистой
резистентности матки. В качестве критерия был использован индекс резистентности
кровотока маточных артерий и крупных артерий миоматозных узлов. В маточных
артериях до лечения он составлял в среднем 0,52, в крупных артериях МУ — 0,48, а
после лечения увеличился соответственно до 0,92 и 0,91. Авторы пришли к
заключению, что достоверное уменьшение объема матки на фоне терапии аГнРГ
обусловлено снижением ее васкуляризации. S. Creighton и соавт., применяя для
лечения миомы матки гозерелин, отметили наряду с достоверным уменьшением
размеров органа и миоматозных узлов повышение пульсационного индекса как в
маточных артериях (с 1,5 до 1,8), так и в сосудах узлов (с 0,9 до 1,6). F. Аlееm и М.
Predanic объясняют значительное увеличение численных значений индексов
сосудистого сопротивления в артериях миоматозных узлов после 1 мес приема аГнРГ
тем, что высокий уровень кровотока в узлах определяется большим количеством
эстрогенных рецепторов, которое довольно быстро уменьшается при приеме аГнРГ.
С этим, по-видимому, связана более медленная редукция кровотока в маточных
артериях. В настоящее время допплерография при миоме матки носит больше
исследовательский характер, нежели практический. Однако этот метод открывает
широкие перспективы в дифференциальной диагностике и лечении миомы матки.
66
3.2 Влияние мифепристона на биохимические показатели крови пациенток
с миомой матки.
3.2.1 Влияние мифепристона на уровень половых стероидов в плазме крови
пациенток с миомой матки.
Для оценки влияния мифепристона на уровень гормонов в системном кровотоке
пациенток с миомой матки было проведено исследование гормонального статуса
женщин до начала лечения и после. На 19-21 день менструального цикла на этапе
первичного осмотра у пациенток осуществляли забор венозной крови для
определения уровня ФСГ, ЛГ, эстрадиола, прогестерона и свободного тестостерона.
Лабораторное исследование гормонов крови проводилось согласно утвержденной
методике лабораторий клинических центров (ГБУЗ МО МОНИИАГ и Национального
медико-хирургического Центра имени Н.И. Пирогова). Полученные результаты
отображены на диаграммах 2, 3.
Из представленных на диаграммах данных видно, что на фоне терапии
мифепристоном пациенток с миомой матки происходит достоверное снижение
концентрации прогестерона в плазме крови в 3,6 раз (р=0,003) по сравнению с
аналогичным параметром до начала лечения. В то время как средний уровень ФСГ,
ЛГ, эстрадиола и свободного тестостерона практически не изменяется.
Для изучения взаимосвязи между снижением концентрации прогестерона в
плазме крови пациенток под действием мифепристона и эфффективностью
антигормональной терапии был проведен анализ сопряжённости исследуемых
параметров при помощи критерия Хи-квадрат. Статистическая обработка данных
показала, что в нашем исследовании снижение концентрации прогестерона в плазме
крови пациенток не связано с эффективностью лечения мифепристоном (Хи-квадрат
= 0,19; р = 0,7).
67
Диаграмма 2. Влияние мифепристона на уровень половых стероидов в плазме
крови пациенток с миомой матки (Mе*10, мМЕ/мл).
До лечения мифепристоном
После лечения мифепристоном
Mе*10, мМЕ/мл
P=0,2
P=0,6
ФСГ
ЛГ
Примечание: для проверки различий между двумя выборками парных измерений
использовали критерий Вилкоксона.
Диаграмма 3. Влияние мифепристона на уровень половых стероидов в плазме
крови пациенток с миомой матки (Mе*10, пг/мл).
До лечения мифепристоном
После лечения мифепристоном
Mе*10, пг/мл
P=0.9
P=0.8
P=0.003
*
Эстрадиол
Прогестрон
Свободный тестостерон
Примечание: * - достоверные различия с аналогичным параметром до лечения
(Вилкоксон).
68
3.2.2 Влияние мифепристона на уровень печеночных ферментов, креатинина и
билирубина в плазме крови пациенток с миомой матки.
Количественная оценка уровня печеночных ферментов, креатинина, билирубина
в крови пациенток до начала лечения и после позволила изучить влияние
мифепристона на системы органов женщин и исследовать профиль безопасности
данного препарата. Результаты исследования представлены на диаграммах 4, 5.
Из диаграмм видно, что значения АСТ, АЛТ, креатинина и щелочной фосфатазы
до и после курса лечения мифепристоном практически не изменюется, в отличие от
уровня билирубина, который увеличивается в 1,3 (p=0,01) по сравнению с
аналогичным показателем до начала лечения. Однако, все показатели билирубина в
плазме крови пациенток находились в пределах референсных значений, что
свидетельствует в пользу безопасности применения этого препарата.
Диаграмма 4. Влияние мифепристона на уровень АСТ, АЛТ и щелочной
фосфатазы в плазме крови пациенток с миомой матки (Mеan, ЕД/л)
До лечения мифепристоном
После лечения мифепристоном
Р=0,6
Р=0,
Mean, ЕД/Л
Р=0,02
АСТ
АЛТ
Щелочная фосфатаза
Примечание: для проверки различий между двумя выборками парных измерений
использовали критерий Вилкоксона.
69
Диаграмма 5. Влияние мифепристона на уровень креатинина и билирубина в
плазме крови пациенток с миомой матки (Mеan, мкмоль/л).
До лечения мифепристоном
После лечения мифепристоном
Р=0,97
мкмоль/Л
*
Креатинин
Р=0,01
Билирубин
Примечание: * - достоверные различия с аналогичным параметром до лечения
(Вилкоксон).
3.2.3 Влияние мифепристона на систему гемокоагуляции пациенток с миомой
матки.
Оценка показателей концентрации фибриногена, протромбинового индекса и
активированного частичного тромбопластинового времи (АЧТВ) у женщин до начала
лечения и после позволила изучить влияние мифепристона на ситстему
гемокоагуляции пациенток. Результаты исследования представлены на диаграммах 6,
7, 8.
Из
диаграмм
видно,
что
70
значения
концентраций
фибриногена
и
протромбинового индекса в точке «после лечения мифепристоном» достоверно не
изменились. Величина АЧТВ у пациенток с миомой матки уменьшилась на несколько
значений по сравнению с аналогичным параметром до начала лечения. Показатели
АЧТВ у всех пациенток находились в пределах референсных значений, что
свидетельствует в пользу безопасности применения мифепристона.
Диаграмма 6. Влияние мифепристона на концентрацию фибриногена в крови
пациенток с миомой матки (Mеan, г/л).
До лечения мифепристоном
После лечения мифепристоном
г/л
Р=0,6
Концентрация фибриногена
Примечание: для проверки различий между двумя выборками парных измерений
использовали критерий Вилкоксона.
71
Диаграмма 7. Влияние мифепристона на протромбиновый индекс пациенток с
миомой матки (Mеan,%).
До лечения мифепристоном
После лечения мифепристоном
% Р=0,44
протромбиновый индекс Диаграмма
8.
Влияние
мифепристона
на
активированное
тромбопластиновое время (Mеan, сек).
До лечения мифепристоном
После лечения мифепристоном
Р=0,04
сек
*
АЧТВ
частичное
72
3.3 Влияние мифепристона на экспрессию генов рецепторов эстрогенов,
гестагенов, глюкокортикоидов и андрогенов в клетках мононуклеарной
фракции периферической крови пациенток с миомой матки.
Результаты исследования влияния мифепристона на экспрессию генов
рецепторов
эстрогенов
(mER),
прогестерона
(PR-A),
андрогенов
(AR)
и
глюкокортикоидов (GR) в клетках МНФ крови пациенток с миомой матки до лечения
и после терапии препаратом представлены на диаграмме (диаг.9).
Диаграмма 9. Уровень экспрессии генов рецепторов стероидных гормонов в
мононуклеарах периферической крови пациенток до и после терапии
мифепристоном (Me, мРНК, 103*0,5∆Ct).
До терапии мифепристоном
После терапии мифепристоном
мРНК
100
10
Р=0,01
*
1
mER
PR-­‐A
GR
AR
Примечание: mER – мембранный рецептор эстрадиола, PR-A – ядерный рецептор
прогестерона типа А, GR – ядерные рецепторы глюкокортикоидов, AR –ядерные рецепторы
андрогенов. Ген сравнения - GAPDH, * - достоверные различия с аналогичным параметром до
лечения (Вилкоксон)
73
Показатели уровня мРНК рецепторов стероидных гормонов в мононуклеарах
пациенток находились в широком диапазоне физиологических значений, нами
выявлено статистически достоверное снижение экспрессии гена ядерного рецептора
PR-A в 9,8 раз (р=0,01). Таким образом, терапия мифепристоном пациенток с миомой
матки
сопровождается
изменением
стероидного
транскриптома
иммунокомпетентных клеток периферической крови.
3.4. Сравнительный анализ экспрессии генов рецепторов стероидных
гормонов
в
мононуклеарах
пациенток
и
клинической
эффективности
применения мифепристона в лечении миомы матки.
Для того, чтобы оценить влияние мифепристона на экспрессию генов рецепторов
стероидных гормонов в МНФК, пациенток, включенных в клиническое исследование,
в зависимости от успеха терапии мифепристоном разделили на две группы: I положительный эффект от терапии, II - отсутствие эффекта (табл.1).
Для исключения возможного влияния внешних факторов на результаты
исследования был проведен анализ признаков генеральной совокупности при помощи
метода Хи-квадрат. Статистическая обработка данных показала отсутствие
достоверных отличий в группах.
Данные исследования экспрессии генов рецепторов mER, PR-A, AR и GR в
МНФК пациенток с миомой матки до лечения и после терапии мифепристоном в
зависимости от эффекта терапии представлены на диаграмме 10.
Из представленных на диаграмме данных видно, что у пациенток с отсутствием
эффекта от терапии (группа II) практически не снижается уровень PR-A после
проведенного курса лечения, в отличие от пациенток I группы. Средние значения
уровня мРНК всех изученных рецепторов в МНФК у пациенток II группы (без
эффекта) до лечения превышают значения аналогичных данных пациенток группы I
в 1,5 раза (диаг. 10). Полученные данные подтвердили нашу гипотезу об участии
иммунокомпетентных клеток в инволюции опухоли под действием мифепристона.
Таким образом, лечебное действие мифепристона сопровождается изменением
рецепторного
профиля
74
иммунокомпетентных
клеток
периферической
крови
пациенток с миомой матки.
Диаграмма
10.
Уровень
экспрессии
генов
стероидных
рецепторов
в
мононуклеарах периферической крови пациенток до и после лечения
мифепристоном в зависимости от эффективности терапии (Ме, мРНК,
103*0,5∆Ct).
100
100
ГРУППА II
мРНК
мРНК
ГРУППА I
10
10
Р=0,02
*
1
1
mER
PR-­‐A
GR
mER
AR
PR-­‐A
GR
AR
До терапии мифепристоном
До терапии мифепристоном
После терапии мифепристоном
После терапии мифепристоном
Примечание: группа I – пациентки с положительным эффектом от терапии
мифепристоном, группа II – пациентки с отсутствием эффекта от лечения
мифепристоном; * - достоверные различия с аналогичным параметром до лечения
(Вилкоксон)
Причинно-следственные отношения выявленных событий требуют дальнейшего
уточнения. Но, вне зависимости от того, что является первичным: действие препарата
на
измененную
ткань
(миому)
или
на
иммуннокомпетентные
клетки,
принципиальным остается тот факт, что успешная терапия мифепристоном
75
сопровождается изменением свойств МНФК, в отличие от ситуаций, где
положительный ответ на терапию отсутствует.
Значение иммунной системы в процессах саногенеза, влияние прогестерона и
СМРП на функциональную активность МНФК, как ранее нами было показано [9], а
также данные представленные в этой работе, свидетельствуют о том, что отношения
эндокринного и иммунного контроля пролиферации гормон-зависимых тканей
женщины тесно переплетены. Обращает на себя внимание тот факт, что средние
значения уровня мРНК всех изученных рецепторов (кроме AR) в МНФК у пациенток
II группы (без эффекта) до лечения превышают значения аналогичных данных
пациенток группы I (диаг.10). Следовательно, отдельные параметры стероидного
транскриптома клеток крови можно использовать в качестве маркеров прогноза
эффективности применения мифепристона у пациенток с миомой матки.
В транскрипционной системе МНФК мифепристон, как показано в нашем
исследовании, проявляет прогестагенный эффект, снижая экспрессию рецептора PRA в клетке-мишени. Известно, что клетки МНФК, выполняют защиту организма
против внешних агрессивных факторов за счет фагоцитоза, цитокино- и
антителопродукции. Нами ранее показано, что прогестерон в условиях in vitro
стимулирует продукцию ФНО-альфа клетками МНФК, мифепристон в этих условиях
проявляет свойства частичного агониста (агониста-антагониста) [9]. Прогестерон
через собственные рецепторы оказывает тормозящее действие на некоторые функции
макрофагов, например, угнетает выработку оксида азота, TLR4 и TLR9индуцированную выработку IL-6, экспрессиюTLR4, FcγR и активацию NF-kappaB
[102]. Уменьшение экспрессии PR-A способно снимать тормозной эффект
прогестерона на иммунокомпетентные клетки. Указанная трансдукция сигнала может
являться одним из механизмов антипролиферативного действия мифепристона в
терапии миомы матки.
Для поиска маркера эффективности применения мифепристона в лечении
пациенток с миомой матки был проанализирован уровень экспрессии генов
76
рецепторов половых стероидов в мононуклеарах пациенток в точке «до» лечения.
Результаты сравнительного анализа уровня мРНК генов стероидных рецепторов в
мононуклеарах периферической крови пациенток с миомой матки до начала лечения
в
зависимости
от
эффективности
последующей
терапии
мифепристоном
представлены на диаграмме 11.
Диаграмма
11.
Уровень
экспрессии
генов
стероидных
рецепторов
в
мононуклеарах периферической крови пациенток до лечения мифепристоном в
зависимости от эффективности последующей терапии (Ме, мРНК, 103*0,5∆Ct).
Есть эффект
100
Нет эффекта
P=0,1
мРНК
P=0,02
*
10
1
mER
PR-­‐A
GR
AG
Примечание: mER – мембранный рецептор эстрадиола, PR-A – ядерный рецептор
прогестерона типа А, GR –ядерные рецепторы глюкокортикоидов, AR –ядерные
рецепторы андрогенов. Ген сравнения GAPDH, * - достоверные различия с
аналогичным параметром в группе пациенток с положительным эффектом от
терапии мифепристоном (Манн-Уитни).
77
Из представленной диаграммы видно, что в МНФК пациенток с отсутствием
эффекта мифепристона в отношении размеров миомы, выявлена повышенная
экспрессия генов ядерных глюкокортикоидных рецепторов в 5 раз и тенденция к
повышению экспрессии генов рецептора прогестерона PR-A (p=0,1) по сравнению с
аналогичным параметром в МНФК пациенток из группы I. Уровень мРНК mER и AR
не различался в МНФК пациенток этих групп. Следовательно, уровень экспрессии
GR может служить маркером прогноза эффективности применения мифепристона в
лечении пациенток с миомой матки.
Выявление
вероятной
зависимости
между
изученными
параметрами
потребовало табуляции непрерывной переменной данных эффективности терапии.
Для этого мы провели перекодирование данных с разбивкой диапазона их изменения
на небольшое число интервалов. В качестве основного параметра эффективности
терапии использовали степень уменьшения объема опухоли от первоначальных
значений в процентах. Весь диапазон эффектов был расчленен на три интервала:
«высокая эффективность» - уменьшение размеров миоматозных узлов к завершению
лечения от 40% до 100%, «средняя эффективность» - уменьшение размеров
миоматозных узлов от 20 % до 40 % и «низкая эффективность» - уменьшение
размеров узлов менее чем на 20 %.
В соответствии с такой табуляцией, у 40% пациенток с множественной
лейомиомой матки в нашем исследовании наблюдали высокую эффективность
лечения, у 32% - среднюю эффективность лечения и у 14% обнаружен низкий
терапевтический эффект мифепристона. Отсутствие терапевтического действия
мифепристона на размеры миоматозных узлы выявили у 14% пациенток. (диаг. 12).
Корреляционный
анализ
экспериментальных
данных
с
параметрами
эффективности антигормональной терапии показал, что экспрессия GR в
мононуклеарах периферической крови пациенток с миомой матки (до начала
лечения) имеет отрицательную корреляционную связь с успехом последующей
терапии мифепристоном (CI 95% Spearman r = - 0,46; р=0,02).
78
Диаграмма 12. Эффективность терапии мифепристоном пациенток с миомой
матки.
Высокая эффективность терапии
Средняя эффективность терапии
Низкая эффективность терапии
Отсутствие терапевтичесого эффекта
14%
40%
14%
32%
Примечание: высокая эффективность лечения (уменьшение размеров миоматозных
узлов > 40%), среднюю эффективность лечения (уменьшение размеров миоматозных
узлов от 20 % до 40 %), низкий терапевтический эффект (уменьшение размеров
миоматозных узлов< 20 %).
Для изучения характеристик потенциального маркера прогноза эффективности
применения мифепристона в терапии пациенток с миомой матки проведен ROCанализ. Выявлено, что увеличение уровня экспрессии гена GR более 0,011 (0,5-ΔCt
относительно GAPDH) в клетках МНФ крови у женщин может свидетельствовать о
снижении эффективности мифепристона в лечении миомы матки. Чувствительность
данного маркера составляет 78%, специфичность 70% (AUC = 0,78; «хорошая»
клиническая значимость теста).
79
Глюкокортикоиды являются физиологическими регуляторами иммунного ответа
и влияют на разные функции лимфоцитов и антигенпрезентирующих клеток. Они
влияют на рециркуляцию лимфоцитов, на адгезию лейкоцитов к эндотелиальным
клеткам, на продукцию цитокинов и количество цитокиновых рецепторов на клетках
[102]. Глюкокортикоиды через собственные рецепторы угнетают активность клеток
лимфоидного ряда, тормозят продукцию антител B-лимфоцитами и плазматическими
клетками,
уменьшают
продукцию
лимфокинов,
цитокинов
разными
иммунокомпетентными клетками и угнетают фагоцитарную активность лейкоцитов.
Повышенная экспрессия генов глюкокортикоидных рецепторов в МНФК у пациенток
с
отсутствием
терапевтического
эффекта
мифепристона
может
отражать
пониженную активность иммунокомпетентных клеток у этих пациенток (группа II).
3.5 Оценка частоты встречаемости железистой дилатации эндометрия у
пациенток в терапии миомы матки мифепристоном.
Безопасность лечения оценивали на основании регистрации нежелательных
явлений путем анализа жалоб, симптомов. Контролировали толщину эндометрия при
помощи УЗ – исследования, фиксировали степень выраженности его изменений.
Железистая дилатация эндометрия (ЖДЭ) была выявлена у 11 из 50 (22%)
пациенток, получавших лечение мифепристоном. В результате морфологического
исследования биопсий эндометрия пациенток с железистой дилатацией ни одного
случая атипической гиперплазии не было выявлено. Полученные данные сходны с
международной статистикой клинического применения мифепристона в терапии
миомы матки [42; 41; 30].
Для изучения взаимосвязи между наличием/отсутствием железистой дилатации
эндометрия у пациенток и показателями эффективности терапии мифепристоном
миомы матки был проведен анализ сопряжённости исследуемых параметров при
помощи критерия Хи-квадрат.
80
Статистическая обработка данных показала, что проявление железистой
дилатации эндометрия у пациенток не связано с эффективностью лечения (Хиквадрат = 0,02; р = 0,86) (диаг. 13). Таким образом, полученные нами результаты
подтверждают данные отечественных и международных клинических исследований.
Так, эффективность лечения миомы СПРМ в среднем составляет 85-95%, тогда как
частота РАЕС – от 15 до 30% [57].
Диаграмма 13. Эффективность мифепристона в терапии пациенток с миомой
матки и частота проявления железистой дилатации эндометрия.
50
Пациентки с ЖДЭ
Пациентки без ЖДЭ
45
КОЛИЧЕСТВО ПАЦИЕНТОК
40
35
30
25
34
20
15
10
5
9
5
2
Положительный эффект от терапии
Отрицательный эффект от терапии
0
Примечание: ЖДЭ – железистая дилатация эндометрия, Хи-квадрат = 0,02; р=0,8.
81
3.6. Сравнительный анализ экспрессии генов рецепторов стероидных
гормонов в мононуклеарных клетках крови пациенток и частоты встречаемости
мифепристон-индуцированной железистой дилатации эндометрия у женщин с
миомой матки.
Для оценки влияние мифепристона на экспрессию генов рецепторов стероидных
гормонов в клетках МНФ крови пациенток, в зависимости от наличия или отсутствия
железистой дилатации эндометрия, разделили на две группы: I - пациентки без ЖДЭ,
II- пациентки с ЖДЭ.
Для исключения возможного влияния внешних факторов на результаты
исследования был проведен анализ признаков генеральной совокупности при помощи
метода Хи-квадрат (табл. 2). Статистическая обработка данных показала отсутствие
достоверных отличий в группах.
Результаты исследования экспрессии генов рецепторов mER, PR-A, AR и GR в
мононуклеарной фракции крови пациенток с миомой матки с изменениями
эндометрия, ассоциированными с терапией мифепристоном и без таковых
представлены на диаграмме 14.
Как видно из данных диаграммы в клетках МНФ крови пациенток с измененным
эндометрием на фоне применения мифепристона выявлено снижение экспрессии
генов ядерных рецепторов андрогенов в 3,7 раз (р=0,03) по сравнению с аналогичным
параметром в мононуклеарах пациенток с неизмененным эндометрием. Уровень
мРНК mER, PR-A и GR в мононуклеарных клетках пациенток не зависел от состояния
эндометрия. Следовательно, уровень экспрессии AR может служить маркером
прогноза развития ЖДЭ у пациенток с миомой матки на фоне терапии
мифепристоном.
82
Диаграмма
14.
мононуклеарах
Уровень
экспрессии
периферической
крови
генов
стероидных
пациенток
с
рецепторов
миомой
матки
в
в
зависимости от наличия или отсутствия железистой дилатации эндометрия (Ме,
мРНК, 103*0,5∆Ct).
Пациентки без ЖДЭ
Пациентки с ЖДЭ
35
30
25
20
15
P=0,03
*
10
5
0
mER
PR-­‐A
GR
AR
Примечание: ЖДЭ – железистая дилатация эндометрия, mER – мембранный
рецептор эстрадиола, PR-A – ядерный рецептор прогестерона типа А, GR – ядерные
рецепторы глюкокортикоидов, AR – ядерные рецепторы андрогенов. Ген сравнения
– GAPDH,* - достоверные различия с аналогичным параметром до лечения (МаннУитни)
83
Корреляционный анализ экспериментальных данных с частотой встречаемости
специфических изменений эндометрия на фоне лечения мифепристоном показал, что
экспрессия гена AR в мононуклеарах периферической крови пациенток с миомой
матки (до начала лечения) имеет отрицательную корреляционную связь с развитием
ЖДЭ (CI 95% Spearman r = - 0,37; р=0,04).
Андрогены через собственные AR в МНФК могут контролировать функцию
иммунокомпетентных
клеток,
участвуют
в
реализации
их
активации,
хемотаксисаисекрециивоспалительныхфакторов. В исследовании in vivo показано,
что блокада AR вызывает увеличение числа про-B, пре-В и незрелых В-клеток в
костном мозге [40]. Стероиды через AR модулируют численность и состав Т-клеток
[72]. Дигидротестостерон уменьшает секрецию ФНО-альфа в ЛПС - индуцированных
макрофагах селезенки, в тоже время вызываясекрециюи ФНО - альфаи ИЛ-6
клетками
Купфера
[97].
Тестостерон
вызывает
увеличение
производства
макрофагами активных форм кислорода [33].
Таким образом, мифепристон, влияя на транскрипционную активность AR в
МНФК, по-видимому, участвует в иммунном контроле пролиферации гормонзависимых тканей женщины.
Для изучения характеристик потенциального прогностического маркера
развития ЖДЭ у пациенток на фоне лечения мифепристоном был проведен ROCанализ. Выявлено, что снижение уровня экспрессии гена AR менее 0,028 в
мононуклеарных клетках периферической крови пациенток (0,5-ΔCt относительно
GAPDH) может свидетельствовать о высокой вероятности развития железистой
дилатации эндометрия у пациенток с миомой матки на фоне терапии мифепристоном.
Чувствительность данного маркера составляет 90%, специфичность 50% (AUC = 0,
74 - «хорошая» значимость теста).
Недостаточная информированность специалистов и пациентов о значении ЖДЭ
на фоне лечения мифепристоном может привести к ошибочной тактике ведения
женщин с миомой матки (необоснованный отказ), снижению комплаентности и как
84
следствие неэффективности лечения. Вызванные изменения эндометрия всегда
обратимы и самостоятельно регрессируют уже через месяц после отмены препарата.
Анализ показанных нами характеристик поможет выявить пациенток с риском
развития железистой дилатации эндометрия, позволит проинформировать врача и
пациентку
и,
как
следствие,
предупредить
необоснованные
оперативные
вмешательства (гистероскопия и резекция), являющиеся дополнительным фактором
риска для репродуктивного здоровья женщины.
На основании результатов диссертационной работы был создан алгоритм
персонализованного назначения мифепристона (50 мг внутрь ежедневно, 3 месяца)
пациенткам репродуктивного возраста с миомой матки соответствующей по величине
6-12 недельной беременности с интерстициальной или интерстициально-субсерозной
локализацией миоматозных узлов (схема. 2).
85
Схема 2. Алгоритм персонализованного назначения мифепристона (50 мг внутрь
ежедневно, 3 месяца) пациенткам с миомой матки.
пациентка,
размер МУ < 12 н.б.
кровь, МНФК
0,5
-ΔCt
> 0,011 относительно GAPDH
рецепторныи6 анализ (GR)
назначить другои6 препарат
0,5
-ΔCt
< 0,011 относительно GAPDH
рецепторныи6 анализ (AR)
> 0,028 0,5-ΔCt относительно GAPDH
мифепристон
< 0,028 0,5-ΔCt относительно GAPDH
проинформировать о предрасположенность к развитию ЖДЭ Примечание: МУ – миоматозный узел, МНФК – мононуклеарная фракция клеток
крови, GR – ядерные рецепторы глюкокортикоидов, AR - ядерные рецепторы
андрогенов, ЖДЭ – железистая дилатация эндометрия.
86
ВЫВОДЫ
1. Эффективность терапии миомы матки мифепристоном (50 мг внутрь
ежедневно, 3 месяца) находилась в пределах референсных значений.
Уменьшение размеров миоматозных узлов (по данным УЗИ в среднем
составило 44%) зарегистрировано у 43 пациенток (из 57), что составило 86%.
2. Относительная экспрессия генов рецепторов mER, PR-A, GR, AR в
клетках мононуклеарной фракции периферической крови пациенток с
миомой матки на 19-21 день м.ц. составила 0,028±0,001, 0,018±0,005,
0,017±0,006,
0,02±0,005
(Me±SE,
0,5∆Ct
относительно
GAPDH),
соответственно.
3. Мифепристон (50 мг внутрь ежедневно, 3 месяца) снижает экспрессию
гена ядерного рецептора прогестерона типа в 9,8 раз (р=0,01) в
мононуклеарной фракции клеток крови пациенток, при этом уровень мРНК
mER, GR и AR достоверно не изменяется.
4. У пациенток с отсутствием эффекта мифепристона в отношении
размеров миомы в мононуклеарных клетках крови выявлена повышенная
экспрессия генов ядерных глюкокортикоидных рецепторов в 5 раз (р=0,002)
по сравнению с аналогичным параметром у женщин с положительным
результатом лечения. Экспрессия генов GR в мононуклеарах пациенток с
миомой матки (до начала лечения) имеет отрицательную корреляционную
связь с успехом последующей терапии мифепристоном (Spearman r = - 0,46;
р=0,02).
и
может
быть
использована
с
прогностической
целью
(чувствительность – 78%, специфичность – 70%).
5. Железистая дилатация эндометрия на фоне лечения мифепристоном
(50 мг, внутрь, 3 месяца) была выявлена у 11 из 50 (22%) пациенток, и не
ассоциирована с эффектом терапии (Хи-квадрат = 0,02; р = 0,86).
87
6. В мононуклеарных клетках крови пациенток с железистой дилатацией
эндометрия (до начала лечения) снижена экспрессия генов AR в 3,7 раз
(р=0,03) по сравнению с аналогичным параметром у женщин с неизмененным
эндометрием. Уровень мРНК AR в мононуклеарах пациенток с миомой матки
имеет отрицательную корреляционную связь с вероятностью развития
железистой дилатации эндометрия (Spearman r = - 0,37; р=0,04), и может быть
использован
с
диагностической
специфичность – 50%).
целью
(чувствительность
–
90%,
88
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕДАЦИИ
Результаты исследования, полученные в ходе диссертационной работы,
позволяют считать, что рецепторный профиль иммунокомпетентных клеток может
служить косвенным прогностическим признаком эффективности и целесообразности
применения мифепристона в терапии пациенток с миомой матки. Увеличение уровня
экспрессии гена GR более 0,011 (0,5-ΔCt относительно GAPDH) в мононуклеарных
клетках крови пациенток может свидетельствовать о снижения эффективности
мифепристона
в
терапии
миомы
матки
(чувствительность
маркера
78%,
специфичность - 70%). Анализ данных параметров позволит прогнозировать исход
терапии для подбора оптимального способа лечения пациентки.
Результаты диссертационной работы позволяют считать, что снижение уровня
относительной экспрессии гена AR менее 0,028 в клетках мононуклеарной фракции
крови (0,5-ΔCt относительно GAPDH) свидетельствует о высокой вероятности
развития железистой дилатации эндометрия у пациенток с миомой матки на фоне
терапии мифепристоном (чувствительность маркера 90%, специфичность –50%).
Пациентка и лечащий врач на основании предложенного критерия будут
предупреждены о высокой вероятности проявлении железистой дилатации
эндометрия, смогут более подробно ознакомиться с текущей научной информацией
об этом явлении, что обеспечит адеватную реакцию первичного и вторичного
потребителя мифепристона.
89
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Буянова
С.Н.,
Мгелиашвили
М.В.,
Петракова
С.А.
Современные
представления об этиологии, патогенезе и морфогенезе миомы матки // Российский
вестник акушера-гинеколога. – 2008. - № 6. – С. 45-51.
2. Вихляева Е.М. Руководство по эндокринной гинекологии. М., 2000. С. 424–87.
3. Волков В.Г., Гусева Н.В. Оптимизация консервативного лечения миомы матки
антипрогестеронами и оценка влияния проводимой терапии на качество жизни
женщин // Вестник новых медицинских технологий. – 2011. – Т. 18. № 1. – С. 92-93.
4. Каграманян А.И., Курцер М.А., Каппушева Л.М., Егикян Н.М. Тотальная
гистерэктомия: выбор хирургического доступа // Вопросы гинекологии, акушерства
и перинатологии. - 2011. - Т. 10. № 4. - С. 24-30.
5. Карева Е.Н. Мифепристон и миома матки // Фарматека. – 2010. - № 14. – C.1830.
6. Карева Е.Н. Молекулярные механизмы действия женских половых стероидов
и их антагонистов. Автореф. дисс. докт. мед. наук. М., 2003. 55 с.
7. Карева Е.Н., Ганковская Л.В. Половые стероиды и иммунитет // Российский
иммунологический журнал. – 2012. –Т. 6(15). № 1. – С. 3-13.
8. Карева Е.Н., Коцюбинская Н.А. Половые гормоны, цитокины и апоптоз в
патогенезе миомы матки. Перспективы фармакотерапии // Физиология и патология
иммунной системы. Иммунофармакогеномика. – 2013. – Т. 2. № 17. – С. 3-15.
9. Карева Е.Н., Маняхина А.Е. Влияние цикло-D’-пентаранов на уровень
продукции ФНО-альфа мононуклеарной фракцией клеток периферической крови у
пациенток с миомой матки // Материалы научно-практической конференции
«Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины». - М.,
2008. - С.69.
10. Краснопольский В.И., Логутова Л.С., Буянова С.Н. и др. Хирургическая и
акушерская тактика при сочетании беременности с опухолями половых органов //
Акушерство и гинекология. - 2002. - № 2. - С. 41–5.
90
11. Кулаков В.И., Шилова М.Н. Применение агонистов гондотропин-рилизинггормона для лечения миомы матки // Акушерство и гинекология. - 1998. - № 6.
12. Луценко Н.С., Олейник Н.С., Евтерева И.А., Шаповал О.С., Потебня В.Ю.
Особенности маточной ангиоархитектоники при лейомиоме матки // Вестник ВГМУ.
– 2015. – Т. 14. №13. – С. 44-49.
13. Медведев М.В., Лютая Е.Д. Миома матки: В кн.: Допплеро- графия в
гинекологии: Энциклопедия ультразвуковой диа- гностики в акушерстве и
гинекологии. Под ред. Б.И. Зыкина, М.В. Медведева. М: Реальное время 2000; 152.
14. Патент на изобретение № 2312354 «Способ диагностики эстроген- и
прогестеронзависимой патологии гениталий» (Карева Е.Н., Гаспарян Н.Д.) от 10
декабря 2007 г.
15. Петркова С.А., Мгелиашвили М.В. Роль ультразвукового иследования в
диагностике миомы матки // Российский вестник акушера-гинеколога. – 2009. – № 2.
– С. 35-38.
16. Савельева Г.М., Краснова И.А., Бреусенко В.Г., Капранов С.А. и др.
Эффективность и профилактика возможных осложнений ЭМА при лечении миомы //
Акушерство и гинекология. - 2014. - № 11. - С. 74-79.
17. Савицкий Г.А. Миома матки. СПб., 2000. 214 с.
18. Самойлова
Т.Е.
Медикаментозное
лечение
лейомиомы
матки
антигестагенами: возможности и перспективы // Охрана материнства и детства. –
2012. - № 1-19. - С. 102-109.
19. Сергеев П.В., Карева Е.Н., Ткачева Н.Ю. Прогестерон: рецепторный
механизм действия в норме и при опухолевом росте // Акушерство и гинекология. –
1994. - N 5. – C. 6-9.
20. Сергеев П.В., Карева Е.Н., Ткачева Н.Ю. Сравнительный анализ рецепторов
прогестерона и эстрадиола при миоме у человека // Бюллетень экспериментальной
биологии и медицины. – 1994. - Т. CXVII. № 7. - С. 33–4.
91
21. Сергеев П.В., Карева Е.Н., Ткачева Н.Ю., Высоцкий М.М. Прогестерон:
рецепторный механизм действия в норме и при опухолевом росте (обзор) //
Акушерство и гинекология. - 1994. - № 5. - С. 6–9.
22. Сидорова И.С. Миома матки (современные проблемы этиологии,
патогенеза, диагностики и лечения). М. 2003; 256с.
23. Тапильская Н.И. Отдаленные результаты применения антигестагенов:
достичь цели // 8-й Общероссийский семинар "Репродуктивный потенциал России:
версии и контрверсии. – С., 2015. – С. 1.
24. Bagaria M., Suneja A. Low-dose mifepristone in treatment of uterine leiomyoma:
a randomised double-blind placebo-controlled clinical trial // Aust N Z J Obstet Gynaecol.
- 2009. – T. 49. № 1. - Р. 77-83.
25. Barbarisi A., Petillo O., Di Lieto A., Melone M.A., Margarucci S., Cannas M.,
Peluso G. 17-beta estradiol elicits an autocrine leiomyoma cell proliferation: evidence for a
stimulation of protein kinase-dependent pathway // Cell Physiol. – 2001. – Т. 186. № 3. –
P. 414-24.
26. Benassayag
C.,
Leroy
M.,
Rigourd
V.,
et
al.
Estrogen
receptors
(ERalpha/ERbeta) in normal and pathological growth of the human myometrium:pregnancy
and leiomyoma // Physiol. – 1999. – Т. 276. № 6. Р. 1. – Р. 112-l18.
27. Boman K., Strang P., Backstrom T., et al. The influence of progesterone and
androgens on the growth of endometrial carcinoma // Cancer. – 1993. – Т. 71. № 11. – P.
3565–69.
28. Brenner R.M., Slayden O.D., Critchley H.O. Anti-proliferative effects of
progesterone antagonists in the primate endometrium: a potential role for the androgen
receptor // Reproduction. – 2002. - № 124. – Р. 167–172.
29. Butts, C.L., Shukair S.A., Duncan K.M., et all Progesterone inhibits mature rat
dendritic cells in a receptor-mediated fashion // Int Immunol. – 2007. –T. 19. № 3. – P. 28796.
30. Carbonell J.L., Acosta R., Pérez Y., Marrero A.G. Safety and effectiveness of
92
different dosage of mifepristone for the treatment of uterine fibroids: a double-blind
randomized clinical trial // Womens Health. – 2013. – Т. 19. № 5. – P.115-24.
31. Cermik D., Arici A., Taylor H. Coordinated regulation of HOX gene expression
in myometrium and uterine leiomyoma // Fertil Steril. – 2002. – Т. 78. № 5. – Р. 979-84.
32. Chabbert-Buffet N., Meduri G., Bouchard Ph., M.Spitz I. Selective progesterone
receptor modulators and progesterone antagonists: mechanisms of action and clinical
applications // Human Reproduction Update. – 2005. – Т. 11. № 3. – Р. 293–307.
33. Chao T.C., Van Alten P.J., Walter R.J., Steroid sex hormones and macrophage
function: modulation of reactive oxygen intermediates and nitrite release // Am. J. Reprod.
Immunol. – 1994. – Т. 32. № 1. – Р. 43–52.
34. Chrapusta S., Sieinski W., Konopka B., et al. Estrogen and progestin receptor
levels in uterine leiomyomata: relation to the tumour histology and the phase of menstrual
cycle // Gynaecol Oncol. – 1900. – T. 11. № 5. – Р. 381–87.
35. Chwalisz K., Brenner R.M., Fuhrmann U.U., Hess Stumpp H., Elger W.
Antiproliferative effects of progesterone antagonists and progesterone receptor modulators
on the endometrium // Steroids. – 2000. - № 65. – Р. 741–751.
36. Chwalisz K., Larsen L., Mattia-Goldberg C., Edmonds A., Elger W., Winkel C.A.
A randomized, controlled trial of asoprisnil, a novel selective progesterone receptor
modulator, in women with uterine leiomyomata // Fertil Steril. - 2007. – № 87. – P. 1399–
1412.
37. Dawood M., Khan-Dawood F. Plasma insulinlike growth factor-I, CA-125,
estrogen, and progesterone in women with leiomyomas // Fertil Steril. – 1994. – № 61. – P.
617–21.
38. Di Tommaso S., Massari S., Malvasi A., Vergara D., Maffia M., Greco M.,
Tinelli A. Selective genetic analysis of myoma pseudocapsule and potential biological
impact on uterine fibroid medical therapy // Expert Opin Ther Targets. – 2015. – T. 19. №
1. – P. 7-12.
39. Eisinger S.H., Bonfiglio T., Fiscella K., Meldrum S., Guzick D.S. Twelve-month
93
safety and efficacy of low-dose mifepristone for uterine myomas // Minim Invasive
Gynecol. - 2005. - № 12. – P. 227–233.
40. Ellis T.M., Moser, M.T., Le P.T., Flanigan R.C., Kwon E.D. Alterations in
peripheral B cells and B cell progenitors following androgen ablation in mice // IntImmunol.
– 2001. – № 13. – P. 553-558.
41. Engman M., Granberg S. Mifepristone for treatment of uterine leiomyoma. A
prospective randomized placebo controlled trial // Hum Reprod. - 2009. - Т. 24. № 8. – Р.
1870-1879.
42. Esteve J.L., Acosta R.C. Mifepristone versus placebo to treat uterine myoma: a
double-blind, randomized clinical trial // Womens Health. - 2013. – N 5. - P. 361–369.
43. Fiscella J., Bonfiglio T., Winters P., Eisinger S.H., Fiscella K. Distinguishing
features of endometrial pathology after exposure to the progesterone receptor modulator
mifepristone // Hum Pathol. – 2011. – Т. 42. № 7. – Р. 947-53.
44. Fiscella K., Eisinger S.H., Meldrum S., Feng C., Fisher S.G., Guzick D.S. Effect
of mifepristone for symptomatic leiomyomata on quality of life and uterine size: a
randomized controlled trial // Obstet Gynecol. - 2006. – № 108. – P.1381–1387.
45. Flake G.P., Andersen J. Etiology and pathogenesis of uterine leiomyomas: a
review //Environ Health Perspest. – 2003. - № 8. – P. 1037-54.
46. Fleischer R., Weston G., Wood C., et al. Pathophysiology of fibroid disease:
angiogenesis and regulation of smooth muscle proliferation // Best Pract Res Clin Obst
Gynaecol. – 2008. – Т. 22. № 4. – P. 603–14.
47. Friedman A.J., Daly M., Juneau-Norcross M., Rein M.S., Fine C., Gleason R.,
Leboff M.A Prospective, randomized trial of gonadotropin-releasing hormone agonist plus
estrogen-progestin or progestin "add-back" regimens for women with leiomyomata uteri //
Clin Endocrinol Metab. – 1993. - T. 76. № 6. – Р. 1439-45.
48. Giangrande P.H.,
McDonnell D.P. The A and B isoforms of the human
progesterone receptor: two functionally different transcription factors encoded by a single
gene // Recent Prog Horm Res. – 1999. - № 54. – Р. 291–313.
94
49. Greb R.R., Heikinheimo O., Williams R.F., Hodgen G.D. Vascular endothelial
growth factor in primate endometrium is regulated by oestrogen-receptor and progesteronereceptor ligands in vivo // Hum Reprod. – 1997. - № 12. – Р. 1280–1292.
50. Gustavsson I., Englund K., et al. Tissue differences but limited sex steroid
responsiveness of c-fosand c-jun in human fibroids and myometrium // Mol Hum Reprod.
– 2000. - № 6. – Р. 55–9.
51. Han S., Sidell N. RU486-induced growth inhibition of human endometrial cells
involves the nuclear factor-kappa B signaling pathway // Clin Endocrinol Metab. 2003. –
№. 88. – Р. 713–719.
52. Harrison-Woolrych M.L., Charnock-Jones D.S., Smith S.K. Quantification of
messenger ribonucleic acid for epidermal growth factor in human myometrium and
leiomyomata using reverse transcriptase polymerase chain reaction // Clin Endocrinol
Metab. - 1994. – № 78. – Р.1179–1184.
53. Heikinheimo O., Hsiu J.G., Gordon K., Kim S., Williams R.F., Gibbons W.E.
Endometrial effects of RU486 in primates--antiproliferative action despite signs of estrogen
action and increased cyclin-B expression // Steroid Biochem Mol Biol. – 1996. – Т. 59. №
2. – Р. 179-90.
54. Hermanson O., Glass C.K., Rosenfeld M.G. Nuclear receptor coregulators:
multiple modes of modification // Trends Endocrinol Metab. – 2002. – № 13. – Р. 55–60.
55. Hodgen G.D. Endometrial effects of RU486 in primates—antiproliferative action
despite signs of estrogen action and increased cyclin-B expression // Steroid Biochem Mol
Biol – 1996. – №. 59. – Р. 179–190.
56. Hoekstra A.V., Sefton E.C., Berry E., et al. Progestins activate the AKT pathway
in leiomyoma cells and promote survival // Clin Endocrinol Metab. – 2009. – Т. 94. № 5. –
Р. 1768–74.
57. Ноrnе F.M., Blithe D.L. Progesterone receptor modulators and the endometrium:
changes and consequences // Hum. Reprod. Update. – 2007. – 13. – Р. 567-80.
95
58. Imir A.G., Lin Z., Yin P., et al. Aromatase Expressionin Uterine Leiomyomata is
regulated by Proximal Promoters 1.3/II // Clin Endocrin Metab. – 2007.– Т. 92. № 5. – Р.
1979-82.
59. Ishikawa H. et al.: Progesterone is essential for maintenance and growth of
uterine leiomyoma // Endocrinology. – 2010. - № 151. – Р. 2433–2442.
60. Ishikawa H., Ishi K., Serna V.A., Kakazu R., Bulun S.E., Kurita T. Progesterone
is essential for maintenance and growth of uterine leiomyoma // Endocrinology. – 2010. –
Т. 151. № 6. – Р. 2433-42.
61. Jeyasuria P., Wetzel J., Bradley M., et al. Progesterone-regulated caspase 3 action
in the mouse may play a role in uterine quiescence during pregnancy through fragmentation
of uterine myocyte contractile proteins // Biol Reprod. – 2009. – Т. 80. № 5. – Р. 928–34.
62. Kastner P., Krust A., Turcotte B., Stropp U., Tora L., Gronemeyer H. Two
distinct estrogen-regulated promoters generatemtranscripts encoding the two functionally
different human progesterone receptor forms A and B // EMBO. – 1990. - №. 9. – Р. 1603–
1614.
63. Kawaguchi K., Fujii S, Konishi I, et al. Immunohistochemical analysis of
oestrogen receptors, progesterone receptors and Ki-67in leiomyoma and myometrium
during the menstrual cycle and pregnancy // J Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. –
1991. – Т. 419. № 4. – Р. 309–15.
64. Kawaguchi K., Fujii S., Konishi I., Nanbu Y., Nonogaki H., Mori T. Mitotic
activity in uterine leiomyomas during the menstrual cycle // Am J Obstet Gynecol. - 1989.
– № 160. – Р. 637–641.
65. Kim J.J., Kurita T. Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis,
uterine fibroids, and breast cancer // Endocr. Rev. – 2013. – Т. 34. № 1. – P. 130-162.
66. Klein S.L., Roberts C.W. Sex Hormones and Immunity to Infection. – Berlin
Heidelberg: Springer-Verlag, 2010. – 319p.
67. Knapp P., Chabowski A. Molecular and cytogenetic evidence for the
development of fibroids // Postepy Hig Med Dosw (Online). – 2012. – P.23-32.
96
68. Kobayashi T., Hirayama Y., Kobayashi E., Kubo Y., Hino O. A germline
insertion in the tuberous sclerosis (Tsc2) gene gives rise to the Eker rat model of dominantly
inherited cancer // Nat Genet. - 1995.- № 9.- P. 70–74.
69. Korte W., Clarke S., Lefkowitz J.B. Short Activated Partial Thromboplastin
Times Are Related to Increased Thrombin Generation and an Increased Risk for
Thromboembolism // Am J Clin Pathol. — 2000. — Т. 113. № 1. — С. 123-127.
70. Kovacs K.A., Oszter A., Gocze P.M., et al. Comparative analysis of cyclin Dl
and oestrogen receptor ({alpha} and {beta}) levels in human leiomyoma and adjacent
myometrium //Mol Hum Reprod. – 2001. – Т. 7. № 1. – Р. 1085–91.
71. Kulshrestha V. Low dose mifepristone in medical management of uterine
leiomyoma // Med Res. - 2013. – Т. 137. № 6. - Р. 1154–1162.
72. Kurachi O., Matsuo H., Samoto T. et al. Tumor necrosis factor- expression in
human uterine leiomyoma and its down-regulation by progesterone // Clin Endocrinol
Metab. – 2001. - № 86. – Р. 2275–80.
73. Lai K.P., Lai J.J., Chang, P., Altuwaijri, S., Hsu, J.W., Chuang, K.H., Shyr, C.R.,
Yeh, S.,Chang C. Targeting thymic epithelia AR enhances T-cell reconstitution and bone
marrow transplant grafting efficacy // Mol Endocrinol. – 2013. – № 27. – Р. 25-37.
74. Lakimiuk Al., Bogusiewicz M., Tarkowski R. et al. Estrogen receptor a and B
expression in uterine leiomyoma from premenopausal women // Fertil and Steril. – 2004. –
Т. 82. № 3. – Р. 1244–49.
75. Lamminen S., Rantala I., Helin H., Rorarius M., Tuimala R.. Proliferative activity
of human uterine leiomyoma cells as measured by automatic image analysis // Gynecol
Obstet Invest. - 1992. - № 34. – Р. 111–114.
76. Leonhardt S.A., Edwards D.P. Mechanism of action of progesterone antagonists
// Exp Biol Med. – 2002. – № 227. – Р. 969–980.
77. Lethaby A.E., Vollenhoven B.J., An evidencebased approach to hormonal
therapies for premenopausal women with fibroids // Best Pract Research Clin Obst
Gynaecol. - 2008. – Т. 22. № 2. – Р. 307–31.
97
78. Lipschotz A., Vargas L., Structure and origin of uterine and extragenital fibroids
induced experimentally in the guinea pig by prolonged administration of estrogens // Cancer
Res. – 1941. - № 1. – Р. 236–249.
79. Liu Z., Auboeuf D., Wong J., Chen J.D., Tsai S.Y., Tsai M.J., O’Malley B.W.
Coactivator/corepressor ratios modulate PR-mediated transcription by the selective receptor
modulator RU486 // Proc Natl Acad Sci USA. – 2002. - № 99. – Р. 7940–7944.
80. Maruo T., Ohara N., Wang J., Matsuo H. Sex steroidal regulation of
uterineleiomyoma growth and apoptosis // Hum Reprod Update. – 2004. – Т. 10. № 3. – P.
207-20.
81. McDonnell D.P., Goldman M.E. RU486 exerts antiestrogenic activities through
a novel progesterone receptor A form-mediated mechanism // Biol Chem. – 1996. – №. 269.
– Р. 11945–11949.
82. McDonnell D.P., Shahbaz M.M., Vegeto E., Goldman M.E. The human
progesterone receptor A-form functions as a transcriptional modulator of mineralocorticoid
receptor transcriptional activity // Steroid Biochem Mol Biol. – 1994. – №. 48. – Р. 425–
432.
83. Mutter G.L., Bergeron C., Deligdisch L., Ferenczy A., Glant M., Merino M.,
Williams A.R., Blithe D.L. The spectrum of endometrial pathology induced by progesterone
receptor modulators // Mod Pathol. – 2008. – Т. 21. № 5. – Р. 591-8.
84. Narayanan R., Adigun A.A., Edwards D.P. et al. Cyclin-Dependent Kinase
Activity Is Required for Progesterone Receptor Function: Novel Role for Cyclin A/Cdk2 as
a Progesterone Receptor Coactivator // Mol Cell Biol. - 2005. – Т. 25. № 1. – Р. 264–77.
85. Neulen J., Williams R.F., Breckwoldt M., Chwalisz K., Baulieu E.E., Hodgen
G.D. Non-competitive anti-oestrogenic actions of progesterone antagonists in primate
endometrium: enhancement of oestrogen and progesterone receptors with blockade of postreceptor proliferative mechanisms // Hum Reprod. – 1996. – №. 11. – Р. 1533–1537.
86. Newbold R.R., Moore A.B., Dixon D. Characterization of uterine leiomyomas in
CD-1 mice following developmental exposure to diethylstilbestrol (DES) // Toxicol Pathol.
98
– 2002. – Т. 30. № 5. – Р. 611-6.
87. Nisolle M., Gillerot S., Casanas-Roux F., et al. Immunohistochemical study of
the proliferation index, oestrogen receptors and progesterone receptors A and B in
leiomyomata and normal myometrium durng the menstrual cycle and under gonadotrophinreleasing hormone agonist therapy // Hum Reprod. – 1999. – №. 14. – Р. 2844–50.
88. Ohara N. Sex steroidal modulation of collagen metabolism in uterine leiomyomas
// Clin Exp Obstet Gynecol. - 2009. – № 36. – Р. 10–11.
89. Paquette B., Bisson M., Baptiste C., et al. Invasiveness of breast cancer cells
MDA-MB-231 through extracellular matrix is increased by the estradiol metabolite 4hydroxyestradiol // Int J Cancer. – 2005. -№ 113. – P. 706–11.
90. Parker W.H. Etiology, symptomatology, and diagnosis of uterine myomas //
Fertility Sterility. – 2007. - Т. 87. № 4. – Р. 725–36.
91. Peng L., Wen Y., Han Y., et al. Expression of insulinlike growth factors (IGFs)
and IGF signaling: molecular complexity in uterine leiomyomas // Fertility Sterility. – 2009.
– Т. 91. № 6. – Р. 2664–75.
92. Rabe T., Ahrendt H.J. Ulipristal Acetate for Symptomatic Uterine Fibroids and
Myoma-Related Hypermenorrhea Joint Statement by the German Society for Gynecological
Endocrinology and Reproductive Medicine (DGGEF) and the German Professional
Association of Gynecologists (BVF) // Reproduktionsmed. Endokrinol. – 2013. – Т. 10. №
1. – Р. 82-101.
93. Ramachandran S., Kwon K-Y., Shin S-J., et al. Cyclin-Dependent Kinase
Inhibitor p27Kip1 Controls Growth and Cell Cycle Progression in Human Uterine
Leiomyoma // Korean Med Sci. – 2008. - № 23. – Р. 667–73.
94. Rein M.S., Nowak R.A. Biology of uterine myomas and myometrium in vitro //
In BarBieri RL (ed) Seminars in Productive Endocrinology. - New York, 1992. – Р. 310–
19.
95. Sabry M., Al-Hendy A. Medical Treatment of Uterina Leiomyoma //
Reproductive Science. – 2012. - №4. – P. 339-353.
99
96. Sankaran S., Manyonda I.T. Medical management of fibroids // Best Pract Res
Clin Obstet Gynaecol. – 2008. – Т. 22. № 4. – Р. 655–76.
97. Schmittgen T.D., Livak K.J. Analyzing real-time PCR data by the comparative
CT method // Nat Protoc. -2008. – Т. 3. № 6. - P. 1101-1108.
98. Schneider C.P., Schwacha M.G., Samy T.S., Bland K.I., Chaudry I.H.
Androgenmediated modulation of macrophage function after trauma-hemorrhage: central
role of 5alfa-dihydrotestosterone // Appl. Physiol. – 2003. – Т. 95. № 1. – Р. 104–112.
99. Slayden O.D., Brenner R.M. RU 486 action after estrogen priming in the
endometrium and oviducts of rhesus monkeys (Macaca mulatta) // Clin Endocrinol Metab.
– 1994. - № 78. – Р. 440–448.
100. Slayden O.D., Hirst J.J., Brenner R.M. Estrogen action in the reproductive tract
of rhesus monkeys during antiprogestin treatment // Endocrinology. – 1993. - № 132. – Р.
1845–1856.
101. Smith C., O’Malley B.W. Coregulator functions: a key to understandingtissue
specificity of selective receptor modulators // Endocr Rev. – 2004. – Т. 25. № 1. – Р. 45–
71.
102. Steinauer J., Pritts E.A., Jackson R., Jacoby A.F. Systematic review of
mifepristone for the treatment of uterine leiomyomata // Obstet Gynecol. - 2004. – № 103.
– Р. 1331–1336.
103. Tait A.S., Butts C.L. The role of glucocorticoids and progestins in
inflammatory, autoimmune, and infectious disease // LeukocBiol. - 2008. –Т. 84. № 4.- Р.
924-931.
104. Tung L., Mohamed M.K., Hoeffler J.P., Takimoto G.S., Horwitz K.B.
Antagonist-occupied human progesterone B-receptors activate transcription without
binding to progesterone response elements and are dominantly inhibited by A-receptors //
Mol Endocrinol. – 1993. - № 7. – Р. 1256–1265.
105. Utsunomiya H., Cheng Y.H. Upstream stimulatory factor-2 regulates
steroidogenic factor-1 expression in endometriosis // Mol Endocrinol. - 2008. – Т. 22. №
100
4. – P. 904-14.
106. Vegeto E., Shahbaz M.M., Wen D.X., Goldman M.E., O’Malley B.W.,
McDonnell D.P. Human progesterone receptor A form is a cell and promoter-specific
repressor of human progesterone receptor B function // Mol Endocrinol. - 1993. - № 7. –
Р. 1244–1255.
107. Wagner B.L., Norris J.D., Knotts T.A., Weigel N.L., McDonnell D.P. The
nuclear corepressors NCoR and SMRT are key regulators of both ligand- and 8-bromocyclic AMP-dependent transcriptional activity of the human progesterone receptor // Mol
Cell Biol. – 1998. - № 18. – Р. 1369–1378.
108. Walker C.L., Hunter D., Everitt J.I. Uterine leiomyoma in the Eker rat: a unique
model for important diseases of women // Genes Chromosomes Cancer.- 2003 – Т. 38. №
4. - P. 349-56.
109. Wei J.J., Chiriboga L., Khush M. Expression profile of the tumorigenic factors
associated with tumor size and sex steroids hormone status in uterine leiomyomata // Fertil
Steril. – 2005. - № 84. – Р. 474–84.
110. Weston G., Trajstman A.C., Gargett C.E., et al. Fibroids display an antiangiogenic gene expression profile when compared with adjacent myometrium // Mol
Human Reprod. – 2003. – Т. 9. № 9. – Р. 541–49.
111. Wilkens, J. Effects of the selective progesterone receptor modulator asoprisnil
on uterine artery blood flow, ovarian activity, and clinical symptoms in patients with
uterine leiomyomata scheduled for hysterectomy // Journal of Clinical Endocrinology and
Metabolism. – 2008. – Т. 93. №. 12. - P. 4664-4671.
112. Williams A.J., Powell W.L., Collins T., Morton C.C. HMGI(Y) expression in
human uterine leiomyomata. Involvement of another high-mobility group architectural
factor in a benign neoplasm // Am J Pathol. – 1997.- Т. 150. № 3. – P. 911-8.
113. Xu Q., Ohara N., Maruo T., et al. Progesterone receptor modulator CDB2914
down-regulates VEGF, adrenomedullin and their receptors and modulates progesterone
101
receptor content in cultured human uterine leiomyoma cells // Hum Reprod. – 2006. - №
21. – Р. 2408–16.
114. Yamada T., Nakago S., Kurachi O., Wang J., Takekida S., Matsuo H., Maruo T.
Progesterone down-regulates insulin-like growth factor-I expression in cultured human
uterine leiomyoma cells // Hum Reprod. - 2004. – Т. 19. № 4. – P. 815-21.
115. Yamada T., Nakago S., Kurachi O., Wang J., Takekida S., Matsuo H., Maruo T.
Progesterone down-regulates insulin-like growth factor-I expression in cultured human
uterine leiomyoma cells // Hum Reprod. – 2004. – Т. 19. № 4. – Р. 815-21.
116. Yin P., Lin Z., Cheng Y-H., et al. Progesterone Receptor Regulates Bcl-2 Gene
Expression through Direct Binding to Its Promoter Region in Uterine Leiomyoma Cells //
Clin Endocrinol Metab. – 2007. – Т. 92. № 11. – Р. 4459–66.
117. Yu L., Saile K., Swartz C.D., et al. Differential Expression of Receptor
Tyrosine Kinases (RTKs) and IGF-I Pathway Activation in Human Uterine Leiomyomas //
Molmed. – 2008. – Т. 14. № 5–6. – Р. 264–75.
118. Zaitseva M., Vollenhoven B. J., Rogers P.A. In vitro culture significantly alters
gene expression profiles and reduces differences between myometrial and fibroid smooth
muscle cells // Mol Hum Reprod. – 2006. – Т. 12. № 3. – P. 187-207.
119. Zelinski-Wooten M.B., Slayden O.D., Chwalisz K., Hess D.L., Brenner R.M.,
Stouffer R.L. Chronic treatment of female rhesus monkeys with low doses of the
antiprogestin ZK 137 316: establishment of a regimen that permits normal menstrual
cyclicity // Hum Reprod. – 1998. - №. 13. – Р. 259–267.