011673 Область, к которой относится изобретение Описание предшествующего уровня техники

011673
Область, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области очистки фолликулостимулирующего гормона (FSH).
Описание предшествующего уровня техники
Фолликулостимулирующий гормон (FSH) представляет собой инъецируемый белок, относящийся к
классу гонадотропинов. FSH используется при лечении бесплодия и репродуктивных нарушений как у
женщин, так и у мужчин.
В природе FSH вырабатывается гипофизом. Для фармацевтического применения FSH можно получить рекомбинантно (rFSH) или его можно выделить из мочи женщин в постменопаузе (uFSH).
FSH используется у женщин при индукции овуляции (OI) и при регулируемой гиперстимуляции
яичников (COH) для вспомогательных репродуктивных технологий (ART). При типичной схеме лечения
для индукции овуляции пациентке ежедневно производят инъекции FSH или его варианта (примерно от
75 до 300 ME FSH/день) в течение периода от примерно 6 до примерно 12 дней. При типичной схеме
лечения для регулируемой гиперстимуляции яичников пациентке ежедневно производят инъекции FSH
или его варианта (примерно 150-600 ME FSH/день) в течение периода от примерно 6 до примерно 12
дней.
FSH также используется для индукции сперматогенеза у мужчин, страдающих олигоспермией.
Схема с использованием 150 ME FSH 3 раза в неделю в комбинации с 2500 ME hCG (человеческого хорионического гонадотропина) 2 раза в неделю была успешна в достижении увеличения количества сперматозоидов у мужчин, страдающих гипогонадотропным гипогонадизмом [Burgues et al.; Subcutaneous
self-administration of highly purified follicle stimulating hormone and human chorionic gonadotrophin for the
treatment of male hypogonadotrophic hypogonadism. Spanish Collaborative Group on Male Hypogonadotrophic
Hypogonadism; Hum. Reprod.; 1997, 12, 980-6].
Ввиду значения FSH при лечении нарушений фертильности желательно получение FSH высокой
чистоты и высокой удельной активности. Лечение FSH требует повторных инъекций. Высоко очищенные препараты FSH можно вводить подкожно, что позволяет пациенту самостоятельно его вводить, увеличивая таким образом удобство для пациента и выполнение им лечебных предписаний.
Lynch et al. [The extraction and purification of human pituitary follicle-stimulating hormone and luteinising hormone; Acta Endocrinologica, 1988, 288, 12-19] описывают способ очистки человеческого гипофизарного FSH. Способ включает анион- и катионобменную хроматографию, иммуноаффинную экстракцию и эксклюзионную хроматографию (гель-хроматографию). Считают, что способ приводит к получению гипофизарного FSH, имеющего удельную активность 4990 ME (иммуноанализ)/мг с 16 МЕ/мг LH
(лютеинизирующего гормона). Содержание белка определяли или по сухой массе или в растворе по поглощению волн при 280 нм (допуская, что A2801 см для 1 г/л равно 1).
В документе WO 98/20039 (IBSA Institut Biochimique SA) описан способ очистки человеческого мочевого FSH, начиная с мочевых экстрактов, называемых человеческими гонадотропинами, обнаруживаемыми в период менопаузы (hMG). В способе используется ионообменная хроматография на слабо основных анионных обменных смолах типа DEAE с последующей аффинной хроматографией на смоле,
имеющей в качестве лиганда производное антрахинона. Считается, что способ дает выход мочевого FSH,
свободного от LH и имеющего удельную активность 6,870 ME (иммуноанализ)/мг. Содержание белка
определяли допущением того, что водный раствор 1 мг/мл белка имеет оптическую плотность 0,62 при
277 нм в кварцевых кюветах с длиной пути 1 см.
В документе WO 00/63248 (Instituto Massone SA) описан способ очистки гонадотропинов, включая
FSH, из мочи человека. Способ включает следующие стадии:
1) ионообменная хроматография с сильной катионной смолой типа сульфопропила;
2) ионообменная хроматография с анионной смолой и
3) хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC).
Сообщают о получении препарата FSH, имеющего удельную активность 8400 МЕ/мг (способ
Steelman-Pohley, Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic
gonadotrophin; Endocrinology; 1953, 53, 604-616) и менее чем 1 ME LH (способ прибавки массы крысиных
семенных пузырьков: (Van Hell H., Matthijsen R. & G.A. Overbeek; Acta Endocrinol, 1964, 47, 409) биологической активности на 75 ME FSH. Содержание белка определяли способом Lowry [О.Н. Lowry et al., J.
Biol. Chem., 1951, 193, 265].
В патенте США № 5990288 (Musick et al.) описан способ очистки FSH из биологических образцов,
таких как гипофизы человека или моча человека в период после менопаузы. В способе используется катионообменная хроматография на Fractogel EMD SO3-650M с последующей стадией аффинной хроматографии с красителем на смоле Mimetic Orang 1, с последующей стадией хроматографии гидрофобного
взаимодействия на смоле Bakerbond Wide Pore Hl-Propyl. Считают, что способ приводит к получению
гипофизарного FSH человека, имеющего удельную активность 7,066 ME (иммуноанализ)/мг и менее чем
1 ME (иммуноанализ)/мг LH, и мочевого FSH, имеющего удельную активность 6,298 ME (иммуноанализ)/мг и менее чем 3 ME (иммуноанализ)/мг LH. Содержание белка определяли по поглощению волн
при 280 нм (допуская, что A2801 см для 1 г/л равно 1).
-1-
011673
В документе Chiba et al. [Isolation and partial characterisation of LH, FSH and TSH from canine pituitary
gland; Endocrinol. J., 1997, 44, 205-218] описана методика очистки гипофизарных гонадотропинов собаки,
включая FSH, с использованием аффинной хроматографии конканавалина (Con) A, хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC) и хроматографии с иммобилизованным ионом металла с Cu++. Сообщают, что полученный FSH имеет удельную активность 2,17 МЕ/г белка, используя радиорецепторный
анализ для FSH для измерения биологической активности и аналитического набора BioRad (BioRad Laboratories СА USA) для определения содержания белка.
В документе WO 88/10270 (Instituto di Ricerca Cesare Serono SPA) описан способ очистки FSH из
мочи человека. Способ включает иммунохроматографию с FSH-специфичными иммобилизованными
моноклональными антителами, связаными с Sepharose 4B дифинилсульфоном с последующей ВЭЖХ с
обращенной фазой. Полученный FSH свободен от LH и других мочевых белков и имеет удельную активность 6,200 МЕ/мг лиофилизированного порошка (способ Steelman-Pohley). Препарат был первым FSH,
подходящим для подкожного введения ввиду его чистоты.
Сохраняется потребность в новых способах очистки FSH и вариантов FSH. В частности, есть потребность в способах очистки, которые избегают применения дорогостоящих стадий иммуноаффинной
хроматографии.
Краткое описание сущности изобретения
Целью изобретения является предоставление нового способа очистки рекомбинантного FSH или
рекомбинантного варианта FSH.
В первом аспекте изобретение предоставляет способ очистки рекомбинантного FSH человека или
варианта FSH, начиная с жидкости, содержащей неочищенный FSH, включающий следующие стадии:
(1) аффинная хроматография с красителем;
(2) хроматография гидрофобного взаимодействия и
(3) хроматография с обращенной фазой;
которые можно проводить в любом порядке.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 иллюстрирует настоящее изобретение, т.е. способ очистки, включающий стадии
аффинной хроматографии с красителем;
хроматографии гидрофобного взаимодействия;
хроматографии с обращенной фазой.
На фиг. 2 показана блок-диаграмма конкретного варианта осуществления настоящего изобретения,
т.е. способа очистки, включающего стадии:
ультрафильтрации/диафильтрации;
анионообменной хроматографии;
аффинной хроматографии с красителем;
хроматографии гидрофобного взаимодействия;
хроматографии с обращенной фазой;
анионообменной хроматографии;
нанофильтрации;
ультрафильтрации/диафильтрации.
Аббревиатуры
При описании изобретения используются следующие аббревиатуры:
DF: диафильтрация.
FSH: фолликулостимулирующий гормон.
r-FSH: рекомбинантный FSH.
hFSH: человеческий FSH.
r-hFSH: рекомбинантный человеческий FSH.
BV: объем слоя.
DEAE: диэтиламиноэтил.
ELISA: ферментный иммуноанализ.
DAC: аффинная хроматография с красителем.
IMAC: хроматография с иммобилизованным ионом металла.
OD: оптическая плотность.
HIC: хроматография гидрофобного взаимодействия.
HPLC: высокоэффективная жидкостная хроматография.
IRMA: иммунорадиометрический анализ.
KD или kD: килодальтон.
НСР: белок клетки-хозяина, белки, возникающие из клетки-хозяина, используемой для экспрессии
FSH.
IPC: контроли в ходе очистки.
IEF: изоэлектрическое фокусирование.
PES: полиэфирсульфон.
-2-
011673
RP-HPLC: высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой.
Q FF: анионный обмен на Q-Sepharose FF.
RT: комнатная температура.
UF: ультрафильтрация.
WFI: вода для инъекций.
Подробное описание изобретения
Изобретение предоставляет способ очистки рекомбинантного FSH человека или варианта рекомбинантного FSH, начиная с жидкости, содержащей неочищенный FSH, включающий стадии:
(1) аффинной хроматографии с красителем;
(2) хроматографии гидрофобного взаимодействия и
(3) хроматографии с обращенной фазой;
которые можно проводить в любом порядке.
Способ очистки по настоящему изобретению дает основное количество FSH высокой чистоты, которое можно затем включить в состав готового к применению лекарственного средства, например
Gonal-F (Serono). Он имеет преимущество получения высокой степени чистоты без использования иммуноаффинной хроматографии. Неочищенный FSH, который образует исходный материал для очистки в
соответствии с настоящим изобретением, состоит из сборов клеточных культур, содержащих рекомбинантный FSH.
В предпочтительном варианте осуществления антиоксидант или свободная аминокислота или дипептид с антиоксидантным и акцепторным эффектом включается на некоторых или на всех стадиях способа очистки в соответствии с настоящим изобретением. Точнее, антиоксидант присутствует в любом из
буферов, используемых для очистки, и/или концентрирования, и/или фильтрации r-hFSH. Антиоксидант
предотвращает окисление FSH во время обработки. Предпочтительным антиоксидантом является
L-метионин. Предпочтительно L-метионин используется в концентрации, равной или примерно
10-100 мМ. Другие примеры антиоксиданта включают трет-бутил-4-метоксифенол, 2,6-бис-(1,1-диметилэтил)-4-метилфенол; бимета-бисульфит калия или натрия, бисульфит натрия. Примерами свободной
аминокислоты и дипептида с антиоксидантным и акцепторным эффектом являются гистидин, таурин,
глицин, аланин, карнозин, ансерин, 1-метилгистидин или их комбинации.
Обычно исходный материал сначала очищается, а затем необязательно концентрируется (например,
использованием ультрафильтрации) и/или производится замена буфера (например, посредством стадии
диафильтрации) перед захватом на первой хроматографической стадии.
На стадиях хроматографии можно использовать смолы на основе полимеров и на основе агарозы.
Можно также использовать мембранную хроматографию, при которой смола заменяется функционализированной мембраной.
Стадии очистки по настоящему изобретению (т.е. аффинная хроматография с красителем, хроматография гидрофобного взаимодействия, хроматография с обращенной фазой) более детально описаны
ниже.
Аффинная хроматография с красителем, стадия (1).
Способ по изобретению включает стадию аффинной хроматографии с красителем (1). В предпочтительном варианте осуществления стадию аффинной хроматографии с красителем осуществляют с использованием смолы, имеющей в качестве иммобилизованного лиганда красящее соединение, которое
хорошо известно специалисту в данной области, т.е. Cibacron Blue F3G-А. Термин «иммобилизованный»
хорошо понятен специалисту в данной области и означает, что лиганд дериватизирован в том смысле,
что он химически связан со смолой. Особенно предпочтительной смолой является Blue Sepharose FF (которую можно получить от Amersham Biosciences Inc.). Технические характеристики Blue Sepharose FF
следующие.
-3-
011673
Технические спецификации
Понятно, что способ можно выполнить с другими смолами, имеющими аналогичные характеристики. Примеры альтернативных смол включают Toyopearl AF-blue-HC-650M (Tosoh Bioscience), Toyopearl
SuperButyl 550, Toyopearl Phenyl 650, Blue Cellthru BigBead (Sterogene), SwellGel Blue (Pierce),
Cibachrome blue 3GA-agarose 100 (Sigma), Affi-Gel Blue (BioRad), Econo-Pac blue cartridges (Bio-Rad),
Blue sepharose HP (Amersham), Cibacron Blue 3GA (Sigma).
Элюирование на стадии аффинной хроматографии с иммобилизованным красителем следует предпочтительно проводить с использованием буфера фосфата, особенно предпочтительно фосфата натрия.
рН элюента должен предпочтительно составлять от 6,0, или примерно 6,0, до 11,5, или примерно 11,5,
предпочтительнее от 6,5, или примерно 6,5, до 8, или примерно 8, особенно предпочтительно 7,0, или
примерно 7,0. Альтернативные буферы, подходящие для поддержания рН 7,0, включают следующие:
MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, BES, MOPS, TES, HEPES. Элюционный буфер для стадии аффинной
хроматографии с красителем должен предпочтительно содержать соль для увеличения проводимости,
предпочтительно NaCl.
В особенно предпочтительном варианте осуществления буферы, контактирующие с продуктом для
стадии аффинной хроматографии с красителем (уравновешивание, промывка и элюирование) содержат
антиоксидант, такой как L-метионин. Другие примеры антиоксиданта включают трет-бутил-4метоксифенол, 2,6-бис-(1,1-диметилзтил)-4-метилфенол; бимета-бисульфит калия или натрия, бисульфит
натрия.
Хроматография гидрофобного взаимодействия, стадия (2).
Способ также включает стадию хроматографии гидрофобного взаимодействия (2). В предпочтительном варианте осуществления хроматографию гидрофобного взаимодействия проводят с такой смолой, как Toyopearl Butyl 650M (которую можно получить от Tosoh Biosep Inc.).
Понятно, что стадию (2) можно выполнять, используя альтернативные смолы, имеющие аналогичные характеристики. Альтернативные смолы, которые можно использовать, следующие: Phenyl
Sepharose 6 Fast Flow (low sub); Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub); Butyl Sepharose 4 Fast Flow; Octyl
Sepharose 4 Fast Flow; Phenyl Sepharose High Performance; SOURCE 15ETH; SOURCE 15ISO; SOURCE
15PHE - все от Amersham Biosciences (800) 526-3593; (см. www.amershambiosciences.com). Другие смолы
представляют собой Hydrocell C3 или С4; Hydrocell Phenyl от BioChrom Labs Inc. (812) 234-2558; (см.
www.biochrom. com).
Связывание на смоле HIC достигается в буфере с высокой проводимостью, полученной посредством добавления соли (например, NaCl, (NH4)2SO4 или Na2SO4). Элюирование на стадии хроматографии
гидрофобного взаимодействия предпочтительно проводится уменьшением проводимости подвижной
фазы (уменьшение концентрации соли), используя буфер, имеющий рН от 6,0, или примерно 6,0, до 8,0,
или примерно 8,0, предпочтительнее от 6,5, или примерно 6,5, до 7,5, или примерно 7,5, наиболее предпочтительно 7,0 или примерно 7,0). Особенно предпочтительная система включает в себя фосфат натрия
для забуферивания предпочтительно при рН 7,0, или примерно 7,0, и сульфат аммония. Альтернативные
буферы указаны выше.
В особенно предпочтительном варианте осуществления контактирующие с продуктом буферы для
стадии (2) HIC (уравновешивание, промывка, элюирование) содержат антиоксидант, такой как
L-метионин. Альтернативные антиоксиданты указаны выше.
-4-
011673
Хроматография с обращенной фазой, стадия (3).
Способ по изобретению также включает стадию хроматографии с обращенной фазой (RPC) (3).
PRC предпочтительно проводят, используя такую смолу, как SOURCE 30 RPC (которую можно получить
Amersham Biosciences). Понятно, что стадию (3) можно выполнять, используя альтернативные смолы,
которые хорошо известны специалисту в данной области и которые имеют аналогичные характеристики.
Хроматографию предпочтительно проводят, используя забуферивание подвижной фазы при слегка
щелочном рН, например при рН 7,0-8,5, или примерно 7,0-8,5, предпочтительнее при 7,5-7,6, или примерно 7,5-7,6. В предпочтительном варианте осуществления забуферивающий вид представляет собой
ацетат аммония. Альтернативные буферы, подходящие для рН 7,6, или примерно 7,6, включают в себя
BES, MOPS, фосфат, TES, HEPES. Буферные растворы, используемые для этой стадии, могут также содержать органический модификатор, концентрация которого модулируется для различных фаз стадии
хроматографии (загрузка, промывание, элюирование и регенерация). В предпочтительном варианте осуществления органический модификатор представляет собой смешиваемый с водой органический растворитель, предпочтительно спирт (такой как метанол, этанол и т.д.), наиболее предпочтительно 2-пропанол
(изопропанол).
В особенно предпочтительном варианте осуществления буферы, содержащие продукт, для стадии
RPC (уравновешивание, промывка, элюирование) содержат антиоксидант, такой как L-метионин. Альтернативные антиоксиданты указаны выше.
Необязательная дополнительная стадия очистки 0 - ионообменная хроматография.
В дополнение к трем основным стадиям очистки, указанным выше, настоящее изобретение может
включать дополнительные стадии очистки.
В одном варианте осуществления способ очистки по изобретению включает предварительную стадию ионообменной хроматографии (0), проводимую предпочтительно с сильной анионообменной смолой, особенно предпочтительно смолой четвертичного аммония, такой как Q-Sepharose FF (которую
можно получить от Amersham Biosciences), имеющей следующие характеристики:
Альтернативно, ионообменную хроматографию стадии (0) можно проводить, используя такую смолу, как Fractogel EMD TMAE HICAP (которую можно получить от Merck KGaA, Darmsradt Germany), или
смолу, имеющую аналогичные характеристики, см. ниже.
-5-
011673
Стадию ионообменной хроматографии предпочтительно проводят, используя буфер, имеющий
слегка щелочной рН (например, от 7,2, или примерно 7,2, до 9,0, или примерно 9,0, или от 8,0, или примерно 8,0, до 9,0, или примерно 9,0, наиболее предпочтительно 8,5, или примерно 8,5). Подходящие буферы включают, например, боратные буферы, триэтаноламин/аминоуксусную кислоту Tris, ацетат аммония, трицин, бицин, TES, HEPES, TAPS. Наиболее предпочтительным является боратный буфер при рН
8,5, или примерно 8,5. Элюирование из ионообменной смолы достигается увеличением проводимости
подвижной фазы посредством добавления соли, предпочтительно NaCl. В особенно предпочтительном
варианте осуществления содержащие продукт буферы для ионообменной хроматографии (уравновешивание, промывка, элюирование) содержат антиоксидант, предпочтительно L-метионин. Альтернативные
антиоксиданты указаны выше.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления способ по настоящему изобретению
включает в себя следующие стадии:
(0) анионообменная хроматография предпочтительно на сильной анионообменной смоле (предпочтительно на смоле четвертичного аммония, такой как Q-Sepharose или Fractogel EMD ТМАЕ);
(1) аффинная хроматография с красителем (предпочтительно на Blue Sepharose FF);
(2) хроматография гидрофобного взаимодействия (предпочтительно на Toyopearl Butyl 650M);
(3) хроматография с обращенной фазой (предпочтительно на Source 30 RPC).
Необязательная дополнительная стадия очистки (-1) - ультрафильтрация/диафильтрация.
Перед стадией ионообменной хроматографии (0) может быть желательно проведение стадии ультрафильтрации для концентрирования неочищенного FSH. Ультрафильтрация (или диафильтрация) предпочтительно проводится с использованием мембраны, имеющей отсечку на уровне 3-10 кДа, или примерно 3-10 кДа, наиболее предпочтительно на уровне 8 кДа, или примерно 8 кДа.
Необязательная дополнительная стадия очистки (4) - анионообменная хроматография.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления способ по изобретению также включает
вторую стадию анионообменной хроматографии (4). Предпочтительная смола представляет собой
Fractogel EMD ТМАЕ HICAP (которую можно получить от Merck KGaA, Darmstadt, Germany) или смола,
имеющая аналогичные характеристики, как указано выше. Альтернативно, вторую стадию анионообменной хроматографии можно проводить на Q-Sepharose FF или другой смоле, имеющей аналогичные
характеристики, как указано выше.
-6-
011673
Стадии анионообменной хроматографии, аффинной хроматографии с красителем, хроматографии
гидрофобного взаимодействия (HIC), хроматографии с обращенной фазой и вторую стадию анионообменной хроматографии можно проводить в любом порядке, хотя предпочтительно первой проводить
стадию анионообменной хроматографии. Остающиеся стадии аффинной хроматографии с красителем,
хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC), RPC и необязательной анионообменной хроматографии можно проводить в любом порядке, хотя предпочтительно следовать порядку, указанному ниже:
(0) анионообменная хроматография;
(1) аффинная хроматография с красителем;
(2) хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC);
(3) хроматография с обращенной фазой (RPC) и
(4) вторая анионообменная хроматография.
Необязательная дополнительная стадия очистки (5) - ультрафильтрация/диафильтрация.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления после любой из стадий хроматографии (в
частности, после стадии хроматографии с обращенной фазой) образец FSH подвергают стадии концентрирования. Предпочтительно эту стадию выполняют, используя ультрафильтрацию в комбинации с
диафильтрацией для получения основного количества продукта, имеющего желательный состав. Ультрафильтрацию (или диафильтрацию) предпочтительно проводят, используя мембрану, имеющую отсечку
на уровне 3-10 кДа, или примерно 3-10 кДа, наиболее предпочтительно на уровне 5 кДа, или примерно
5 кДа.
В особенно предпочтительном варианте осуществления стадии проводят в следующем порядке:
(-1) ультрафильтрация (предпочтительно с мембраной, имеющей отсечку на уровне 8 кДа, или примерно 8 кДа);
(0) анионообменная хроматография (предпочтительно с использованием колонки Q-Sepharose FF);
(1) аффинная хроматография с красителем (предпочтительно с использованием колонки Blue
Sepharose FF);
(2) хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC) (предпочтительно с использованием колонки Butyl 650M);
(3) хроматография с обращенной фазой (RPC) (предпочтительно с использованием колонки Source
30 RPC);
(4) анионообменная хроматография на сильно основной анионообменной смоле (предпочтительно с
использованием смолы ТМАЕ hicap) и
(5) ультрафильтрация (предпочтительно с мембраной, имеющей отсечку 5 кДа).
Может быть желательно подвергнуть образец FSH стадии нанофильтрации, в частности в качестве
стадии очистки от вирусов, т.е. для снижения риска загрязнения препарата FSH вирусами или подобными вирусам частицами, происходящими из клеточной культуры. Нанофильтрацию можно проводить на
любой стадии процесса очистки, однако особенно предпочтительно проводить нанофильтрацию после
2-й стадии ионообменной хроматографии, или после хроматографии с обращенной фазой, или после хроматографии гидрофобного взаимодействия. Нанофильтрацию можно выполнять более одного раза, например ее можно выполнять дважды.
В особенно предпочтительном варианте осуществления способ по изобретению включает следующие стадии:
(-1) ультрафильтрация (предпочтительно с мембраной, имеющей отсечку на уровне 8 кДа, или примерно 8 кДа);
(0) анионообменная хроматография (предпочтительно с использованием колонки Q-Sepharose FF);
(1) аффинная хроматография с красителем (предпочтительно с использованием колонки Blue
Sepharose FF);
(2) хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC) (предпочтительно с использованием колонки Butyl 650M);
(3) хроматография с обращенной фазой (RPC) (предпочтительно с использованием колонки Source
30 RPC);
(4) анионообменная хроматография на сильно основной анионообменной смоле (предпочтительно с
использованием смолы ТМАЕ hicap);
(4') нанофильтрация;
(5) ультрафильтрация (предпочтительно с мембраной, имеющей отсечку 5 кДа).
Преимущество настоящего изобретения состоит в том, что способ очистки лишен дорогостоящей
стадии иммуно-аффинной хроматографии и обеспечивает каким-то образом высокую степень чистоты
FSH и удельной биологической активности. Очищенный FSH по настоящему изобретению также не содержит нежелательных примесей, привносимых иммуно-аффинной хроматографией (например, иммуноглобулинов, выщелачиваемых из смолы).
-7-
011673
Хранение/Лиофоилизация.
Жидкую композицию, полученную в результате описанного выше способа очистки и содержащую
очищенный FSH, можно заморозить для хранения в том виде, как она есть, или после очистки элюат
можно подвергнуть лиофилизации («сушке замораживанием») для удаления растворителя. Полученный
жидкий или лиофилизированный продукт называется «основная масса FSH».
Препаративные формы FSH.
FSH, или вариант FSH по изобретению, или очищенные в соответствии со способом по изобретению можно включить в препаративную форму для инъекций: внутримышечных или подкожных, предпочтительно подкожных. Препаративную форму FSH можно лиофилизировать, и в этом случае ее растворяют в воде для инъекций перед инъекцией. Препаративная форма FSH может также представлять
собой жидкую препаративную форму, и в этом случае ее можно инъецировать непосредственно, без
предварительного растворения.
Препаративная форма FSH может представлять собой одну дозу или множество доз. Если она представляет собой множество доз, она должна предпочтительно содержать бактериостатическое средство,
такое как, например, бензиловый спирт, метакрезол, тимол или фенол, предпочтительно бензиловый
спирт или метакрезол. Однодозовые препаративные формы могут также включать бактериостатическое
средство.
FSH по изобретению может быть включен в препаративную форму с известными наполнителями и
стабилизаторами, например сахарозой или маннитом. Она может также включать антиоксидант, такой
как метионин. Она может, кроме того, включать поверхностно-активное вещество, такое как TWEEN
(предпочтительно TWEEN 20) или Pluronic (предпочтительно, Pluronic F68).
В особенно предпочтительной препаративной форме FSH, полученный способом по изобретению,
включается в препаративную форму растворением его в воде для инъекций с сахарозой, фосфатным буфером (рН 7), Pluronic F68, метионином и метакрезолом или бензиловым спиртом.
Особенно предпочтительная жидкая многодозовая препаративная форма рекомбинантного FSH для
подкожной или внутримышечной инъекции следующая.
Компоненты многодозовых жидких препаративных форм FSH
Показания.
FSH по изобретению подходит для применения при всех видах лечения, для которых показан FSH.
Он особенно подходит для подкожного введения при индукции овуляции, регулируемой гиперстимуляции яичников для вспомогательных репродуктивных технологий и при лечении олигоспермии. Его можно применять в сочетании с другими гонадотропинами, такими как LH и hCG. Его можно также применять с другими соединениями, которые усиливают реакцию на FSH, такие как кломифен цитрат, ингибиторы ароматазы, такие как анастрозол, летрозол, фадрозол и YM-511.
-8-
011673
Последовательности
Фолликулостимулирующий гормон, или FSH, используемый здесь, относится к FSH человека
(hFSH), получаемому в виде зрелого белка полной длины. FSH представляет собой димер, состоящий из
α-субъединицы гликопротеина человека и β-субъединицы FSH человека. Белковая последовательность
α-субъединицы гликопротеина человека представлена в SEQ ID NO:1, а белковая последовательность
β-субъединицы FSH человека приведена в SEQ ID NO:2. Использование термина «рекомбинантный»
относится к препаратам FSH, которые получают посредством использования технологии рекомбинантной ДНК (см., например, WO 85/01958). Один пример способа экспрессии FSH с использованием рекомбинантной технологии заключается в трансфекции эукариотических клеток последовательностями ДНК,
кодирующими α- и β-субъединицы FSH, предоставленные на одном векторе или на двух векторах, причем каждая субъединица имеет отдельный промотор, как описано в европейских патентах № ЕР 0211894
и ЕР 0487512. ДНК, кодирующая FSH, может представлять собой кДНК или она может содержать интроны. Другой пример использования рекомбинантной технологии для получения FSH является использование гомологичной рекомбинации для вставки гетерологичного регуляторного сегмента в функциональной связи с эндогенными последовательностями, кодирующими одну или обе из субъединиц FSH,
как описано в европейском патенте № ЕР 0505500 (Applied Research Systems ARS Holding NV). Предусмотрены также способы, такие как способы, описанные в WO 99/57263 (Transkaryotic Therapies), где
одна из субъединиц вставляется гетерологично в клетку, а другая субъединица экспрессируется активацией геномных последовательностей вставкой гетерологичного регуляторного сегмента гомологичной
рекомбинацией. Способ по изобретению можно использовать для очистки FSH, экспрессируемого с использованием любого из этих способов и других способов.
Выражение «рекомбинантная клетка» относится к клетке, получаемой вставкой гетерологичной
ДНК, включая любой из указанных выше способов генетической манипуляции.
Предпочтительно FSH получают рекомбинантно в клетках яичников китайских хомячков (СНО),
трансфецированных вектором или векторами, включающими ДНК, кодирующую α-субъединицу гликопротеина человека и β-субъединицу FSH. ДНК, кодирующая α- и β-субъединицы, может присутствовать
на одном и том же или различных векторах.
Выражение «вариант FSH» предназначено для охвата тех молекул, которые отличаются по аминокислотной последовательности, типом гликозилирования или связью между субъединицами из FSH человека, но проявляют активность FSH. Примеры включают CTP-FSH, длительно действующий модифицированный рекомбинантный FSH, состоящий из α-субъединицы дикого типа и гибридной
β-субъединицы, в которой карбоксиконцевой белок был слит с С-концевым пептидом β-субъединицы
FSH, как описано в публикациях (LaPolt et al.; Endocrinology; 1992, 131, 2514-2520 или Klein et al.; Development and characterization of a long-acting recombinant hFSH agonist; Human Reprod. 2003, 18, 50-56).
Включен также одноцепочечный CTP-FSH, одноцепочечная молекула, состоящая из следующих последовательностей (от N-концевой к С-концевой):
где βFSH обозначает β-субъединицу FSH,
βhCG-CTP (113-145) обозначает карбоксиконцевой пептид hCG и
αFSH обозначает α-субъединицу FSH, как описано в публикации Pharmacokinetics and pharmacodynamics of single-chain recombinant human follicle-stimulating hormone containing the human chorionic gonadotrophin carboxyterminal peptide in the rhesus monkey, Fertility & Sterility; 2002, 77, 1248-1255.
Другие примеры вариантов FSH включают молекулы FSH, имеющие дополнительные сайты гликозилирования, включенные в α- и/или β-субъединицу, как раскрыто в WO 01/58493 (Maxygen), и молекулы FSH со связями S-S между субъединицами, как описано в WO 98/58957. Другие примеры вариантов
FSH включают химерные молекулы, включающие последовательности из FSH и последовательности из
hCG или LH, такие как последовательности, описанные в WO 91/16922 и WO 92/22568.
Указанные здесь варианты FSH также включают карбоксиконцевые делеции β-субъединицы, которая короче, чем зрелый белок полной длины SEQ ID NO:2. Карбоксиконцевые делеции человеческой
β-субъединицы представлены в SEQ ID NOS:3, 4 и 5. Понятно, что карбоксиконцевые варианты β-цепи
образуют комплекс с известной α-субъединицей для образования гетеродимера варианта FSH.
В предпочтительном варианте осуществления FSH получают рекомбинантно в клетках СНО, или в
сыворотке, или в бессывороточной среде.
-9-
011673
В предпочтительном варианте осуществления очищенный FSH, полученный в соответствии со способом по изобретению, подходит для подкожного введения, обеспечивая возможность самостоятельного
введения пациентом.
Выражение «неочищенный рекомбинантный FSH» относится к надосадочной жидкости клеточной
культуры из рекомбинантных клеток, экспрессирующих FSH, перед тем как он был подвергнут любой
хроматографической стадии. Это выражение охватывает сырую форму надосадочной жидкости (выделенную из клеток), а также концентрированную, и/или отфильтрованную, и/или ультрафильтрованную
надосадочную жидкость.
Термин «биологическая активность» в отношении активности FSH относится к способности препаративной формы FSH вызвать биологические реакции, связанные с FSH, такие как увеличение массы
яичников при анализе Steeman-Pohley (Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation
with human chorionic gonadotrophin; Endocrinology; 1953, 53, 604-616), или рост фолликулов у пациентки.
Фолликулярный рост у пациентки можно оценить ультразвуком, например с точки зрения ряда фолликулов, имеющих средний диаметр на уровне примерно 16 мм на 8-й день стимуляции. Биологическую активность оценивают в отношении принятых стандартов для FSH.
Содержание LH в препарате FSH можно измерить, например, используя LH-специфический иммуноанализ, такой как Delfia hLH Spec (Wallac Oy, Turku, Finland).
Термин «удельная активность» в отношении FSH означает биологическую активность в ME препарата в признанном биологическом анализе FSH, таком как биологический анализ Steelman Pohley [деленную на количество белка, по данным определения анализом общего содержания белка, таким как анализ
Лоури (О.Н. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr and R.J. Randall (1951), J. Biol. Chem. 193: 265; Hartree E.E.
(1972). Anal. Biochem. 48: 422; J. R. Dulley and P.A. Grieve (1975), Anal. Biochem. 64: 136), анализ Bradford
(Bradford, M.M. (1976), Anal. Biochem. 72, 248)], спектральная поглощательная способность 280 нм.
Предпочтительно FSH, полученный по изобретению, имеет удельную активность более чем
8000 МЕ/мг, или примерно 8000 МЕ/мг, предпочтительнее больше чем 9000 МЕ/мг, или примерно
9000 МЕ/мг, еще предпочтительнее более чем 10000 МЕ/мг, или примерно 10000 МЕ/мг, еще предпочтительнее 14000 МЕ/мг, или примерно 14000 МЕ/мг, где биологическую активность измеряют биологическим анализом Steelman Pohley, а содержание белка измеряют SE-HPLC (субстратно-ферментной
ВЭЖХ).
Образцы FSH можно анализировать в отношении их чистоты на различных стадиях процедуры, используя, например, такие методики, как методики, перечисленные ниже.
Количественный анализ r-hFSH/свободная α-субъединица/чистота/окисленные формы: RP-HPLC.
Как указано выше, FSH представляет собой гетеродимерный гликопротеин, составленный из α- и
β-субъединицы. Может происходить некоторая диссоциация субъединиц и это можно контролировать
определением количества свободной α-субъединицы, присутствующей в образце. Кроме того, субъединицы FSH могут стать окисленными. Окисленные примеси можно количественно определить, используя
RP-HPLC, в то время как свободные субъединицы можно оценить, используя SDS-PAGE (электрофорез в
полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия).
Количественное определение r-hFSH: иммуноанализ.
Содержание FSH в образце можно определить, используя иммуноанализ, специфичный для FSH,
такой как иммуноанализ FSH DELFIA.
Общий белок: анализ Bradford, анализ Лоури, спектральная поглощательная способность при
280 нм.
Как и в отношении любого белкового препарата, общее содержание белка можно определить, используя такие методики, как анализ Bradford, анализ Лоури, спектральная поглощательная способность
при 280 нм.
Тип изоформ: IEF.
Как указано выше, FSH представляет собой гликопротеин, имеющий множественные олигосахаридные остатки, присоединенные в различных местах на обеих субъединицах. Олигосахаридные остатки
могут иметь различные степени разветвления и могут быть перекрыты остатками сиаловой кислоты. Остатки сиаловой кислоты отрицательно заряжены (при нейтральном рН). Различия перекрытия ведут к
неоднородности, причем смесь видов имеет различные изоэлектрические точки (pl). Это можно оценить,
используя методику, которая разделяет на основании заряда, такую как изоэлектрическое фокусирование
(IEF).
Белок клетки-хозяина (НСР).
Белок клетки-хозяина можно анализировать, используя анализ ELISA. Например, антитела могут
вырабатываться к «культуре-пародии», которая представляет собой культуру клеток-хозяев без гена FSH.
- 10 -
011673
Примеры
Теперь настоящее изобретение будет проиллюстрировано посредством двух примеров.
Соответствующие блок-диаграммы, иллюстрирующие указанные 2 примера, представлены на
фиг. 1 и 2. Полученный r-hFSH называется «основная масса r-hFSH».
Пример 1 (см. фиг. 1).
Стадия (1). Аффинная хроматография с красителем на синей сефарозе.
Исходный материал FSH для очистки получают из сборов клеточных культур, содержащих рекомбинантный FSH, т.е. FSH, который был получен рекомбинантно в клетках СНО, или в сыворотке, или в
бессывороточной среде. Колонку для аффинной хроматографии с красителем (смола Blue Sepharose FF)
сначала уравновешивают буфером с низкой электропроводностью при рН 8,5, содержащим L-метионин.
Затем жидкость, содержащую FSH, наносят непосредственно на смолу. После загрузки несвязанный материал вымывают, используя уравновешивающий буфер. Наконец, FSH элюируют промыванием колонки
буфером фосфата натрия при рН 7,0, содержащим NaCl и L-метионин. Объединенный элюат непосредственно подвергают химической обработке на следующей стадии. Эту стадию проводят при 2-8°С.
Стадия (2). Хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC) на Toyopearl Butyl 650М.
Элюат Blue Sepharose FF со стадии (1) загружают на колонку Toyopearl Butyl 650М против буфера
фосфата натрия, рН 7,0 содержащего сульфат аммония и L-метионин. Несвязанный материал вымывают
уравновешивающим буфером. FSH элюируют тем же буфером, но со сниженной концентрацией сульфата аммония. Элюат перерабатывают на следующей стадии. Стадию проводят при комнатной температуре.
Стадия (3). Обращенная фаза на колонке Source 30 RPC.
Элюат HIC (со стадии (2)) сначала кондиционируют добавлением IPA (изопропанол). Колонку
Source 30 RPC уравновешивают против буфера ацетата аммония, рН 7,6, содержащим L-метионин и
2-пропанол в концентрации, эквивалентной концентрации кондиционированного загрузочного материала. После вымывания несвязанный материал с уравновешивающим буфером смолу промывают буфером
ацетата аммония, рН 7,6, содержащим L-метионин и повышенную концентрацию 2-пропанола. FSH
окончательно элюируют дальнейшим увеличением концентрации 2-пропанола. Объединенный элюат в
конечном счете разбавляют при перемешивании водой, содержащей L-метионин. Разведенный объединенный элюат перерабатывают на следующей стадии. Стадию проводят при комнатной температуре.
После выполнения описанной выше процедуры фактор очистки, т.е. отношение чистоты FSH в
очищенном образце к чистоте FSH в исходном материале (неочищенном FSH), составляет примерно
40,000.
Пример 2 (см. фиг. 2).
Стадия (-1). Ультрафильтрация/диафильтрация концентрированного r-hFSH.
Все операции выполняют в условиях охлаждения (2-8°С). Неочищенный FSH, формирующий исходный материал для очистки, получен из сборов клеточных культур, содержащих рекомбинантный
FSH.
Осветление.
Неочищенный r-hFSH фильтруют через фильтр глубиной 0,5 мкм (такой как фильтры Pall Profile II
или его эквивалент).
Ультрафильтрация.
Осветленный неочищенный продукт сначала концентрируют ультрафильтрацией, используя полиэфирсульфоновую мембрану 10 кДа. Затем концентрированный удерживаемый материал диафильтруют
против по меньшей мере 5 двойных объемов боратного буфера, рН 8,5, содержащего L-метионин в качестве антиоксиданта. Электропроводность и рН удерживаемого материала измеряют для контроля хода
диафильтрации. Затем удерживаемый материал дополнительно концентрируют перед опорожнением
системы. Блок ультрафильтрации в конечном счете промывают диафильтрационным буфером и промывную жидкость смешивают с извлеченным удерживаемым материалом. Объединенный раствор подвергают переработке на следующей стадии.
Фильтрация.
Концентрированный продукт фильтруют через полиэфирсульфоновый фильтр с размером пор
0,2 мкм (или его эквивалент).
Стадия (0). Анионный обмен на Q-Sepharose FF.
Затем отфильтрованный материал наносят на прочную анионообменную (Q-Sepharose FF) смолу,
уравновешенную против буфера бората натрия, рН 8,5, содержащего L-метионин. После загрузки колонку промывают уравновешивающим буфером для вымывания всего несвязанного материала. Затем колонку элюируют буфером бората натрия, рН 8,5, содержащим NaCl (для увеличения электропроводности) и
L-метионин (в качестве антиоксиданта). Собранный объединенный элюат перерабатывают для аффинной
хроматографии с красителем.
Стадия (1). Аффинная хроматография с красителем на синей сефарозе.
Колонку для аффинной хроматографии с красителем (смола Blue Sepharose FF) сначала уравновешивают элюционным буфером со стадии Q-Sepharose FF. Затем элюат захвата наносят непосредственно
на смолу. После загрузки несвязанный материал вымывают, используя уравновешивающий буфер. Нако- 11 -
011673
нец, FSH элюируют промыванием колонки буфером фосфата натрия при рН 7,0, содержащим NaCl и
L-метионин. Объединенный элюат непосредственно перерабатывают на следующей стадии. Эту стадию
выполняют при 2-8°С.
Стадия (2). Хроматография гидрофобного взаимодействия на Toyopearl Butyl 650M.
Элюат Blue Sepharose FF загружают на колонку Toyopearl Butyl 650M, уравновешенную против буфера фосфата натрия, рН 7,0, содержащего сульфат аммония и L-метионин. Несвязанный материал вымывают уравновешивающим буфером. FSH элюируют тем же буфером, но со сниженной концентрацией
сульфата аммония. Элюат перерабатывают на следующей стадии. Эту стадию выполняют при комнатной
температуре.
Стадия (3). Обращенная фаза на колонке Source 30RPC.
Элюат HIC (со стадии (2)) сначала кондиционируют добавлением IPA (изопропанола). Колонку
Source 30RPC уравновешивают против буфера ацетата аммония, рН 7,6, содержащего L-метионин и
2-пропанол в концентрации, эквивалентной концентрации кондиционированного загрузочного материала. После вымывания несвязанного материала уравновешивающим буфером смолу промывают буфером
ацетата аммония, рН 7,6, содержащим L-метионин и повышенную концентрацию 2-пропанола. FSH
окончательно элюируют дальнейшим увеличением концентрации 2-пропанола. Объединенный элюат в
конечном счете при перемешивании разбавляют водой, содержащей L-метионин. Разбавленный объединенный элюат перерабатывают на следующей стадии. Эту стадию выполняют при комнатной температуре.
Стадия (4). Анионообменная хроматография на колонке со смолой Fractogel EMD TMAE hicap.
Колонку со смолой Fractogel EMD TMAE hicap сначала уравновешивают буфером бората натрия,
рН 8,5, содержащим L-метионин. Разбавленный материал после RPC со стадии (3) загружают на колонку. Несвязанный материал вымывают, используя уравновешивающий буфер. FSH элюируют из колонки,
увеличивая концентрацию соли линейным образом. Эту стадию выполняют при 2-8°С.
Стадия (4'). Нанофильтрация.
Элюат со стадии (4) Fractogel EMD TMAE наносят непосредственно на устройство нанофильтрации
20 нм под давлением 3 бар в атмосфере азота. Фильтрат перерабатывают на следующей стадии. Эту операцию выполняют при 2-8°С.
Стадия (5). Ультрафильтрация основной массы продукта.
Подвергнутый нанофильтрации материал FSH концентрируют фильтрацией в тангенциальном потоке на полиэфирсульфоновой мембране 5 кДа. Когда удерживаемый материал достигает примерно половины исходного объема, материал обменивают буфером диафильтрацией против WFI.
Чистота образцов.
Определяют чистоту образцов FSH после стадий очистки.
- 12 -
011673
Биологическая активность образцов.
Биологическую активность очищенного r-hFSH измеряют, используя способ прибавки массы яичников Steelman-Pohley. Удельную активность рассчитывают, используя биологическую активность, деленную на содержание FSH по данным определения способом SE-HPLC, как описано ниже.
Удельная активность конечной основной массы полученного продукта составляет обычно от 10000
до 17000 МЕ/мг. Иллюстративные величины для 2 образцов конечной основной массы продукта, полученного в соответствии со способом примера 2, представлены ниже в таблице.
- 13 -
011673
Удельная активность основной массы очищенного r-hFSH по изобретению
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ очистки рекомбинантного FSH или варианта FSH, включающий подвергание жидкости,
содержащей FSH:
(1) аффинной хроматографии с красителем;
(2) хроматографии гидрофобного взаимодействия и
(3) хроматографии с обращенной фазой,
которые можно проводить в любом порядке.
2. Способ по п.1, где аффинную хроматографию с красителем стадии (1) проводят со смолой,
имеющей иммобилизованный Cibacron Blue F3G-A.
3. Способ по п.1 или 2, где смола, используемая для аффинной хроматографии с красителем стадии
(1), представляет собой Blue Sepharose FF.
4. Способ по любому из пп.1-3, где аффинную хроматографию с красителем стадии (1) проводят,
используя буфер фосфата натрия при рН на уровне или примерно от 6,5 до 11,5 в качестве элюента.
5. Способ по любому из пп.1-4, где хроматографию гидрофобного взаимодействия (HIC) стадии (2)
проводят, используя Toyapearl Butyl 650M или смолу, имеющую аналогичные характеристики.
6. Способ по любому из пп.1-5, где хроматографию гидрофобного взаимодействия (HIC) стадии (2)
проводят, используя фосфат натрия/сульфат аммония в качестве элюента.
7. Способ по любому из пп.1-6, где стадию хроматографии с обращенной фазой стадии (3) проводят, используя Source 30 RPC в качестве смолы.
8. Способ по любому из пп.1-7, где стадию хроматографии с обращенной фазой стадии (3) проводят, используя ацетат аммония с 2-пропанолом в качестве элюента.
9. Способ по любому из пп.1-8, где стадии проводят в следующем порядке:
(1) аффинная хроматография с красителем;
(2) хроматография гидрофобного взаимодействия и затем
(3) хроматография с обращенной фазой.
10. Способ по любому из пп.1-9, дополнительно включающий стадию анионообменной хроматографии - стадию (0).
11. Способ по п.10, где стадию анионообменной хроматографии проводят перед стадиями (1), (2) и
(3).
12. Способ по п.11, где стадии проводят в следующем порядке:
(0) анионообменная хроматография;
(1) аффинная хроматография с красителем;
(2) хроматография гидрофобного взаимодействия и затем
(3) хроматография с обращенной фазой.
13. Способ по пп.10, 11 или 12, где анионообменную хроматографию стадии (0) проводят со смолой
Q-Sepharose FF или смолой Fractogel EMD TMAE HiCap.
14. Способ по любому из пп.10-13, где ионообменную хроматографию стадии (0) проводят, используя боратный буфер в качестве элюента.
15. Способ по п.14, где боратный буфер имеет рН на уровне или примерно 8,5.
16. Способ по любому из пп.10-15, дополнительно включающий вторую стадию анионообменной
хроматографии - стадию (4).
17. Способ по п.16, где вторую стадию анионообменной хроматографии стадии (4) проводят после
стадий (1), (2) и (3).
18. Способ по п.17, где стадии проводят в следующем порядке:
(0) анионообменная хроматография;
(1) аффинная хроматография с красителем;
(2) хроматография гидрофобного взаимодействия;
(3) хроматография с обращенной фазой и
(4) анионообменная хроматография.
19. Способ по любому из пп.16-18, где вторую стадию анионообменной хроматографии стадии (4)
проводят, используя смолу Fractogel EMD TMAE HiCap или смолу Q-Sepharose FF.
- 14 -
011673
20. Способ по пп.16-19, где вторую стадию анионообменной хроматографии стадии (4) проводят,
используя боратный буфер и градиент возрастающей концентрации NaCl.
21. Способ по любому из пп.16-20, включающий стадию нанофильтрации - стадию (4'), проводимую после второй стадии анионообменной хроматографии стадии (4).
22. Способ по п.21, включающий стадию ультрафильтрации (5), после стадии нанофильтрации (4').
23. Способ по любому из пп.1-22, где любой из элюентов и/или буферов может содержать антиоксидант, в частности L-метионин.
24. Способ очистки человеческого рекомбинантного FSH, включающий стадии:
(-1) ультрафильтрации;
(0) анионообменной хроматографии на Q-Sepharose FF с боратом/NaCl, L-метионином с рН на уровне или примерно 8,5 в качестве элюента;
(1) подвергания элюата стадии (0) стадии аффинной хроматографии с красителем на Blue Sepharose
FF и фосфате, NaCl, L-метионине при рН на уровне или примерно 7,0 в качестве элюента;
(2) подвергания элюата стадии (1) стадии хроматографии гидрофобного взаимодействия на
Toyapearl Butyl 650M с фосфатом, сульфатом аммония, L-метионином при рН на уровне или примерно
7,0 в качестве элюента;
(3) подвергания элюата стадии (2) стадии хроматографии с обращенной фазой на Source 30 RPC с
ацетатом аммония, L-метионином, с 2-пропанолом при рН на уровне или примерно 7,6 в качестве элюента;
(4) подвергания элюата стадии (3) стадии анионообменной хроматографии на смоле Fractogel EMD
TMAE HiCap с боратом, L-метионином при рН на уровне или примерно 8,5 и NaCl;
(4') подвергания элюата стадии (4) стадии нанофильтрации и
(5) подвергания фильтрата стадии (4) стадии ультрафильтрации.
Фиг. 1
Фиг. 2
- 15 -
011673
Список последовательностей
- 16 -
011673
- 17 -
011673
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 18 -