^ ^ « а

. .
<^'^
^^«а
Институт бнологвв моря
Дальневосточного отделения РАН
ЛАМАШ
Нина Евгеньевна
СВОЙСТВА АДЕНИЛАТЦИКЛАЗНОИ СИСТЕМЫ
ООЦИТОВ МОРСКИХ ОВЕЗД И ЕЖЕЙ
Специальность 03.00.11 - эмбрнологиа, гистология и
цитология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертёщил на соискание ученой степени
кандидата бнологнчесхих наутк
Владивосток
1993
Работа Былопнена в пабораторин цитофиоиологви и фармакологии
Института биологии мора ДВО РАН
Научный руководитель:
доктор биологических наук
Ю.С. Хотимченко
Официальные оппоненты:
доктор биологических иаух
кандидат биопогичесхих наук
А.А. Максимович
П.М. Жадан
Ведущее научно-исследовательское учреждение:
Институт эволюционной фиоиологии и биохимии им. И.М. Сеченова,
С.-Петербург.
Защита диссертации состоится
_1994 г. в ' ^ часов на
оаседании Специааиоированного совета К 003.66.02. при Институте би­
ологии моря ДВО РАН по адресу: 690041 г. Владивосток, Пальчевского
17, Институт биологии моря.
. С диссертацией можио оонакомитьса в Центральной библиотеке ДВО
РАН.
Ученый секретарь Совета
кандидат биологических наук
С М . Гнвздилова
ОБЩАЯ Х А Р А К Т Е Р И С Т И К А Р А Б О Т Ы
Актуальность проблемы. Расшифровка механиоиов действия биологи­
чески актив}1ых веществ на клеткн-митпени ведет к пониманию законо­
мерностей регуляции клеточной активности и поовояяет осуществлять
направленный контроль процессов жионедаятельности. Проблема фун­
кционирования внутриклеточных регулдторных систем связана с реше­
нием таких фундаментальных проблем биологии раовития как сооревание реагирующих систем раовивающихся оргаииомов, приобретение ими
способности специфически отвечать на воодействие индуктора. В конеч­
ном ятоге, именно на клеточном уровне реалноуются все регуляторные
воодейстЕия, обеспечивающие раовитие органиома, его существование
как единой системы, гомеостао и адаптацию к изменяющимся условиям
внешней среды (Турпаев, Манухин, 1981).
Данная проблема прямо связана и с таким важным вопросом естествоонанЕЯ как формирование и раовитие половых клеток. Нервная система
охаоывает регуляторное действие на гаметогенео морских беспоовоночНых с помощью химических передатчиков - медиаторов и гормонов
(Walker, 1984; Paris! et al., 1987; Smiley, 1990). Достаточно обширный
фактический материал докаоывает участие биогенных моиоаминов, ме­
диаторов моноаминергической системы, в регуляции роста и сооревания
гамет морских беспозвоночных. Исследования в втон области ведутся по
таким направлениям как идентификация биогенных моноаминов в нер­
вной ткани (CottreU, Pentreath, 1970; Pentreath, 1972; Huet, Pranquinet,
1981; Хотимченко, 1989); иоучение сеоонной динамики уровня этих ве­
ществ в ЦНС и половых жеяеоах (Хотимченко, Деридович, 1988); выясне­
ние роли биогенных моноаминов в регуляции обмена веществ в гонадах
(Khotimchenko, 1982), стимуляции вьшета половых клеток (Iwata, 1976;
Matsutani, Namura, 1982). Молекулярные механиомы действия медиа­
торов моноаминергической системы на половые клетки поучены крайне
слабо. Лишь окспериментальные исследования, посвященные влиянию катехоламннов и индолилалкнламинов на активность аденилатциклазы
ооцитов и орелых ятп^ нгпохожях, лоаволают предположить участие аде, нилатцижлаоной системы в проведении регупяторного сигнала, индуци­
рованного биогенными моноаминамя (Renaud et al., 1983; Shenker et al.,
1985; Parisi et al., 1987; Хотиычеию, 1989). В свяои с этим воонихают
следующие вопросы. Кахие рецепторы опосредуют действие биогенных
моноамннов? Каким обраоом эти рецепторы воанмодействуют с аденипатцихлаоой? Каховы свойства и особенности регуляции аденвлатцихлаоы в половых клетках? Как иоменяегся функциональная активность
аденилатцихлсюы в период внутригонадного оогенеоа? Ответы на эти
вопросы особенно необходимы в свлэн с открытием донервных нейротрансмиттеров и рецепторных обраоованнй хах внутри ооцитов, так и
на поверхностной мембране (Буонжков, 1987; Kusano et al., 1978, 1982;
Miledi, 1980; Eusebi et aJ., 1984). В этом отношении ооциты иглоко­
жих представиют удобную модель для изучения функционального соот­
ношение внутриклеточных и расположенных на клеточной поверхности
трансмиттерных рецепторов, а тахже для исследования воаимодействня
ОТЕК'рецепторов с внутриклеточными регуляторными системами. Уни­
кальность этой модели оахлючается и в том, что исследования можно
проводить как на живых клетках, так и на мембранных препаратах.
Цель и оадачи работы. Цель работы состояла в изучении структуры
и механиома действия аденилатциклааной системы-ооцитов иглокожих.
Для этого необходимо было решить следующие оадачи:
1. Методами световой цитохимии и епехтроннон гистохимии исследо­
вать дохалшзацию аденилатцихпаоы в гонадах иглокожих.
2. Иоучить свойства и особенности регуляции активности аденилатциклавы. Сравнить полученные реоультаты с литературными дан­
ными.
3. Выявить и идентифицировать клеточные рецепторы, связанные с
аденипатцихлгю ой.
4. Провести исследования функциональной активности аденипатцихдаоной системы в период роста ооцитов и в раннем вибриогенеое.
Научная новизна. Впервые проведены детальные исследования свойств
аденилатцихпаоы ооцитов игяокожнх. Показано, что аденипатциклаоа
входит в состав мембранного комплекса, включающего, кроме фермента,
рецепторную и регуляторную субъеднниды.
Установлено, что основные свойства аденилатцикпаяного комплекса
ооцитов амурской овеоды, такие как: кинетические константы воаимодействия фермента с субстратом; способность активироваться ионами
магния, марганца, фтора, гуаниловыми нукпеотидами и биогенными моно­
аминами,- схожи со свойствами одноименного комплекса соматических
клеток других животных организмов. Особенность регуляхщи аденилатциклаоы ооцитов Ьакпючаегся в том, что рецепторная субъединица пред­
ставлена рецепторами цвух типов - дофаминовыми и адренергическими,
свяоанными с ферментом черео стимулирующий Gs-бепок.
Впервые идентифицированы адренорецепторы в ооцнтах амурской
овеоды. Радиолигандный аналио покаоап, что оти рецепторы относятся
к /5-типу. Показано, что по мере роста оогшгов агтнвносгь аденилатцнклаоы снижается. Это свяоано с уменьшением количества фермента в
мембране и иомененвеи механиома регуляции его активности, что выра­
жается в "исчезновении" рецепторов к биогенным моноаминам, свяоанных с О^-белком.
Теоретическое и практическое оначение. Совокупность полученных в
работе данных дает детгяьную картину функционирования аденилатциклааного комплекса в ооцитах игжзкожих - важнейшей системы регуля­
ции клеточной активности. Это расширяет представления о механиомах
действия медиаторов моноаминергнческой системы на формирование и
раивитие половых клеток. Исследование особенностей регуляции акти­
вности аденипатциклааы в оогенеое вносит определенный вклад в пони­
мание эволюционных процессов становления гормональных регупяторных систем.
Иовестно, что аденилагцикпаоная система половых и соматических
клеток имеет больше сходств, чем раоличий. В сваои с этим, ооциты
иглокожих являются наиболее вероятным гфетендентом на роль модель­
ного объекта для исследований действия многих биологически активных
веществ и биопрепаратов.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Советсхофинскоы сиыпооиуме по биологии развитня "Свтнальные молекулы и кле­
точная дифференцировка" (Суодаль, 1991), на Международной конфе­
ренции "Нейрофармакология на рубеже двух тысячелетий" (Санкт-Пе­
тербург, 1992), на 8 Международной конференции по иглокожим (Дижон,
Франция, 1993), на ежегодных отчетных сессиях ИБМ (1992, 1993).
Пубпикадии. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.
Структура д объем диссертации. Работа состоит но введения, 6 глав,
выводов; список литературы включает 190 источников, в том числе 166
иностранных. Диссертация ноложена на 135 стр. и включает 3 таблицы,
28 рисунков (графики, схемы, макрофотографии).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования проводили на иглокожих, обитающих в проливе Старка
(оал. Петра Великого, Японское море),- двух видах морских ежей Strongylocentrotiis wtermedius (серый еж), S. nudus (черный еж),- и двух видах
морских овеод - Astericis a-muiensis (амурская овеода), Aphelasteiias japonica (афеластериа японскаа). Животных собирали с помощью легководолаоной техники н либо сраоу обрабатывали, либо помещали в аквариумы
с аэрируемой проточной морской водой, где они находились до опытов.
Для гистологических исследований материал фиксировали в жидкости
Буэна и оаключали в парафин по общепринятым методикам. Среоы тол­
щиной 3-5 мкм, приготовленные на санном микротоме, окрашивали ге­
матоксилином Эрлиха.
Модифицированным для светооптической микроскопии способом ис­
следовали яожалиоацию аденипатциклаоы в ооцитах. Для получения ооцнтов, женские гонады иовпекалн из лучей половоорелых морских овеод,
промывали в искусственной ледяной бескальцевой морской воде и бы­
стро раореоали на мелкие кусочки. Суспеноию ооцитов фильтровали черео тонкий гас и отмьгоали от фолликулярных клеток в этой же воде
трехкратным гереосаждеипем с помощью ручной центрифуги в тече­
ние 2-3 мин. Зрелые яйда морского ежа получали методом описанным
Г.А.Буониковым (1975).
Для выявления локалиоацнн аденипатщппаоы клетки фиксировали 2,5%
глутаральдегидом на 0,1 М Трис-малеатнои буфере, содержащем 4,5%
глюгооы, рН 7,4, в течение 30 мин. Промывали тем же буфером, содер­
жащем 8% глюкозы, 2 раса по 10 мин п помещали на 90 мин в инкуба­
ционную среду: 0,88 М Трис-малеатного буфера, рН 7,4; 0,5 аденилилимидодифосфата; 8% глюкозы; 2 мМ геофиллина; 4 мМ MgSO^ . В конце
инкубации добавляли 2,4 мМ РЬ{МОз]2 и вьщерживали материал в тече­
ние 4 ч при комнатной температуре. Промывали днстилированной водой,
обрабатывали 1% уксусной кислотой 1 мпн. Дла перевода неокрашенного
пирофосфата свинца в темноокрашенный продукт материал 5 мин обра­
батывали 0,5% раствором Na^S, оаключалл в глицерин-желатину; Кон­
трольные обраоцы инкубировалл в среде бео субстрата. Количествен­
ное определение активности аденилатцикяаоы проноводила на днтофотометре "Vikers". Испольоовали маску А4, А = 550 нм.
Электронно-цитохимическим методом (Culter, 1983; Zajic, Schacht,
1983) исстедовалп покалиоацию аденилатцвкяаоы в клетках гонад. Ку­
сочки тканей префпкспровали в 1% растворе глутаральдегида на 0,1 М
какодилатном буфере в течение часа при СС, отмывали и помещали на
30 мин при 20°С в инкубационную среду: 100 мМ Т)рнс-малеатного бу­
фера, 5 мМ MpCij, 5 мМ SrCli, 0,5 мМ 5-аденипллимидодифосфат, 5 мМ
теофиллина, 207 мМ NaCl и 10% декстрозы; осмотичность среды 1200
MOSM; рН 8,6. Для проявления стронциевого преципитата нспольоовали
2% раствор Pb(N03)2- После ополаскивания, фиксации и дегидратации
материал ааключали в Эпон 812. Контрольные обраоцы инкубировали
в среде бео субстрата и в среде с субстратом, к которой добавляли 10
мМ фторида натрия, либо нагревали иикубационную среду до 60''С для
инактивации фермента.
Локализацию адренорецепторов в ооцптах изучали методом радиоав­
тографии. Клетки инкубировали в искусственной морской воде, содержа­
щей 10-*М меченого рН]-дигидроальпренолола (L-Dichydroalprenolol-l-
propil-2,3-'H, удельная активность 2,005 ТБк/ммояь, "Izinta"). Черео 90
мпн ооцпты осаждали с помощью ручной центрифуги и после двухкрат­
ной отмывки охаажденной искусственной морской водой фиксировали в
3% растворе глутаральдегида на морской воде. Парафиновые среоы тол­
щиной 5 мкм покрывали фотоэмульсией марки "М", время експооиции
составляло 45 суток. После проявления среоы окрашивали гематоксилинэоовном.
Для идентификации адренорецепторов испольоовали метод радиодигандного анадиоа. Суспеноию ооцитов инкубировали в искусственой мор­
ской воде с до'бавпенЕеи определенного количества меченого [^Н]-дигидроальпренолола в присутствии или отсутствии агоипстов или антагонистов
различных рецепторов. Общий объем пробы составлял 1 мл. Реакци­
онную смесь инкубировали 30 мвн при 15"С и пропускали черео GF/C
фильтр. Фпдьтры промывали и после высушивания помещали в виалы,
оаливали 5 ил сцинцилляционной ЖЕЩКОСТИ марки Ж-8,,черео 2-3 ч подс­
читывали радиактнвность с помощью ''SL-4221" (Франция). Неспецифи­
ческое связывание определяли при добавлении в среду инкубации 10~^М
немеченого пропранолола. Для определения специфического свяоывання
Ео среднего оначениа общего вычитали иеспецифическое свяоывалве.
Активность адеиплатдиЕпаоы определяли в мембранных препаратах
ооцитов морских овеод и гомогеиатах яиц и ранних эмбрионов мор­
ского ежа модифицированным методом Ткачука и Балденкова (1978).
Мембранн)ао фракцию ооцитов морских овеод получали методом Doree
(1978). Яйца и оародышей морскою ежа S.intexjnedius гомогенивировали не более двух мин в 0,05 М Трис-НС1 буфере, рН 7,4, содержащем 2
мМ ЭДТА. Количество 1?АМФ определяли методом Джильмана (Gilman,
1970) с помощью набора реактивов "Cyclic AMP assay Kit" фирмы Amersham (Англия).
Концентрацию белка в образцах определяли методом Gieenbeig и Jaddock (1982) с помощью БФ-реактива.
Экспериментальные методы. Для ЕРзучения свойств аденилатциклавнон системы в раннем эмбриогенеое морского ежа животных собирали
Б сеоон раомноження. Получение половых продуктов, оплодотворение и
раавптие зародышей проводили по методике г.А. Буоникова (1975). Экс­
перименты по поучению влияния биогенных моноаминов на сооревание
ооцитов морских овеод выполняли в период нереста. Для индукции соореванзм применяли арахпдоновую кислоту в конечной концентрации
5 • 10~^М. В опытах с ооцитами испопьоовали только тех животных, у
которых процент индуцированного созревания составлял не менее 98%.
Выделенные ооциты инкубировали при 20''С в искусственной морской
воде (10%-ная суспеноия об-ьеиом 1 мл) в трех вариантах опытов: без
добавок (для определения процента слонтанного сооревания), с добавле­
нием арахидоновой кислоты (для определения процента индуцированного
сооревания), с. добавлением арахидоновой кислоты после 20 мин преинкубации ооцптов с различными концентрациями препаратов. Исходные
растворы адреналина, норадреналина, дофамина были приготовлены на
искусственной морской воде. Процент сооревания определ^али черео 30
мин после начала инкубации по числу ооцитов с растворенным зароды­
шевым пуоырыо.м но расчета па, 100 клеток.
Для работы исполъоовалнсь следующие препараты : дофамин гпдрохлорид ("Fluka"), норадреналин битартрат, адреналин ("Serva"), арахидоновая кислота, выделенная ио бычьей печени (Лаборатория сравни­
тельной биохимии Института биологин моря).
Данные обрабатывали методами вариационной статистики. Различия
между средними величинами считали достоверными при Р < 0,05.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
АДЕНИЛАТЦИКЛАЗА В ООЦВТАХ МОРСКОЙ ЗВЕЗДЫ
И МОРСКОГО ЕЖА
Локадиоация аденадатциклавы. Зерна осадка цитохимической реак­
ции, выявляющие локадноацию фермента, располагаются над поверхно­
стью ооцитов в виде «Сдельных електролно-плотных гранул. По мере ро­
ста и сооревания реакция на аденилатциклаоу уменьшается и в зрелых
яйцах морских ежей она практически отсутствует.
в гонадах aiiypciofi овеоды электронно-плотные оерна осадка видны
на плаомалемме клеток деломического эпителия (особенно на микровор­
синках и жгутиках) и гладких мышечных клетках стенки гонады. В оодитах гранулы обнаруживаютса в толще плазматической мембраны. Во
внутриклеточных структурах аденялатцикпаюа отсутствует.
Таким обраоом, ооциты исследованных видов иглокожих проявляют
аденилатцнкдаоную активность. Плаоматическая мембрана является ос­
новной н единственной структурой, содержащей фермент. По мере ро­
ста и дифференциации ооцятов происходит уменьшение интенсивности
реакции на аденипатциклаоу, и она становится минимальной в оакончивших рост ооцитах.
Каталитические свойства аденияатциклаоы. Баоальнаа активность
аденилатциклаоы мембран ооцитов амурской овеоды составляет в сре­
днем 8-12 пыоль цАМФ/мт белка/10 мин, а в некоторых случаях - до
24 ед. Скорость реакции зависит от времени ее протекания и концен­
трации мембранного белка. При оптимальных условиях (концентрация
белка - 50-70 мкг в пробе; время инкубации - 20 мин) насыщение фер­
мента субстратом происходит при концентрации АТФ 2,2 мМ (рис.1),
Кто=0,45 мМ, Ктаг=25 пмопь цАМФ/мг белка/10 мин.
Необходимым условием для проявления активности аденилатциклаоы
является присутствие в среде инкубации одного ио ионов: либо магния,
либо марганца. Эти ионы, вероятно, формируют комплекс с АТФ, кото­
рый и является субстратом ферментативной реакции. При насыщающих
концентрациях (2,5 мМ для MgCl^ и 5 мМ для MnCh ) активность адени­
латциклаоы в експериментгис, когда субстратом реакции служит комплекс
Мп^+-АТФ, составляет 159 пмоль цАМФ/мг белка/10 мин, а в экспери­
ментах с ЛГ^г'^-АТФ - лишь 18 ед. Следовательно, увеличение концентра­
ции ионов магния и марганца до насыщающих концентраций вьгоывает
однонаправленный (стимулирующий), но отличающийся по силе действия
эффект. Форсколин - активатор аденилатциклазы соматических клеток
- усиливает каталитическую активность фермента ооцитов в 7 рао.
Регудящия аденилатциклаоы G-белками. Для выявления воаимодействия аденилатциклаоы с G-белками в качестве функциональных оондов
jlQ
Z0-[
/
/>
15-
10-
/°
5-
Kr. = 0.4S
/
MM
a ^
/
r ^
1
1
'
1
'
1 '
I
•I 1 1 1 1 1 1 I T - n 1
1/S
Рис. 1: Зависимость агтивиости аденилатцихлаоы от концентрации субстрата в при­
сутствии 5 мМ MsCXi.
А - в обычных хоординатах. По оси абсцисс - юнцентрация АТФ в мМ, по оси ор­
динат - агтнЕность аденилатджжлаоы в пмоль цАМФ/мг белга/Ю мин.
Б - в обратных юординатах Лайнуивера-Бэрха. По оси абсцисс - обратная величина
жонцентрации субстрата. По оси ординат — обратная величина начальной сжоростн
ферментативной реакция.
Таблица 1: Влияние модифи1аторов регуляторного G-белка
на актлвность адсиляатцнллаоы мембра» ооцитов амурсжой
овеоды.
Модификаторы Концентрация
вещества
100 мкг/мл
Активность
аденилатцикпаоы
(пмоль цАМФ/мг белка/10 мин)
8,9±0,9
425,1 ±32,1
48,1±8,1
10 мкг/мл
28,2±6,0
10-5
10-5
54,2±2,0
204,4 ±18,4
• .
Баоальнаа
NaF
Холерный
токсин
Кокшопшый
токсин
ГТФ
ГИТФ
(м)
'
10-2
применяли гуалиловые нуклеотиды (ГТФ и его негидропиоуемый аналог
- ГИТФ), фторид натрия и бахтериальные токсины - холерный и ко­
клюшный. ГТФ в концентрации IQ-^M увеличивает активность аденипатЕ(ижлады в 6 рао, а ГИТФ - в 23 раоа (таблида 1). Аденипатцикпаоа'
ооцитов амурской овеоды характерноуегся высокой чувствительностью
к активирующему действию фтористого натрия. Активность фермента
при добавлении 10 мМ ^aF увеличивается в 48 рао. Холерный и ко­
клюшный Т0КС1Ш стимулируют аденилатщикдаоу мембран.
Отмеченная способность аденилатциклаоы отвечать усилением акти­
вности на воодействие гуаниловых нуклеотидов, фторида натрия и бакте­
риальных токсинов ухаоьгвает на существование функциональной связи
G-белка (или белков) с ферментом в плаоыатической мембргше ооцитов
амурской овеоды.
Влияние биогенных моноаминов на активность аденилатциклаоы. Адреналин н норадреналин оказывают оавнсимый от дооы стимулирую­
щий эффект на аденнлатцикпаоу при концентрациях от 10"^ до 10~'М
10
^50
й
И
Ш40О
и
я
<30
9
S
<:
Я20-
о
2 10
а
I
1 I 1 I
10''
I
I
10"'
J I
I
I
'—I I
10''
I
I '
10'"
• •
> I '
10"°
•
'—^~1~^
10'
10"
Биогенные моноамины, М
Рис. 2; Влияние биогенных моноамвнов на активность аденнлатциклаоы. По оси аб­
сцисс - хонцентрацня норадренвлжна (1), адреналина (2), дофамина (3), серотонина
и триптамина (4); по оси ординат - активность аденилатциглаоы в пмоль цАМФ/мг
6елжа/10 мин.
(рис.2). Зависимость сворости формирования цАМФ ио АТФ от дей­
ствия воорастающих концентрации дофамина описывается хривой, со­
стоящей шз двзгх раолнчных по высоте пнюв. Первый, больший пих, ре­
гистрируется при жонцентрацни дофамина 10~^М, второй,, меньший при 10~*М. Серотонин н триптамин в диапазоне исследуемых концен­
траций (10"^ -7- 10~''М) не влияют на баоальную активность фермента.
Для определения специфичности действви биогенных моноаминов на
аденилатциклаоную активность ооцнтов испопьоовали блокаторы рао­
лнчных рецепторов : альпренопоп - блокатор адренорецепторов ^-типа,
фентоламин - блокатор а-адренорецепторов, галоперидол - блокатор до­
фаминовых рецепторов.
Апьпренолол подавляет стимулирующий эффект, выованный адрена­
лином и норадреналином, но не дофамином. Ингибирующее действие аль11
пренопола носит дооооависимый характер. Бадальный уровень фермен­
тативной активности не иоменается при действии альпренолола в отсут­
ствии адреналина, норадреналина и дофамина. Фентоламин даже при вы­
сокой концентргщии (10~''М) не подавляет усиление активности циклаоы,
Быованное норадреналином, адреналином и дофамином. Галоперидол ча­
стично блокирует вффект дофамина, но не других моноаминов.
Проведенные вкспериментальные исследования, во-первых, докапыва­
ют наличие в мембранах ооцитов амурской овеоды рецепторных образо­
ваний, чувствительных к адреналину, норадреналпну и дофамину, сти­
муляция которых активирует аденплатциклаоу, во-вторых, свидетель­
ствуют о том, что этл рецепгорные структуры могут быть подобны
/?-адренергическим и дофаминовым рецептора*!, описанным в соматиче­
ских клетках позвоночных.
ХАРАКТЕРИСТИКА АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ
ООЦИТОВ АМУРСКОЙ ЗВЕЗДЫ
Радоавтографическое исследование локализации адренорецепторов.
После инкубации ооцитов в искусственной морской воде с антагонистом
/?-адренередепторов рн]-диги:дроальпренополом ([•'Н]-ДНА) метка, мар­
кирующая места связывания меченого питан да обнаруживается в мембра­
не и внутри клеток. Добавление в среду шиубацви немеченного антаго­
ниста этого же типа рецепторов пропранолола приводит к исчеоновению
метки ио ооцитов.
Идентификация рецепторов ооцитов. Изучение кинетики связывания
РН]-ДНА с рецепторами ооцитов проводили на интактных клетках, пред­
варительно освобожденньрс от фолликулярных клеток и студенистой обо­
лочки для облегчения доступа меченого вещества к участкам специфи­
ческого связывания. Зависимость между количеством ооцитов и коли­
чеством специфически свяоанного рн]-ДНА носит линейный характер
при концентрации клеток не более чем 5000 в 1 мл инкубационной среды,
что соответствует примерно 240 мкг белка. Процесс связывания РН]дигидроальпренолола характеризуется насыщаемостью (рис.3). Аналио
12
кривой насыщения по методу Скотчарда выявил один класс свяоывающих
мест с Кс = 0,62 ± 0,02 нМ и макспмальньш сваоывапием - 567,6 ± 5,4
фмоль/мг клеточного белка. Коэффициент Хнлла равен 1, то есть сваоывание не носит кооперативзюго характера. Исследование скорости фор­
мирования и распада компдегса лиганд-рецептор показывает, что свяоыванне ооцитами [^Н]-ДНА достигает равновесия черео 30-35 мин при
15''С. Дальнейшее увеличение времени инкубации не вызывает досто­
верных изменений уровня специфического связывания. Скорость ассоци­
ации (K+i) составляет 0,102 мин~^нM~^. Добавление в инкубационную
среду адреналина в концентрации 10~''М приводит к распаду комплекса
лиганд-рецептор через 18 мин (период попужпвни комплекса 9 мин, а
скорость диссоциация - 0,074 мин"^). По соотношению констант скоро­
стей ассоциации и диссоциации вычислили константу свяоывания - Кс
= 0.73 нМ. Эта же константа была вычислена по кривой насыщения и
составила 0.62 нМ. Хорошее соответствие значений Koi^cTaHT связыва­
ния, полученное в различных окспериментах, свидетельствует о высокой
степени специфичности связывания [^Н]-ДНА ооцитами.
Еще одним звеном, доказывающим специфичность связывания мече­
ного дигидроальпренопояа, являются реоультаты, полученные при те­
стировании способности раяличных веществ замещать его в центрах
специфического связывания. В этой серии экспериментов из катехоламинов использовали адреналин, норадреналин н дофамин. В качествеантагонистов адренорецелторов /3-типа служил фентопамин. Наиболее
сильным ингибитором свяоьшания меченого соединения был альпренолол (рис.4). Полумакснмальное ингибирование свяоывания (IC^o) паблюдаетса при концентрации альпренолола 7 • 10"*М. Другой антаго­
нист - пропранолоя конкурирует за места специфического связывания
с гораздо меньшим сродством ( / С и = 2- 10~'М). Фентопамин в преде­
лах исследуемых концентраций практически не вытесняет меченый лпганд. Ио агоиисгов наиболее сильным ингибитором оказался адреналин
(JCso = 2 • IQ-'^M). Действие норадреналина было слабее. Полумакси­
мальное ингибирование наблюдается при концентрации норадреналина
9- 10~'М. Ни фентопамин, нн дофамин даже при высоких концентрациях
13
500 п
400-
^300•в
С
о
3 200•в»
Я
100
1
10
1
1 — I — I
,,
,
I
I
1 I
too
1
1
1 — I — I
I
I I I
1
1
1000
I n j -дигидроальпренопол, пМ
Рис. 3: Спецкфичесхое свяоывание рН]-днгидроальпренолола ооцитами амурсгой
овеодн в првсутствии в<х5ра(;таю1цюс хондентрацнй меченного лиганда. По оси аб­
сцисс - концентрация рн]-дигидроальпренояола в пМ; по оси ординат - специфичесюе связывание (В), выраженное в фмолях на мг хлеточного белга.
(10~'—10~''М) не хонхурируют с меченьом лигандом оа места специфичесхого связывания.
Таким образом, все соединения, способные воаимодействовать с вы­
являемыми с помощью меченого ДНА связывающими местами, являются
либо адренергичесхими агонистами (адреналин, норадреналин), либо адренергическнмж антагонистами (алъпренолол, пропранолол). Эти места
обладают свойствами рецепторов. Поскольку фентоламин не вытесняет
меченый питанд, но ингибирующее действие адреналина выше, чем йорадренадина, а действие адреналина и норадреналнна приводит к акти­
вации аденнлатциклаоы, то на основании этих критериев (Levitzki, 1978)
выявленные нами рередепторы можно отнести к адренергическим рецеп­
торам /б-типа.
14
10"'
10'°
10'^
10-
10"°
Конкурентное соединение, М
Рис. 4: Ингибирование специфичесюго свяоывания рН]-двгидроальпренололаальпренололом (1), адреналином (2), пропралололом (3), норадреналнном (4), фентоламином
и дофамином (5). По осн абсцисс - концентрация конкурентного соединения в М. По
оси ординат - % ингибирования специфического связывания. Концентрация оодитов
амурской овеоды в пробе составляла 2000-3000 клеток, концентрация меченого лнганда - 10"^Л^, в р е м я инкубации - 30 мин. при 18°С.
АДЕНИЛАТЦИКЛАЗНАЯ СИСТЕМА
РАСТУЩИХ И ЗАКОНЧИВШИХ РОСТ
ООЦИТОВ АФЕЛАСТЕРИИ ЯПОНСКОЙ
При изучении состоания аденилатщплаоы в растущих и оакончивших
рост ооцитах установлено, что ппапматичесхие мембраны этих клеток
проявляют разную баоальную активность. Б растущих ооцитах акти­
вность фермента составляет в среднем 10,9±0,9 пмоль цАМФ/мг белка/
10 мпп, тогда как в достнгпшх максимального раоыера и готовых к вы­
мету ооцитах - 1,8 ± 0 , 5 ед. По мере роста ооцитов наблюдается до­
стоверное падение активности аденилатциклаоы. Для выяснения при­
чин снижения активности фермента, исследовали влияние модификато­
ров различных субъединиц аденилатциклаоной системы на фермент рас15
тущих и оакончивших рост ооцитов. Фсрсжоднн, действующий на ката­
литические свойства фермента, стимулирует скорость синтеоа цАМФ
мембранаьш растуищх ооцитов, и активность аденилатциклавы соста­
вляет в среднем 161,2 ±11,0 ед. У достигших максимального раомера
ооцитов аденипагцикпаоа тоже активируется форскопином, однако оффектнвность втого действия оначжтельно меньше, и скорость синтеоа
цАМФ - 8,9 ± 0 , 8 ед. Уменьшение чувствительности аденилатцикпаоы
ж воодействию форсколина свяоано, скорее всего, с уменьшением коли­
чества фермента в мембранах оакончивших рост ооцитов.
Фторид натрия, взаимодействующий с регуляторным компонентом
адепилатциклаоного комплекса, был самым сильным активатором фер­
мента как растущих, так и оакончнвших рост ооцитов. Активность аденилатциклаоы мембран растущих ооцитов в присутствии 10~^М фторида
натрия составляет в среднем 430,3±33,1 ед., а в мембранах, оакончивших
рост,- только 12,2 ± 1,4 ед. Другой модификатор регуляторной субъеди­
ницы - ГТФ,- усиливает ферментативную активность до 52,3 ± 2,0 ед.
растущих ооцитов и полностью ингибирует фермент оакончивших рост.
Активаторы рецепторной субъединицы - биогенные моноамины, - до­
бавляли в инкубационную среду в конечной концентрации 10~^М. Адре­
налин, норадреналнл и дофамин стимулируют адеыилатцнклаоу мембран
растущих ооцитов. Наиболее сильное действие на аденилатциклаоу рас­
тущих ооцитов окаоывает адреналин, и активация фермента составляет
в среднем 380%. При действии норадреиапина активность фермента
увеличивается в среднем на 310%, стимулирующее действие дофамина
оначительно ниже, процент активации - 180%. При одновременном ин­
кубировании мембран растущих ооцитов с биогенными моноамннами и
ГТФ происходит суммирование их стимулирующего действия. Амплифи­
кация действия биогенных моноаминов гуаниловыми нуклеотидоы указы­
вает на сопряжение рецепторного и каталитического компонентов аденилатцжклаоиай системы в растущих оощигах посредством регуляторного
(js-белка.
При изучении влияния биогенных моноаминов на аденилатциклаоу
мембран ооцитов, оакончивших рост, оказалось, что адреналин, норадре16
налш! и дофамин даже при больших концентрациях (10~') не влияют на
активность фермента. Для того, чтобы убедиться, что аденилатцихлаоа
оакончивших рост и готовых к вымету женских гамет теряет чувстви­
тельность I биогенным моноаминам, проводили эжсперименты по влия­
нию отих веществ на сооревание нераарушенных ооцитов. Для индукции
сооревания необходимо падение уровня цАМФ, а препараты, повышаю­
щие концентрацию этого циклического нукпеотида, препятствуют воообновленню мейотическнх делений. Исчезновение зародышевого пуоырька
KcLK в экспериментальных (преинкубированных в течение 15 мин с моно­
аминами) ооцитах, так и в контрольных (преинкубированных бео моно­
аминов) начинается в среднем черео 12-13 мин после воодействня арахидоновой кислоты. В диапазоне исследуемых концентраций (10~*-г 10"'*)
ни один ио моноаминоБ не выоывает оависнмого от дооы достоверного
подавления сооревания, что свидетельствует об отсутствии связи адениратциклаоы с рецепторами к биогенным моноаминам.
АДЕНИЛАТЦИКЛАЗА В РАННИХ ЭМБРИОНАХ
СЕРОГО МОРСКОГО Е Ж А
В сеоон размножения серого морского ежа проводили изучение свойств
аденилатхщклаоы яиц и ранних эмбрионов. Активность аденилатцикпаоы
определяли в орелых яйцеклетках, в оиготе (черео 10 мин после оплодо­
творения), в оародышах на стадии двух бластомеров (черео 1,5 ч.) и
бластулы (черео 5 ч.).
Баоальная активность фермента минимальна до оплодотворения и со­
ставляет 8,1 ± 0,8 пмоль цАМФ/мг белка/Ю мин. Самая высокая адекилатпдкладная активность регистрируется на стадии первого деления
дробления 36,1±3,3 пмоль цАМФ/мг белка/10 мин. В эмбрионах на ста­
дии бластулы активность циклаоы в 1,5 раоа ниже, чем у дробящихся
оародышен, но в 2,8 раоа выше, чем у орелых яиц и составляет 22,5 ±2,2
ед. При добавлении в среду инкубации фторида натрия в концентрации
10~^ М скорость синтеоа цАМФ увеличивается. В орелых яйцеклетках,
на стадии первого деления дробления и бластулы активация аденилатци17
жпаоы фторидом натрия составляет 130-170%. На 10 мин после оплодо­
творения стимулирующий эффект этого модификатора достоверно вьпие
и активность фермента - 221%.
Гуаннловые нуклеотиды стимупирзтот ферментативную активность
неопяодотворенных яиц. В орчлых яйцеклетхах негидролиоуемый ана­
лог Г Т Ф - гуанооиннмндотрифосфат (ГИТФ) - при концентрации 10~*
М Б среднем на 323% усиливает скорость синтеоа цАМФ, тогда как ГТФ
при такой же концентрации - на 265%. Действие ГИТФ на аденилатциклаоу сильнее, чем ГТФГНа 10-ой минуте лосле оплодотворения, а также
на стадии второго деления дробления стимулирующее действие гуаниповых нуклеотидов сохраняется, и аденнлатцнхлава более чувствительна
к ГИТФ, чем к Г Т Ф . В онготах активация аденилатцнхпавы ГИТФ 265%, а ГТФ - 165%, на стадии первого деления дробления - 280% и
171%, соответственно. На стадии бластулы аденилатциклаоа теряет чу­
вствительность к гуаниловым нуклеотндгл!, что свидетельствует о napj'шелии воаимодейстБия фермента с регуляторным G5-6eni0M.
При исследовалии влияния дофамина на аденилатдиклаяу яйцеклеток
и бластул окаоалось, что дофамин в концентрации 10~^ М стимулирует
ферментативную активность неоплодотворенных яиц (процент актива­
ции составляет 227%) и его действие усиливается в присутствии ГИТФ.
На стадии бластулы дофамин не эффективен, даже при совместном дей­
ствии с Г Е Т Ф .
Полученные данные пооволяют говорить о функционировании в адеНЕшатщцпаоной системе ялц морского ежа гуаниллукпеотидсвяоывающих белков, ответственных оа сопряжение рецептора с каталитическим
компонентом системы. В раннем вмбриогенеае происходят события, при­
водящие к потере способности аденилатцикяаоы на стадии бластулы ре­
гулироваться дофамином и ГИТФ, что, вероятно, свяоано с иоменением
механизма воаимодействия епементов аденипатциклаоной системы.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Реоультаты работы показывают, что в ооцитах иглокожих существует
адениаатцикпаоная система, яокалиаованнаа в плазматической мембране.
18
Стимулирующее действие фторида натрия, гуанияовых нуклеотидов
и холерного токсина на аденнлатцнклаоу мембран ооцитов свидетель­
ствует о вовлечении в регуляцию ферментативной активности 05-белка.
Активация аденилатцжкпаоы дофамином, блокируемая галоперидолом, и
адреналином и норадреналином, чье действие снимается альпренополом,
а также потенцирование действия этих биогенных моноаминов гуаниповыми нукпеотндами, пооволяют считать, что ооциты морских овеод
содержат рецепторы двух типов, сопряженные с аденилатциклаоой черео Од-беяок - дофаминовые н адренергические. Анализ мест связы­
вания специфического антагониста Д-адренергических рецепторов РН]ДНА ооцитами амурской овеоды показывает, что что адренергические
рецепторы представлены рецепторами ji-твяа,.
Исследование динамики активности аденилатциклаоы в период роста
ооцитов покаоывает, что ее минимальный уровень совпадает с низкой
гаметотенетическон активностью половых желео. К концу "внутригонадного" оогенеза активность аденилатциклаоы минимальна. Снижение
ферментативной активности обусловлено уменьшением количества са­
мого фермента и изменением механизма регуляции аденилатциклаоы
Од-бепком. Результатом етого изменения, в конечном счете, является
потеря реактивности аденилатщилаоы к биогенным моноаминам перед
нерестом, что указывает на исчезновение (инактивацию) рецепторрв к
этим иейротрансмиттерам. Эксперименты по влиянию биогенных моноа­
минов на созревание ооцитов подтверждают предположение о нарушении
взаимодействия элементов комплекса: адренергнческие или дофаминовые
рецепторы - Од-белок - аденилатцикпаоа в закончивших рост и готовых
к вымету ооцитах.
Обнаруженные изменения механизма регуляции актхшности адени­
латциклаоы в процессе роста ооцитов обусловлены раопичным функцио­
нальным состоянием гамет во время роста'и в момент его окончания. В
период роста происходят интенсивные обменные процессы, направлен­
ные на накопление белков, пипидов, углеводов, нуклеиновых кислот и дру­
гих биохимических компонентов клетки, необходимых для структурного
и энергетического обеспечения будущего оародыша (Айзенштадт, 1984).
19
в оаюнчлвших рост, готовых i вымету ооцитах эти процессы уже оавершены, поэтому растукще ооциты в большей степени нуждаются в
регуляции коррекции развития, осуществляемой внешними сигналами,
чём орелые клетки, у которых, вероятно, включаются автономные регуляторные механизмы.
У иглокожих в регуляции развития половых клеток участвуют ме­
диаторы моноамннергической системы - биогенные моноамины, кото­
рые на уровне гонады функционируют как нейротрансмиттеры (Хотимченко, 1989), и нгдабопее веролтной внутриклеточной системой, опосреду­
ющей действие этих соединений, является аденилатциклаоная. Для этого
в мембранах растущих ооцитов есть cooTBeTCTBjTonyie рецепторы, со­
пряженные с аденилатцЕкпаооп черео (7з-белок.
Установлено, что у морских ежей после оплодотворения, происходит
активация аденипатциклаоиой системы. Существуюгцие данные о спо­
собности серотоиина повышать интенсивность цитохимической реакции
на аденилатцнклаоу у дробящихся зародышей морского ежа (Ростомян
и др., 1985), реактивность циклаоы к дофамину после оплодотворения
(Parisi et aJ., 1987) л неспособность адеиилатцжкпаоы стимулироваться
этим же трансмиттером на стадии бластулы указывают на то, что раз­
личные трансмиттеры функционируют на определенных стадиях раннего
эмбриогенеза.
ВЫВОДЫ
1. Аденилатцикпаоа в ооцитах морской овеоды Asteiias amurensis в
морского ежа Stroii^jiocefitrotus nudus локализуется в плазматической
мембргше. В цитоплаоматических структурс1Х ооцитов различных раз­
мерных групп фермент не выявляется.
2. Аденилатцикпаоа ооцитов морской овеоды Asterias ajnuiensis вхо­
дит в состав мембранного комплекса, включающего, помимо фермента,
рецептор и регуляторный G-белок. В качестве субстрата фермент ис­
пользует комплекс Afg^+-ATO с Km = 0,45 мМ и Vmax = 25 пмопь цАМФ/
мг бепка/10 мин. Выявлена зависимость каталитической активности аде20
иилатдиЕпаоы от ионов магния и марганца.
3. Биогенные моноамины (адреналин, норадреналжн и дофамин) ока­
зывают стимулирующее действие на аденилатциклаоу ооцитов морсжих
овеод. а-адренергическин блокатор фентопамли не влияет на актива­
цию фермента биогенными моноаминами; /З-адренергжческий бложатор
альпренолол подавляет действие адреналина и норадреналина, а дофами­
новый бпозатор галоперидол - дофамина. Это свидетельствует о воаимодействии аденилатцшлааы с рецепторами, по крайней мере, двух типов
- адренергическими и дофаминовыми.
4. В ооцитах морской овеоды Asterias amurensis выявлены Д-адренергические рецепторы с К^ для рН]-дш'Идроальпренолола 0,62 нМ и макси­
мальным числом связывающих мест 567,6 фмопь/мг белка. По способ­
ности агонистов и антагонистов конкурировать оа участки специфиче­
ского свяоывания их можно расположить в следующий ряд убывающей
эффективности: альпренолол > адреналин > норадреналин > пропранолол. Особенности действия этих веществ на аденилатциклаонуго акти­
вность свидетельствуют, что идентифицированные рецепторы в расту­
щих ооцитах взаимодействуют с циклаоой.
5. По мере роста ооцитов морских овеод и ежей интенсивность цито­
химической реакции на аденилатциклаоу снижается. Данные биохимиче­
ских исследований аденилатциклаоной системы раст}гщих и оакончивших
рост ооцитов морской овеоды Apbelasterias ja-ponica свидетельствуют об
уменьшении количества фермента и иоменении свойств регуляторного
G-6enia. В готовых к вымету ооцитах аденипатцикяаоа не воанмоденствует с рецепторами биогенных ионоаминов и Gs-белком. Обнаружен­
ная негативная регуляция ГТФ активности фермента пооволяет пред­
положить, что аденилатцикпава оакончивших рост ооцитов свяоана с
0,-белкои.
6. Аденилатцнклаоа орелых яйцеклеток морского ежа Strongylocentrotus jDterined/us функционально активна на ранних стадиях эмбриогенеоа.
В яйцеклетках, оиготах и дробящихся оародьппах фермент сопряжен с
дофаминовыми рецепторами посредством регуляторного Сд-белка. На
стадии бластулы происходят события, приводящие к потере свяои ци21
жлаоы с поверхностной мембраной. Вероятно, в ото время большее оначение приобретают регуляторные системы, локалиоованные во внутри­
клеточных стрзт[турах.
СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ,
ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Kreimer D.L.Lamash N.E.,Fedqseev V.Ya., Grishchenko V.M. Change .
in water-soluble Ca^+-caImodulin target proteins during embryogenesis of the
sea urchin Strongylocentiotus JMteimedius. / / Онтогенео. 1991. T.22. N 4.
P.421.
2. Lamash N.E., Khotimchenko Yu.S. Properties of the adenylate cyclase
in the oocyte of starfish Asteiias amuxeusis. / / Сотр. Biochem. Physiol.
1992. V. 103. N 2. P.379-382.
3. Ламаш H.E., Хотнмченко Ю.С. Харахтеристиха аденилатциклаоы
на донервных стадиях омбриогенеоа морского ежа. / / Тео. докл. межд.
Еонф. "НеЁфофармахопогия на рубеже двух тысячелетий". С.-Петербург.
1992. Р.119.
4. Ламаш Н.Е. Свойства аденилатцнжлаяы апц и эмбрионов морского
ежа Sfrongyiocentrotus iatermedius. / / Биология моря. 1993. N 4. C.T^-yff
5. Lcimash N.E.,.Karaseva Е.М., Khotimchenko Yu.S. Alteration of starfish
oocyte adenylate cyclase properties. / / С о т р . -Biochem. Physiol. 1993.
V.105. N 3. P.531-534.
22