ÌÈÍÈÑÒÅÐÑÒÂÎ ÇÄÐÀÂÎÎÕÐÀÍÅÍÈß ÐÅÑÏÓÁËÈÊÈ ÁÅËÀÐÓÑÜ ÌÅÒÎÄÈ×ÅÑÊÈÅ ÐÅÊÎÌÅÍÄÀÖÈÈ

реклама
ÌÈÍÈÑÒÅÐÑÒÂÎ ÇÄÐÀÂÎÎÕÐÀÍÅÍÈß ÐÅÑÏÓÁËÈÊÈ ÁÅËÀÐÓÑÜ
ÌÅÒÎÄÈ×ÅÑÊÈÅ ÐÅÊÎÌÅÍÄÀÖÈÈ
ÑÎÃËÀÑÎÂÀÍÎ
Çàìåñòèòåëü íà÷àëüíèêà
Ãëàâíîãî óïðàâëåíèÿ êàäðîâîé ïîëèòèêè,
ó÷åáíûõ çàâåäåíèé è íàóêè Í.È. Äîñòà
ÓÒÂÅÐÆÄÀÞ
Ïåðâûé çàìåñòèòåëü
ìèíèñòðà äðàâîîõðàíåíèÿ
Â.Ì.Îðåõîâñêèé
16 ôåâðàëÿ 1999 ã.
18 ôåâðàëÿ 1999 ã.
Ðåãèñòðàöèîííûé ¹ 140-9812
ÌÅÒÎÄÈ×ÅÑÊÈÅ ÐÅÊÎÌÅÍÄÀÖÈÈ
ÏÎ ÝÊÑÏÅÐÈÌÅÍÒÀËÜÍÎÌÓ (ÄÎÊËÈÍÈ×ÅÑÊÎÌÓ)
ÈÑÏÛÒÀÍÈÞ ÈÌÌÓÍÎÌÎÄÓËÈÐÓÞÙÅÃÎ ÄÅÉÑÒÂÈß
ÔÀÐÌÀÊÎËÎÃÈ×ÅÑÊÈÕ ÑÐÅÄÑÒÂ
Ìèíñê 1999
1
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
Îñíîâíîå ó÷ðåæäåíèå-ðàçðàáîò÷èê: ÍÈÈ ãåìàòîëîãèè è ïåðåëèâàíèÿ êðîâè ÌÇ ÐÁ
Ó÷ðåæäåíèÿ-èñïîëíèòåëè: ÍÈÈ ïóëüìîíîëîãèè è ôòèçèàòðèè ÌÇ ÐÁ, Ìåæäóíàðîäíûé
èíñòèòóò ïî ðàäèîýêîëîãèè èì. À.Ä. Ñàõàðîâà
Àâòîðû: ä-ð ìåä.íàóê Ì.Ï. Ïîòàïíåâ, êàíä. ìåä. íàóê Ë.Ã. Áîðòêåâè÷, êàíä. ìåä. íàóê
Ä.Â. Ïå÷êîâñêèé, Å.Â. Ðóêøà, Ò.Ñ. Ãàðáóçåíêî, Æ.À. Èáðàãèìîâà, Â.Â. Áëèíîâ
Ðåöåíçåíò: êàíä. ìåä. íàóê Â.È. Ëåâèí
 ìåòîäè÷åñêèõ ðåêîìåíäàöèÿõ ïî îöåíêå èììóíîìîäóëèðóþùèõ ñâîéñòâ
ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ äàíî îïèñàíèå ìåòîäîâ îöåíêè èõ äåéñòâèÿ íà Ò-êëåòî÷íûå, Âêëåòî÷íûå ðåàêöèè èììóíèòåòà, íåñïåöèôè÷åñêóþ ðåçèñòåíòíîñòü (ôóíêöèþ íåéòðîôèëîâ,
ñèñòåìó êîìïëåìåíòà) ó ýêñïåðèìåíòàëüíûõ æèâîòíûõ (ëèíåéíûõ ìûøåé, ìîðñêèõ ñâèíîê)
è â êóëüòóðå ëåéêîöèòîâ êðîâè ÷åëîâåêà.  êà÷åñòâå ñàìîñòîÿòåëüíîãî ðàçäåëà ïðèâåäåíî
îïèñàíèå ìåòîäîâ îöåíêè àëëåðãèçèðóþùèõ ñâîéñòâ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ íà òåõ æå
ýêñïåðèìåíòàëüíûõ ìîäåëÿõ.  ïåðå÷åíü ïðåäëàãàåìûõ èììóíîëîãè÷åñêèõ ìåòîäîâ
âêëþ÷åíû êàê îáùåïðèíÿòûå, òàê è íîâûå (àïðîáèðîâàííûå çà ïîñëåäíèå 10 ëåò),
ïîçâîëÿþùèå âñåñòîðîííå îöåíèòü äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêîãî ñðåäñòâà íà îòäåëüíûå
çâåíüÿ èììóíèòåòà è àëëåðãèè. Ïðåäñòàâëåí ìèíèìàëüíûé ïåðå÷åíü òåñòîâ äëÿ
ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ ñ ðàçíîé ñòåïåíüþ èììóíîòðîïíîñòè, îáîñíîâàíà ñòåïåíü åãî
ðàñøèðåíèÿ äëÿ ðàçëè÷íûõ ãðóïï ëåêàðñòâåííûõ ïðåïàðàòîâ.
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïðåäíàçíà÷åíû äëÿ ôàðìàêîëîãîâ, èììóíîëîãîâ,
àëëåðãîëîãîâ, íàó÷íûõ ðàáîòíèêîâ, âðà÷åé-ëàáîðàíòîâ êîíòðîëüíûõ ëàáîðàòîðèé.
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè óòâåðæäåíû Ìèíèñòåðñòâîì çäðàâîîõðàíåíèÿ Ðåñïóáëèêè
Áåëàðóñü â êà÷åñòâå îôèöèàëüíîãî äîêóìåíòà.
2
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
Îãëàâëåíèå
ÂÂÅÄÅÍÈÅ .......................................................................................................................................................... 4
ÎÁÙÈÅ ÏÎËÎÆÅÍÈß ÈÇÓ×ÅÍÈß ÈÌÌÓÍÎÌÎÄÓËÈÐÓÞÙÈÕ
ÑÂÎÉÑÒ ÔÀÐÌÀÊÎËÎÃÈ×ÅÑÊÈÕ ÑÐÅÄÑÒ ..................................................................................... 6
ÈÑÏÛÒÀÍÈÅ ÈÌÌÓÍÎÌÎÄÓËÈÐÓÞÙÅÃÎ ÄÅÉÑÒÂÈß
ÔÀÐÌÀÊÎËÎÃÈ×ÅÑÊÈÕ ÑÐÅÄÑÒ .......................................................................................................... 7
ÕÀÐÀÊÒÅÐÈÑÒÈÊÀ ÀËËÅÐÃÈÇÈÐÓÞÙÈÕ ÑÂÎÉÑÒÂ
ÔÀÐÌÀÊÎËÎÃÈ×ÅÑÊÈÕ ÑÐÅÄÑÒ ........................................................................................................ 32
ÎÁÙÈÅ ÐÅÊÎÌÅÍÄÀÖÈÈ ÏÎ ÕÀÐÀÊÒÅÐÈÑÒÈÊÅ ÈÌÌÓÍÎÌÎÄÓËÈÐÓÞÙÈÕ
ÑÂÎÉÑÒ ÔÀÐÌÀÊÎËÎÃÈ×ÅÑÊÈÕ ÑÐÅÄÑÒ ................................................................................... 35
3
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
ÂÂÅÄÅÍÈÅ
Ôàðìàêîëîãè÷åñêèå ñðåäñòâà, âîçäåéñòâóþùèå íà îðãàíèçì ÷åëîâåêà, îáëàäàþò íå òîëüêî
îñíîâíûì áèîëîãè÷åñêèì äåéñòâèåì íà ÷óâñòâèòåëüíûå îðãàíû è òêàíè èëè ïàòîãåí, íî
ïðîÿâëÿþò ìîäóëèðóþùåå äåéñòâèå íà äðóãèå ñèñòåìû îðãàíèçìà. Ñòåïåíü âîçäåéñòâèÿ
ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ íà èììóííóþ ñèñòåìó îïðåäåëÿåòñÿ ïðèðîäîé ýòîãî ñðåäñòâà
(áèîëîãè÷åñêîé, õèìè÷åñêîé, ôèçè÷åñêîé), òðîïíîñòüþ ê ðàçëè÷íûì òêàíÿì è ñèñòåìàì
îðãàíèçìà ÷åëîâåêà, åãî ôóíêöèîíàëüíûì ñîñòîÿíèåì. Èììóííàÿ ñèñòåìà âûïîëíÿåò
ðåãóëÿòîðíóþ ôóíêöèþ, îòñëåæèâàÿ ëþáîé ïðîöåññ âîçäåéñòâèÿ íà îðãàíèçì ÷åëîâåêà
(âíóòðåííèõ èëè âíåøíèõ ôàêòîðîâ). Ïðè ýòîì îíà ðåàãèðóåò êàê íà ïàòîëîãè÷åñêèé ïðîöåññ
â îðãàíèçìå ÷åëîâåêà, òàê è íà ôàðìàêîëîãè÷åñêèå ñðåäñòâà, èñïîëüçóåìûå äëÿ ëå÷åíèÿ.
Ôàðìàêîëîãè÷åñêèå ñðåäñòâà ìîãóò ïðîÿâëÿòü ïðÿìîå âîçäåéñòâèå íà èììóííóþ ñèñòåìó,
òî åñòü îáëàäàòü èììóíîòðîïíîñòüþ. Ïåðå÷åíü òàêèõ ñðåäñòâ íåâåëèê — èõ îòíîñÿò ê
èììóíîìîäóëÿòîðàì. Òàêèå ïðåïàðàòû ïðèìåíÿþòñÿ äëÿ èììóíîòåðàïèè è
èììóíîêîððåêöèè. Ñåé÷àñ ñòàëî î÷åâèäíûì, ÷òî áîëüøèíñòâî ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
ïðîÿâëÿþò íåïðÿìîå âîçäåéñòâèå íà èììóííóþ ñèñòåìó — çà ñ÷åò ðåãóëÿöèè îáðàçîâàíèÿ
âòîðè÷íûõ áèîëîãè÷åñêè àêòèâíûõ ýíäîãåííûõ èììóíîìîäóëÿòîðîâ. Ýòè ïðåäñòàâëåíèÿ
òðåáóþò ïî-íîâîìó ïîäîéòè ê îöåíêå èììóíîìîäóëèðóþùèõ ñâîéñòâ íîâûõ è óæå èçâåñòíûõ
ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ. Ðàíåå îöåíêà èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ áûëà
îáÿçàòåëüíà äëÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ, ÿâëÿþùèõñÿ íåïîñðåäñòâåííî
èììóíîìîäóëÿòîðàìè.  íàñòîÿùåå âðåìÿ ïåðå÷åíü òàêèõ ñðåäñòâ ðàñøèðÿåòñÿ çà ñ÷åò
ìàññîâîãî âíåäðåíèÿ áèîëîãè÷åñêè àêòèâíûõ àäàïòîãåíîâ, à òàêæå ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ
ñðåäñòâ, ñïîñîáíûõ âîçäåéñòâîâàòü íà èììóííóþ ñèñòåìó îðãàíèçìà ÷åëîâåêà.
4
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
Ïðîâåäåíèå ýêñïåðèìåíòàëüíîãî (äîêëèíè÷åñêîãî) èñïûòàíèÿ èììóíîìîäóëèðóþùåãî
äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ òàêæå ïðåòåðïåâàåò èçìåíåíèå, ÷òî ñâÿçàíî ïðåæäå
âñåãî ñ ðàñøèðåíèåì èñïîëüçîâàíèÿ ìåòîäîì àíàëèçà in vitro íàðÿäó ñ èñïîëüçîâàíèåì
ìåòîäîì àíàëèçà in vivo íà æèâîòíûõ. Ýòî îáúÿñíÿåòñÿ áîëåå âûñîêîé ÷óâñòâèòåëüíîñòüþ,
ýêîíîìè÷íîñòüþ è òåõíîëîãè÷íîñòüþ ìåòîäîâ àíàëèçà in vitro, à òàêæå âîçìîæíîñòüþ
èñïîëüçîâàòü êëåòî÷íûå ñèñòåìû ÷åëîâå÷åñêîãî ïðîèñõîæäåíèÿ.  òî æå âðåìÿ èññëåäîâàíèÿ
in vitro è èññëåäîâàíèÿ in vivo ÿâëÿþòñÿ îáÿçàòåëüíîé ñîñòàâíîé ÷àñòüþ îöåíêè
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ, òàê êàê îòðàæàþò ðàçíûé
óðîâåíü ðåàêöèè îðãàíèçìà (êëåòî÷íûé, òêàíåâîé, îðãàíèçìåííûé) íà âíåøíåå âîçäåéñòâèå.
Âàæíîé îñîáåííîñòüþ äîêëèíè÷åñêîãî èñïûòàíèÿ èììóíîìîäóëèðóþùèõ ñâîéñòâ
ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ ÿâëÿåòñÿ îöåíêà èõ âîçäåéñòâèÿ íà ïðàêòè÷åñêè çäîðîâûõ
æèâîòíûõ èëè êëåòî÷íûå ñèñòåìû. Ýòî ïîçâîëÿåò îöåíèòü ñïîñîáíîñòü ñàìèõ
ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ ïðîÿâëÿòü ïðÿìîå èììóíîòðîïíîå äåéñòâèå, âîçìîæíîñòü åãî
èñïîëüçîâàíèÿ ñ öåëüþ èììóíîïðîôèëàêòèêè. Ïîñëåäóþùèé êëèíè÷åñêèé ýòàï èçó÷åíèÿ
ôàðìàêîëîãè÷åñêîãî ñðåäñòâà ïîçâîëèò îöåíèòü åãî àêòèâíîñòü â óñëîâèÿõ ïàòîëîãè÷åñêîãî
ïðîöåññà â îðãàíèçìå ÷åëîâåêà, åãî ñïîñîáíîñòü âûñòóïàòü â êà÷åñòâå
èììóíîòåðàïåâòè÷åñêîãî èëè èììóíîêîððèãèðóþùåãî ëåêàðñòâåííîãî ïðåïàðàòà. Íàêîíåö,
èñïîëüçîâàíèå èììóíîòðîïíûõ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ â ôàçå âûçäîðîâëåíèÿ ïàöèåíòîâ
ïîçâîëÿåò ñóäèòü î åãî àêòèâíîñòè âûñòóïàòü â êà÷åñòâå èììóíîðåàáèëèòàöèîííîãî
ôàðìàêîëîãè÷åñêîãî ñðåäñòâà.
Îöåíêà èììóíîìîäóëèðóþùèõ ñâîéñòâ âõîäèò â êîìïëåêñ äîêëèíè÷åñêèõ èñïûòàíèé,
âêëþ÷àþùèé òàêæå îöåíêó áåçâðåäíîñòè ïðåïàðàòà (ïèðîãåííîñòü, àëëåðãåííîñòü,
êàíöåðîãåííîñòü, òåðàòîãåííîñòü, ýìáðèîòîêñè÷íîñòü, ìóòàãåííîñòü), ôàðìàêîêèíåòèêè è
ñïåöèôè÷åñêîé áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòè ôàðìàêîëîãè÷åñêîãî ñðåäñòâà.
5
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
Îáùèå ïîëîæåíèÿ èçó÷åíèÿ èììóíîìîäóëèðóþùèõ ñâîéñòâ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ
ñðåäñòâ
Ìåòîäîëîãèÿ îöåíêè èììóíîìîäóëèðóþùèõ ñâîéñòâ ôàðìàêîëîãè ÷åñêèõ ñðåäñòâ ìàëî
îòëè÷àåòñÿ îò êëàññè÷åñêîé, îáùåïðèçíàííîé 10–15 ëåò íàçàä. Îíà âêëþ÷àåò ïðåæäå âñåãî
îöåíêó âîçäåéñòâèÿ ïðåïàðàòîâ íà Ò-êëåòî÷íûé è Â-êëåòî÷íûé (ãóìîðàëüíûé) èììóíèòåò,
ôàãîöèòàðíîå çâåíî èììóíèòåòà, ñèñòåìó êîìïëåìåíòà. Àëëåðãè÷åñêèå ðåàêöèè, ÿâëÿþùèåñÿ
ïî ñâîåé ïðèðîäå Ò- èëè Â-êëåòî÷íûìè èììóííûìè ðåàêöèÿìè, òàêæå âêëþ÷åíû â
íàñòîÿùèé ïåðå÷åíü èììóíîëîãè÷åñêèõ ìåòîäîâ èñïûòàíèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ,
õîòÿ è ìîãóò ðàññìàòðèâàòüñÿ â êà÷åñòâå ñàìîñòîÿòåëüíîãî ðàçäåëà äîêëèíè÷åñêèõ
èñïûòàíèé.
Èññëåäîâàíèÿ ïðîâîäÿòñÿ â ñðàâíåíèè ñ èçâåñòíûìè àíàëîãàìè èçó÷àåìîãî
ôàðìàêîëîãè÷åñêîãî ñðåäñòâà. Ïðè ïðîâåäåíèè èññëåäîâàíèé in vitro øèðîêî èñïîëüçóþò
ïîëèêëîíàëüíûå àêòèâàòîðû ëèìôîöèòîâ ÷åëîâåêà. Èõ èñïîëüçîâàíèå â îïòèìàëüíîé è â
ñóáîïòèìàëüíîé êîíöåíòðàöèÿõ ïîçâîëÿåò îöåíèòü äåéñòâèå èììóíîìîäóëÿòîðà â óñëîâèÿõ
ìàêñèìàëüíîãî è ôèçèîëîãè÷åñêîãî âîçäåéñòâèÿ íà èììóííóþ ñèñòåìó
(èììóíîêîìïåòåíòíûå êëåòêè).
6
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
ÈÑÏÛÒÀÍÈÅ ÈÌÌÓÍÎÌÎÄÓËÈÐÓÞÙÅÃÎ
ÄÅÉÑÒÂÈß ÔÀÐÌÀÊÎËÎÃÈ×ÅÑÊÈÕ ÑÐÅÄÑÒÂ
1. Îöåíêà âëèÿíèÿ ïðåïàðàòà íà Â-êëåòî÷íûé (ãóìîðàëüíûé) èììóííûé îòâåò
1.1. Îïðåäåëåíèå àíòèòåëîîáðàçóþùèõ êëåòîê â ñåëåçåíêå ìûøåé
Ìûøåé ëèíèè ÑÂÀ âåñîì 20 ± 2 ã, ñàìîê, èììóíèçèðóþò âíóòðèáðþøèííî ýðèòðîöèòàìè
áàðàíà (ÝÁ) â ñóáîïòèìàëüíîé äîçå 2×107 â 100 ìêë. Îäíîâðåìåííî ââîäÿò èññëåäóåìûé
ïðåïàðàò â äîçå, áëèçêîé ê ðàñ÷åòíîé òåðàïåâòè÷åñêîé, èëè ôèçðàñòâîð.  êà÷åñòâå êîíòðîëÿ
òàêæå ââîäÿò ÝÁ â îïòèìàëüíîé äîçå (2×108 ÝÁ). Êàæäàÿ ãðóïïà ìûøåé ñîñòîèò èç 3 îñîáåé.
×åðåç 4 äíÿ ìûøåé çàáèâàþò, ñåëåçåíêè çàáèðàþò, ãîìîãåíèçèðóþò, ñïëåíîöèòû îòìûâàþò
äâàæäû è èñïîëüçóþò äëÿ îïðåäåëåíèÿ êëåòîê, îáðàçóþùèõ àíòèòåëà (ÀÎÊ) ê ÝÁ, ïî ìåòîäó
Cunningham. Îïðåäåëÿþò ÀÎÊ, ñåêðåòèðóþùèå àíòèòåëà êëàññà Ì. Äëÿ ýòîãî ñìåøèâàþò
ïî 100 ìêë âçâåñè ñïëåíîöèòîâ (â êîíöåíòðàöèè îêîëî 10 ìëí/ìë), 100 ìêë 5% âçâåñè ÝÁ è
100 ìêë àäñîðáèðîâàííîãî êîìïëåìåíòà (îáû÷íî â ðàçâåäåíèè 1:2). Ñìåñüþ ìåðíî çàïîëíÿþò
ñòåêëÿííûå êàìåðû, êîòîðûå çàïàèâàþò ïàðàôèíîì/âàçåëèíîì è èíêóáèðóþò â òå÷åíèå 1 ÷
ïðè 37îÑ íà ãîðèçîíòàëüíîé ïëîñêîñòè. Çàòåì ïðîâîäÿò âèçóàëüíûé ó÷åò çîí ãåìîëèçà,
ñîîòâåòñòâóþùèõ ÀÎÊ. Ïîëó÷åííûå ðåçóëüòàòû âûðàæàþò êîëè÷åñòâîì ÀÎÊ â ïåðåñ÷åòå
íà 1 ìëí ñïëåíîöèòîâ.
7
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
1.2. Îïðåäåëåíèå ãåìàããëþòèíèíîâ â ñûâîðîòêå êðîâè ìûøåé
Ìûøåé ëèíèè ÑÂÀ, âåñîì 20 ± 2 ã, ñàìîê, èììóíèçèðóþò âíóòðèáðþøèííî
ñóáîïòèìàëüíîé äîçîé àíòèãåíà (1–2×107 ÝÁ/ìûøü) âìåñòå ñ èññëåäóåìûì ïðåïàðàòîì.
Êîíòðîëüíûå ìûøè ïîëó÷àþò ôèçðàñòâîð èëè îïòèìàëüíóþ äîçó àíòèãåíà (1×109ÝÁ). Êàæäàÿ
ãðóïïà ìûøåé âêëþ÷àåò ïî 3 îñîáè. ×åðåç 7 äíåé ó ìûøåé èç ðåòðîîðáèòàëüíîãî ñèíóñà
çàáèðàþò êðîâü. Ïîñëå ñâåðòûâàíèÿ êðîâÿíîãî ñãóñòêà (ïðè +37îÑ) îòáèðàþò ñûâîðîòêó,
òåðìîèíàêòèâèðóþò åå ïðè 56 î Ñ â òå÷åíèå 30 ìèí è èñïîëüçóþò äëÿ âûÿâëåíèÿ
ñïåöèôè÷åñêèõ àíòèòåë ê ÝÁ â ðåàêöèè ãåìàããëþòèíàöèè (ÐÃÀ). Ðåàêöèþ ñòàâÿò â
ìèêðîïëàíøåòàõ ñ êðóãëîäîííûìè ëóíêàìè ïóòåì ñìåøèâàíèÿ 50 ìêë äâóêðàòíî
ðàçâåäåííûõ îáðàçöîâ èññëåäóåìûõ ñûâîðîòîê è 25 ìêë 2% âçâåñè ÝÁ. Ìèêðîïëàíøåòû
èíêóáèðóþò â òå÷åíèå 1 ÷ ïðè 37îÑ. Ðåçóëüòàòû îöåíèâàþò ïî øêàëå ++++. Ïîëîæèòåëüíîé
ñ÷èòàþò ÐÃÀ íå ìåíåå ++. Ðåçóëüòàòû ÐÃÀ ïðåäñòàâëÿþò â îáðàòíûõ çíà÷åíèÿõ log2 òèòðà
ãåìàããëþòèíèíîâ, ãäå òèòðîì ñ÷èòàþò íàèáîëüøåå ðàçâåäåíèå ñûâîðîòêè êðîâè, äàþùåå
ïîëîæèòåëüíóþ ðåàêöèþ.
1.3. Îïðåäåëåíèå àíòèòåë ê äðóãèì àíòèãåíàì
Ó÷èòûâàÿ, ÷òî ÝÁ âûçûâàþò îòâåò ê ýðèòðîöèòàðíûì (êëåòî÷íûì) àíòèãåíàì, ñëåäóåò
òàêæå èñïîëüçîâàòü êàêîé-ëèáî èç ñòàíäàðòèçîâàííûõ òêàíåâûõ, áàêòåðèàëüíûõ èëè
âèðóñíûõ àíòèãåíîâ â ñîîòâåòñòâèè ñ èñêîìîé íàïðàâëåííîñòüþ äåéñòâèÿ èññëåäóåìîãî
ïðåïàðàòà. Ïåðå÷åíü òàêîâûõ ìîæåò âêëþ÷àòü îâàëüáóìèí, ïðåïàðàòû ÄÍÊ, ñòàôèëîêîêêîâûé
àíàòîêñèí, ñòîëáíÿ÷íûé àíàòîêñèí, äèôòåðèéíûé àíàòîêñèí, ãåìàããëþòèíèí âèðóñà ãðèïïà
è äð. Íèæå íàìè ïðîâîäèòñÿ îïèñàíèå îöåíêè ó ìûøåé îáðàçîâàíèÿ (àóòî-) àíòèòåë ê ÄÍÊ
â ïðèñóòñòâèè îäíîãî èç èññëåäîâàííûõ èììóíîìîäóëÿòîðîâ.
8
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
Ìûøåé ëèíèè Ñ57Bl/6 âåñîì 23–26 ã èììóíèçèðóþò âíóòðèáðþøèííî ÄÍÊ, âûäåëåííîé
èç êëåòîê ñåëåçåíêè ìûøåé òîé æå ëèíèè ìåòîäîì ôåíîëüíîé ýêñòðàêöèè â äîçå 25 ìêã/
æèâîòíîå. Èììóíèçàöèþ ïðîâîäèëè òðåõêðàòíî 1 ðàç â íåäåëþ. Îäíîâðåìåííî ââîäÿò
èññëåäóåìûé ïðåïàðàò â ðàçëè÷íîé äîçèðîâêå äëÿ êàæäîé ãðóïïû æèâîòíûõ.  êà÷åñòâå
ïîçèòèâíîãî êîíòðîëÿ èñïîëüçóþò áàêòåðèàëüíûé ëèïîïîëèñàõàðèä (ËÏÑ). ×åðåç íåäåëþ
ïîñëå ïîñëåäíåé èììóíèçàöèè êðîâü çàáèðàþò èç ðåòðîîðáèòàëüíîãî ñèíóñà è ïîëó÷àþò
ñûâîðîòêó. Òèòð àíòèòåë ê ÄÍÊ îïðåäåëÿþò èììóíîôåðìåíòíûì ìåòîäîì. Äëÿ ýòîãî
ìèêðîïëàíøåòû äëÿ èììóíîôåðìåíòíîãî àíàëèçà, ïðåäâàðèòåëüíî îáðàáîòàííûå ïîëè-Ëëèçèíîì (10 ìêã/ìë), ïîêðûâàþò àíòèãåíîì (äâóõöåïî÷å÷íîé ÄÍÊ, 5 ìêã/ìë). Åñëè â êà÷åñòâå
àíòèãåíà èñïîëüçóþò îäíîöåïî÷å÷íóþ ÄÍÊ, åå âíîñÿò â êîíöåíòðàöèè 2 ìêã/ìë â ëóíêè
ìèêðîïëàíøåò áåç îáðàáîòêè ïîëè-Ë-ëèçèíîì. ×åðåç 16–18 ÷ èíêóáàöèè ïðè êîìíàòíîé
òåìïåðàòóðå ìèêðîïëàíøåòû îòìûâàþò, â ëóíêè âíîñÿò îáðàçöû èññëåäóåìûõ ìûøèíûõ
ñûâîðîòîê (ïåðâîíà÷àëüíîå ðàçâåäåíèå — 1:100) è èíêóáèðóþò â òå÷åíèå 1 ÷ ïðè êîìíàòíîé
òåìïåðàòóðå ïðè âñòðÿõèâàíèè (íà «øåéêåðå»). Ìèêðîïëàíøåòû îòìûâàþò çàáóôåðåííûì
ôèçðàñòâîðîì, ñîäåðæàùèì 0,02% òâèí-20 (Ò-ÇÔÐ). Çàòåì âíîñÿò ðàñòâîð êîíúþãàòà
(ìå÷åíóþ ïåðîêñèäàçîé êîçüþ àíòèñûâîðîòêó ïðîòèâ èììóíîãëîáóëèíîâ ìûøåé) è
èíêóáèðóþò 1,5 ÷ ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå. Ïîñëå îòìûâêè ÇÔÐ-Ò â ëóíêè ìèêðîïëàíøåòû
âíîñÿò ðàñòâîð ñóáñòðàòà (îðòîôåíèëåíäèàìèí, ÎÔÄ). Ðåàêöèþ îñòàíàâëèâàþò 5% ðàñòâîðîì
ñåðíîé êèñëîòû. Ó÷åò ðåàêöèè ïðîâîäÿò ïðè 492 íì íà ÈÔÀ-ðèäåðå (ñïåêòðîôîòîìåòðå).
9
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
1.4. Îïðåäåëåíèå èììóíîãëîáóëèíñåêðåòèðóþùèõ êëåòîê ÷åëîâåêà,
èíäóöèðîâàííûõ in vitro
Èììóíîãëîáóëèíñåêðåòèðóþùèå êëåòêè (ÈÑÊ) èíäóöèðóþò â êóëüòóðå ëèìôîèäíûõ
êëåòîê (ìîíîíóêëåàðîâ ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè, ÌÏÊ) çäîðîâûõ ëþäåé, âûäåëåííûõ íà
ãðàäèåíòå ôèêîëë/âåðîãðàôèí ïî ìåòîäó Boyum. Êóëüòèâèðîâàíèå ïðîâîäÿò â ñðåäå RPMI1640, ñîäåðæàùåé 10% ñûâîðîòêè ýìáðèîíîâ êîðîâ (ÑÝÊ) è àíòèáèîòèêè. Êëåòêè
êóëüòèâèðóþò â êîíå÷íîé êîíöåíòðàöèè 1 ìëí/ìë â ïëîñêîäîííûõ ìèêðîïëàíøåòàõ â îáúåìå
0,2 ìë â òå÷åíèå 7 ñóò â àòìîñôåðå âîçäóõà ñ 5% ÑÎ2. Îäíîâðåìåííî âíîñÿò èññëåäóåìûé
ïðåïàðàò.  êà÷åñòâå ïîëîæèòåëüíîãî êîíòðîëÿ èñïîëüçóþò êëåòêè, àêòèâèðîâàííûå
ìèòîãåíîì ëàêîíîñà (ÌË), â êîíöåíòðàöèè 1,0 ìêã/ìë. Êàæäûé âàðèàíò âêëþ÷àåò 3 ïîâòîðà.
 êîíöå êóëüòèâèðîâàíèÿ êëåòêè îòìûâàþò 2 ðàçà áåññûâîðîòî÷íîé ñðåäîé, ñîäåðæàùåé
àíòèáèîòèêè. ÈÑÊ îïðåäåëÿþò ìèêðîìåòîäîì îáðàòíîãî ãåìîëèòè÷åñêîãî
áëÿøêîîáðàçîâàíèÿ.
Äëÿ ýòîãî â ëóíêè ïëîñêîäîííûõ ìèêðîïëàíøåò âíîñÿò ïî 60 ìêë âçâåñè ÌÏÊ è 20 ìêë
0,5% âçâåñè ÝÁ, ïîêðûòûõ ñòàôèëîêîêêîâûì áåëêîì À. Ìèêðîïëàíøåòû èíêóáèðóþò â
òå÷åíèå 1 ÷ ïðè +37 î Ñ â àòìîñôåðå âîçäóõà ñ 5% ÑÎ 2 . Çàòåì âíîñÿò ïî 10 ìêë
àíòèèììóíîãëîáóëèíîâîé êðîëè÷üåé àíòèñûâîðîòêè (1:10) è âíîâü èíêóáèðóþò 1 ÷ ïðè
+37îÑ. Äîïîëíèòåëüíî âíîñÿò ïî 10 ìêë êîìïëåìåíòà (1:6) è ñíîâà èíêóáèðóþò 1 ÷ ïðè
+37îÑ. Ó÷åò çîí ãåìîëèçà, ñîîòâåòñòâóþùèõ ÈÑÊ, ïðîâîäÿò ïîä èíâåðòèðîâàííûì
ìèêðîñêîïîì ïîä óâåëè÷åíèåì â 160 ðàç. Ïîëó÷åííûå ðåçóëüòàòû âûðàæàþò êàê ñîäåðæàíèå
ÈÑÊ â êóëüòóðå êëåòîê.
10
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
Äëÿ îïðåäåëåíèÿ ÈÑÊ (è ÀÎÊ) ÷åëîâåêà ìîæíî èñïîëüçîâàòü ìåòîä ELISPOT, îñíîâàííûé
íà âûÿâëåíèè «ïÿòåí» îêðàøèâàíèÿ ôèëüòðîâàëüíîé áóìàãè, ïîêðûòîé àíòèòåëàìè ê
èììóíîãëîáóëèíàì ÷åëîâåêà èëè àíòèãåíîì, íà ìåñòàõ èíêóáàöèè Â-ëèìôîöèòîâ,
ñåêðåòèðóþùèõ èììóíîãëîáóëèíû èëè àíòèòåëà ñîîòâåòñòâåííî. Ìåòîäèêà ïîñòàíîâêè
îïèñàíà â äðóãèõ ðóêîâîäñòâàõ.
11
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
1.5. Îïðåäåëåíèå èììóíîãëîáóëèíîâ, ñåêðåòèðóåìûõ Â-ëèìôîöèòàìè ÷åëîâåêà
in vitro
Èíäóêöèþ ñåêðåöèè èììóíîãëîáóëèíîâ â êóëüòóðå ëèìôîèäíûõ êëåòîê ÌÏÊ ÷åëîâåêà in
vitro ïðîâîäÿò, êàê îïèñàíî â ï. 1.4. ×åðåç 7–9 äíåé ïîñëå èíêóáàöèè ñ èññëåäóåìûì ïðåïàðàòîì
(â òàêîì ñëó÷àå ÷åðåç 3–4 äíÿ äåëàþò ñìåíó ñðåäû) ñ èëè áåç ïîëèêëîíàëüíîãî Â-êëåòî÷íîãî
àêòèâàòîðà (ìèòîãåíà ëàêîíîñà — 10 ìêã/ìë, âçâåñè S. aureus Cowan 1 — 0,01%) ñóïåðíàòàíò
êóëüòóð êëåòîê ñîáèðàþò öåíòðèôóãèðîâàíèåì è èñïîëüçóþò äëÿ èçìåðåíèÿ ñåêðåòèðîâàííûõ
èììóíîãëîáóëèíîâ (îáû÷íî êëàññà G) èììóíîôåðìåíòíûì ìåòîäîì. Äëÿ ýòîãî íà äíî ëóíîê
ìèêðîïëàíøåò âíîñÿò ïî 100 ìêë îïòèìàëüíî ðàçâåäåííûõ (1:3000) êðîëè÷üèõ àíòèòåë
ïðîòèâ IgG ÷åëîâåêà (èëè ñïåöèôè÷åñêóþ àíòèñûâîðîòêó) íà 0,1 ìîëü â áèêàðáîíàòíîì
áóôåðå, ðÍ 9,6. Èíêóáèðóþò â òå÷åíèå íî÷è ïðè +4îÑ. Ìèêðîïëàíøåòû îòìûâàþò îò
íåñâÿçàâøèõñÿ àíòèòåë ñ ïîìîùüþ ÇÔÐ, ñîäåðæàùåãî 0,08% òâèí-20 (ÇÔÐ-Ò). Â ëóíêè âíîñÿò
ïî 100 ìêë äâóêðàòíî ðàçâåäåííûõ èññëåäóåìûõ êóëüòóðàëüíûõ ñóïåðíàòàíòîâ èëè
ñòàíäàðòíîãî ïðåïàðàòà IgG ÷åëîâåêà. Ìèêðîïëàíøåòû èíêóáèðóþò â òå÷åíèå 2 ÷ ïðè
+37îÑ, çàòåì îòìûâàþò ÇÔÐ-Ò è âíîñÿò ðàçâåäåííûå (1:5000–1:10000) êîçüè àíòèòåëà ïðîòèâ
IgG ÷åëîâåêà, êîíúþãèðîâàííûå ñ ïåðîêñèäàçîé õðåíà. Ìèêðîïëàíøåòû âíîâü èíêóáèðóþò
â òå÷åíèå 1 ÷ ïðè +37îÑ, çàòåì îòìûâàþò ÇÔÐ-Ò è äîáàâëÿþò ÎÔÄ â ôîñôàòíî-öèòðàòíîì
áóôåðå (ðÍ 5,0). ×åðåç 5–15 ìèíóò ðåàêöèþ îñòàíàâëèâàþò âíåñåíèåì 50 ìêë 4 N ðàñòâîðà
ñåðíîé êèñëîòû. Ó÷åò ðåàêöèè ïðîâîäÿò ïðè 492 íì íà ÈÔÀ-ðèäåðå (ñïåêòðîôîòîìåòðå).
Ñîäåðæàíèå IgG â èññëåäóåìûõ ñóïåðíàòàíòàõ êóëüòóð êëåòîê ÷åëîâåêà ðàññ÷èòûâàþò
ãðàôè÷åñêè èëè ñ ïîìîùüþ àäàïòèðîâàííûõ êîìïüþòåðíûõ ïðîãðàìì.
12
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
1.6. Îïðåäåëåíèå àíòèòåë, ñåêðåòèðóåìûõ  ëèìôîöèòàìè ÷åëîâåêà in vitro
Èññëåäîâàíèå ïðîâîäÿò àíàëîãè÷íî ïðèâåäåííîìó â ï. 1.5. Âìåñòî ïîëèêëîíàëüíûõ
àêòèâàòîðîâ, âíîñèìûõ âìåñòå ñ èññëåäóåìûì èììóíîìîäóëÿòîðîì, èñïîëüçóåòñÿ îäèí èç
ñòàíäàðòíûõ àíòèãåíîâ, óêàçàííûõ â ï. 1.3. Îñîáåííîñòüþ ïîñòàíîâêè ÈÔÀ ÿâëÿåòñÿ
èñïîëüçîâàíèå âûáðàííîãî àíòèãåíà äëÿ ïîñàäêè íà ïëàñòèê â áèêàðáîíàòíîì áóôåðå. Â
êà÷åñòâå êîíòðîëåé àíòèãåíà èñïîëüçóþò íåðîäñòâåííûé àíòèãåí è àíòèñûâîðîòêó ê IgG
÷åëîâåêà. Æåëàòåëüíî èìåòü â êà÷åñòâå ïîçèòèâíîãî êîíòðîëÿ ñûâîðîòêó (ïëàçìó) ÷åëîâåêà,
ñîäåðæàùóþ àíòèòåëà ê èññëåäóåìîìó àíòèãåíó.
2. Îöåíêà âëèÿíèÿ ïðåïàðàòà íà Ò-êëåòî÷íûé èììóííûé îòâåò
2.1. Ãèïåð÷óâñòâèòåëüíîñòü çàìåäëåííîãî òèïà
Ãèïåð÷óâñòâèòåëüíîñòü çàìåäëåííîãî òèïà (ÃÇÒ) ó ìûøåé-ãèáðèäîâ F1 (ÑÂÀ × Ñ57Bl/6),
ñàìîê âåñîì 18–20 ã èíäóöèðóþò ââåäåíèåì âíóòðèâåííî 2 ×105 ÝÁ, îäíîâðåìåííî ââîäÿò
èññëåäóåìûé ïðåïàðàò â íåñêîëüêèõ äîçàõ. Êàæäàÿ ãðóïïà ìûøåé âêëþ÷àåò ïî 3–4 îñîáè.
Ðàçðåøàþùóþ äîçó ÝÁ (108/ìûøü) ââîäÿò íà 5 ñóò â ïîäóøå÷êó ïðàâîé çàäíåé ëàïû. Â
êîíòðëàòåðàëüíóþ ëàïó ââîäÿò 0,15 ìîëü ðàñòâîð õëîðèñòîãî íàòðèÿ. Ìåñòíóþ
âîñïàëèòåëüíóþ ðåàêöèþ îöåíèâàþò ÷åðåç 24 ÷ ïóòåì èçìåðåíèÿ òîëùèíû ëàï ìèêðîìåòðîì.
(Ìîæíî èñïîëüçîâàòü äðóãèå ìåòîäû èçìåðåíèÿ äèàìåòðà, îêðóæíîñòè èëè âåñà ëàï
æèâîòíûõ). Èíäåêñ ðåàêöèè (ÈÐ) âû÷èñëÿþò äëÿ êàæäîé ìûøè ïî ôîðìóëå:
ÈÐ (%) =
Ò (îïûò) – Ò (êîíòðîëü)
× 100,
Ò (êîíòðîëü)
ãäå Ò — òîëùèíà ïîäóøå÷êè ëàïêè â ìì.
13
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
2.2. Ðåàêöèÿ «òðàíñïëàíòàò ïðîòèâ õîçÿèíà»
Ðåàêöèþ «òðàíñïëàíòàò ïðîòèâ õîçÿèíà» (ÐÒÏÕ) âûçûâàþò ó ìûøåé ãèáðèäîâ F1
(CBAõC57Bl/6) ïî ìåòîäó Ford ñ ñîàâò. ïóòåì èíúåêöèè â ïîäóøå÷êó ïðàâîé çàäíåé ëàïû
(«îïûòíîé») 2×106 êëåòîê ñåëåçåíêè ìûøåé ðîäèòåëüñêîé ëèíèè (ÑÂÀ).  ïîäóøå÷êó ëåâîé
çàäíåé ëàïû («êîíòðîëüíóþ») ââîäÿò òàêîå æå êîëè÷åñòâî ñèíãåííûõ ñïëåíîöèòîâ.
Èññëåäóåìûé ïðåïàðàò â íåñêîëüêèõ ðàçâåäåíèÿõ èõ ðàñ÷åòà íà êã âåñà ââîäÿò â ïîäóøå÷êó
«îïûòíîé» ëàïû îäíîâðåìåííî ñ êëåòêàìè. ×åðåç 7 ñóò ìûøåé çàáèâàþò è îïðåäåëÿþò ìàññó
ïîäêîëåííûõ ëèìôîóçëîâ â «îïûòíîé» è «êîíòðîëüíîé» ëàïàõ. ÈÐ âû÷èñëÿþò ïî ôîðìóëå:
ÈÐ =
âåñ ëèìôîóçëà «îïûòíîé» ëàïêè
âåñ ëèìôîóçëà «êîíòðîëüíîé» ëàïêè
Êàæäàÿ ãðóïïà ìûøåé âêëþ÷àåò 3–4 æèâîòíûõ.
2.3. Ïðîëèôåðàòèâíàÿ àêòèâíîñòü ëèìôîèäíûõ êëåòîê ÷åëîâåêà
Ïðÿìóþ ìèòîãåííóþ àêòèâíîñòü ïðåïàðàòà èññëåäóþò â êóëüòóðå ÌÏÊ çäîðîâûõ ëþäåé,
âûäåëåííûõ ïî ìåòîäó Boyum. ÌÏÊ â äâóêðàòíîé êîíöåíòðàöèè 2×106 êëåòîê íà ìë âíîñÿò
ïî 100 ìêë â ëóíêè ïëîñêîäîííûõ êóëüòóðàëüíûõ ìèêðîïëàíøåò. Äîïîëíèòåëüíî âíîñÿò
èññëåäóåìûé ïðåïàðàò â ðàçëè÷íûõ êîíöåíòðàöèÿõ. Êóëüòóðàëüíàÿ ñðåäà — RPMI-1640,
ñîäåðæàùàÿ 10% ñûâîðîòêè IV ãðóïïû êðîâè ÷åëîâåêà (ÀÂ-ñûâîðîòêè) èëè ñûâîðîòêè
ýìáðèîíîâ êîðîâ (ÑÝÊ) è àíòèáèîòèêè (ïåíèöèëëèí — 100 ÅÄ/ìë, ñòðåïòîìèöèí —100 ìêã/
ìë). Êëåòêè èíêóáèðóþò â òå÷åíèå 48 ÷ ïðè 37îÑ â àòìîñôåðå âîçäóõà ñ 5% ÑÎ2. Êóëüòóðû
êëåòîê ñòàâÿò â 3–4 ïîâòîðàõ. Ñèíòåç ÄÍÊ â êóëüòóðå ÌÏÊ îöåíèâàþò ïî âêëþ÷åíèþ ìåòèë3
Í-òèìèäèíà, âíîñèìîãî íà ïîñëåäóþùèå 18 ÷ èíêóáàöèè èç ðàñ÷åòà 37 Êáê íà ëóíêó. Êëåòêè
ïåðåíîñÿò íà áóìàæíûå ôèëüòðû è îòìûâàþò. Ñ÷åò ðàäèîàêòèâíîñòè ïðîâîäÿò â áåòàñ÷åò÷èêå.
14
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
Èììóíîìîäóëèðóþùåå äåéñòâèå ïðåïàðàòà (ôàðìàêîëîãè÷åñêîãî ñðåäñòâà) îöåíèâàëè
ïî èíäåêñó ñòèìóëÿöèè (ÈÑ) ðåàêöèè ïðîëèôåðàöèè ÌÏÊ, êîòîðûé ðàññ÷èòûâàåòñÿ ïî
ôîðìóëå:
ÈÑ = îïûò / êîíòðîëü,
ãäå: îïûò — óðîâåíü ñèíòåçà ÄÍÊ (èìï./ìèí) â ÌÏÊ â ïðèñóòñòâèè èññëåäóåìîãî ïðåïàðàòà, à
êîíòðîëü — óðîâåíü ñèíòåçà ÄÍÊ (èìï./ìèí) â îòñóòñòâèè ïðåïàðàòà.
Àëüòåðíàòèâîé ðàäèàöèîííîé ìåòêè ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàíèå ÌÒÒ (äèìåòèëòèàçîëèë
äèôåíèëòåòðàçîëèÿ áðîìèäà) èëè åãî ïðîèçâîäíûõ äëÿ îöåíêè èíòåíñèâíîñòè ïðîëèôåðàöèè
ëèìôîèäíûõ êëåòîê in vitro.
2.4. Ïîñòàíîâêà êîñòèìóëÿòîðíîãî ïðîëèôåðàòèâíîãî òåñòà
Îöåíêó ñïîñîáíîñòè èññëåäóåìîãî ïðåïàðàòà âëèÿòü íà ïðîëèôåðàöèþ ëèìôîöèòîâ
÷åëîâåêà, âûçâàííóþ ïîëèêëîíàëüíûì Ò-êëåòî÷íûì àêòèâàòîðîì ôèòîãåìàããëþòèíèíîì
(ÔÃÀ), ïðîâîäÿò â êóëüòóðå ÌÏÊ. Ïðè ýòîì îäíîâðåìåííî ñ èññëåäóåìûì ïðåïàðàòîì â
êóëüòóðû ÌÏÊ âíîñÿò îïòèìàëüíóþ (10 ìêã/ìë) èëè ñóáîïòèìàëüíóþ (0,5 ìêã/ìë)
êîíöåíòðàöèþ àêòèâàòîðà. Ïîñòàíîâêó ïðîëèôåðàòèâíîãî òåñòà ïðîâîäÿò, êàê îïèñàíî â ï.
3.1. Êóëüòóðû êëåòîê ñòàâÿò â 3–4 ïîâòîðàõ. Êîíòðîëüíûå âàðèàíòû âêëþ÷àþò ÌÏÊ,
êóëüòèâèðîâàííûå òîëüêî â ïðèñóòñòâèè ÔÃÀ.
Äðóãîé âàðèàíò ïîñòàíîâêè êîñòèìóëÿòîðíîãî ïðîëèôåðàòèâíîãî òåñòà ïðåäïîëàãàåò
îöåíêó äåéñòâèÿ ïðåïàðàòà íà ïðîëèôåðàöèþ ëèìôîèäíûõ êëåòîê ÷åëîâåêà ïîä äåéñòâèåì
àëëîãåííûõ êëåòîê-ñòèìóëÿòîðîâ, ñìåøàííûõ â îòíîøåíèè 1:1 èëè 1: 0,02. Ïîñòàíîâêó òåñòà
ïðîâîäÿò êàê îïèñàíî â ï. 2.5. Ñìåñü êëåòîê êóëüòèâèðóþò â òå÷åíèå 4 ñóò, çàòåì íà 16–18 ÷
âíîñÿò ìåòèë-3Í-òèìèäèí èç ðàñ÷åòà 37 ÊÁê (1 ìèêðîêþðè) íà ëóíêó. Êëåòêè ïåðåíîñÿò íà
áóìàæíûå ôèëüòðû è îòìûâàþò. Ñ÷åò ðàäèîàêòèâíîñòè ïðîâîäÿò â áåòà-ñ÷åò÷èêå.
15
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
Èììóíîìîäóëèðóþùåå äåéñòâèå ôàðìàêîëîãè÷åñêîãî ñðåäñòâà îöåíèâàþò ïî ÈÑ (ñì.
2.3.), ãäå êîíòðîëåì ñëóæèò óðîâåíü ÄÍÊ â êóëüòóðå ÌÏÊ, àêòèâèðîâàííûõ ñòèìóëÿòîðîì.
2.5. Îáðàçîâàíèå öèòîòîêñè÷åñêèõ Ò-ëèìôîöèòîâ ÷åëîâåêà in vitro
2.5.1. Ñìåøàííàÿ êóëüòóðà ëèìôîöèòîâ ÷åëîâåêà
Öèòîòîêñè÷åñêèå Ò-ëèìôîöèòû ÷åëîâåêà èíäóöèðóþò â àëëîãåííîé îäíîíàïðàâëåííîé
ñìåøàííîé êóëüòóðå ëèìôîöèòîâ (ÑÊË). Äëÿ ýòîãî âûäåëÿþò ÌÏÊ îò äâóõ çäîðîâûõ ëþäåé.
Êëåòêè îäíîãî èç íèõ èñïîëüçóþò â êà÷åñòâå «ñòèìóëÿòîðîâ». Äëÿ ýòîãî èõ îáëó÷àþò (20
Ãð) èëè îáðàáàòûâàþò ìèòîìèöèíîì Ñ (50 ìêã/ìë, 37°Ñ, 30 ìèí â òåìíîòå), çàòåì òùàòåëüíî
îòìûâàþò ïèòàòåëüíîé ñðåäîé RPMI-1640, ñîäåðæàùåé 10% ÀÂ ñûâîðîòêè. Êëåòêèýôôåêòîðû îäíîãî äîíîðà è êëåòêè-ñòèìóëÿòîðû äðóãîãî äîíîðà â êîíöåíòðàöèÿõ 1 ìëí â
ìë ñìåøèâàþò â ñîîòíîøåíèè 1:1 è êóëüòèâèðóþò â ïèòàòåëüíîé ñðåäå RPMI-1640,
ñîäåðæàùåé 10% ÀÂ-ñûâîðîòêè (èëè ÝÒÑ) è àíòèáèîòèêè (ïåíèöèëëèí — 100 ÅÄ/ìë,
ñòðåïòîìèöèí —100 ìêã/ ìë) â òå÷åíèå 5 ñóò (äëÿ îöåíêè ïðîëèôåðàòèâíîãî îòâåòà) èëè 6–
7 ñóò (äëÿ îöåíêè îáðàçîâàíèÿ öèòîòîêñè÷åñêèõ Ò-ëèìôîöèòîâ). Èññëåäóåìîå
ôàðìàêîëîãè÷åñêîå ñðåäñòâî âíîñÿò â íåñêîëüêèõ ðàçâåäåíèÿõ â ëóíêè ìèêðîïëàòû (èëè
êóëüòóðàëüíûå ôëàêîíû), ñîäåðæàùèå êëåòêè-ýôôåêòîðû è ñòèìóëÿòîðû. Ïî îêîí÷àíèþ
êóëüòèâèðîâàíèÿ êëåòêè-ýôôåêòîðû îòìûâàþò îäèí ðàç öåíòðèôóãèðîâàíèåì,
ðåñóñïåíäèðóþò â êîíöåíòðàöèè 4 ìëí â ìë â ïîëíîé ïèòàòåëüíîé ñðåäå è èñïîëüçóþò äëÿ
ïîñòàíîâêè öèòîòîêñè÷åñêîãî òåñòà.
16
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
2.5.2. Öèòîòîêñè÷åñêèé òåñò
Àíòèãåí-ñïåöèôè÷åñêóþ öèòîòîêñè÷íîñòü êëåòîê-ýôôåêòîðîâ, ïîëó÷åííûõ â ÑÊË,
îïðåäåëÿþò â öèòîòîêñè÷åñêîì òåñòå ïðîòèâ êëåòîê-ìèøåíåé.  êà÷åñòâå êëåòîê-ìèøåíåé
îáû÷íî èñïîëüçóþò íåîáëó÷åííûå ÌÏÊ, èñïîëüçîâàííûå â êà÷åñòâå êëåòîê-ñòèìóëÿòîðîâ
â ÑÊË. Êëåòêè-ìèøåíè (2–3 ìëí/ìë) èíêóáèðóþò â ïîëíîé ïèòàòåëüíîé ñðåäå â òå÷åíèå 3
ñóò ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå, çàòåì âíîñÿò ÔÃÀ (10 ìêã/ìë) è èíêóáèðóþò äîïîëíèòåëüíî
â òå÷åíèå 3 ñóò ïðè +37îÑ. Çàòåì èõ îòìûâàþò îäíîêðàòíî öåíòðèôóãèðîâàíèåì è ìåòÿò
51Cr. Äëÿ ýòîãî ê îñàäêó êëåòîê-ìèøåíåé (2 ìëí ëèìôîáëàñòîâ, èíäóöèðîâàííûõ ÔÃÀ, â 0,1
ìë ïîëíîé ïèòàòåëüíîé ñðåäû) âíîñÿò Na51Cr04 (500 ìèêðîêþðè â 0,5 ìë) íà 1 ÷ ïðè +37îÑ.
Çàòåì êëåòêè-ìèøåíè îòìûâàþò 3 ðàçà è ðåñóñïåíäèðóþò â ïîëíîé ïèòàòåëüíîé ñðåäå äî
êîíöåíòðàöèè 100 òûñ. â ìë.
 êðóãëîäîííûå ëóíêè ìèêðîïëàíøåò âíîñÿò ïî 100 ìêë ìå÷åíûõ êëåòîê-ìèøåíåé è 100
ìêë êëåòîê-ýôôåêòîðîâ. Êëåòêè-ýôôåêòîðû ïðåäâàðèòåëüíî ðàçâîäÿò òàê, ÷òîáû ïîëó÷èòü
èõ ñîîòíîøåíèå ñ êëåòêàìè-ìèøåíÿìè 80:1, 40:1, 20:1. Âîçìîæíî èñïîëüçîâàòü ñîîòíîøåíèÿ
100: 1, 50:1, 25:1. Êàæäûé âàðèàíò âêëþ÷àåò 3–4 ïîâòîðà. Ñìåñü êëåòîê öåíòðèôóãèðóþò â
ìèêðîïëàíøåòå ïðè 1000 îá./ìèí â òå÷åíèå 5 ìèí, çàòåì èíêóáèðóþò â òå÷åíèå 4 ÷ ïðè
+37îÑ.  êà÷åñòâå êîíòðîëåé îöåíèâàþò óðîâíè «ñïîíòàííîãî» ëèçèñà (â ëóíêàõ èíêóáèðóþò
ñìåñü êëåòîê-ìèøåíåé â ïèòàòåëüíîé ñðåäå) è «òîòàëüíîãî» ëèçèñà (â ëóíêàõ êëåòêè-ìèøåíè
èíêóáèðóþò ñ 0,1 N ðàñòâîðîì ñîëÿíîé êèñëîòû èëè 2% ðàñòâîðîì äîäåöèëñóëüôàòà íàòðèÿ).
 êîíöå èíêóáàöèè ìèêðîïëàíøåòó âíîâü öåíòðèôóãèðóþò â òå÷åíèå 5–10 ìèí ïðè 1000 îá./
ìèí. Èç ëóíîê îòáèðàþò ïî 150 ìêë ñóïåðíàòàíòà è ïåðåíîñÿò â ïëàñòìàññîâûå ïðîáèðêè
Ýïïåíäîðôà. Ðàäèîàêòèâíîñòü ïðîá èçìåðÿëè â ãàììà-ñ÷åò÷èêå. (Âîçìîæíî îïðåäåëåíèå
ðàäèîàêòèâíîñòè â áåòà-ñ÷åò÷èêå. Äëÿ ýòîãî 100 ìêë ñóïåðíàòàíòà îòáèðàþò èç ëóíîê è
ïåðåíîñÿò â ñ÷åòíûå ôëàêîíû ñ 2–3 ìë ãîìîãåííîé ñèñòåìû, íàïðèìåð, ÆÑ-8).
17
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
Ïðîöåíò ñïåöèôè÷åñêîãî ëèçèñà ïîäñ÷èòûâàëè ïî ôîðìóëå:
% ëèçèñà =
èìï./ìèí (îïûò)–èìï./ìèí (ñïîíò. ëèçèñ)
èìï./ìèí (òîòàë. ëèçèñ) – èìï./ìèí (ñïîíò. ëèçèñ)
× 100
Ñïîíòàííûé ëèçèñ íå äîëæåí ïðåâûøàòü 15–20% îò çíà÷åíèÿ òîòàëüíîãî ëèçèñà êëåòîêìèøåíåé.
Âìåñòî Na 51 Cr0 4 êëåòêè-ìèøåíè ìîæíî ìåòèòü 125 J-dUTP (éîä-äåçîêñèóðèäèí
òðèôîñôàòîì) èëè êàðáîêñèôëþîðåñöåèíîì ñ ïîñëåäóþùèì ó÷åòîì ðåàêöèè íà ãàììàñ÷åò÷èêàõ èëè ëþìèíåñöåíòíîì ìèêðîñêîïå ñîîòâåòñòâåííî.
Îöåíêó äåéñòâèÿ èññëåäóåìîãî ïðåïàðàòà ïðîâîäÿò íà îñíîâàíèè ñðàâíåíèÿ çíà÷åíèé %
ëèçèñà ó êëåòîê-ýôôåêòîðîâ, ïîëó÷åííûõ â ïðèñóòñòâèè è îòñóòñòâèè èñïûòóåìîãî
ôàðìàêîëîãè÷åñêîãî ñðåäñòâà.
3. Îöåíêà âëèÿíèÿ ïðåïàðàòà íà àêòèâíîñòü åñòåñòâåííûõ êèëëåðîâ
3.1. Ïðîëèôåðàòèâíàÿ àêòèâíîñòü åñòåñòâåííûõ êèëëåðíûõ êëåòîê ÷åëîâåêà
Îäíèì èç íîâûõ ìåòîäîâ îöåíêè àêòèâíîñòè åñòåñòâåííûõ êèëëåðíûõ (ÅÊ) êëåòîê
÷åëîâåêà ÿâëÿåòñÿ êðàòêîñðî÷íàÿ (â òå÷åíèå 3 äíåé) ïðîëèôåðàöèÿ ëèìôîèäíûõ êëåòîê
÷åëîâåêà ïîä äåéñòâèåì ïðåïàðàòîâ èíòåðëåéêèíà-2 (ÈË-2). Ïîñòàíîâêó òåñòà ïðîâîäÿò, êàê
îïèñàíî â ï. 2.3. Ïðè ýòîì àêòèâàöèþ êëåòîê ïðîâîäÿò, ïðåïàðàòîì ðåêîìáèíàíòíîãî ÈË-2
(ðÈË-2) â êîíå÷íûõ êîíöåíòðàöèÿõ 10 è 100 ÌÅ/ìë. Îäíîâðåìåííî â ëóíêè ñ ÌÏÊ âíîñÿò
èñïûòóåìûé ïðåïàðàò (íåñêîëüêî ðàçâåäåíèé). ×åðåç 48 ÷ íà ïîñëåäóþùèå 16–18 ÷ âíîñÿò ìåòèë3
Í-òèìèäèí èç ðàñ÷åòà 37 ÊÁê (1 ìèêðîêþðè) íà ëóíêó. Êëåòêè ïåðåíîñÿò íà áóìàæíûå ôèëüòðû
è îòìûâàþò. Ñ÷åò ðàäèîàêòèâíîñòè ïðîâîäÿò â áåòà-ñ÷åò÷èêå.
18
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
Îöåíêó èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêîãî ñðåäñòâà ïðîâîäÿò íà
îñíîâàíèè ðàñ÷åòà ÈÑ, êàê îïèñàíî â ðàçäåëå 2.3.
3.2. Öèòîòîêñè÷åñêàÿ àêòèâíîñòü ÅÊ êëåòîê ÷åëîâåêà
Ñòàíäàðòíîé ìîäåëüþ ôóíêöèîíàëüíîé õàðàêòåðèñòèêè ÅÊ êëåòîê ÷åëîâåêà ÿâëÿåòñÿ
îïðåäåëåíèå èõ öèòîòîêñè÷åñêîé àêòèâíîñòè ïðîòèâ îïóõîëåâûõ êëåòîê ëèíèè Ê-562 (êëåòêè
ýðèòðîëåéêåìèè ÷åëîâåêà), âûñîêî÷óâñòâèòåëüíûõ ê ëèòè÷åñêîìó äåéñòâèþ ÅÊ êëåòîê.
19
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
Äëÿ âûÿâëåíèÿ ìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ èññëåäóåìûõ ïðåïàðàòîâ íà ôóíêöèîíàëüíóþ
àêòèâíîñòü ÅÊ êëåòîê ñâåæåâûäåëåííûå ëèìôîèäíûå êëåòêè (ÌÏÊ) çäîðîâûõ ëþäåé
èíêóáèðóþò â êîíöåíòðàöèè 2–3 ìëí/ìë â ïèòàòåëüíîé ñðåäå RPMI-1640, ñîäåðæàùåé 1%
ÀÂ-ñûâîðîòêè èëè 1% ÝÒÑ, ñ ðàçëè÷íûìè ðàçâåäåíèÿìè ïðåïàðàòà â òå÷åíèå 4 ÷ â àòìîñôåðå
âîçäóõà ñ 5% ÑÎ2 . ( ñëó÷àå îæèäàíèÿ âûñîêîãî ýôôåêòà âîçäåéñòâèÿ ïðåïàðàòà íà àêòèâíîñòü
ÅÊ êëåòîê âðåìÿ èíêóáàöèè ìîæíî ñîêðàòèòü äî 1 ÷ è äàæå äî 30 ìèí). Çàòåì êëåòêè îòìûâàþò
îäíîêðàòíî öåíòðèôóãèðîâàíèåì è ðåñóñïåíäèðóþò â ñðåäå RPMI-1640 ñ 5% ÀÂ-ñûâîðîòêè
èëè ÝÒÑ äî êîíöåíòðàöèé 8, 4 è 2 ìëí/ìë. Îäíîâðåìåííî ãîòîâÿò êëåòêè-ìèøåíè. Äëÿ ýòîãî
êëåòêè ëèíèè Ê-562 ìåòÿò 51Cr â òå÷åíèå 1 ÷ è îòìûâàþò, êàê îïèñàíî â ðàçäåëå 2.5.2. Çàòåì
â ëóíêè êðóãëîäîííûõ ìèêðîïëàíøåò âíîñÿò ïî 100 ìêë, ñîäåðæàùèõ 10 òûñ. êëåòîêìèøåíåé, è 100 ìêë êëåòîê-ýôôåêòîðîâ (ÌÏÊ çäîðîâûõ ëþäåé, èíêóáèðîâàííûõ ñ
èññëåäóåìûì ïðåïàðàòîì). Ïîëó÷àåìîå ñîîòíîøåíèå êëåòîê-ìèøåíåé è êëåòîê-ýôôåêòîðîâ
ñîñòàâëÿåò 80:1, 40:1, 20:1. Êàæäûé âàðèàíò âêëþ÷àåò 3–4 ïîâòîðà. Ìèêðîïëàíøåòó ñî ñìåñüþ
êëåòîê öåíòðèôóãèðóþò ïðè 1000 îá./ìèí â òå÷åíèå 5 ìèí, çàòåì èíêóáèðóþò â òå÷åíèå 4 ÷
ïðè +37°Ñ â àòìîñôåðå âîçäóõà ñ 5% ÑÎ2 . Ïîñëå èíêóáàöèè ìèêðîïëàíøåòó âíîâü
öåíòðèôóãèðóþò, çàòåì îòáèðàþò ïî 100 èëè 150 ìêë ñóïåðíàòàíòà è ïåðåíîñÿò â
ïëàñòìàññîâûå ïðîáèðêè Ýïïåíäîðôà äëÿ ó÷åòà ðàäèîàêòèâíîñòè îáðàçöîâ, êàê îïèñàíî â
ï. 2.5.2. Ïîñòàíîâêó êîíòðîëåé ñïîíòàííîãî è «òîòàëüíîãî» ëèçèñà êëåòîê-ìèøåíåé, ó÷åò
ðàäèîàêòèâíîñòè, à òàêæå ðàñ÷åò ïðîöåíòà öèòîòîêñè÷íîñòè êëåòîê-ýôôåêòîðîâ ïðîâîäÿò,
êàê îïèñàíî â ï. 2.5.2.
Öèòîòîêñè÷íîñòü ÅÊ êëåòîê (è äðóãèõ öèòîòîêñè÷åñêèõ êëåòîê) ìîæíî âûðàçèòü â
ëèòè÷åñêèõ åäèíèöàõ (ËÅ), ðàññ÷èòûâàåìûõ ïî êîìïüþòåðíîé ïðîãðàììå êàê ñîäåðæàíèå
â 1 ìëí êëåòîê-ýôôåêòîðîâ öèòîòîêñè÷åñêèõ êëåòîê, âûçûâàþùèõ 50% ëèçèñ 5 òûñ. (èëè
10 òûñ.) êëåòîê-ìèøåíåé, íàõîäÿùèõñÿ â ëóíêå.
20
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
Äëÿ õàðàêòåðèñòèêè èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ èñïûòóåìîãî ïðåïàðàòà
ñðàâíèâàþò óðîâíè öèòîòîêñè÷íîñòè ÌÏÊ, èíêóáèðîâàííûõ ïåðåä ïîñòàíîâêîé
öèòîòîêñè÷åñêîãî òåñòà ñ ïðåïàðàòîì èëè áåç íåãî.
Àêòèâíîñòü åñòåñòâåííûõ êèëëåðíûõ (ÅÊ) êëåòîê ìûøåé îïðåäåëÿåòñÿ ïî ñïîñîáíîñòè
êëåòîê ëèìôîóçëîâ (èëè ñåëåçåíêè) âûçûâàòü ëèçèñ ðàäèîàêòèâíî-ìå÷åíûõ îïóõîëåâûõ
êëåòîê ëèíèè YAC-1. Ïîñòàíîâêà òåñòà ïðîâîäèòñÿ àíàëîãè÷íî îïèñàíèþ äëÿ
õàðàêòåðèñòèêè ÅÊ êëåòîê ÷åëîâåêà
21
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
3.3 Àíòèòåëîçàâèñèìàÿ êëåòî÷íàÿ öèòîòîêñè÷íîñòü åñòåñòâåííûõ êèëëåðîâ
÷åëîâåêà
Àíòèòåëîçàâèñèìàÿ êëåòî÷íàÿ öèòîòîêñè÷íîñòü (ÀÇÊÖ) ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé äðóãîé òèï
öèòîòîêñè÷íîñòè ÅÊ êëåòîê ÷åëîâåêà, íå ñâÿçàííîé ñ èõ ïðÿìîé öèòîòîêñè÷íîñòüþ. Â
êà÷åñòâå êëåòîê-ìèøåíåé îáû÷íî èñïîëüçóþò êóëüòèâèðóåìûå îïóõîëåâûå êëåòêè ÷åëîâåêà,
íå ÷óâñòâèòåëüíûå (èëè ñëàáî÷óâñòâèòåëüíûå) ê ïðÿìîìó öèòîòîêñè÷åñêîìó äåéñòâèþ ÅÊ
êëåòîê (Raji, Daudi, U-937, CEM-E5 è äð.). Ïðè îöåíêå äåéñòâèÿ èññëåäóåìûõ ïðåïàðàòîâ
èññëåäîâàíèÿ ïðîâîäÿò àíàëîãè÷íî îïèñàíèþ â ï. 3.2. Îñîáåííîñòüþ ïîñòàíîâêè ÀÇÊÖ
ÿâëÿåòñÿ ïðåäâàðèòåëüíîå âíåñåíèå àíòèñûâîðîòîê (êðîëè÷üèõ, êîçüèõ), ñîäåðæàùèõ
àíòèòåëà ê èñïîëüçîâàííûì îïóõîëåâûì êëåòêàì, íà 30 ìèí ïðè +37°Ñ â ëóíêè êðóãëîäîííûõ
ìèêðî-ïëàíøåò ñ ðàäèîàêòèâíî-ìå÷åíûìè îïóõîëåâûìè êëåòêàìè-ìèøåíÿìè. Êîíå÷íîå
ðàçâåäåíèå òåðìîèíàêòèâèðîâàííîé àíòèñûâîðîòêè (èëè êîíòðîëüíîé íîðìàëüíîé ñûâîðîòêè
òîãî æå âèäà æèâîòíîãî) äîëæíî áûòü íå ìåíåå 1:100, ïðè êîòîðîì îíè íå îáëàäàþò ïðÿìîé
öèòîòîêñè÷íîñòüþ ïðîòèâ êëåòîê-ìèøåíåé. Çàòåì êëåòêè-ýôôåêòîðû (ÌÏÊ çäîðîâûõ ëþäåé,
ïðåèíêóáèðîâàííûõ ñ èññëåäóåìûì ïðåïàðàòîì) âíîñÿò ê êëåòêàì-ìèøåíÿì òàê, ÷òîáû
ïîëó÷èòü ñîîòíîøåíèå Ý/Ì 40:1 è 20:1. (Ñîîòíîøåíèÿ êëåòîê-ýôôåêòîðîâ è êëåòîê-ìèøåíåé
ìîæåò áûòü â 2 ðàçà óâåëè÷åíî èëè óìåíüøåíî â çàâèñèìîñòè îò ÷óâñòâèòåëüíîñòè êëåòîêìèøåíåé è ñòåïåíè àêòèâàöèè êëåòîê-ýôôåêòîðîâ èññëåäóåìûì ïðåïàðàòîì). Âðåìÿ
èíêóáàöèè êëåòîê-ýôôåêòîðîâ è êëåòîê-ìèøåíåé â ïðèñóòñòâèè ïðîòèâîîïóõîëåâûõ
àíòèòåë — 6 ÷ ïðè +37îÑ â àòìîñôåðå âîçäóõà ñ 5% ÑÎ2. Êàæäûé âàðèàíò òåñòèðóåìûõ
êëåòîê ñòàâÿò â 3–4 ïîâòîðàõ. Ñïîíòàííûé è «òîòàëüíûé» êîíòðîëè öèòîòîêñè÷íîñòè, à òàêæå
ó÷åò ðàäèîàêòèâíîñòè ïðîá è ðàñ÷åò öèòîòîêñè÷íîñòè äëÿ êàæäîãî âàðèàíòà êëåòîêýôôåêòîðîâ ïðîâîäÿò, êàê îïèñàíî â ï. 2.5.2. Ðàñ÷åò «ñïåöèôè÷åñêîé öèòîòîêñè÷íîñòè» (%
öèòîòîêñè÷íîñòè êëåòîê-ýôôåêòîðîâ ÀÇÊÖ) ïðîâîäÿò ïî ôîðìóëå:
22
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
% ÖÒÀ ýôôåêòîðîâ ÀÇÊÖ = % ÖÒÀ (+ àíòèñûâîðîòêà) –
% ÖÒÀ (+ íîðì. ñûâîðîòêè)
% ÖÒÀ ýôôåêòîðîâ ÀÇÊÖ ðàññ÷èòûâàåòñÿ äëÿ êàæäîãî âàðèàíòà êëåòîê-ýôôåêòîðîâ (îáðàáîòàííûõ
èëè íå îáðàáîòàííûõ èññëåäóåìûì ïðåïàðàòîì).
Äîïóñêàåòñÿ ó÷åò öèòîòîêñè÷íîñòè êëåòîê-ýôôåêòîðîâ ÀÇÊÖ ïóòåì îêðàñêè ñ âèòàëüíûìè
êðàñèòåëÿìè (òðèïàíîâûé ñèíèé, íåéòðàëüíûé êðàñíûé), à òàêæå ïî äûõàòåëüíîìó
ìåòàáîëèçìó êëåòîê-ìèøåíåé (ñ ÌÒÒ è åãî ïðîèçâîäíûìè).
Äëÿ õàðàêòåðèñòèêè èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ èñïûòóåìîãî ïðåïàðàòà íà êëåòêèýôôåêòîðû ÀÇÊÖ ñðàâíèâàëè çíà÷åíèÿ % ÖÒÀ äëÿ ÌÏÊ, èíêóáèðîâàííûõ ñ ïðåïàðàòîì
ïåðåä âíåñåíèåì ïðîòèâîîïóõîëåâûõ àíòèòåë, è ÌÏÊ, íå èíêóáèðîâàííûõ ñ íèì.
4. Âëèÿíèå ïðåïàðàòà íà ôàãîöèòàðíîå
çâåíî èììóíèòåòà
4.1. Îïðåäåëåíèå ôàãîöèòàðíîé àêòèâíîñòè
íåéòðîôèëîâ ÷åëîâåêà
Äëÿ îöåíêè àíòèáàêòåðèàëüíîé (ôàãîöèòàðíîé, áàêòåðèöèäíîé) àêòèâíîñòè ôàãîöèòîâ
÷åëîâåêà èñïîëüçóþò ïîëèìîðôíî-ÿäåðíûå íåéòðîôèëû (ÏÌÍ) êðîâè ÷åëîâåêà, âûäåëåííûå
ïî Boyum íà ãðàäèåíòå ïëîòíîñòè ôèêîëë-âåðîãðàôèí ñ ïîñëåäóþùèì óäàëåíèåì èç îñàäêà,
ñîäåðæàùåãî íåéòðîôèëû, ýðèòðîöèòîâ ïóòåì äîáàâëåíèÿ 0,87% ðàñòâîðîì õëîðèñòîãî
àììîíèÿ ïðè +37îÑ â òå÷åíèå 5–7 ìèí è îòìûâàíèåì ïèòàòåëüíîé ñðåäîé, ñîäåðæàùåé 10%
ÀÂ-ñûâîðîòêè. ×èñòîòà òàêèõ íåéòðîôèëîâ îáû÷íî ñîñòàâëÿåò 88–92%. Âîçìîæíî
èñïîëüçîâàòü è äðóãèå ìåòîäû ïîëó÷åíèÿ íåéòðîôèëîâ êðîâè ÷åëîâåêà äëÿ îöåíêè èõ
àíòèáàêòåðèàëüíîé àêòèâíîñòè.
23
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
4.1.1. Ìèêðîñêîïè÷åñêèé ìåòîä îöåíêè ôàãîöèòîçà
Âëèÿíèå èññëåäóåìîãî ïðåïàðàòà íà ôàãîöèòîç áàêòåðèé íåéòðîôèëàìè îöåíèâàþò ïóòåì
ìèêðîñêîïè÷åñêîãî ó÷åòà ðåçóëüòàòîâ ðåàêöèè. Äëÿ ýòîãî ñìåøèâàþò 1 ìë âçâåñè ÏÌÍ (1
ìëí/ìë), 0,5 ìë âçâåñè áàêòåðèé S. aureus SG 511 (20 ìëí/ìë) è 0,5 ìë ôèçðàñòâîðà,
ñîäåðæàùåãî èññëåäóåìûé ïðåïàðàò â ðàçëè÷íûõ êîíöåíòðàöèÿõ. Ñìåñü èíêóáèðóþò ïðè
ïîìåøèâàíèè â òå÷åíèå 30 ìèí ïðè +37°Ñ. Ïðèãîòàâëèâàþò ìàçêè íà ñòåêëå, ôèêñèðóþò èõ
è îêðàøèâàþò ïî Ðîìàíîâñêîìó —Ãèìçà.  ìàçêàõ ïîäñ÷èòûâàþò ïî 200 íåéòðîôèëîâ,
ñîäåðæàùèõ èëè íå ñîäåðæàùèõ áàêòåðèè. Ïîëó÷åííûå äàííûå âûðàæàþò â âèäå
ôàãîöèòàðíîãî ïîêàçàòåëÿ (% ôàãîöèòîâ (íåéòðîôèëîâ è ìîíîöèòîâ), ñîäåðæàùèõ áàêòåðèè)
è ôàãîöèòàðíîãî èíäåêñà (ñðåäíåå ñîäåðæàíèå ôàãîöèòèðîâàííûõ áàêòåðèé â ðàñ÷åòå íà
îäèí ôàãîöèò).
Âìåñòî áàêòåðèé ìîæíî èñïîëüçîâàòü ÷àñòèöû ëàòåêñà ðàçìåðîì îêîëî 1,2–1,5 ìêì.
4.1.2. Ðàäèîìåòðè÷åñêèé ìåòîä îöåíêè ôàãîöèòîçà
Áàêòåðèàëüíóþ âçâåñü S. aureus SG 511 âûðàùèâàþò â òå÷åíèå 16 ÷ â 10 ìë ìÿñîïåïòîííîãî ïèòàòåëüíîãî áóëüîíà â ïðèñóòñòâèè 9,2 ÌÁê ìåòèë- 3Í-òèìèäèíà. Çàòåì âçâåñü
ñòàôèëîêîêêà òðèæäû îòìûâàþò ïðè 3000 îá./ìèí è äîâîäÿò íåôåëîìåòðè÷åñêè äî 1 ìëä
ìèêðîáíûõ òåë â ìë. Îïñîíèçàöèþ áàêòåðèé ïðîâîäÿò ïðåäâàðèòåëüíî â òå÷åíèå 30 ìèí â
ñðåäå RPMI-1640, ñîäåðæàùåé 10% ñûâîðîòêè IV ãðóïïû êðîâè ÷åëîâåêà.
24
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
Ðåàêöèþ ôàãîöèòîçà ñòàâÿò â êðóãëîäîííîé ìèêðîïëàíøåòå. Â ëóíêè âíîñÿò 50 ìêë âçâåñè
íåéòðîôèëîâ ñ êîíöåíòðàöèåé êëåòîê 10 ìëí/ìë è 100 ìêë ðàñòâîðà èññëåäóåìîãî ïðåïàðàòà â
ðàçëè÷íîé êîíöåíòðàöèè. Êàæäûé âàðèàíò ïîñòàíîâêè òåñòà âêëþ÷àåò 3–4 ïîâòîðà. ×åðåç 30
ìèí èíêóáàöèè ïðè +37îÑ â ëóíêè äîïîëíèòåëüíî âíîñÿò 50 ìêë âçâåñè îïñîíèçèðîâàííûõ
áàêòåðèé (100 ìëí/ìë), ñìåñü âíîâü èíêóáèðóþò ïðè +37îÑ â òå÷åíèå 30 ìèí. Ìèêðîïëàíøåòó
îõëàæäàþò íà ëüäó, íå ñâÿçàâøèåñÿ ñ íåéòðîôèëàìè áàêòåðèè òðèæäû îòìûâàþò ðàñòâîðîì
Âåðñåíà ïóòåì öåíòðèôóãèðîâàíèÿ ìèêðîïëàíøåòû ïðè 1000 îá./ìèí. Îñàäîê êëåòîê,
ôàãîöèòèðîâàâøèõ áàêòåðèé, ðåñóñïåíäèðóþò â ðàñòâîðå Âåðñåíà (0,02% ðàñòâîð ÝÄÒÀ) è
ïåðåíîñÿò âî ôëàêîíû ñî ñöèíòèëëÿöèîííîé æèäêîñòüþ (ÆÑ-8 èëè ÆÑ-106).
Ðàäèîàêòèâíîñòü ïðîá èçìåðÿþò â áåòà-ñ÷åò÷èêå. Ïðîöåíò ôàãîöèòîçà ïîäñ÷èòûâàëè ïî
ôîðìóëå:
% ôàãîöèòîçà =
ðàäèîàêòèâíîñòü áàêòåðèé â íåéòðîôèëàõ
ðàäèîàêòèâíîñòü èíòàêòíûõ áàêòåðèé
× 100
Èììóíîìîäóëèðóþùåå äåéñòâèå èñïûòóåìîãî ïðåïàðàòà îöåíèâàþò ïóòåì ñðàâíåíèÿ
ïîêàçàòåëåé ôàãîöèòîçà íåéòðîôèëîâ, èíêóáèðîâàííûõ â ïðèñóòñòâèè ïðåïàðàòà è áåç íåãî.
25
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
4.2. Îïðåäåëåíèå áàêòåðèöèäíîñòè íåéòðîôèëîâ ÷åëîâåêà
Áàêòåðèöèäíóþ àêòèâíîñòü íåéòðîôèëîâ ÷åëîâåêà îöåíèâàþò ìèêðî-ìåòîäîì. Äëÿ ýòîãî
0,5 ìëí íåéòðîôèëîâ â ñðåäå RPMI-1640, ñîäåðæàùåé 10% ÀÂ-ñûâîðîòêè, èíêóáèðóþò â
ëóíêàõ êðóãëîäîííîé ìèêðîïëàíøåòû â òå÷åíèå 20 ìèí ïðè +37îÑ ñ ïðåäâàðèòåëüíî
îïñîíèçèðîâàííûìè áàêòåðèÿìè S. aureus øòàììà SG 511 (5 ìëí ìèêðîáíûõ òåë). Êàæäûé
âàðèàíò òåñòà âêëþ÷àåò 3–4 ïîâòîðà. Çàòåì íåéòðîôèëû äâàæäû îòìûâàþò îò íåñâÿçàâøèõñÿ
áàêòåðèé è èíêóáèðóþò 4 ÷ â ïðèñóòñòâèè èñïûòóåìîãî ïðåïàðàòà ïðè +37îÑ â àòìîñôåðå
âîçäóõà ñ 5% ÑÎ 2 . Â êîíöå èíêóáàöèè ñóïåðíàòàíò óäàëÿþò, êëåòêè ëèçèðóþò
áèäèñòèëëèðîâàííîé âîäîé. Ëèçàò êëåòîê ñ âûæèâøèìè áàêòåðèÿìè ïåðåíîñÿò â ëóíêè
äðóãîé ìèêðîïëàíøåòû ñ ìÿñî-ïåïòîííûì áóëüîíîì (îáùèé îáúåì ïðîáû — 200 ìêë). Ïîñëå
ïåðåìåøèâàíèÿ ïî 20 ìêë ïðîáû îòáèðàþò è âûñåâàþò íà ÷àøêè Ïåòðè ñ ïèòàòåëüíûì
àãàðîì. ×àøêè Ïåòðè èíêóáèðóþò 24 ÷ ïðè +37îÑ, çàòåì ïðîâîäÿò âèçóàëüíûé ó÷åò âûðîñøèõ
áàêòåðèàëüíûõ êîëîíèé. Áàêòåðèöèäíóþ àêòèâíîñòü íåéòðîôèëîâ (ÁÀÍ) õàðàêòåðèçóþò
èíäåêñîì áàêòåðèöèäíîñòè (ÈÁ), êîòîðûé ðàññ÷èòûâàþò ïî ôîðìóëå:
ÈÁ = (1 – Ê4/Ê0) × 100%,
ãäå Ê4 — êîëè÷åñòâî æèâûõ áàêòåðèé (êîëîíèåîáðàçóþùèõ åäèíèö) ÷åðåç 4 ÷ èíêóáàöèè ñ
íåéòðîôèëàìè,
Ê0 — êîëè÷åñòâî æèâûõ áàêòåðèé ïîñëå ñìåøèâàíèÿ ñ íåéòðîôèëàìè.
Èììóíîìîäóëèðóþùåå äåéñòâèå èñïûòóåìîãî ïðåïàðàòà îöåíèâàþò ïóòåì ñðàâíåíèÿ
ÈÁ íåéòðîôèëîâ (èëè êîëè÷åñòâà âûðîñøèõ ïîñëå èõ ëèçèñà áàêòåðèàëüíûõ êîëîíèé),
èíêóáèðîâàííûõ â ïðèñóòñòâèè ïðåïàðàòà è áåç íåãî.
4.3. Îïðåäåëåíèå õåìîòàêñèñà íåéòðîôèëîâ ÷åëîâåêà
 ðàáîòå èñïîëüçóþò äâà êëàññè÷åñêèõ ìåòîäà îöåíêè õåìîòàêñèñà íåéòðîôèëîâ êðîâè
÷åëîâåêà, âûçûâàåìîãî áèîëîãè÷åñêè àêòèâíûìè ïðåïàðàòàìè.
26
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
4.3.1. Õåìîòàêñèñ íåéòðîôèëîâ â êàìåðå Áîéäåíà
Îöåíêó ñïîíòàííîãî è èíäóöèðîâàííîãî õåìîòàêñèñà (íàïðàâëåííîãî äâèæåíèÿ)
íåéòðîôèëîâ, âûäåëåííûõ ïî Boyum îò çäîðîâûõ ëþäåé, ïðîâîäèëè â êàìåðàõ Áîéäåíà ñ
öåëëþëîçíûì ôèëüòðîì (Synpor, ×åõèÿ) ñ äèàìåòðîì ïîð 2,5 ìêì èëè àíàëîãè÷íûì ôèëüòðîì
ôèðìû Nucleopore. Äëÿ îáíàðóæåíèÿ ìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ íà õåìîòàêñèñ íåéòðîôèëîâ
èññëåäóåìûé ïðåïàðàò âíîñÿò ïðåäâàðèòåëüíî âî âçâåñü íåéòðîôèëîâ (1 ìëí/ìë) â íåñêîëüêèõ
ðàçâåäåíèÿõ íà ïèòàòåëüíîé ñðåäå (íàïðèìåð, RPMI-1640) è èíêóáèðóþò â òå÷åíèå 1 ÷ ïðè
+37îÑ. Çàòåì îáðàáîòàííûå è íåîáðàáîòàííûå (êîíòðîëüíûå) êëåòêè îòìûâàþò îäíîêðàòíî.
Äëÿ èíèöèàöèè õåìîòàêñèñà íåéòðîôèëîâ â íèæíèå ÿ÷åéêè êàìåðû âíîñÿò õåìîàòòðàêòàíòû:
ôîðáîë ìèðèñòàò àöåòàò (ÔÌÀ) â êîíöåíòðàöèè 1,0–10,0 íã/ìë, ôîðìèë ïåïòèäû (FMLP, Nformyl-met-leu-phe; 1,0–0,1 ìêã/ìë), 1% ðàñòâîð êàçåèíàòà íàòðèÿ èëè êðîëè÷üþ ñûâîðîòêó,
àêòèâèðîâàííóþ çèìîçàíîì, è êîíòðîëüíóþ ïèòàòåëüíóþ ñðåäó. Ïîñëå ñáîðêè êàìåðû
Áîéäåíà â îòäåëüíûå ÿ÷åéêè åå âåðõíåãî îòñåêà âíîñÿò âçâåñü îáðàáîòàííûõ ïðåïàðàòîì
èëè êîíòðîëüíûõ íåéòðîôèëîâ â ïèòàòåëüíîé ñðåäå. Çàïîëíåííûå êàìåðû Áîéäåíà ïîìåùàþò
íà 1 ÷ (èëè 2 ÷) ïðè +37îÑ, çàòåì ôèëüòð èçâëåêàþò, ôèêñèðóþò 3 ìèí 96% ýòèëîâûì ñïèðòîì,
îêðàøèâàþò â òå÷åíèå 10 ìèí 1% ðàñòâîðîì òðèïàíîâîãî ñèíåãî, ìåòèëåíîâîãî ñèíåãî èëè
ïî Ðîìàíîâñêîìó. Êëåòêè, ìèãðèðîâàâøèå íà íèæíþþ ñòîðîíó ôèëüòðà, ïîäñ÷èòûâàþò â
10 ïîëÿõ çðåíèÿ ìèêðîñêîïà ïîä óâåëè÷åíèåì â 280 ðàç. Ïîêàçàòåëåì õåìîòàêñè÷åñêîé
àêòèâíîñòè íåéòðîôèëîâ ñëóæèò õåìîòàêñè÷åñêèé èíäåêñ (ÕÈ), èñ÷èñëÿåìûé ïî ôîðìóëå:
ΖÊ
ÕÈ =
× 100%
Î
ãäå Î — ÷èñëî êëåòîê, ìèãðèðîâàâøèõ ÷åðåç ôèëüòð íà õåìîàòòðàêòàíò,
Ê — ÷èñëî ñïîíòàííî ìèãðèðîâàâøèõ êëåòîê (â ÿ÷åéêå áåç õåìîàòòðàêòàíòà).
27
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
Ïðè îöåíêå ïðÿìîé õåìîòàêñè÷åñêîé àêòèâíîñòè èñïûòóåìîãî ïðåïàðàòà åãî âíîñÿò (â
íåñêîëüêèõ ðàçâåäåíèÿõ) â íèæíèå ÿ÷åéêè êàìåðû, çàòåì â âåðõíèå — íåîáðàáîòàííûå
íåéòðîôèëû. Ïðîâåäåíèå ýêñïåðèìåíòà è ó÷åò ðåçóëüòàòîâ ïðîâîäÿò, êàê îïèñàíî âûøå.
 íàñòîÿùåå âðåìÿ øèðîêî èñïîëüçóþò 48-ëóíî÷íûå ìèêðîêàìåðû äëÿ îïðåäåëåíèÿ
õåìîòàêñèñà ëåéêîöèòîâ.
4.3.2. Õåìîòàêñèñ íåéòðîôèëîâ ïîä àãàðîçîé
 êà÷åñòâå øèðîêî ðàñïðîñòðàíåííîãî ñåé÷àñ ðàññìàòðèâàåòñÿ ìåòîä îïðåäåëåíèÿ
õåìîòàêñèñà íåéòðîôèëîâ ïîä àãàðîçîé. Ðàáîòà ïî çàëèâêå àãàðîçû ïðîâîäèòñÿ â ñòåðèëüíûõ
óñëîâèÿõ!  ÷àøêó Ïåòðè äèàìåòðîì 40 ìì, ïðåäâàðèòåëüíî èíêóáèðîâàííóþ ñ ïèòàòåëüíîé
ñðåäîé (199, RPMI-1640) â òå÷åíèå 30 ìèí ïðè +4îÑ, äîáàâëÿþò 4,2 ìë ïîäîãðåòîé ñìåñè
(1:1) 2% àãàðîçû (Sigma, Serva, ...) c ïèòàòåëüíîé ñðåäîé. Ïîñëå îñòûâàíèÿ àãàðîçû ÷àøêè
Ïåòðè õðàíÿò äî 2 íåäåëü ïðè +4îÑ âî âëàæíîé êàìåðå äî ïðîâåäåíèÿ èññëåäîâàíèé
õåìîòàêñèñà. Íåïîñðåäñòâåííî ïåðåä ïðîâåäåíèåì èññëåäîâàíèé â àãàðîçå ïðîáîéíèêîì
èëè øòàìïîì äåëàþò ñòðîåííûå ëóíêè äèàìåòðîì 2 ìì ñ ðàññòîÿíèåì ìåæäó íèìè 5–6 ìì.
Äëÿ îöåíêè ñïîñîáíîñòè èññëåäóåìîãî ïðåïàðàòà îêàçûâàòü ìîäóëèðóþùåå äåéñòâèå íà
õåìîòàêñèñ íåéòðîôèëîâ ÷åëîâåêà êëåòêè ïðåäâàðèòåëüíî èíêóáèðóþò ñ íåñêîëüêèìè
ðàçâåäåíèÿìè ïðåïàðàòà â òå÷åíèå 1 ÷ ïðè +37îÑ, çàòåì îòìûâàþò îäíîêðàòíî è âíîñÿò â
öåíòðàëüíûå ëóíêè, êàê è êîíòðîëüíûå íåîáðàáîòàííûå íåéòðîôèëû. Â öåíòðàëüíûå ëóíêè
âíîñÿò ïî 10 ìêë íåéòðîôèëîâ (â êîíöåíòðàöèè 20 ìëí/ìë), â ïðàâûå — îäèí èç
âûøåïåðå÷èñëåííûõ õåìîàòòðàêòàíòîâ, â ëåâûå — êîíòðîëüíóþ ïèòàòåëüíóþ ñðåäó199 èëè
RPMI-1640. Ïîñëå ýòîãî ÷àøêó Ïåòðè çàêðûâàþò êðûøêîé, èíêóáèðóþò âî âëàæíîé êàìåðå
ïðè +37îÑ â òå÷åíèå 2 ÷. Ìèãðàöèþ íåéòðîôèëîâ ïîä ñëîåì àãàðîçû îñòàíàâëèâàþò ïóòåì
äîáàâëåíèÿ ìåòàíîëà è ïîñòàíîâêè ÷àøêè Ïåòðè íà íî÷ü ïðè +4îÑ. Ìåòàíîë óäàëÿþò,
äîáàâëÿþò 2% ïàðàôîðìàëüäåãèä â òå÷åíèå 1 ÷ (äëÿ ôèêñàöèè êëåòîê). Çàòåì ôèêñàòîð è
28
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
àãàðîçó àêêóðàòíî óäàëÿþò, âûñóøèâàþò êëåòêè íà äíå ÷àøêè Ïåòðè ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå
â òå÷åíèå 2 ÷. Íåéòðîôèëû äîêðàøèâàþò êðàñèòåëÿìè (êðàñêà Ìàé-Ãðþíâàëüäà — 2 ìèí,
êðàñêà Ðîìàíîâñêîãî — 10 ìèí), ïðîìûâàþò âîäîé è îöåíèâàþò ìèêðîñêîïè÷åñêè äëèíó
ïðîáåãà êëåòîê, ìèãðèðîâàâøèõ â ñòîðîíó õåìîàòòðàêòàíòà (Î) èëè ïèòàòåëüíîé ñðåäû (Ê).
Çíà÷åíèå õåìîòàêñè÷åñêîãî èíäåêñà ðàññ÷èòûâàþò, êàê îïèñàíî âûøå. Îá
èììóíîìîäåëèðóþùåì äåéñòâèè èññëåäóåìûõ ïðåïàðàòîâ ñóäÿò ïî èçìåíåíèþ çíà÷åíèé
ÕÈ (%) ó îáðàáîòàííûõ íåéòðîôèëîâ ïî ñðàâíåíèþ ñ êîíòðîëüíûìè íåîáðàáîòàííûìè.
4.4. Îöåíêà êèñëîðîäçàâèñèìîãî è -íåçàâèñèìîãî ïóòåé áàêòåðèöèäíîãî äåéñòâèÿ
ôàãîöèòîâ ÷åëîâåêà
 ïîñëåäíåå âðåìÿ øèðîêî èñïîëüçóþò ìåòîäû îöåíêè ñîñòîÿíèÿ áèîõèìè÷åñêèõ ñèñòåì
ôàãîöèòîâ (ïðåæäå âñåãî íåéòðîôèëîâ) äëÿ õàðàêòåðèñòèêè ìåòàáîëè÷åñêîé àêòèâíîñòè
êëåòîê. Îöåíêó êèñëîðîäçàâèñèìîãî ïóòè áàêòåðèöèäíîñòè íåéòðîôèëîâ ïðîâîäÿò ïî
ïðîäóêöèè ñóïåðîêñèäíûõ àíèîíîâ, âûÿâëÿåìûõ â ÍÑÒ-òåñòå ñ íèòðîñèíèì òåòðàçîëèåì
èëè ÌÒÒ-òåñòå ñ åãî ðàñòâîðèìûì ïðîèçâîäíûì. Òàêæå âîçìîæíà îöåíêà
êèñëîðîäçàâèñèìîãî ïóòè áàêòåðèöèäíîñòè íåéòðîôèëîâ ïî îöåíêå óðîâíÿ
ìèåëîïåðîêñèäàçû, ñèíòåçèðóåìûõ àíèîíîâ êèñëîðîäà, ëþìèíîëçàâèñèìîé
õåìèëþìèíåñöåíöèè. Êèñëîðîäíåçàâèñèìûé ïóòü îñóùåñòâëåíèÿ áàêòåðèöèäíîñòè
íåéòðîôèëîâ ìîæåò áûòü îõàðàêòåðèçîâàí ïî óðîâíþ ñèíòåçèðóåìîãî íåéòðîôèëàìè NO
èëè êàòèîííûõ áåëêîâ. Ìåòîäû ïðèåìëåìû äëÿ îöåíêè èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ
èñïûòóåìûõ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ ïóòåì ïðîâåäåíèÿ èññëåäîâàíèé ñ êîíòðîëüíûìè
íåîáðàáîòàííûìè è îáðàáîòàííûìè íåéòðîôèëàìè, èíêóáèðîâàííûìè ïðåäâàðèòåëüíî ñ
èñïûòóåìûìè ïðåïàðàòàìè ïî îáùåïðèíÿòîé ñõåìå. Îïèñàíèå ìåòîäîâ ïðèâîäèòñÿ â
ñïåöèàëüíîé ìåòîäè÷åñêîé ëèòåðàòóðå.
29
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
5. Îöåíêà âëèÿíèÿ ïðåïàðàòà íà ñèñòåìó êîìïëåìåíòà
Èçìåíåíèå àêòèâíîñòè ñèñòåìû êîìïëåìåíòà ïîä äåéñòâèåì èññëåäóåìîãî ïðåïàðàòà
îöåíèâàþò íà ìîðñêèõ ñâèíêàõ. Äëÿ ýòîãî îòáèðàþò ãðóïïû ïî 4–6 ìîðñêèõ ñâèíîê âåñîì
300–500 ã. Êàæäîé ãðóïïå ìîðñêèõ ñâèíîê ââîäÿò âíóòðèâåííî èññëåäóåìûé ïðåïàðàò â
íåñêîëüêèõ êîíöåíòðàöèÿõ. Êîíòðîëüíîé ãðóïïå æèâîòíûõ ââîäÿò ôèçèîëîãè÷åñêèé ðàñòâîð.
Äî ââåäåíèÿ ïðåïàðàòà è ÷åðåç 30 ìèí, 4 ÷ (ìîæíî äîïîëíèòåëüíî ââåñòè 1 ÷ è 24 ÷) ïîñëå
ââåäåíèÿ èç óøíîé âåíû æèâîòíûõ çàáèðàþò îáðàçöû êðîâè (50 ìêë), ïîñëå ñâåðòûâàíèÿ
êðîâè ïðè +37°Ñ ñûâîðîòêó êðîâè îòáèðàþò öåíòðèôóãèðîâàíèåì, ðàçâîäÿò â 10 ðàç ìåäèíàëâåðîíàëîâûì áóôåðíûì ðàñòâîðîì (ÌÂÁ, ðÍ 7,4) è èñïîëüçóþò â òå÷åíèå 1–2 ÷ äëÿ
îïðåäåëåíèÿ àêòèâíîñòè êîìïëåìåíòà ïî 50% ãåìîëèçó ìèêðîìåòîäîì. Äëÿ ýòîãî â
êðóãëîäîííûõ ìèêðîïëàíøåòàõ â êîíå÷íîì îáúåìå 100 ìêë ïðèãîòàâëèâàþò ñåðèéíûå
äâóêðàòíûå ðàçâåäåíèÿ ñûâîðîòîê æèâîòíûõ.  êà÷åñòâå îòðèöàòåëüíîãî êîíòðîëÿ
èñïîëüçóþò ÌÂÁ, â êà÷åñòâå ïîëîæèòåëüíîãî — äèñòèëëèðîâàííóþ âîäó. Âî âñå ëóíêè
ìèêðîïëàíøåòû âíîñÿò ïî 100 ìêë ãåìñèñòåìû, ñîñòîÿùåé èç ðàâíûõ îáúåìîâ ðàçâåäåííîé
ãåìîëèòè÷åñêîé ñûâîðîòêè è 2% âçâåñè ýðèòðîöèòîâ áàðàíà, èíêóáèðîâàííîé
ïðåäâàðèòåëüíî â òå÷åíèå 30–40 ìèí ïðè +37°Ñ. Ìèêðîïëàíøåíòû èíêóáèðóþò ïðè +37îÑ
â òå÷åíèå 30–40 ìèí, öåíòðèôóãèðóþò, ñóïåðíàòàíò (100 èëè 50 ìêë) îòáèðàþò è ïåðåíîñÿò
â ëóíêè äðóãîé ìèêðîïëàíøåòû. Ó÷åò ñòåïåíè ãåìîëèçà ïðîâîäÿò íà ìèêðîïëàíøåòî÷íîì
ñïåêòðîôîòîìåòðå (ÈÔÀ-ðèäåðå) ïðè ÎÄ405. Ðàñ÷åò ñîäåðæàíèÿ ãåìîëèòè÷åñêèõ åäèíèö â
ñûâîðîòêå ïðîâîäÿò ãðàôè÷åñêè.
30
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
Îá èììóíîìîäóëèðóþùåì äåéñòâèè ïðåïàðàòà ñóäÿò ïî èçìåíåíèþ óðîâíÿ êîìïëåìåíòà
â ñûâîðîòêå ìîðñêèõ ñâèíîê â áëèæàéøèå (20 ìèí — 1 ÷) è ïîçäíèå ñðîêè ïîñëå ââåäåíèÿ
èññëåäóåìîãî ïðåïàðàòà â ñðàâíåíèè ñ àíàëîãîì.  êà÷åñòâå àíàëîãà ìîæíî èñïîëüçîâàòü
èçâåñòíûé ïðåïàðàò òîé æå ãðóïïû, áàêòåðèàëüíûå ïðîäóêòû (ïèðîãåíàë, ëèïîïîëèñàõàðèä
è ò.ä.).
6. Õàðàêòåðèñòèêà ëèìôîòîêñè÷íîñòè ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
 êà÷åñòâå ñïåöèàëüíîãî òåñòà èññëåäîâàíèÿ ëèìôîòîêñè÷íîñòè èñïûòóåìîãî ïðåïàðàòà
in vitro èñïîëüçóåòñÿ ñëåäóþùèé ïðîòîêîë. ÌÏÊ êðîâè çäîðîâûõ ëþäåé äâàæäû îòìûâàþò
áåññûâîðîòî÷íîé ñðåäîé RPMI-1640, ñîäåðæàùåé àíòèáèîòèêè (ïåíèöèëëèí — 100 åä./ìë, +
ñòðåïòîìèöèí — 100 ìêã/ìë, èëè ãåíòàìèöèí — 40 ìêã/ìë) è L-ãëþòàìèí (2 ììîëü), è
ðåñóñïåíäèðóþò äî êîíå÷íîé êîíöåíòðàöèè 1 ìëí/ìë.  êóëüòóðû êëåòîê îáúåìîì ïî 0,2 ìë
âíîñÿò äîïîëíèòåëüíî ïðåïàðàò â 5–7 äâóêðàòíûõ ðàçâåäåíèÿõ èñõîäíîãî ðàñòâîðà. ÌÏÊ
èíêóáèðóþò ñ èññëåäóåìûì ïðåïàðàòîì â òå÷åíèå 18 ÷ â àòìîñôåðå âîçäóõà ñ 5% ÑÎ2. Êàæäûé
âàðèàíò ñòàâèòñÿ â òðåõ ïîâòîðàõ. Ïîñëå îêîí÷àíèÿ èíêóáàöèè êëåòêè ðåñóñïåíäèðóþò, èõ
æèçíåñïîñîáíîñòü îöåíèâàåòñÿ ìèêðîñêîïè÷åñêè ñ 0,02% òðèïàíîâîãî ñèíåãî
(ïðèãîòîâëåííîãî íà çàáóôåðåííîì ôèçðàñòâîðå, ðÍ 7,4 + 0,05% àçèä íàòðèÿ). ËÄ50 èñõîäíîãî
ðàñòâîðà ïðåïàðàòà ðàññ÷èòûâàåòñÿ ãðàôè÷åñêè ìåòîäîì «ïðîáèò»-àíàëèçà è ïðåäñòàâëÿåò
ñîáîé åãî êîëè÷åñòâî (èñõîäíîãî ðàñòâîðà), âûçûâàþùåå 50% -þ ãèáåëü ëèìôîèäíûõ êëåòîê
÷åëîâåêà in vitro.
Êîñâåííî î òîêñè÷íîñòè èñïûòóåìîãî ôàðìàêîëîãè÷åñêîãî ñðåäñòâà ìîæíî ñóäèòü ïî
ìèêðîñêîïè÷åñêîé (â èíâåðòèðîâàííîì èëè ñâåòîâîì ìèêðîñêîïå) îöåíêå æèçíåñïîñîáíîñòè
òåñòèðóåìûõ êëåòîê, êóëüòèâèðóåìûõ in vitro.
31
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
ÕÀÐÀÊÒÅÐÈÑÒÈÊÀ ÀËËÅÐÃÈÇÈÐÓÞÙÈÕ ÑÂÎÉÑÒÂ
ÔÀÐÌÀÊÎËÎÃÈ×ÅÑÊÈÕ ÑÐÅÄÑÒÂ
1. Îöåíêà àíàôèëàêòîãåííîé àêòèâíîñòè ïðåïàðàòà
Îöåíêó àíàôèëàêòîãåííîé àêòèâíîñòè èññëåäóåìîãî ïðåïàðàòà ïðîâîäÿò íà ìîäåëè
ëåãî÷íîé àíàôèëàêñèè. Äëÿ ýòîãî ìîðñêèõ ñâèíîê âåñîì îêîëî 300 ã ± 50 ã, ïî 6 îñîáåé â
ãðóïïå ñåíñèáèëèçèðóþò ïóòåì ïîäêîæíîãî ââåäåíèÿ ïðåïàðàòà â ðàçëè÷íûõ äîçèðîâêàõ.
Ïðåïàðàò ïîâòîðíî ââîäÿò âíóòðèìûøå÷íî ÷åðåç 48 è 96 ÷ â òîì æå êîëè÷åñòâå. Îäíà
êîíòðîëüíàÿ ãðóïïà æèâîòíûõ ïîëó÷àåò 0,15 ìîëü ðàñòâîðà õëîðèñòîãî íàòðèÿ, äðóãàÿ —
îâàëüáóìèí â äîçå äî 5 ìã/îñîáü. ×åðåç 20–21 äåíü ïîñëå ïîñëåäíåé èíúåêöèè ìîðñêèì
ñâèíêàì ââîäÿò ðàçðåøàþùóþ äîçó ïðåïàðàòà â äîçå 3 ìã/îñîáü. Ðåàêöèþ àíàôèëàêñèè
îöåíèâàþò ïî âíåøíèì ïðîÿâëåíèÿì (÷àñòîòà äûõàíèÿ, îäûøêó, äèñêîîðäèíàöèÿ ïîõîäêè,
âçúåðîøåííîñòü øåðñòè, ïî÷åñûâàíèå íîñà, ñóäîðîãè, ñìåðòü) â ðàííèå (ïåðâûå 5–10 ìèí),
îòäàëåííûå (2 ÷ íàáëþäåíèÿ) è ïîçäíèå (÷åðåç 18 ÷) ñðîêè. Èíòåíñèâíîñòü ðåàêöèè
àíàôèëàêñèè îöåíèâàþò ïî ñèñòåìå ++++ â ñîîòâåòñòâèè ñ ïðåäëîæåíèÿìè Weigle. Ïðè ýòîì
îòìå÷àþò ñëåäóþùèå âèçóàëüíûå ïðèçíàêè:
++++ — ñóäîðîãè æåâàòåëüíûõ ìûøö è êîíå÷íîñòåé, ïàäåíèå íà áîê, ñàìîïðîèçâîëüíûå
ìî÷åèñïóñêàíèå è äåôåêàöèÿ, ñìåðòü â òå÷åíèå 2–7 ìèí;
+++ — çóä êîæè (ïî÷åñûâàíèå íîñà è çà óøàìè), îäûøêà, ñóäîðîãè, ñàìîïðîèçâîëüíûå
ìî÷åèñïóñêàíèå è äåôåêàöèÿ, ïåðèîäè÷åñêè ïàäåíèå íà áîê;
++ — çóä êîæè, îäûøêà, åäèíè÷íûå ñóäîðîãè, ñîõðàíÿþùèåñÿ â òå÷åíèå 1–2 ÷;
+ — êðàòêîâðåìåííûå çóä êîæè, îäûøêà, âîçìîæíû åäèíè÷íûå ñóäîðîãè, ïðîõîäÿùèå â
òå÷åíèå 1 ÷.
32
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
Ðàñ÷åò èíòåíñèâíîñòè àíàôèëàêñèè ïðîâîäÿò ïóòåì ñóììèðîâàíèÿ âñåõ áàëëîâ â ãðóïïå,
çàòåì äåëåíèÿ ïîëó÷åííîãî ïîêàçàòåëÿ íà êîëè÷åñòâî ìîðñêèõ ñâèíîê. Äëÿ îïðåäåëåíèÿ
èíòåíñèâíîñòè àíàôèëàêñèè äëÿ êàæäîé ãðóïïû æèâîòíûõ åå ïîêàçàòåëü äåëÿò íà ïîêàçàòåëü
ïîçèòèâíîãî êîíòðîëÿ (+îâàëüáóìèí) è óìíîæàþò íà 100 (%). Èñïûòóåìûé ïðåïàðàò ñ÷èòàþò
êàê ñïîñîáíûé âûçûâàòü àíàôèëàêñèþ ïðè èíòåíñèâíîñòè ðåàêöèè (â áàëëàõ) áîëåå 25% îò
ïîëîæèòåëüíîãî êîíòðîëÿ.
2. Îöåíêà êîæíîé àíàôèëàêñèè
Ìûøåé ëèíèè BALB/c ñåíñèáèëèçèðóþò âíóòðèáðþøèííî èññëåäóåìûì ïðåïàðàòîì â
íåñêîëüêèõ äîçàõ, êîòîðûå ââîäÿò 3 ðàçà ÷åðåç 28–30 äíåé. Êàæäàÿ ãðóïïà âêëþ÷àåò 8–10 ìûøåé
(ñàìîê) âåñîì 20 ± 2 ã. ×åðåç 7 äíåé ïîñëå ïîñëåäíåé ñåíñèáèëèçèðóþùåé èíúåêöèè ñòðîãî
âíóòðèêîæíî â îáúåìå 25 ìêë ââîäÿò ðàçðåøàþùóþ äîçó äâóêðàòíî ðàçâåäåííîãî ïðåïàðàòà.
Îäíîâðåìåííî ââîäÿò âíóòðèâåííî (â õâîñòîâóþ âåíó èëè ðåòðîîðáèòàëüíûé ñèíóñ) 200
ìêë 0,5% ðàñòâîðà ñèíåãî Ýâàíñà. ×åðåç 30 ìèí ìûøü óìåðùâëÿþò è âûðåçàþò ó÷àñòîê
êîæè äèàìåòðîì îêîëî 8 ìì, ñîîòâåòñòâóþùèé ïðîêðàøåííîìó ïÿòíó â ìåñòå ââåäåíèÿ
ñåíñèáèëèçèðóþùåé äîçû ïðåïàðàòà. Ïðîêðàøåííûé ó÷àñòîê êîæè ïîìåùàþò â ïðîáèðêó
ñ 1 ìë 1 N ðàñòâîðà ÊÎÍ, èíêóáèðóþò ïðè +37îÑ â òå÷åíèå 12–14 ÷ (íà íî÷ü). Çàòåì â ïðîáèðêó
âíîñÿò 9 ìë ëèçèðóþùåé ñìåñè 0,6 N ðàñòâîðà Í3ÐÎ4 è àöåòîíà, âçÿòûõ â ñîîòíîøåíèè 5:13.
Ïðîáèðêó èíòåíñèâíî âñòðÿõèâàþò è öåíòðèôóãèðóþò. Íà ñïåêòðîôîòîìåòðå (íàïðèìåð,
ÑÔ-46) îïðåäåëÿþò îïòè÷åñêóþ ïëîòíîñòü ñóïåðíàòàíòà ïðè 620 íì. Îäíîâðåìåííî ñòðîÿò
êàëèáðîâî÷íóþ êðèâóþ ñ îáðàçöàìè, ñîäåðæàùèìè 2–10 ìêã êðàñèòåëÿ â ìë ëèçèðóþùåé
ñìåñè. Ïî êàëèáðîâî÷íîé êðèâîé ãðàôè÷åñêè îïðåäåëÿþò ñîäåðæàíèå êðàñèòåëÿ â êîæå
ñåíñèáèëèçèðîâàííûõ ìûøåé. Ðåçóëüòàòû èçìåðåíèé îáðàáàòûâàþò ñòàòèñòè÷åñêè ïî îòäåëüíûì
ãðóïïàì ìûøåé.
33
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
3. Ïðîäóêöèÿ in vitro èììóíîãëîáóëèíà Å ÷åëîâåêà
Êðîâü çäîðîâûõ ëþäåé êóëüòèâèðóþò â ïåíèöèëëèíîâûõ ôëàêîíàõ â ðàçâåäåíèè 1:10 ñî
ñðåäîé RPMI-1640 (Sigma, ÑØÀ), ñîäåðæàùåé 10% òåðìîèíàêòèâèðîâàííîé ýìáðèîíàëüíîé
òåëÿ÷üåé ñûâîðîòêè, 2 ììîëü (300 ìã/ë) L-ãëþòàìèíà, 40 ìêã/ìë ãåíòàìèöèíà, 25 ÅÄ/ìë ãåïàðèíà.
Êëåòêè êðîâè êóëüòèâèðóþò â àòìîñôåðå âîçäóõà ñ 5% ÑÎ2 ïðè +37îÑ â òå÷åíèå 5 ñóò. Ïðè
îöåíêå ïðÿìîãî äåéñòâèÿ èññëåäóåìîãî ïðåïàðàòà åãî âíîñÿò â êóëüòóðó êëåòîê êðîâè â
íåñêîëüêèõ êîíå÷íûõ êîíöåíòðàöèÿõ. Ïðè îöåíêå êîñòèìóëèðóþùåé àêòèâíîñòè ïðåïàðàòà
åãî âíîñÿò â êóëüòóðó êëåòîê êðîâè îäíîâðåìåííî ñ ìèòîãåíîì ëàêîíîñà â êîíå÷íîé
êîíöåíòðàöèè 15 ìêã/ìë. Ïî îêîí÷àíèè êóëüòèâèðîâàíèÿ ñóïåðíàòàíò êóëüòóð êëåòîê êðîâè
ñîáèðàþò öåíòðèôóãèðîâàíèåì è èñïîëüçóþò äëÿ îïðåäåëåíèÿ òîòàëüíîãî IgE ñ ïîìîùüþ
êîììåð÷åñêîãî èììóíîôåðìåíòíîãî íàáîðà (íàïðèìåð, ôèðìû «Hoffman La Roshe»).
Ïðîâåäåíèå òåñòà îïðåäåëåíèÿ ñóììàðíîãî IgE îñóùåñòâëÿþò â ñîîòâåòñòâèè ñ èíñòðóêöèåé
ôèðìû-èçãîòîâèòåëÿ ñ ó÷åòîì îïèñàíèÿ àâòîðîâ-ðàçðàáîò÷èêîâ. Ïîëó÷åííûå äàííûå
âûðàæàþò â ÌÅ/ìë ïî îòíîøåíèþ ê òèòðîâàííîìó ñòàíäàðòó ôèðìû.
34
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
ÎÁÙÈÅ ÐÅÊÎÌÅÍÄÀÖÈÈ ÏÎ ÕÀÐÀÊÒÅÐÈÑÒÈÊÅ
ÈÌÌÓÍÎÌÎÄÓËÈÐÓÞÙÈÕ ÑÂÎÉÑÒ ÔÀÐÌÀÊÎËÎÃÈ×ÅÑÊÈÕ ÑÐÅÄÑÒÂ
Îáÿçàòåëüíîé îöåíêå èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ïîäëåæàò ôàðìàêîëîãè÷åñêèå
ñðåäñòâà, èñïîëüçóåìûå äëÿ èììóíîêîððåêöèè, èììóíîòåðàïèè, àäàïòîãåíû,
îáùåóêðåïëÿþùèå è ïðåïàðàòû äëÿ ïðåâåíòèâíîé òåðàïèè ëèö, ðàáîòàþùèõ â çîíàõ
ýêîëîãè÷åñêèõ áåäñòâèé.
Ìèíèìàëüíûé ïåðå÷åíü òåñòîâ äëÿ äîêëèíè÷åñêîé îöåíêè èììóíîìîäóëèðóþùåãî è
àëëåðãèçèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãèè÷åñêèõ ñðåäñòâ âêëþ÷àåò:
îäèí ìåòîä îöåíêè âëèÿíèÿ íà ãóìîðàëüíûé èììóííûé îòâåò,
îäèí ìåòîä îöåíêè âëèÿíèÿ íà Ò-êëåòî÷íûé èììóííûé îòâåò,
îäèí ìåòîä îöåíêè âëèÿíèÿ íà ñèñòåìó ôàãîöèòîâ èëè ñèñòåìó êîìïëåìåíòà,
îäèí ìåòîä îöåíêè àëëåðãèçèðóþùåãî äåéñòâèÿ èññëåäóåìîãî ïðåïàðàòà.
 íàñòîÿùåå âðåìÿ îáùåïðèçíàííî, ÷òî áîëüøèíñòâî ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ, äàæå
íå îáëàäàþùèõ ïðÿìûì èììóíîòðîïíûì äåéñòâèåì, ñïîñîáíû ïðîÿâëÿòü
èììóíîìîäóëèðóþùåå äåéñòâèå. Ïîýòîìó ñëåäóåò èñïîëüçîâàòü ìèíèìàëüíûé íàáîð òåñòîâ
äëÿ îöåíêè èììóíîìîäóëèðóþùèõ è àëëåðãèçèðóþùèõ ñâîéñòâ ëåêàðñòâåííûõ ïðåïàðàòîâ,
ïðèìåíÿåìûõ äëèòåëüíî, ïàðåíòåðàëüíî, èëè ïðè çàáîëåâàíèÿõ ÷åëîâåêà, ñîïðîâîæäàþùèõñÿ
ôîðìèðîâàíèåì èììóíîäåôèöèòíûõ ñîñòîÿíèé. Ýòî ïîçâîëèò îöåíèòü êàê èõ áèîëîãè÷åñêóþ
áåçîïàñíîñòü, òàê è ñïîñîáíîñòü âûñòóïàòü â êà÷åñòâå èììóíîêîððåêòîðîâ. Ïðîâåäåíèå
äîêëèíè÷åñêèõ (ýêñïåðèìåíòàëüíûõ) èñïûòàíèé ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ òàêæå ïîçâîëèò
öåëåíàïðàâëåííî îòîáðàòü (êðîìå îáùåïðèçíàííûõ) ëàáîðàòîðíûå ìåòîäû îöåíêè äåéñòâèÿ
ôàðìàêîëîãè÷åñêîãî ñðåäñòâà ó ïàöèåíòîâ âî âðåìÿ åãî êëèíè÷åñêèõ èñïûòàíèé.
35
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
Ðàñøèðåíèå ïåðå÷íÿ èñïîëüçóåìûõ ìåòîäîâ ïî ñðàâíåíèþ ñ ìèíèìàëüíûì òðåáóåòñÿ äëÿ
`õàðàêòåðèñòèêè íàïðàâëåííîãî äåéñòâèÿ ýòèõ ñðåäñòâ íà îòäåëüíûå çâåíüÿ ñèñòåìû
èììóíèòåòà,
– ïðåïàðàòîâ, ïðåäíàçíà÷åííûõ äëÿ ïàðåíòåðàëüíîãî ââåäåíèÿ,
– ïðåïàðàòîâ ñ ñèëüíûì âûðàæåííûì è î÷åíü ñèëüíûì ìîäóëèðóùèì äåéñòâèåì íà
èììóííûå ðåàêöèè in vivo ó æèâîòíûõ è in vitro â êóëüòóðå êëåòîê ÷åëîâåêà.
Ðàñøèðåíèå ïåðå÷íÿ ïðåäïîëàãàåò èñïîëüçîâàíèå 2–3 ðàçíîïëàíîâûõ ìåòîäîâ îöåíêè
èììóíîìîäóëèðóþùèõ ñâîéñòâ èñïûòóåìîãî ïðåïàðàòà ïî êàæäîìó èç îáîçíà÷åííûõ çâåíüåâ
èììóíèòåòà è àëëåðãèçèðóþùèõ ñâîéñòâ. Ýòî ïîçâîëèò îöåíèòü êàê îñíîâíûå, òàê è
äîïîëíèòåëüíûå ýôôåêòû âîçäåéñòâèÿ íà èììóííóþ ñèñòåìó, íàìåòèòü ìåðû
ïðåäóïðåæäåíèÿ âîçìîæíûõ îñëîæíåíèé îò èõ ñèñòåìàòè÷åñêîãî ïðèìåíåíèÿ.
Ïðîâåäåíèå ñàìèõ äîêëèíè÷åñêèõ èññëåäîâàíèé òðåáóåò ïðèäåðæèâàòüñÿ ïðèíöèïà
ïîâòîðíîñòè èññëåäîâàíèé (ýêñïåðèìåíòîâ). Ïðè ýòîì èõ äîëæíî áûòü íå ìåíåå 3 — ïðè
èññëåäîâàíèè êëåòîê êðîâè ðàçëè÷íûõ çäîðîâûõ ñóáúåêòîâ, è íå ìåíåå 2 (ïðè ïîëó÷åíèè
îäíîòèïíûõ ðåçóëüòàòîâ) — ïðè ïðîâåäåíèè èññëåäîâàíèé in vivo íà æèâîòíûõ. Âñå
ðåçóëüòàòû äîëæíû áûòü ñòàòèñòè÷åñêè îáðàáîòàíû, îáÿçàòåëüíî äîëæíû âêëþ÷àòü çíà÷åíèÿ
ïîëîæèòåëüíîãî è îòðèöàòåëüíîãî êîíòðîëåé. Æåëàòåëüíî ïðåäñòàâèòü ðåçóëüòàòû ñðàâíåíèÿ
èñïûòóåìîãî ôàðìàêîëîãè÷åñêîãî ñðåäñòâà ñ àíàëîãîì (åñëè òàêîé èìååòñÿ).
36
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ
Ïðè îöåíêå ñòåïåíè èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ïðåäëàãàåòñÿ ïðèäåðæèâàòüñÿ
øêàëû ++++, ãäå îäèí + ñîîòâåòñòâóåò 25% ýôôåêòà. Ïðè ýòîì 0% — ýòî çíà÷åíèå
îòðèöàòåëüíîãî (áàçîâîãî) êîíòðîëÿ, à 100% — çíà÷åíèå ïîëîæèòåëüíîãî êîíòðîëÿ. Äëÿ
êàæäîãî ìåòîäà îöåíêè
+ (0–25%) ðàññìàòðèâàåòñÿ êàê ñëàáûé ìîäóëèðóþùèé ýôôåêò,
++ (25–50%) — êàê âûðàæåííûé ìîäóëèðóþùèé ýôôåêò,
+++ (50–75%) — êàê ñèëüíûé âûðàæåííûé ìîäóëèðóþùèé ýôôåêò,
++++ (75–100% è áîëåå) ðàññìàòðèâàåòñÿ êàê î÷åíü ñèëüíûé ìîäóëèðóþùèé ýôôåêò
èñïûòóåìîãî ôàðìàêîëîãè÷åñêîãî ñðåäñòâà. ( ñëó÷àå ïðåâûøåíèÿ çíà÷åíèé
ïîëîæèòåëüíîãî êîíòðîëÿ ìîäóëèðóþùèé ýôôåêò ôàðìàêîëîãè÷åñêîãî ñðåäñòâà
ðàññìàòðèâàåòñÿ êàê î÷åíü ñèëüíûé).
Ïðè èñïîëüçîâàíèè ôàðìàêîëîãè÷åñêîãî ñðåäñòâà ñðàâíåíèÿ (àíàëîãà) åãî äåéñòâèå
òàêæå îöåíèâàåòñÿ ïî ïðåäëàãàåìîé øêàëå.
Ïðåäëàãàåìûé ïîäõîä ïîçâîëÿåò ðàíæèðîâàòü èììóíîìîäóëÿòîðû (à òàêæå
ôàðìàêîëîãè÷åñêèå ñðåäñòâà ñ äðóãèì îñíîâíûì áèîëîãè÷åñêèì äåéñòâèåì) è îïðåäåëÿòü
íåîáõîäèìûé îáúåì î ñíîâíûõ è äîïîëíèòåëüíûõ ìåòîäîâ îöåíêè èõ
èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ in vitro è in vivo.
37
Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ
Скачать