1 004385 2 Область, к которой относится изобретение

1
Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу очистки лютеинизирующего гормона (ЛГ),
а в частности к способу очистки рекомбинантного ЛГ (р-ЛГ) из образца неочищенного рекомбинантного ЛГ, предусматривающему комбинированное использование ионообменной
хроматографии и ВЭЖХ в обращенных фазах.
Лютеинизирующий гормон (ЛГ) представляет собой гонадотропин, секретируемый передней долей гипофиза вместе с другим гонадотропином, фолликулостимулирующим гормоном (ФСГ). Эти гормоны представляют собой
гетеродимеры, состоящие из нековалентно связанных α- и β-субъединиц.
Указанные гонадотропины стимулируют
нормальное функционирование гонад и секрецию половых гормонов, как у мужчин, так и у
женщин. У женщин, фолликулостимулирующий
гормон стимулирует развитие и созревание
фолликулов и яйцеклетки. По мере созревания
фолликула, в нем продуцируется эстроген в
возрастающих количествах, который в середине
цикла стимулирует высвобождение ЛГ. Это
приводит к разрыву фолликула и овуляции, после чего фолликул превращается в желтое тело,
которое секретирует прогестерон. У мужчин
лютеинизирующий гормон стимулирует секрецию тестостерона интерстициальными клетками
яичек, который, в свою очередь, оказывает непосредственное действие на семявыводящие
канальцы. Гонадотропные вещества с лютеинизирующей или фолликулостимулирующей активностью, или с той и другой активностью,
используются для лечения бесплодия, главным
образом у женщин, но также и у мужчин. Такими веществами является хорионический гонадотропин, который обладает ЛГ-активностью, и
гонадотропины менопаузы человека, которые
обладают как ЛГ-, так и ФСГ-активностью. Были проведены исследования для выявления возможности использования ДНК-кодируемого
рекомбинантного лютеинизирующего гормона
человека (рек.ч.ЛГ) как альтернативы хорионическому гонадотропину или возможности его
введения в сочетании с ФСГ.
Для выделения и очистки ЛГ были использованы различные методы, такие как ионообменная хроматография, гель-фильтрация и иммуноаффинная хроматография (Jack, G.W.,
Blazek, R., James, K.Boyd, J.E. & Micklem, L.R.
The automated production by immunoaffinity
chromatography of the human pituitary glycoprotein hormones thyrotropin, follitropin and lutropin.
Journal of Chemical Technology and Biotechnology 39, 45-58, 1987).
Для выделения этих гормонов была использована ионообменная хроматография, однако, применение этого метода осложняется
несколькими взаимосвязанными проблемами,
обусловленными присутствием значительной
гетерогенности заряда ЛГ в ткани гипофиза. Во-
004385
2
первых, поскольку эти гликопротеины и ФСГ
имеют перекрывающиеся заряды, то полное их
разделение представляет определенные трудности и является трудоемким процессом. Вовторых, очистка этих гормонов в виде отдельных фракций может оказаться затруднительной
(Stockell Hartree, A., Thomas, M., Furnival, B.E.,
Burns, T.W. & Langley, P. Thyroid-stimulating and
lipolytic activities of purified preparations of human thyroid-stimulating hormone. Journal of Endocrinology 53, 95-100, 1972). В результате, некоторые заряженные формы данного гормона могут быть отобраны в процессе очистки, как
предлагалось в случае ЛГ (Storring, P.L., Zaidi,
A.A., Mistry, Y.G., Lindberg, M., Stenning, B.E. &
Diczfalusy, E. A comparison of preparations of
highly purified human pituitary luteinising
hormone: differences in the luteinising hormone
potencies as determined by in vivo bioassays, in
vitro bioassay and immunoassay. Acta Endocrinologica 101, 339-342, 1982). Селективная очистка,
кроме того, усложняет характеристику этих гетерогенных форм, включая структурный анализ
их углеводных компонентов. Различия в составе
анионных олигосахаридов, которые содержат
сиалильные и сульфатные группы, может быть
основной причиной гетерогенности заряда в ЛГ.
Были описаны стандартные методы фракционирования для получения мочевого лютеинизирующего гормона человека (ЛГ) с эффективностью 982 МЕ/мг по данным биологического анализа и 1166 ME по данным радиоиммуноанализа (Donini S. & Donini P. Acta endocr.,
Copenh. 63, Suppl. 142, 257-277, 1969). Иммуноабсорбент в виде кроличьей антисыворотки для
очищенного хорионического гонадотропина
человека (ЧХГ) был использован для очистки
ЛГ из главных и боковых фракций, приготовленных в процессе получения фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) из мочи, взятой в
период менопаузы (van Hell, H., Schuurs
A.H.W.M. & den Hollander, F.C. In Symposium on
gonadotrophins. New York, 17 June 1971. Eds.
B.B. Saxena, C.G. Beling & H.M. Gandy. New
York: John Wiley & Son, Inc. 1972) . Полученный
препарат
имел
более
высокую
ЛГэффективность, а также и более высокие отношения ФСГ:ЛГ, чем те, которые были получены
методом Donini & Donini (1969).
Рекомбинантный ЛГ имеет то преимущество, что он не содержит других гонадотропных
гормонов, таких как ФСГ и ТСГ. Однако неочищенный препарат рекомбинантного ЛГ содержит все остальные белки и примеси, содержащиеся в клетке, используемой для его рекомбинантного продуцирования, а поэтому разработка метода достижения абсолютной чистоты
рекомбинантного лютеинизирующего гормона
является крайне необходимой.
Краткое описание изобретения
Авторами настоящего изобретения было
обнаружено, что неочищенный препарат ЛГ,
3
происходящий от образца культуральной среды,
полученной в процессе осуществления рекомбинантных процедур, или из неочищенного
концентрата мочи, взятой после менопаузы,
может быть очищен до такой степени, что полученный ЛГ практически не будет содержать
белков и/или других примесей, находящихся в
неочищенном препарате ЛГ. В зависимости от
исходного материала, белок и другие примеси
происходят от человека (исходный материал:
гонадотропины, образующиеся в человеческом
организме после менопаузы) или от клеткихозяина, например, СНО в случае, если клеткойхозяином является СНО.
Данный способ очистки основан на использовании ионообменной хроматографии и
обращенно-фазовой ВЭЖХ. Дополнительное,
но необязательное использование гельпроникающей колонки позволяет удалять любые остаточные следовые количества примесей из
чистого препарата ЛГ. Оптимальные результаты
получаются при осуществлении двух этапов
ионообменной хроматографии и двух этапов
обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Способ настоящего изобретения может
быть использован для очистки рекомбинантного
ЛГ, происходящего от образца культуральной
среды, полученной в процессе осуществления
рекомбинантных процедур, так, чтобы полученный в высокой степени очищенный ЛГ практически не содержал, например, белков FBS, часто
встречающихся в культуральной среде, нуклеиновых кислот или других примесей, присутствующих в клетках-хозяевах, используемых в
данном рекомбинантном способе.
Способ настоящего изобретения может
быть также использован для очистки мочевого
ЛГ, полученного из неочищенного концентрата
мочи, образующейся в организме человека после менопаузы, и для очистки ЛГ, происходящего от других видов, а в частности, млекопитающих, включая, например, коров, лошадей, свиней, овец, крыс, мышей и обезьян.
Следовательно, целью настоящего изобретения является способ очистки ЛГ из образца,
предусматривающий комбинированное использование ионообменной хроматографии и обращенно-фазовой ВЭЖХ. Данный способ включает этапы, в которых образец (при необходимости, концентрированный) подвергают ионообменной хроматографии, а элюат подвергают
обращенно-фазовой ВЭЖХ. Кроме того, может
быть проведен дополнительный этап нанесения
элюата на гельпроникающую колонку.
В зависимости от чистоты исходного препарата, ионообменную хроматографию и обращенно-фазовую ВЭЖХ предпочтительно проводить дважды в целях получения оптимальных
результатов указанного способа очистки. Такой
способ может включать этапы
004385
4
(a) элюирования образца через ионообменную хроматографическую колонку с DEAECефарозой;
(b) элюирования через ионообменную
хроматографическую колонку с Q-Сефарозой;
(c) элюирования через обращенно-фазовую
ВЭЖХ-колонку с двуокисью кремния С18;
(d) повторного элюирования через обращенно-фазовую ВЭЖХ-колонку с двуокисью
кремния С18 [необязательно, другим элюентом
этапа (с)]; и
(е) элюирования через гельпроникающую
колонку.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения элюирование в процессе ионообменной хроматографии на DEAE-Сефарозе осуществляют в фосфатно-натриевом буфере при рН 8.
Элюирование в процессе ионообменной
хроматографии на Q-Сефарозе предпочтительно
осуществляют в аммонийацетатном буфере при
рН 7,5.
Этап (с) обращенно-фазовой ВЭЖХ предпочтительно осуществляют с использованием
смеси 2-пропанол/ацетат аммония в качестве
подвижной фазы.
Этап (d) обращенно-фазовой ВЭЖХ предпочтительно осуществляют с использованием
смеси 2-пропанол/Трис-НСl в качестве подвижной фазы.
ЛГ настоящего изобретения предпочтительно представляет собой человеческий ЛГ, а
наиболее предпочтительно, рекомбинантный
человеческий ЛГ, полученный из культуральной
среды клеток млекопитающих (предпочтительно, клеток СНО), используемых в данном рекомбинантном способе.
Другой целью настоящего изобретения является получение фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное
количество рекомбинантного ЛГ, продуцированного рекомбинантным способом, описанным
выше, вместе с подходящими наполнителями,
такими как сахароза, необходимыми для стабилизации лиофилизованного продукта. Фармацевтическая композиция рекомбинантного ЛГ
является особенно подходящей для подкожного
введения.
Подробное описание настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к способу очистки ЛГ, а в частности, к способу очистки рекомбинантного ЛГ из неочищенного
препарата в культуральной среде, полученного
рекомбинантным способом. р-чЛГ получают с
высокой степенью чистоты и с высокой удельной
активностью, и этот препарат практически не
содержит белков фетальной бычьей сыворотки
(FBS), если они присутствуют в культуральной
среде, и нуклеиновых кислот или других примесей, находящихся в клетках-хозяевах, используемых в указанном рекомбинантном способе.
Настоящее изобретение относится к использованию биологических материалов, в ча-
5
стности, неочищенных смесей, содержащих ЛГ
и другие примесные белки и называемых в данной заявке образцами исходного материала. В
примерах, подробно описанных ниже, используются образцы исходного материала, содержащие р-чЛГ и полученные из среды супернатанта культуры в биореакторе. Альтернативно,
указанным образцом является гонадотропин,
образующийся в человеческом организме после
менопаузы (hMG), т.е. неочищенный концентрат мочи, взятой после менопаузы.
Указанный образец представляет собой
свежесобранную из биореактора среду супернатанта клеточной культуры. Предпочтительно,
он может быть осветлен путем фильтрации. Затем неочищенный раствор может быть концентрирован, если это необходимо, и подвергнут
ультрафильтрации для удаления материала,
имеющего молекулярную массу меньше 10.
Ультрафильтрация также позволяет заменить
используемый буфер фосфатно-натриевым буфером, рН 8.
После осуществления предварительных
этапов, образец подвергают ионообменной хроматографии и обращенно-фазовой ВЭЖХ, каждую из которых, предпочтительно, проводить
дважды. Первый этап ионообменной хроматографии предпочтительно осуществляют с использованием DEAE-Сефарозы. Этот этап, по
существу, является этапом "сквозного прохождения" ЛГ, при котором удаляется большая
часть белков, не являющихся ЛГ. Второй этап
ионообменной хроматографии предпочтительно
осуществляют на колонке с Q-Сефарозой. Этот
этап также является этапом "сквозного прохождения" ЛГ и предназначен для удаления возможных ДНК и клеток-хозяев или белковых
примесей среды. В предпочтительном варианте
осуществления изобретения этот этап проводят
при температуре примерно 5°С, элюируя аммонийацетатным буфером при рН 7,5.
Обращенно-фазовую хроматографию на
двуокиси кремния С18 также предпочтительно
осуществляют дважды, и эта хроматография
позволяет эффективно удалять следовые количества FBS, клеточного белка и эндотоксиновых
примесей. Первый этап ВЭЖХ предпочтительно
осуществляют с использованием смеси 2пропанол/ ацетат аммония в качестве подвижной фазы. Второй этап обращенно-фазовой
ВЭЖХ предпочтительно осуществляют с использованием смеси 2-пропанол/Трис-НСl в
качестве подвижной фазы. Затем раствор ретентата концентрируют, после чего он может быть
выделен с использованием бикарбоната аммония, рН 8. Концентрированный продукт предпочтительно подвергают гельпроникающей
хроматографии на Сефакриле S100 HR. На этом
этапе, разделение молекул по размерам достигается при элюировании бикарбонатом аммония,
рН 8, а затем, элюат предпочтительно подвергают фильтрации для удаления вирусных при-
004385
6
месей, после чего проводят ультрафильтрацию
на мембранах с 10 кДа-отсечкой в фосфатнонатриевом буфере, рН 8. После фильтрации
очищенную массу ЛГ предпочтительно хранят в
стерильных сосудах при низкой температуре.
Пример 1.
Реагенты.
Уксусная кислота (ледяная), аналитической чистоты (Ph.Eur.)
Ацетат аммония, аналитической чистоты
Бикарбонат аммония, аналитической чистоты (В.Р.)
Двухосновный фосфат натрия, аналитической чистоты
Соляная кислота, аналитической чистоты
(Ph.Eur.)
Фосфорная кислота, аналитической чистоты (Ph.Eur.)
2-Пропанол, аналитической чистоты (Ph.Eur.)
Хлорид натрия, аналитической чистоты
(Ph.Eur.)
Одноосновный фосфат натрия, аналитической чистоты
Гранулы гидроксида натрия, аналитической чистоты (Ph.Eur.)
Трифторуксусная кислота (TFA), ВЭЖХчистоты
Трис-(гидроксиметил)аминометан, аналитической чистоты
Вода для инъекций (WFI) (Ph.Eur.)
Краткая блок-схема способа очистки.
Табл. 1 представляет собой блок-схему, в
которой систематизирован способ очистки рчЛГ, иллюстрирующий принципы осуществления каждого из промежуточных этапов.
Таблица 1
Блок-схема, в которой систематизирован способ
очистки р-чЛГ
Культуральная среда из биореактора
Ультрафильтрация (10 кДа)
Этап I
Сбор концентрированного
неочищенного р-чЛГ
Сбор объединенного, концентрированного неочищенного р-чЛГ
DEAE-Сефароза CL-6B
Этап II
Несвязанная фракция содержит р-чЛГ
Ультрафильтрация (100 кДа)
Ультрафильтрация (10 кДа)
Q-Сефароза FF
Этап III
Несвязанная фракция содержит р-чЛГ
1-ая ОФ-ВЭЖХ
Этап IV
Элюат содержит р-чЛГ
2-ая ОФ-ВЭХХ
Этап V
Элюат содержит р-чЛГ
Ультрафильтрация (10 кДа)
Сефакрил S100 HR
Несвязанная фракция содержит р-чЛГ
Этап VI
Ультрафильтрация (10 кДа)
Ретентат содержит р-чЛГ
Раствор всего р-чЛГ
7
Осветление, концентрирование, диализ и
фильтрация сборов (этап I).
На данном этапе (этапе I) , буфер заменяют
так, чтобы он имел регулируемый состав, и получают исходную концентрацию. Этот этап
осуществляют примерно при +5°С и повторяют
отдельно для каждого сбора в течение цикла
продуцирования в биореакторе. Предпочтительный интервал температуры составляет
5±3°С.
(i) Осветление сборов.
После получения свежесобранной культуральной среды из биореактора, этот материал
предпочтительно обрабатывают, начиная с осветления раствора супернатанта путем фильтрации.
(ii) Концентрирование/диализ сборов.
Мембраны, которые между получением
партий хранились в 0,05 М гидроксиде натрия,
промывают в WFI до тех пор, пока рН не
уменьшится приблизительно до 8.
Затем воду заменяют уравновешивающим
буфером, 0,025М фосфатом натрия, рН 8. После
кондиционирования, неочищенный раствор рчЛГ из биореактора концентрируют и диализуют для удаления материала, имеющего молекулярную массу ниже 10 кДа (с отсечкой мембраной молекулярной массы 10 кДа).
Полученный концентрат хранят приблизительно при -15°С.
Ионообменная хроматография на DEAEСефарозе CL-6B (этап II).
Данный хроматографический этап представляет собой этап "сквозного прохождения" рчЛГ, в котором большая фракция белков, не
являющихся р-чЛГ, удаляется, после чего раствор концентрируют и диализуют. Хроматографические стадии, в которых продукт пропускают через колонку, осуществляют в холодном
помещении.
(i) Ионообменная хроматография на
DEAE-Сефарозе CL-6B.
Колонку упаковывают слабо заряженной
анионообменной смолой, диэтиламиноэтан
(DEAE)-Сефарозой, уравновешенной, в первом
случае, 0,15М фосфатом натрия, рН 8. Предпочтительный диапазон рН составляет 8±0,3.
Затем колонку кондиционируют рабочим
буфером, 0,025М фосфатом натрия, рН 8. Предпочтительный диапазон рН составляет 8±0,3.
Раствор р-чЛГ загружают на колонку через
фильтрующее устройство, которое установлено
на колонке в качестве защиты.
В колонку загружают 0,025М фосфат натрия, рН 8. Предпочтительный диапазон рН составляет 8±0,3. Мониторинг хроматографического процесса осуществляют посредством
спектрофотометрии при 280 нм. Первый вытекающий поток (эффлюент) отбрасывают до тех
пор, пока базовая линия не пройдет отметку 5%ного поглощения. Несвязавшуюся фракцию,
004385
8
содержащую р-чЛГ, собирают до тех пор, пока
базовая линия не опустится до отметки 10%.
(ii) Ультрафильтрация.
Аппарат для ультрафильтрации, снабженный мембраной, дающей отсечение молекулярной массы 100 кДа, хранят в 0,05М NaOH и
промывают WFI до тех пор, пока рН пермеата
не достигнет приблизительно 8.
Затем воду заменяют уравновешивающим
буфером, 0,08М ацетатом аммония, рН 7,5.
Предпочтительный диапазон рН составляет
7,5±0,3.
Раствор р-чЛГ, полученный на этапе ионообменной хроматографии, подвергают ультрафильтрации через 100 кДа-мембрану и собирают фракцию пермеата.
Ультрафильтр промывают аликвотами
0,08М ацетата аммония, рН 7,5 и все промывочные фракции собирают в растворах пермеата.
(iii) Концентрирование/диализ.
Аппарат для ультрафильтрации, снабженный мембраной, дающей отсечение молекулярной массы 10 кДа, хранят в 0,05М NaOH и промывают WFI до тех пор, пока рН пермеата не
достигает приблизительно 8. Затем воду заменяют уравновешивающим буфером, 0,08М ацетатом аммония, рН 7,5. Раствор р-чЛГ концентрируют. Затем к ретентату добавляют ацетат
аммония 0,08М, рН 7,5, и раствор концентрируют. Диализ продолжают до тех пор, пока рН и
проводимость ретентата (удерживаемой фракции) не будут аналогичными рН и проводимости входящего буфера. Полученный ретентат
выделяют.
Ионообменная хроматография на QСефарозе Fast Flow (этап III).
Этот этап, так же, как и этап "сквозного
прохождения" р-чЛГ, предназначен для удаления возможно присутствующей ДНК и клетокхозяев или белковых примесей, присутствующих в среде.
(i) Уравновешивание колонки.
Кондиционирование колонки осуществляют рабочим буфером, 0,08М аммонийацетатным
буфером, рН 7,5. Предпочтительный диапазон
рН составляет 7,5±0,3.
(ii) Этап очистки р-чЛГ на Q-Сефарозе FF.
Раствор р-чЛГ загружают на колонку через
фильтрующее устройство, которое установлено
на колонке с Q-Сефарозой в качестве защиты.
Затем колонку еще раз промывают 0,08М
аммонийацетатным буфером, рН 7,5.
Первый эффлюент отбрасывают до тех
пор, пока базовая линия не пройдет отметку 5%ного поглощения.
Несвязавшуюся фракцию, содержащую рчЛГ, собирают до тех пор, пока базовая линия
не опустится до отметки 10%.
Раствор р-чЛГ из этапа III можно хранить
замороженным для последующего использования. При хранении при температуре -15°С или
ниже, промежуточный р-чЛГ оттаивают при
9
+5±3°С, а обычно в течение периода времени
24±8 ч перед проведением обращенно-фазовой
ВЭЖХ (этап IV).
Первая препаративная обращенно-фазовая
ВЭЖХ (этап IV).
Этот этап, проводимый при комнатной
температуре, является эффективным для удаления следовых количеств FBS/CHO-белка и эндотоксиновых примесей.
(i) Упаковка колонки и активация смолы.
Колонку упаковывают двуокисью кремния
С 18 с широким диапазоном размера пор, и если
эта С18-смола новая, то ее кондиционируют 2пропанолом.
(ii) Уравновешивание колонки.
Колонку уравновешивают 12,4% мас./мас.
2-пропанола в 0,05М аммонийацетатном буфере, рН 7. Предпочтительный диапазон рН составляет 7±0,2.
(iii) рН и коррекция объема р-чЛГраствора, полученного на этапе III.
Раствор р-чЛГ доводят до рН 7 добавлением концентрированной уксусной кислоты.
Предпочтительный диапазон рН составляет
7±0,2.
Затем регулируют объем раствора р-чЛГ
добавлением 2-пропанола до получения конечной концентрации 2-пропанола, равной 12,4%
мас./мас.
(iv) Фильтрация отрегулированного раствора р-чЛГ.
Аппараты для фильтрации, снабженные
0,22 мкм-фильтром, промывают 12,4% мас./мас.
2-пропанола в 0,05М аммонийацетатном буфере, рН 7. Предпочтительный диапазон рН составляет 7±0,2.
Отрегулированный раствор р-чЛГ фильтруют.
Сборник промывают аликвотами 12,4%
мас./мас. 2-пропанола в 0,05М аммонийацетатном буфере, рН 7, фильтруют и промывки объединяют с раствором р-чЛГ. Предпочтительный
диапазон рН составляет 7±0,2.
(v) Этап очистки р-чЛГ на первой колонке
С18 ОФ-ВЭЖХ.
Раствор р-чЛГ загружают на колонку и
мониторинг хроматографии осуществляют с
помощью УФ-спектрофотометрии при 280 нм.
На колонку подают 12,4% мас./мас. 2пропанола в 0,05М аммонийацетатном буфере,
рН 7, до тех пор, пока А280 снова не достигнет
базового уровня, после чего несвязавшуюся
фракцию отбрасывают.
Затем элюирование осуществляют с использованием смеси 2-пропанол/0,05 М ацетат
аммония в качестве подвижной фазы в линейном градиенте от 14,7 до 20,7% мас./мас. 2пропанола.
Когда А280 начинает увеличиваться, р-чЛГ
фракционируют. Все фракции р-чЛГ, которые
имеют высоту пиков, превышающую 20% от
полной шкалы, собирают.
004385
10
Препаративная обращенно-фазовая ВЭЖХ
на второй колонке (этап V).
Этот этап, проводимый при комнатной
температуре, является эффективным для удаления следовых количеств FBS/CHO-белка и эндотоксиновых примесей.
(i) Упаковка колонки и активация смолы.
Колонку упаковывают С18 с широким
диапазоном размера пор, и если эта C18-смола
новая, то ее кондиционируют 2-пропанолом.
(ii) Уравновешивание колонки.
Колонку уравновешивают 14,7% мас./мас.
2-пропанола в 0,5М буфере Трис-HCl, рН 7.
Предпочтительный диапазон рН составляет
7±0,2.
(iii) pH и коррекция объема р-чЛГраствора, полученного на этапе IV.
2М буфер Трис-HCl, pH 7, добавляют к
образцу р-чЛГ для доведения концентрации 2пропанола приблизительно до величины, равной
концентрации в буфере для уравновешивания
колонки (14,7% мас./мас.).
Раствор р-чЛГ доводят до pH 7 добавлением 12М НСl. Предпочтительный диапазон pH
составляет 7±0,2.
(iv) Этап очистки р-чЛГ на второй С18
ОФ-ВЭЖХ-колонке
Раствор р-чЛГ загружают на колонку и
мониторинг хроматографии осуществляют с
помощью УФ-спектрофотометрии при 280 нм.
На колонку подают 14,7% мас./мас. 2пропанола в буфере 0,5М Трис-HCl, pH 7.
Предпочтительный диапазон pH составляет
7±0,2. Несвязавшуюся фракцию отбрасывают.
Затем элюирование осуществляют с использованием смеси 2-пропанол/0,5М Трис-HCl
в качестве подвижной фазы в линейном градиенте от 14,7 до 20,7% мас./мас. 2-пропанола.
Когда А280 начинает увеличиваться, р-чЛГ
фракционируют. Все фракции р-чЛГ, которые
имеют высоту пиков, превышающую 20% от
полной шкалы, объединяют.
(v) Диализ.
Раствор р-чЛГ, полученный на втором этапе С18 ОФ-ВЭЖХ, разбавляют WFI. Предпочтительно использовать 8 объемов WFI.
Разбавленный раствор р-чЛГ диализуют
посредством ультрафильтрации на 10 кДамембране (см. этап II) против WFI. Затем добавляют аликвоты 0,5М бикарбоната аммония, pH
8, и диализ продолжают до тех пор, пока параметры аммонийбикарбонатного буфера не будут
удовлетворять нужным требованиям.
Раствор ретентата концентрируют до конечного объема приблизительно 1 л и выделяют. Ультрафильтр промывают 0,5М бикарбонатом аммония, pH 8, и промывки после ультрафильтрации объединяют с ретентатом и снова,
но необязательно, концентрируют. Это дополнительное концентрирование зависит от размера колонки, используемой на следующем этапе,
т.е. на этапе VI.
11
Гельпроникающая хроматография на Сефакриле S100 HR и ультрафильтрация (этап VI).
На этом этапе достигается разделение, основанное на размере молекул, и раствор подвергают ультрафильтрации. Все операции, осуществляемые на данном этапе, проводят при температуре примерно +5°С. Предпочтительный
диапазон температуры составляет +5°С±3.
(i) Гельпроникающая хроматография на
Сефакриле S100 HR.
Колонку упаковывают Сефакрилом S100
HR и уравновешивают в первом случае WFI.
Затем колонку уравновешивают 0,5М бикарбонатом аммония, рН 8.
Колонку загружают 0,5М бикарбонатом
аммония, рН 8. Мониторинг процесса хроматографии осуществляют с помощью спектрофотометрии при 280 нм.
Когда А280 начинает увеличиваться, р-чЛГ
фракционируют. Все фракции р-чЛГ, которые
имеют высоту пиков, превышающую 20% от
полной шкалы, объединяют.
Затем раствор р-чЛГ, элюированный с колонки с Сефакрилом S100 HR, предпочтительно
пропускают
через
фильтр,
например,
Virosolve™, для удаления вирусных примесей.
(ii) Диализ и концентрирование р-чЛГ.
Мембраны (10 кДа-мембраны для ультрафильтрации), которые хранились в 0,05М гидроксиде натрия между процессами очистки,
промывают WFI до тех пор, пока рН не снизится примерно до 8.
Разбавленный раствор р-чЛГ диализуют (с
использованием 10 кДа-мембран для ультрафильтрации) против WFI. Затем добавляют аликвоты 0,01М фосфатно-натриевого буфера, рН
8, и диализ продолжают до тех пор, пока параметры фосфатно-натриевого буфера не будут
удовлетворять нужным требованиям.
Если необходимо, раствор ретентата концентрируют до конечного объема приблизительно 500 мл и выделяют. Ультрафильтр промывают 0,01М фосфатно-натриевым буфером,
рН 8, и промывки после ультрафильтрации объединяют с ретентатом.
Дополнительный необязательный этап
концентрирования может быть осуществлен в
зависимости от условий хранения.
Раствор р-чЛГ фильтруют и фильтрат собирают в стерильном сосуде.
Очищенный объем р-чЛГ предпочтительно
хранят в стерильных сосудах, примерно при
-15°С.
Реагенты, буферы, элюаты и химические
вещества.
Хроматографические смолы.
В современных способах очистки используются указанные ниже хроматографические
смолы. В этом способе очистки могут быть также использованы эквивалентные смолы.
004385
12
Этап
II:
DEAE-Сефароза
CL-6B
(Pharmacia)
Этап III: Q-Сефароза Fast Flow (Pharmacia)
Этап IV: Двуокись кремния С18 ОФВЭЖХ (Waters)
Этап V: Двуокись кремния С18 ОФ-ВЭЖХ
(Waters)
Этап VI: Сефакрил S100 HR (Pharmacia)
Поставщиками являются
Amersham Pharmacia Biotech,
Björkgatan 30
S-751 84, Uppsala
Sweden
Waters Corporation
34 Maple Street
Milford, MA 01757
USA
Результаты
Биологическая активность.
Биологическая активность различных серий р-ЛГ после очистки способом настоящего
изобретения представлена в табл. 2. Концентрацию белка (мг белка ЛГ/мл) определяли с помощью спектрофотометрии при 276,5 нм с использованием коэффициента поглощения, экспериментально определенного, исходя из анализа аминокислотной последовательности а=0,812.
Средняя удельная активность препарата рЛГ является особенно высокой и составляет
примерно 25000 МЕ/мг (белка ЛГ).
Таблица 2
Удельная активность объемных партий р-чЛГ
Лот №
Удельная активность, МЕ/мг
BLCA 9802
28173
BLCA 9803
25819
BLCA 9804
27472
BLCA 9805
31229
BLCA 9806
26995
BLCA 9808
26279
BLCA 9809
20522
BLCA 9810
22275
BLCA 9811
27642
BLCA 9812
29941
BLCA 9813
28345
BLCA 9814
27581
BLCA 9815
24541
Композиции.
Лиофилизованные композиции были получены с использованием высокоочищенного
рекомбинантного ЛГ настоящего изобретения.
В качестве типичного примера может служить лиофилизованная композиция с концентрацией 75 ME, которая была получена в сосудах DIN 2R с использованием сахарозы в качестве наполнителя (табл. 3) и которая оставалась
стабильной при 4°С в течение нескольких месяцев.
13
004385
Таблица 3
Название ингредиентов
Разовая форма
Активный ингредиент
Рекомбинантный человеческий ЛГ 3,4 мкг (75 ME)
Другие ингредиенты
Сахароза
47,75 мг
Твин 20
0,05 мг
Дигидрат бифосфата натрия
0,825 мг
Моногидрат монофосфата натрия
0,052 мг
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ выделения лютеинизирующего
гормона (ЛГ) из образца, предусматривающий
использование ионообменной хроматографии на
анионообменной смоле и обращенно-фазовой
ВЭЖХ.
2. Способ по п.1, включающий этапы
(a) проведения хроматографии образца на
ионообменной колонке с получением первого
элюата;
(b) проведения обращенно-фазовой ВЭЖХ
первого элюата с получением второго элюата;
(c) проведения гельпроникающей хроматографии второго элюата.
3. Способ по п.1 или 2, где указанную обращенно-фазовую ВЭЖХ и гельпроникающую
хроматографию осуществляют дважды.
4. Способ по п.3, где ионообменную хроматографию и обращенно-фазовую ВЭЖХ осуществляют дважды на другой матрице и/или в
других рабочих условиях.
5. Способ по любому из пп.1-4, где этап
ионообменной хроматографии осуществляют с
использованием DEAE-Сефарозы в качестве
твердого носителя.
6. Способ по любому из пп.1-5, где этап
ионообменной хроматографии осуществляют с
использованием Q-Сефарозы в качестве твердого носителя.
7. Способ по любому из пп.1-6, где этап
обращенно-фазовой ВЭЖХ осуществляют с
использованием двуокиси кремния С18 в качестве твердого носителя.
8. Способ по любому из пп.1-4, включающий этапы
(a) элюирования образца через ионообменную хроматографическую колонку с DEAEСефарозой;
14
(b) элюирования через ионообменную
хроматографическую колонку с Q-Сефарозой;
(c) элюирования через обращенно-фазовую
ВЭЖХ-колонку с двуокисью кремния С18.
9. Способ по п.8, включающий дополнительный этап
(d) повторного элюирования через обращенно-фазовую ВЭЖХ-колонку с двуокисью
кремния С18.
10. Способ по любому из пп.5-9, где элюирование в процессе ионообменной хроматографии на DEAE-Сефарозе осуществляют в фосфатно-натриевом буфере при рН 8.
11. Способ по любому из пп.5-10, где
элюирование в процессе ионообменной хроматографии на Q-Сефарозе осуществляют в аммонийацетатном буфере при рН 7,5.
12. Способ по п.8, где этап (с) осуществляют с использованием смеси 2-пропанол/ацетат аммония в качестве подвижной фазы.
13. Способ по п.9, где этап (d) осуществляют с использованием смеси 2-пропанол/ТрисНСl в качестве подвижной фазы.
14. Способ по любому из пп.1-13, где указанным ЛГ является человеческий ЛГ.
15. Способ по любому из пп.1-14, где указанным ЛГ является рекомбинантный ЛГ.
16. Способ по любому из пп.1-15, где указанным образцом является культуральная среда
клеток СНО.
17. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество
рекомбинантного ЛГ, полученного способом по
п.15, и подходящие наполнители.
18. Фармацевтическая композиция по п.17,
где указанным наполнителем является сахароза.
19. Фармацевтическая композиция по
пп.17 и 18 для подкожного введения.
20. Препарат рекомбинантного ЛГ, имеющий удельную активность от 20522 до 31229
МЕ/мг.
21. Препарат рекомбинантного ЛГ, имеющий удельную активность примерно 25000
МЕ/мг.
22. Препарат рекомбинантного ЛГ по п.20
или 21, где указанным ЛГ является человеческий ЛГ.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6