Метилотрофные дрожжи как продуценты рекомбинантных белков

Курс лекций «Биотехнология прокариот»
Метилотрофные дрожжи как
продуценты рекомбинантных
белков
Расшифровка и анализ экспрессии генома
термотолерантных метилотрофных дрожжей
Hansenula polymorpha DL1, - перспективного
продуцента рекомбинантных белков
Н.В. Равин
Центр «Биоинженерия» РАН
Метилотрофные дрожжи Hansenula
polymorpha DL1
Несколько штаммов выделено
начиная с 1950-х годов
- объект фундаментальных
исследований биологии дрожжей
- продуцент рекомбинантных белков
Особенность - термотолерантность
Независимо выделенные штаммы Hansenula polymorpha,
реально представляющие разные виды и даже рода:
CBS4732 (CCY38-22-2; ATCC34438, NRRL-Y-5445)
DL-1 (NRRL-Y-7560; ATCC26012)
NCYC495 (CBS1976; ATAA14754, NRLL-Y-1798)
Пути метаболизма метанола у
метилотрофных дрожжей
- возможность использования метанола в качестве
недорогого субстрата для роста
-возможность индуцированной экспрессии
Генная инженерия: направленная инкативация
хромосомных генов
HR: гомологичная рекомбинация
NHEJ: негомологичное соединение концов
Направленная инкативация хромосомных генов
«split-marker» метод
Рекомбинантные белки, получаемые в
дрожжах Hansenula
Для разработки биоинженерных штаммов H. polymorpha,
обеспечивающих высокий уровень продукции белка и его
секрецию при отсутствии протеолиза, и/или оптимизированных
для переработки различного сырья, необходимо знание путей
метаболизма, механизмов синтеза и секреции белков.
Основой для этого является расшифровка полной геномной
последовательности, дающая доступ ко всей генетической
информации организма.
Анализ экспрессии генов позволяет установить, какие наборы
генов экспрессируются в определенных условиях и, тем самым
идентифицировать активные промоторы и провести анализ
основных путей метаболизма
Цель работы - определение нуклеотидной последовательности
генома метилотрофных дрожжей H. polymorpha DL1 и
полногеномный анализ транскрипции при выращивании
штамма на метаноле и сахарах
Секвенирование полных геномов –
общие принципы
Длина генома – 107 нт
Длина чтения одной реакции –
35-700 нт
Необходимо разбиение генома
на короткие фрагменты
случайная
фрагментация
сиквенс
фрагментов
полный геном
Сборка «контигов»
заполнение
«брешей» - ПЦР
При случайном выборе фрагментов
требуемый объем секвенирования
многократно превышает длину генома
1400
1200
Contigs
1000
800
600
400
200
0
0
1
2
3
4
5
Coverage
6
7
8
9
Почему так нельзя просеквенировать геном
полностью?
1. Необходимость упорядочивать контиги: число вариантов - N2
заполнение «брешей» - ПЦР
2. Если в геноме имеется повторяющийся участок ДНК, длина
которого превышает длину чтения индивидуальной реакции –
однозначная сборка генома невозможна
1
2
3
4
или
1
3
2
4
Библиотеки парных чтений позволяют
упорядочить контиги в цепочки и решить
проблему повторов
2 - 40тпн
случайная
фрагментация
полный геном
сиквенс фрагментов с
двух концов
упорядочивание
контигов в цепочки
заполнение «брешей» - ПЦР
Расшифровка генома H. polymorpha – основа
для создания генно-инженерных штаммов
продуцентов
Использованная методика: параллельное пиросеквенирование
-библиотека «случайных фрагментов» геномной ДНК
-библиотека парно-концевых фрагментов
Хромосома
Контиги (нт)
Общая длина
GC
состав(%)
1
297,310 + 7,737(x25) +
650,519
1,141,254
48.9
2
990,963
990,963
48.2
3
1,273,462
1,273,462
49.0
4
366,734 + 922,894
1,289,628 *
47.7
5
1,330,267
1,330,267
48.3
6
1,514,933
1,514,933
46.7
7
1,515,570
1,515,570
46.4
9,056,077
47.8
Total
Аннотация генома: идентификация генов и
предсказание их функций
Использованная методика: поиск открытых рамок считывания в геноме
+ секвенирования транскриптома (кДНК)
Coding sequences (% of total)
84,4
Average gene length (bp)
1416
Average exon frequency
1,09
Average exon length
1289
Average intron length
65
rRNA genes
3 (x 25)
tRNA genes
80
Protein-coding genes
5325
Proteins with GO terms
2396
Proteins with EC numbers
1041
Основные характеристики геномов
H. polymorpha, D. bruxellensis и P. pastoris
Вид
Число
хромосо
м
Размер
генома
(млн нт)
GC
соста
в
Число
генов
(CDS)
Размер
CDS
(кодоны)
CDS/
10 тпн
Dekkera
bruxellensis CBS
2499
?
13,39
39,9
5636
440
4,21
Pichia pastoris
GS115
4
9,22
41,1
5040
476
5,46
Hansenula
polymorpha DL1
7
9,л6
47.8
5325
469
5,88
Анализ геномных данных: филогенетическое
положение штамма H. polymorpha DL1
дерево построено методом
Maximum Likelihood на основе
конкатенированного алаймента
153 белков, присутствующих в
42 секвенированных геномов
грибов и дрожжей
Равномерное или преимущественно
субтеломерное распределение представителей
двух мультигенных семейств в геноме H.
polymorpha
"Субтеломерное" семейство
представлено MFSтранпортерами (115 копий в
геноме, показаны красным),
"равномерно распределенное"
по геному – белками с armadilloподобным доменомs (68 копий
на геном, показаны зеленым).
Кластеризация LTR элементов в АТ богатом
участке хромосомы 3
(А) «GC-профиль» хромосомы 3. Прямоугольником выделен АТ богатый островок.
Б) Кластер LTR элементов группы Ty/Copia в составе АТ-богатого островка. LTR
элементы выделены как зеленые стрелки, цифры обозначают номера генов. Один
из генов кодирует полноразмерный полипротеин TyCopia элемента.
Генные и геномные дупликации и повторы
Общая избыточность генома, определенная как отношение общего количества
белок-кодирующих генов (5325) к общему числу уникальных белковых семейств
(4217) составляет, таким образом, для H. polymorpha 1,26 - значение, близкое к
рассчитанному для "протоплоидных сахаромицетов.
Сравнение геномов H. polymorpha DL1,
D. bruxellensis CBS2499 и P. pastoris GS115
Сравнение наборов белок-кодирующих последовательностей
Сравнение геномов H. polymorpha DL1,
D. bruxellensis CBS2499 и P. pastoris GS115
Сравнение геномов P. pastoris, H. polymorpha, D. bruxellensis методом Dot-Plot
Геномы D. bruxellensis и H. polymorpha обладают более высокой степенью
синтении по сравнению с парой P. pastoris и H. polymorpha
Сравнение геномов H. polymorpha DL1,
D. bruxellensis CBS2499 и P. pastoris GS115
Карта синтении в МОХ локусе H. polymorpha и ортологичных локусах D. bruxellensis
и P. pastoris. Ген МОХ выделен прямоугольником
Геномы D. bruxellensis и H. polymorpha обладают более высокой степенью
синтении по сравнению с парой P. pastoris и H. polymorpha
Сравнение геномов H. polymorpha DL1,
D. bruxellensis CBS2499 и P. pastoris GS115
Карта синтении в МОХ локусе H. polymorpha и ортологичных локусах
D. bruxellensis и P. pastoris. Ген МОХ выделен прямоугольником
Встречаемость и сходство белковых
последовательностей ферментов пути
утилизации метанола у аскомицетов
Слева – филогенетическое
дерево видов Saccharomycotina и
Pezizomycotina. Справа –
таблица, отражающая наличие
ортологов генов пути утилизации
метанола H. polymorpha- MOX,
FLD, FDH, DAS.
Размеры цветных прямоугольников
пропорциональны степени
идентичности между белками H.
polymorpha и их ортологами у
дрожжей и грибов с полностью
расшифрованными геномами.
Встречаемость и сходство белковых
последовательностей ферментов пути
утилизации метанола у аскомицетов
Comparison of phylogenetic trees of MOX proteins and phylogenomic trees of
MOX genomes in Ascomycetes
Встречаемость и сходство белковых
последовательностей ферментов пути
утилизации метанола у аскомицетов
Потеря способности к утилизации метанола в некоторых линиях –
результат единичных делеций
Полногеномный анализ транскрипции –
секвенирование кДНК
В результате секвенирования препаратов кДНК получено 733.393
независимых чтения для образца, культивированного на среде с
метанолом, и 709.815 чтений для образца, росшего на среде с
глюкозой.
Из них 94.1% и 95.0% картировались на геноме H. polymorpha, и, в
свою очередь 90% и 88% картированных чтений соответствовали
экзонам генов.
Для количественного определения уровней экспрессии генов
проводили нормировку т.е. определяли количество картированных
на данный ген чтений как долю от общего числа картированных на
геном чтений с учетом длины гена.
Из 5325 генов, аннотированных в геноме H. polymorpha, экспрессия
наблюдалась для 5238 хотя-бы в одних условиях роста. Индукции
при росте на метаноле (относительно роста на глюкозе)
подвергались 2312 генов, 968 генов репрессировались
Полногеномный анализ транскрипции –
секвенирование кДНК
Транскрипционный ландшафт генома H.
polymorpha.
«Температурная» карта, показывающая
хромосомное распределение
транскрибируемых генов в
соответствии с уровнем их экспрессии
(log2 от нормализованного числа
чтений).
G – клетки, выращенные на глюкозе,
M –клетки, выращенные на метаноле.
Полногеномный анализ транскрипции –
секвенирование кДНК
Дифференциальная экспрессия генов H. polymorpha, распределенных по
различным KEGG категориям в условиях роста клеток на метаноле и глюкозе
Метаболизм: 1 – Метаболизм углеводов , 2 – Энергетический метаболизм, 3 – Метаболизм
липидов, 4 – Метаболизм нуклеотидов, 5 –Метаболизм аминокислот, 6 – Биосинтез и метаболизм
гликанов, 7- Метаболизм кофакторов и витаминов, 8 – Биосинтез вторичных метаболитов, 9 –
Биодеградация и метаболизм ксенобиотиков. Переработка генетической информации: 1л Транскрипция, 11 - Трансляция, 12 – Фолдинг, сортинг, деградация белков, 13 – Репликация и
репарацияr. Переработка информации о внешней среде: 14 – Передача сигнала. Клеточные
процессы: 15 – Транспорт и катаболизм, 16 - Пролиферация и смерть клеток. Фракция генов,
экспрессия которых индуцируется на метаноле указана зеленым, генов, экспрессия которых генов
индуцируется на глюкозе – красным, генов с конститутивной экспрессией в этих условиях –
желтым.
Полногеномный анализ транскрипции –
секвенирование кДНК
Функция
Gene ID
Нормализированное
покрытие (x106)
глюкоза
LOG2 (M/G)
метанол
Утилизация метанола
Аlcohol oxidase
HPODL_3886
23.72
15669.48
9.37
Сatalase
HPODL_4626
148.28
12011.77
6.34
Dihydroxyacetone
synthase
HPODL_4602
11.86
12304.39
10.02
HPODL_4538
1.48
756.17
8.99
HPODL_1039
22.24
817.01
5.20
Formaldehyde
dehydrogenase
HPODL_2554
628.71
18455.13
4.88
S-formylglutathione
hydrolase
HPODL_3324
222.42
8423.59
5.24
Formate dehydrogenase
HPODL_3145
10.38
19760.32
10.89
Dihydroxyacetone kinase
Полногеномный анализ транскрипции –
секвенирование кДНК
Ген
Рост с глюкозой
(нормализованно
е число чтений)
Рост с метанолом
(нормализованное
число чтений)
Изменение
экспрессии
метанол
/глюкоза (Log 2)
Продукт гена
HPODL_3074
26764,5
97,1
-8,1
hypothetical protein
HPODL_0974
20788,8
8010,7
-1,4
Elongation factor 1-alpha 1
HPODL_0153
19737,5
4286,4
-2,2
General control protein GCN4
HPODL_3666
16724,5
21204,6
0,3
HPODL_1451
13600,2
15,9
-9,7
hypothetical protein
Alcohol dehydrogenase 2
HPODL_1336
11109,1
1322,6
-3,1
Acetolactate synthase small subunit,
mitochondrial
HPODL_5269
10582,7
184,0
-5,8
hypothetical protein
HPODL_0674
9209,7
97,1
-6,6
ATP-dependent RNA helicase fal-1
HPODL_3277
8214,7
945,9
-3,1
Argininosuccinate synthase
HPODL_1785
7909,2
8600,3
0,1
HPODL_1893
7838,1
3741,7
-1,1
PHO85 cyclin CLG1
-1,0
Glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase
HPODL_4957
6849,0
3381,0
Pyrimidine precursor biosynthesis enzyme
THI13
Гены, наиболее активно экспрессирующиеся при росте на глюкозе
Полногеномный анализ транскрипции –
секвенирование кДНК
Ген
Рост с глюкозой
(нормализованно
е число чтений)
Рост с метанолом
(нормализованное
число чтений)
Изменение
экспрессии
метанол/ глюкоза
(Log 2)
HPODL_3666
16724,5
21204,6
0,3
HPODL_3145
10,4
19760,3
10,9
Продукт гена
Alcohol dehydrogenase 2
Formate dehydrogenase
HPODL_2554
628,7
18455,1
4,9
S-(hydroxymethyl)glutathione
dehydrogenase
HPODL_3886
23,7
15669,5
9,4
Alcohol oxidase
HPODL_2008
206,1
12741,9
6,0
Transaldolase
HPODL_4602
11,9
12304,4
10,0
HPODL_4626
148,3
12011,8
6,3
Peroxisomal catalase
HPODL_2395
553,1
11661,2
4,4
Sugar (and other) transporter
HPODL_3669
2950,8
9988,1
1,8
Fructose-bisphosphate aldolase
HPODL_0752
2087,8
9019,0
2,1
60S ribosomal protein L2
Dihydroxyacetone synthase
Гены, наиболее активно экспрессирующиеся при росте на метаноле
Центр «Биоинженерия» РАН
Равин Н.В.
Эльдаров М.А.
Кадников В.В.
Белецкий А.В.
Марданов А.В.
Марданова Е.С.
Скрябин К.Г.
Москва, просп. 60-летия Октября, 7/1
nravin@biengi.ac.ru
В сотрудничестве:
Химический факультет МГУ
Bielefeld University