Исследование свойств и механизмов формирования субпопуляций активированных тромбоцитов 03.01.02 - биофизика АВТОРЕФЕРАТ
реклама
На правах рукописи ТОПАЛОВ Николай Николаевич Исследование свойств и механизмов формирования субпопуляций активированных тромбоцитов 03.01.02 - биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2012 Работа выполнена в Федеральном Государственном Бюджетном Учреждении Гематологический научный центр Министерства Здравоохранения и Социального Развития РФ и в Федеральном Государственном Бюджетном Учреждении Науки Центр Теоретических Проблем Физико-химической Фармакологии РАН Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор Пантелеев Михаил Александрович Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Дудченко Александр Максимович доктор биологических наук Сарбаш Василий Иванович Bедущая организация: Учреждение Российской Академии Наук Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН. Защита диссертации состоится « » 2012 года в часов на заседании Диссертационного совета Д.002.252. Учреждении Российской академии наук Центре теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН: 119991, г. Москва, ул. Косыгина, д.4 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЦТП ФХФ РАН. Автореферат разослан « » 2012 года Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук И.С.Николаева 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Тромбоциты - это безъядерные клетки крови, основной функцией которых является участие в свертывании крови, процессе, предотвращающем кровопотерю при повреждении кровеносного сосуда. Повреждение кровеносного сосуда приводит к активации каскада реакций плазменного гемостаза и тромбоцитов. Основные активаторы тромбоцитов это коллаген, обнажающийся при повреждении сосуда, тромбин, основной белок каскада плазменного гемостаза, АДФ и тромбаксан А2, секретируемые тромбоцитами в процессе активации. При активации тромбоцит может изменять форму, адгезировать к месту повреждения, агрегировать с другими тромбоцитами, секретировать различные вещества, формировать прокоагулянтную поверхность, содержащую фосфатидилсерин, и отделять микровезикулы. Известно, что любая сильная активация тромбоцитов приводит к разделению тромбоцитов на две субпопуляции. Это так называемые укутанные и неукутанные тромбоциты. Поверхность укутанных тромбоцитов, в отличие от неукутанных, содержит фосфатидилсерин, такая поверхность необходима для существенного ускорения реакций плазменного звена системы гемостаза. Укутанные тромбоциты также характеризуются наличием альфа-гранулярных белков, связанных с поверхностью таких тромбоцитов, и дезактивацией интегрина αIIbβ3a, основного трансмембранного белка, обеспечивающего агрегацию тромбоцитов. Механизмы формирования субпопуляций активированных тромбоцитов изучены недостаточно хорошо. Известно, что различная активация ведет к формированию различного количества укутанных тромбоцитов, что говорит о том, что тромбоциты изначально являются гомогенной популяцией и разделяются на субпопуляции именно в процессе активации. Также было показано, что секреция АДФ, но не тромбаксана А2, регулирует формирование укутанных тромбоцитов. Также известно, что добавление кальциевого ионофора А23187 ведет к экспрессии фосфатидилсерина всеми тромбоцитами суспензии, что говорит о вероятной роли кальциевой сигнализации в формировании субпопуляций активированных тромбоцитов. В данной работе изучалась роль кальциевой сигнализации в формировании укутанных тромбоцитов. Была разработана методика детекции кальция в субпопуляциях тромбоцитов, произведен сравнительный анализ флуоресцентных красителей, чувствительных к концентрации кальция в цитоплазме тромбоцитов. Произведен анализ кинетики кальция в субпопуляциях активированных тромбоцитов при различной активации. В большинстве работ, посвященных изучению субпопуляций активированных тромбоцитов, тромбоциты активировались в концентрации более чем на порядок ниже 3 физиологической. Такой подход позволяет упростить экспериментальную модель, сведя к минимуму вклад секреции тромбоцитов и межклеточных взаимодействий. Таким образом, в данный момент существует необходимость детального изучения процессов, происходящих в тромбоцитах при их активации в физиологической концентрации, что, возможно, позволит прояснить ряд противоречий и выявить дополнительные механизмы, ведущие к экспрессии фосфатидилсерина при активации тромбоцитов. Цель работы: Изучить свойства и механизмы формирования фосфатидилсеринположительных тромбоцитов в физиологических концентрациях. Задачи исследования: 1. Подобрать оптимальный внутриклеточный Ca2+-флуорофор, подходящий для достоверной оценки изменений концентраций кальция, характерных для сильной активации тромбоцитов. 2. Исследовать кальциевую сигнализацию в тромбоцитах при использовании различных активаторов. 3. Исследовать зависимость кальциевой сигнализации и экспрессии фосфатидилсерина от концентрации активированных тромбоцитов. 4. Выявить механизмы, регулирующие экспрессию фосфатидилсерина при активации тромбоцитов в физиологической концентрации. Научная новизна. При активации тромбоцитов в физиологических концентрациях (2×108/мл-4×108/мл) впервые выявлена гетерогенность среди ФС-положительных тромбоцитов. Помимо известной ранее ФС-положительной субпопуляции с устойчиво повышенной концентрацией внутриклеточного кальция, выявлена новая, также ФСположительная субпопуляция с низкой концентрацией кальция, не превышающей уровня, характерного для неактивированных тромбоцитов. Для тромбоцитов новой ФС-положительной субпопуляции характерны высокие значения прямого и бокового светорассеяния, способность связывать фибриноген/фибрин и наличие активного интегрина αIIbβ3a. Показано, что секреция тромбоцитов в процессе активации увеличивает количество тромбоцитов в обеих ФС-положительных субпопуляциях, но не влияет на соотношение между ними. Показано, что тромбоциты новой субпопуляции формируются в результате межклеточных взаимодействий с участием интегрина αIIbβ3a. При снижении концентрации активируемых тромбоцитов ниже 5×107/мл, вновь выявленная вторая ФС-положительная субпопуляция не образуется. Научно-практическое значение. Полученные результаты позволяют по-новому взглянуть на роль активации тромбоцитов в свертывании крови. Тромбоциты вновь открытой субпопуляции, сочетающие прокоагулянтные и агрегационные способности, представляются наиболее важными участниками свертывания крови. Полученные результаты по-новому раскрывают роль межклеточных взаимодействий в процессе 4 активации тромбоцитов. Также результаты, полученные в работе, дают новое представление о возможном дополнительном влиянии на гемостаз антагонистов интегрина αIIbβ3a, использующихся в терапии сердечно-сосудистых заболеваний. Положения, выносимые на защиту: 1) Концентрации кальция, наблюдаемые в тромбоцитах при сильной активации, находятся в пределах динамического диапазона флуоресцентного Ca2+-флуорофора Fura Red. В отличие от Calcium Green-1, она может использоваться для исследования кальциевой сигнализации в субпопуляциях тромбоцитов крови. 2) Экспрессия фосфатидилсерина укутанными тромбоцитами сопровождается продолжительным увеличением концентрации кальция в цитоплазме. 3) При активации тромбоцитов в физиологических концентрациях формируется новая субпопуляция тромбоцитов, экспрессирующих фосфатидилсерин, которая характеризуется: а) низким уровнем внутриклеточного кальция б) более высоким сигналом прямого и бокового светорассеяния, чем у укутанных тромбоцитов в) поверхностью, покрытой фибриногеном г) наличием активированного интегрина αIIbβ3, в отличие от ранее описанных укутанных тромбоцитов. 4) Формирование этой субпопуляции прокоагулянтных тромбоцитов при физиологической концентрации обусловлено межклеточными взаимодействиями через интегрин αIIbβ3 в процессе активации. Апробация работы. Работа прошла апробации: 26 марта 2012 года на заседании межлабораторного семинара Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН. Результаты диссертационной работы были представлены: 12-я международная школа-конференция “Биология наука XXI века” (Пущино, Россия, 10-14 ноября 2008), 36th FEBS Congress, (Турин, Италия, 25–30 июня 2011), XXIII Congress of the international society on thrombosis haemostasis (ISTH) (Киото, Япония, 23-28 июля 2011). Публикации. По материалы диссертационной работы опубликовано 6 научных работ. Статей в рецензируемых журналах – 1; публикаций в трудах конференций и съездов – 5 Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 83 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 – обзора литературы, главы 2 – описания материалов и методов, главы 3 – описание экспериментальных результатов, главы 4 – обсуждения результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 88 источников. Работа выполнена на базе Учреждения Российской академии медицинских наук Гематологический научный 5 центр РАМН в лаборатории физической биохимии системы крови (зав. лабораторией проф., д.б.н. Атауллаханов Ф.И.) и Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН в лаборатории молекулярных механизмов гемостаза (зав. лабораторией д.ф-м.н. Пантелеев М.А.). СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении показана актуальность исследуемой темы, обозначены основные проблемы в данной области, сформулированы цели и задачи, дана общая характеристика работы. Глава 1 посвящена обзору литературы. Она содержит сведения об активации тромбоцитов и о формировании субпопуляций тромбоцитов в процессе активации. Рассмотрены основные сведения о свойствах и механизмах формирования субпопуляций активированных тромбоцитов. Изложены основные представления о внутриклеточной сигнализации в тромбоцитах. Отдельно подробно изложены основные методы, применяемые для исследования субпопуляций активированных тромбоцитов. В главе 2 описываются материалы и методы, используемые в работе. В том числе приводятся все реактивы, использовавшиеся при проведении экспериментов, методики забора крови у доноров, выделения тромбоцитов при помощи центрифугирования и гель-фильтрации, загрузки тромбоцитов флуоресцентными красителями, чувствительными к концентрации кальция в цитоплазме. Подробно изложены методы окраски тромбоцитов различными антителами, активации тромбоцитов. Изложены основные принципы настройки параметров проточного цитометра, а также обработки результатов, полученных в результате анализа. Отдельно рассмотрены специфические методы, используемые для анализа кинетики формирования субпопуляций, а также для изучения роли секреции и межклеточных взаимодействий в формировании субпопуляций. Загрузка тромбоцитов флуоресцентными красителями, чувствительными к концентрации внутриклеточного кальция Для изучения кальциевой сигнализации в субпопуляциях тромбоцитов использовали метод загрузки флуоресцентными красителями, чувствительными к концентрации кальция (внутриклеточными Ca2+-флуорофорами). В данной работе использовались два таких Ca2+-флуорофора - Calcium Green-1 и Fura Red. Загрузку тромбоцитов этими Ca2+флуорофорами производили путем инкубации суспензии тромбоцитов (концентрация красителей 10 мкМ) в течение 30 минут в присутствии простагландина Е1 (1 мкM) и апиразы (0.1 ед./мл) перед гель-фильтрацией. 6 Окраска тромбоцитов меченными антителами, активация тромбоцитов Для анализа свойств тромбоцитарных субпопуляций использовали метод флуоресцентного мечения. В работе использовалии следующие типы окраски. 1) Окраска флуоресцеин- и фикоэритрин- меченным аннексином V. Окраску производили путем добавления в пробу 1% аннексина V непосредственно перед активацией тромбоцитов. 2) Окраска флуоресцеин- меченным антителом PAC-1. Окраску данным антителом производили после активации тромбоцитов путем инкубации в течение 3 минут (объемная концентрация антитела 10%) непосредственно перед измерением. 3) Окраска флуоресцеин- меченным поликлональныым антителом к фибриногену. Аналогично окраске антителом PAC-1, окраску антителом к фибриногену производили путем инкубации с антителом в течение 3 минут (объемная концентрация антитела 5%). В работе использовались следующие типы активации тромбоцитов: а) 10 нМ тромбина и 100 нг/мл конвульксина. б) 100 нМ тромбина. в) 150 мкМ SFLLRN и 100 нг/мл конвульксина. г) 150 мкМ SFLLRN. д) 10 мкМ ионофора А23187. Изучение роли секреции в формировании субпопуляций Для изучения роли секреции в формирование субпопуляций тромбоцитов производился следующий эксперимент. Тромбоциты, загруженные Ca2+-флуорофором Fura Red, взятые в концентрации 2х108 мл-1 или 0,2х108 мл-1, окрашивали флуоресцеинмеченным аннексином V, активировали 100 нМ тромбина в течение 20 минут и анализировали на проточном цитометре. Аналогичная проба, содержащая тромбоциты в концентрации 2х108 мл-1, после 20 минут активации центрифугировалась в течение 5 минут при 400 g для осаждения тромбоцитов. Отбирался супернатант, содержащий тромбин и вещества, секретированные тромбоцитами, к нему добавлялись интактные тромбоциты в концентрации 0,2х108 мл-1, через 15 минут пробу анализировали на проточном цитометре. О роли секреции судили по изменению соотношения между тромбоцитами разных субпопуляций. Изучение роли межклеточных взаимодействий в формировании субпопуляций Для изучения роли межклеточных взаимодействий в формировании субпопуляций выполнялся следующий эксперимент. Тромбоциты, загруженные краской Fura Red, взятые в концентрациях 0,2х108 мл-1 или 2х108 мл-1, окрашивали меченным аннексином V и активировали 100 нМ тромбина в течение 15 минут. Для ингибирования межклеточных взаимодействий через гликопротеин IIb-IIIa к тромбоцитам перед активацией добавляли его селективный ингибитор монафрам (300 мкг/мл). Для увеличения вероятности взаимодействия тромбоцитов друг с другом, проба, 7 содержавшая тромбоциты в концентрации 0,2х108 мл-1, в процессе активации подвергалась перемешиванию на шейкере со скоростью 300 об/мин. Глава 3 содержит результаты работы. Выбор оптимального Ca2+-флуорофора. Тромбоциты загружали Ca2+-флуорофорами Calcium Green-1 или Fura Red перед помещением суспензии на колонку. Тромбоциты окрашивали флуоресцеин-меченным (для краски Fura Red) или фикоэритрин-меченным (для краски Calcium Green-1) аннексином V, активировали смесью тромбина и конвульксина либо ионофором A23187 и анализировали на проточном цитометре. Также анализировались неактивированные тромбоциты. На рисунках 1А и 1Б представлены типичные гистограммы распределений тромбоцитов разных субпопуляций по флуоресценции Ca2+-флуорофоров Calcium Green-1 (А) и Fura Red (Б). В случае использования краски Calcium Green-1 оказалось, что флуоресценция краски как в укутанных, так и в неукутанных тромбоцитах совпадает с флуоресценцией тромбоцитов, активированных ионофором A23187. Это означает, что концентрации кальция, характерные как для укутанных, так и для неукутанных тромбоцитов, лежат вне предела динамического диапазона Ca2+-флуорофора Calcium Green-1. На рисунке 1Б приведены аналогичные кривые для краски Fura Red. Как и для Calcium Green-1, флуоресценция Fura Red в укутанных тромбоцитах совпадает с флуоресценцией Fura Red в тромбоцитах, активированных ионофором A23187. Флуоресценция Fura Red в неукутанных тромбоцитах при этом лежит в промежутке между флуоресценцией в неукутанных тромбоцитах и в тромбоцитах, активированных ионофором A23187. Это означает, что концентрации кальция, характерные для неукутанных тромбоцитов, лежат в пределах динамического диапазона Ca2+-флуорофора Fura Red. Рис. 1. Выбор Ca2+-флуорофора, чувствительного к концентрации кальция. Тромбоциты загружались флуоресцентными красителями Calcium Green-1 (А) и Fura Red (Б), окрашивались аннексином V, оставались интактными, либо активировались 100 нг/мл конвульксина и 10 нМ тромбина, либо 10 мкМ ионофора A23187 в течение 10 минут и анализировались на проточном цитометре. Представлены гистограммы распределения флуоресценции красок в субпопуляциях тромбоцитов. Представлены данные типичного эксперимента (n=3). 8 Кинетика кальция в субпопуляциях активированных тромбоцитов Для исследования кинетики кальция в субпопуляциях активированных тромбоцитов производился следующий эксперимент. Тромбоциты, загруженные Ca2+-флуорофором Fura Red, окрашивали флуоресцеин-меченным аннексином V, активировали различными веществами. Через заданные промежутки времени часть пробы отбиралась, разбавлялась и анализировалась на проточном цитометре. Кинетика кальция в субпопуляциях тромбоцитах зависит от используемого вещества-активатора. В данной работе тромбоциты активировались тромбином (рис. 2А), активатором тромбинового PAR-1 рецептора SFLLRN (рис. 2Б), смесью тромбина и конвульксина (активатора коллагенового рецептора гликопротеина VI, рис. 2В), а также смесью SFLLRN и конвульксина (рис. 2Г). На данных графиках представлены временные зависимости флуоресценции Fura Red в субпопуляциях тромбоцитов. При любом типе активации наблюдается быстрый рост уровня кальция во всех тромбоцитах. Далее начинается разделение тромбоцитов на субпопуляции. При любом типе активации в укутанных тромбоцитах устанавливается высокий и стабильный уровень кальция (рис. 2А-Г). Кинетика кальция в неукутанных тромбоцитах зависит от используемого вещества-активатора. При активации тромбоцитов тромбином или SFLLRN уровень кальция в неукутанных тромбоцитах возвращается к исходному значению соответственно за 10 или 4 минуты (рис. 2А,Б); при активации смесью тромбина с конвульксином или SFLLRN с конвульксином в неукутанных тромбоцитах происходит стабилизация уровня кальция на промежуточном уровне (рис. 2В,Г). Кинетика формирования укутанных тромбоцитов также зависит от типа активации. На рисунке 2Д представлены типичные зависимости количества укутанных тромбоцитов от времени с момента активации. При любом типе активации количество укутанных тромбоцитов наиболее быстро растет в течение первых 4 минут после активации, к 10 минуте эксперимента формирование укутанных тромбоцитов завершается. Общее количество укутанных тромбоцитов зависит от типа активации: при активации тромбином или SFLLRN формируется 5-10% укутанных тромбоцитов, в то время как при активации смесью тромбина с конвульксином или SFLLRN с конвульксином формируется до 70% укутанных тромбоцитов. На рисунке 2.Е представлены гистограммы распределения флуоресценции Fura Red в неактивированных тромбоцитах (черный столбец), укутанных тромбоцитах (белые столбцы) и неукутанных тромбоцитах (серые столбцы) через 10 мин после активации. Представлены средние значения ± стандартные отклонения для экспериментов, выполненных на образцах крови различных доноров. 9 Рис. 2. Кинетика субпопуляциях тромбоцитов. кальция в активированных Тромбоциты загружались флуоресцентным красителем Fura Red, окрашивались меченным аннексином V и активировались указанными веществами. А-Г - зависимости от времени средней флуоресценции краски тромбоцитов до Fura Red разделения для на субпопуляции (▲), укутанных тромбоцитов (■) и неукутанных тромбоцитов (●). Д кинетика формирования тромбоцитов при Представлены эксперимента флуоресценция тромбоцитах укутанных разной активации. данные (n=3). Е краски до типичного Fura средняя Red разделения в на субпопуляции (черный столбец), укутанных тромбоцитов (белые столбцы) и неукутанных тромбоцитов (серые столбцы). Третья субпопуляция активированных тромбоцитов и ее свойства В ходе изучения кальциевой сигнализации в субпопуляциях активированных тромбоцитов было выяснено, что, при активации тромбоцитов в их физиологической концентрации 2х108 мл-1, помимо известных субпопуляций укутанных и неукутанных тромбоцитов, формируется ранее не описанная третья субпопуляция активированных тромбоцитов. На рисунке 3А изображена точечная диаграмма флуоресценции аннексина V (ось абсцисс) и краски Fura Red (ось ординат) для тромбоцитов, активированных 100 нМ тромбина в течение 10 минут (концентрация тромбоцитов 2х108 мл-1). Видны субпопуляции укутанных и неукутанных тромбоцитов, а также тромбоцитов третьей субпопуляции, которые экспрессируют фосфатидилсерин и содержат низкий уровень внутриклеточного кальция. 10 Рис. 3. Свойства субпопуляций активированных тромбоцитов. 8 -1 Тромбоциты (2х10 мл ) загружались флуоресцентным красителем Fura Red, окрашивались аллофикоцианин-меченным аннексином V и активировались 100 нМ тромбина. За 2 мин до анализа на проточном цитометре тромбоциты окрашивались флуоресцеин-меченным антителом к фибриногену или флуоресцеин- меченным антителом PAC-1. А точечная диаграмма флуоресценции аннексина V (ось абсцисс) и Fura Red (ось ординат). Представлены точечные диаграммы флуоресценции Fura Red (Б-Ж, ось ординат) и прямого светорассеяния (Б, В, ось абсцисс), флуоресценции антитела к фибриногену (Г, Д, ось абсцисс) и антитела PAC-1 (Е, Ж, ось абсцисс) для субпопуляций неукутанных тромбоцитов (Б, Г, Е), а также укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции (В, Д, Ж). Представлены данные типичного эксперимента. n=3. 11 На рисунках 3Б-Ж представлены точечные диаграммы распределения тромбоцитов по прямому светорассеянию (рис. 3Б,В, ось абсцисс), флуоресценции антитела к фибриногену (рис. 3Г,Д, ось абсцисс) и антитела PAC-1 (рис. 3Е,Ж, ось абсцисс). По оси ординат на рисунках 3Б-Ж отложена флуоресценция Fura Red. На левых панелях (рис.3Б,Г,Е) представлены значения для неукутанных тромбоцитов, на правых (рис. 3В,Д,Ж) - для укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции. Из рисунка 3 Б,В видно, что укутанные тромбоциты и тромбоциты третьей субпопуляции существенным образом отличаются по параметру прямого светорассеяния, в то время как неукутанные тромбоциты сильно распределены по этому параметру. Из рисунка 3 Г,Д видно, что укутанные тромбоциты и тромбоциты третьей субпопуляции, в отличие от неукутанных тромбоцитов, одинаково хорошо связывают антитело к фибриногену. Из рисунка 3.5. Е,Ж видно, что тромбоциты третьей субпопуляции связывают антитело PAC-1 так же хорошо, как и неукутанные тромбоциты, в отличие от укутанных тромбоцитов. Таким образом, тромбоциты третьей субпопуляции отличаются по параметру прямого светорассеяния от укутанных тромбоцитов. Тромбоциты третьей субпопуляции покрыты фибриногеном (или фибрином), что роднит их с укутанными тромбоцитами, однако имеют активный интегрин αIIbβ3a, что роднит их с неукутанными тромбоцитами. Исследование роли секреции АДФ в формировании субпопуляций Для изучения роли секреции АДФ в формировании субпопуляций активированных тромбоцитов тромбоциты активировались 100 нМ тромбина в течение 10 мин в присутствии различных концентраций апиразы. На рисунке 4А представлен график зависимости количества укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции от концентрации апиразы. Представлены средние значения ± стандартные отклонения для экспериментов, выполненных на образцах крови различных доноров (n=3). Видно, что добавление апиразы приводит к дозо-зависимому снижению количества как укутанных тромбоцитов, так и тромбоцитов третьей субпопуляции. На рисунке 4Б представлен график зависимости количества укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции от концентрации, в которой активировались тромбоциты. Видно, что при увеличении концентрации тромбоцитов количество укутанных тромбоцитов практически не меняется, в то время как количество тромбоцитов третьей субпопуляции значительно возрастает. 12 Рис. 4. Роль секреции АДФ в формировании субпопуляций активированных тромбоцитов. Тромбоциты 2х108 мл-1 загружались флуоресцентным красителем Fura Red, окрашивались флуоресцеинмеченным аннексином V и активировались 100 нМ тромбина в течение 10 мин. А - зависимость количества укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции от концентрации апиразы. Б - зависимость количества укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции от концентрации тромбоцитов в пробе. Представлены средние величины между экспериментами, выполненными на образцах крови различных доноров. n=3. Исследование роли секреции в формировании субпопуляций. Для изучения роли секреции в формировании субпопуляций активированных тромбоцитов был выполнен следующий эксперимент. Тромбоциты, загруженные Ca2+флуорофором Fura Red, взятые в концентрациях 2х108 мл-1, или 0,2х108 мл-1, окрашивали флуоресцеин-меченным аннексином V, активировали 100 нМ тромбина в течение 20 минут и анализировали на проточном цитометре. Также готовилась аналогичная проба, содержащая тромбоциты, активированные в концентрации 2х108 мл-1. Тромбоциты осаждались при помощи центрифугирования на 400 g в течение 5 минут, отбирался супернатант, содержавший тромбин и вещества, секретированные тромбоцитами в процессе активации. К супернатанту далее добавляли тромбоциты в концентрации 0,2х108 мл-1, через 20 минут проба анализировалась на проточном цитометре. На рисунке 5 представлена гистограмма распределения количества укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции при различной активации. Видно, что при активации тромбоцитов в концентрации 0,2х108 мл-1, супернатантом, а не тромбином, происходит пропорциональное увеличение как количества укутанных тромбоцитов, так и количества тромбоцитов третьей субпопуляции. Вещества, секретируемые тромбоцитами в процессе активации, увеличивают количество тромбоцитов обеих аннексин-положительных субпопуляций. Таким образом, секреция тромбоцитов в процессе активации не способна объяснить феномен существования третьей субпопуляции тромбоцитов при их активации в высокой концентрации. 13 Рис. 5. Роль секреции в формировании субпопуляций активированных тромбоцитов. Тромбоциты загружались флуоресцентным красителем Fura Red, окрашивались флуоресцеин-меченным аннексином V, активировались 100 нМ тромбина в течение 20 мин в концентрациях 0,2х108 мл-1 и 2х108 мл-1 и анализировались на 8 проточном цитометре. Проба, содержащая тромбоциты, активированные в -1 концентрации 2х10 мл , центрифугировалась при 400 g в течение 5 мин. Отбирался супернатант, к нему добавлялись тромбоциты в концентрации 0,2х108 мл-1, инкубировались в течение 20 мин и анализировались на проточном цитометре. Представлены средние значения количеств укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции между экспериментами, выполненными на крови различных доноров. n=3. Исследование роли межклеточных взаимодействий в формировании субпопуляций Поскольку секреция не способна объяснить формирование третьей субпопуляции тромбоцитов при их активации в высокой концентрации, была выдвинута гипотеза о роли межклеточных взаимодействий в формировании третьей субпопуляции активированных тромбоцитов. Для проверки этой гипотезы был выполнен следующий эксперимент. Тромбоциты, загруженные Ca2+-флуорофором Fura Red, взятые в концентрациях 2х108 мл-1 или 0,2х108 мл-1, окрашивали флуоресцеин-меченным аннексином V, активировали 100 нМ тромбина в течение 10 минут и анализировали на проточном цитометре. Аналогичная проба, содержавшая тромбоциты в концентрации 0,2х108 мл-1, подвергалась перемешиванию на шейкере на 300 об/мин в процессе активации, и/или перед активацией в нее добавлялся селективный блокатор интегрина 14 αIIbβ3a монафрам. На рисунке 6 представлена гистограмма распределения количества укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции при различной активации. Видно, что перемешивание тромбоцитов в процессе активации приводит к перераспределению тромбоцитов между субпопуляциями: число укутанных тромбоцитов снижается, а количество тромбоцитов третьей субпопуляции возрастает. Из рисунка 6 также видно, что добавление монафрама полностью блокирует эффект перераспределения тромбоцитов между субпопуляциями. Данный результат свидетельствует о роли сигнализации через интегрин αIIbβ3a в формировании тромбоцитов третьей субпопуляции. Таким образом, межклеточные взаимодействия через интегрин αIIbβ3a в процессе активации приводят к формированию тромбоцитов третьей субпопуляции при активации тромбоцитов в высокой концентрации. Рис. 6. Роль межклеточных взаимодействий в формировании субпопуляций активированных тромбоцитов. Тромбоциты загружались флуоресцентным красителем Fura Red, окрашивались флуоресцеин-меченным аннексином V, активировались 100 нМ тромбина в течение 10 мин в концентрациях 20000 мкл-1 и 200000 мкл-1 и анализировались на проточном цитометре. В пробу, содержащую тромбоциты в концентрации 20000 мкл -1 добавлялся монафрам и/или проба подвергалась встряхиванию на шейкере при 300 об/мин в процессе активации. Представлены средние значения количеств укутанных тромбоцитов и тромбоцитов третьей субпопуляции между экспериментами, выполненными на крови различных доноров. n=3. 15 Глава 4 посвящена обсуждению основных результатов работы. Целью данной работы было изучение свойств и механизмов формирования субпопуляций активированных тромбоцитов. Была разработана методика детекции кальция в цитоплазме сильно активированных тромбоцитов, изучена кинетика кальция в субпопуляциях тромбоцитов. Также в работе было показано существование третьей субпопуляции активированных тромбоцитов, изучены ее свойства и механизмы формирования. В данной работе была разработана методика детекции кальция в тромбоцитах при их сильной активации. Выяснилось, что краска Calcium Green-1, идеально подходящая для изучения кальциевой сигнализации в тромбоцитах при активации АДФ, не подходит для случая сильной активации. Было доказано, что экспрессия фосфатидилсерина укутанными тромбоцитами всегда сопровождается сильным и продолжительным ростом уровня кальция в цитоплазме. Этот результат в совокупности с известными литературными данными позволяет предположить, что формирование укутанных тромбоцитов - процесс, по своей природе сходный с апоптозом и некрозом. В данной работе впервые показано существование третьей субпопуляции активированных тромбоцитов, формирующейся при сильной активации тромбоцитов в их физиологической концентрации. Эта субпопуляция уникальным образом сочетает прокоагулянтную активность и способность к агрегации, что позволяет предположить ее исключительную важность в гемостазе и тромбозе. Важно отметить, что условия in vitro, в которых формируется эта субпопуляция, гораздо ближе к физиологическим, нежели условия, в которой эти тромбоциты не формируются. Тот факт, что формирование этой субпопуляции регулируется межклеточными контактами в процессе активации тромбоцитов, позволяет предположить, что в условиях in vivo, когда тромбоциты доставляются потоком и прикрепляются к растущему сгустку, третья субпопуляция тромбоцитов играет определяющую роль. Еще одним важным аспектом работы является то, что тромбоциты третьей субпопуляции способны экспрессировать фосфатидилсерин, сохраняя низкий уровень внутриклеточного кальция. Этот факт позволяет предположить, что экспрессия фосфатидилсерина такими тромбоцитами происходит благодаря неизвестным ранее сигнальным процессам, запускаемым активированным интегрином αIIbβ3a. Возможно, данный процесс имеет общие черты с запрограммированной клеточной гибелью вследствие апоптоза. Изложенные в работе результаты позволяют по-новому взглянуть на процессы, происходящии при тромбообразовании. Межклеточные контакты, помимо возможности тромбоцитам формировать агрегат около места повреждения сосуда, также обеспечивают мощную поддержку росту тромба, поддерживая формирование тромбоцитов третьей субпопуляции. Таким образом, блокирование интегрина αIIbβ3a 16 антагонистами, часто использующимися в клинической практике, может регулировать не только агрегацию тромбоцитов, но и генерацию тромбина благодаря снижению численности прокоагулянтных тромбоцитов третьей субпопуляции. ВЫВОДЫ 1) Концентрации кальция, наблюдаемые в тромбоцитах при сильной активации, находятся в пределах динамического диапазона флуоресцентного Ca2+-флуорофора Fura Red. В отличие от Calcium Green-1, она может использоваться для исследования кальциевой сигнализации в субпопуляциях тромбоцитов крови. 2) Экспрессия фосфатидилсерина укутанными тромбоцитами сопровождается продолжительным увеличением концентрации кальция в цитоплазме. 3) При активации тромбоцитов в физиологических концентрациях формируется новая субпопуляция тромбоцитов, экспрессирующих фосфатидилсерин, которая характеризуется: а) низким уровнем внутриклеточного кальция б) более высоким сигналом прямого и бокового светорассеяния, чем у укутанных тромбоцитов в) поверхностью, покрытой фибриногеном г) наличием активированного интегрина αIIbβ3, в отличие от ранее описанных укутанных тромбоцитов. 4) Формирование этой субпопуляции прокоагулянтных тромбоцитов при физиологической концентрации обусловлено межклеточными взаимодействиями через интегрин αIIbβ3 в процессе активации. Список работ, опубликованных по теме диссертации: 1. Топалов Н.Н., Котова Я.Н., Атауллаханов Ф.И., Пантелеев М.А., Роль кальциевой сигнализации в формировании “укутанных” тромбоцитов, Абстракт 12-й международной школы-конференции “Биология наука XXI века”, Пущино, Россия, 1014 ноября 2008, стр. 109-110. 2. I. D. Tarandovskiy, M. A. Panteleev, E. I.Sinauridze, N. N. Topalov, E. O. Artemenko, N. A. Podoplelova and F. I. Ataullakhanov Appearance of the second thrombin peak on thrombin generation curve in platelet rich plasma depends on phosphatidylserine expression during platelet activation, Abstract of 36th FEBS Congress, Torino, Italy, 25–30 June 2011, p. 292. 3. N. N. Topalov, Y. N. Kotova, S. A. Vasil’ev and M. A. Panteleev, Identification of signal transduction pathwaysinvolved in the formation of platelet subpopulations during activation, Abstract of 36th FEBS Congress, Torino, Italy, 25–30 June 2011, p. 365. 4. Ivan Dmitrievitsh Tarandovskiy, Mikhail Panteleev, Elena Sinauridze, Nikolai 17 Topalov, Elena Artemenko, Nadejda Podoplelova, Fazoil Ataullakhanov, FORMATION OF THE SECOND PEAK IN PLATELET-RICH PLASMA THROMBIN GENERATION CURVE IS LINKED WITH PHOSPHATIDYLSERINE EXPRESSION DURING PLATELET ACTIVATION, Abstracts of XXIII Congress of the international society on thrombosis haemostasis (ISTH), Kyoto, July 23-28, 2011. 5. Nikolay N. Topalov, Yana N. Kotova, Sergey A. Vasil’ev, Mikgail A. Panteleev, IDENTIFICATION OF SIGNAL TRANSDUCTION PATHWAYS INVOLVED IN THE FORMATION OF PLATELET SUBPOPULATIONS DURING ACTIVATION, Abstracts of XXIII Congress of the international society on thrombosis haemostasis (ISTH), Kyoto, July 23-28, 2011. 6. Nikolai N. Topalov, Yana N. Kotova, Sergey A. Vasil’ev, Mikhail A. Panteleev, Identification of signal transduction pathways involved in the formation of platelet subpopulations upon activation, British Journal of Haematology, Volume 157, Issue 1, pages 105–115, April 2012. 18
