ÌÈÍÈÑÒÅÐÑÒÂÎ ÇÄÐÀÂÎÎÕÐÀÍÅÍÈß ÐÅÑÏÓÁËÈÊÈ ÁÅËÀÐÓÑÜ ÌÅÒÎÄÈ×ÅÑÊÈÅ ÐÅÊÎÌÅÍÄÀÖÈÈ ÑÎÃËÀÑÎÂÀÍÎ Çàìåñòèòåëü íà÷àëüíèêà Ãëàâíîãî óïðàâëåíèÿ êàäðîâîé ïîëèòèêè, ó÷åáíûõ çàâåäåíèé è íàóêè Í.È. Äîñòà ÓÒÂÅÐÆÄÀÞ Ïåðâûé çàìåñòèòåëü ìèíèñòðà äðàâîîõðàíåíèÿ Â.Ì.Îðåõîâñêèé 16 ôåâðàëÿ 1999 ã. 18 ôåâðàëÿ 1999 ã. Ðåãèñòðàöèîííûé ¹ 140-9812 ÌÅÒÎÄÈ×ÅÑÊÈÅ ÐÅÊÎÌÅÍÄÀÖÈÈ ÏÎ ÝÊÑÏÅÐÈÌÅÍÒÀËÜÍÎÌÓ (ÄÎÊËÈÍÈ×ÅÑÊÎÌÓ) ÈÑÏÛÒÀÍÈÞ ÈÌÌÓÍÎÌÎÄÓËÈÐÓÞÙÅÃÎ ÄÅÉÑÒÂÈß ÔÀÐÌÀÊÎËÎÃÈ×ÅÑÊÈÕ ÑÐÅÄÑÒ Ìèíñê 1999 1 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ Îñíîâíîå ó÷ðåæäåíèå-ðàçðàáîò÷èê: ÍÈÈ ãåìàòîëîãèè è ïåðåëèâàíèÿ êðîâè ÌÇ ÐÁ Ó÷ðåæäåíèÿ-èñïîëíèòåëè: ÍÈÈ ïóëüìîíîëîãèè è ôòèçèàòðèè ÌÇ ÐÁ, Ìåæäóíàðîäíûé èíñòèòóò ïî ðàäèîýêîëîãèè èì. À.Ä. Ñàõàðîâà Àâòîðû: ä-ð ìåä.íàóê Ì.Ï. Ïîòàïíåâ, êàíä. ìåä. íàóê Ë.Ã. Áîðòêåâè÷, êàíä. ìåä. íàóê Ä.Â. Ïå÷êîâñêèé, Å.Â. Ðóêøà, Ò.Ñ. Ãàðáóçåíêî, Æ.À. Èáðàãèìîâà, Â.Â. Áëèíîâ Ðåöåíçåíò: êàíä. ìåä. íàóê Â.È. Ëåâèí  ìåòîäè÷åñêèõ ðåêîìåíäàöèÿõ ïî îöåíêå èììóíîìîäóëèðóþùèõ ñâîéñòâ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ äàíî îïèñàíèå ìåòîäîâ îöåíêè èõ äåéñòâèÿ íà Ò-êëåòî÷íûå, Âêëåòî÷íûå ðåàêöèè èììóíèòåòà, íåñïåöèôè÷åñêóþ ðåçèñòåíòíîñòü (ôóíêöèþ íåéòðîôèëîâ, ñèñòåìó êîìïëåìåíòà) ó ýêñïåðèìåíòàëüíûõ æèâîòíûõ (ëèíåéíûõ ìûøåé, ìîðñêèõ ñâèíîê) è â êóëüòóðå ëåéêîöèòîâ êðîâè ÷åëîâåêà.  êà÷åñòâå ñàìîñòîÿòåëüíîãî ðàçäåëà ïðèâåäåíî îïèñàíèå ìåòîäîâ îöåíêè àëëåðãèçèðóþùèõ ñâîéñòâ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ íà òåõ æå ýêñïåðèìåíòàëüíûõ ìîäåëÿõ.  ïåðå÷åíü ïðåäëàãàåìûõ èììóíîëîãè÷åñêèõ ìåòîäîâ âêëþ÷åíû êàê îáùåïðèíÿòûå, òàê è íîâûå (àïðîáèðîâàííûå çà ïîñëåäíèå 10 ëåò), ïîçâîëÿþùèå âñåñòîðîííå îöåíèòü äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêîãî ñðåäñòâà íà îòäåëüíûå çâåíüÿ èììóíèòåòà è àëëåðãèè. Ïðåäñòàâëåí ìèíèìàëüíûé ïåðå÷åíü òåñòîâ äëÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ ñ ðàçíîé ñòåïåíüþ èììóíîòðîïíîñòè, îáîñíîâàíà ñòåïåíü åãî ðàñøèðåíèÿ äëÿ ðàçëè÷íûõ ãðóïï ëåêàðñòâåííûõ ïðåïàðàòîâ. Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïðåäíàçíà÷åíû äëÿ ôàðìàêîëîãîâ, èììóíîëîãîâ, àëëåðãîëîãîâ, íàó÷íûõ ðàáîòíèêîâ, âðà÷åé-ëàáîðàíòîâ êîíòðîëüíûõ ëàáîðàòîðèé. Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè óòâåðæäåíû Ìèíèñòåðñòâîì çäðàâîîõðàíåíèÿ Ðåñïóáëèêè Áåëàðóñü â êà÷åñòâå îôèöèàëüíîãî äîêóìåíòà. 2 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ Îãëàâëåíèå ÂÂÅÄÅÍÈÅ .......................................................................................................................................................... 4 ÎÁÙÈÅ ÏÎËÎÆÅÍÈß ÈÇÓ×ÅÍÈß ÈÌÌÓÍÎÌÎÄÓËÈÐÓÞÙÈÕ ÑÂÎÉÑÒ ÔÀÐÌÀÊÎËÎÃÈ×ÅÑÊÈÕ ÑÐÅÄÑÒ ..................................................................................... 6 ÈÑÏÛÒÀÍÈÅ ÈÌÌÓÍÎÌÎÄÓËÈÐÓÞÙÅÃÎ ÄÅÉÑÒÂÈß ÔÀÐÌÀÊÎËÎÃÈ×ÅÑÊÈÕ ÑÐÅÄÑÒ .......................................................................................................... 7 ÕÀÐÀÊÒÅÐÈÑÒÈÊÀ ÀËËÅÐÃÈÇÈÐÓÞÙÈÕ ÑÂÎÉÑÒ ÔÀÐÌÀÊÎËÎÃÈ×ÅÑÊÈÕ ÑÐÅÄÑÒ ........................................................................................................ 32 ÎÁÙÈÅ ÐÅÊÎÌÅÍÄÀÖÈÈ ÏÎ ÕÀÐÀÊÒÅÐÈÑÒÈÊÅ ÈÌÌÓÍÎÌÎÄÓËÈÐÓÞÙÈÕ ÑÂÎÉÑÒ ÔÀÐÌÀÊÎËÎÃÈ×ÅÑÊÈÕ ÑÐÅÄÑÒ ................................................................................... 35 3 Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ ÂÂÅÄÅÍÈÅ Ôàðìàêîëîãè÷åñêèå ñðåäñòâà, âîçäåéñòâóþùèå íà îðãàíèçì ÷åëîâåêà, îáëàäàþò íå òîëüêî îñíîâíûì áèîëîãè÷åñêèì äåéñòâèåì íà ÷óâñòâèòåëüíûå îðãàíû è òêàíè èëè ïàòîãåí, íî ïðîÿâëÿþò ìîäóëèðóþùåå äåéñòâèå íà äðóãèå ñèñòåìû îðãàíèçìà. Ñòåïåíü âîçäåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ íà èììóííóþ ñèñòåìó îïðåäåëÿåòñÿ ïðèðîäîé ýòîãî ñðåäñòâà (áèîëîãè÷åñêîé, õèìè÷åñêîé, ôèçè÷åñêîé), òðîïíîñòüþ ê ðàçëè÷íûì òêàíÿì è ñèñòåìàì îðãàíèçìà ÷åëîâåêà, åãî ôóíêöèîíàëüíûì ñîñòîÿíèåì. Èììóííàÿ ñèñòåìà âûïîëíÿåò ðåãóëÿòîðíóþ ôóíêöèþ, îòñëåæèâàÿ ëþáîé ïðîöåññ âîçäåéñòâèÿ íà îðãàíèçì ÷åëîâåêà (âíóòðåííèõ èëè âíåøíèõ ôàêòîðîâ). Ïðè ýòîì îíà ðåàãèðóåò êàê íà ïàòîëîãè÷åñêèé ïðîöåññ â îðãàíèçìå ÷åëîâåêà, òàê è íà ôàðìàêîëîãè÷åñêèå ñðåäñòâà, èñïîëüçóåìûå äëÿ ëå÷åíèÿ. Ôàðìàêîëîãè÷åñêèå ñðåäñòâà ìîãóò ïðîÿâëÿòü ïðÿìîå âîçäåéñòâèå íà èììóííóþ ñèñòåìó, òî åñòü îáëàäàòü èììóíîòðîïíîñòüþ. Ïåðå÷åíü òàêèõ ñðåäñòâ íåâåëèê èõ îòíîñÿò ê èììóíîìîäóëÿòîðàì. Òàêèå ïðåïàðàòû ïðèìåíÿþòñÿ äëÿ èììóíîòåðàïèè è èììóíîêîððåêöèè. Ñåé÷àñ ñòàëî î÷åâèäíûì, ÷òî áîëüøèíñòâî ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ ïðîÿâëÿþò íåïðÿìîå âîçäåéñòâèå íà èììóííóþ ñèñòåìó çà ñ÷åò ðåãóëÿöèè îáðàçîâàíèÿ âòîðè÷íûõ áèîëîãè÷åñêè àêòèâíûõ ýíäîãåííûõ èììóíîìîäóëÿòîðîâ. Ýòè ïðåäñòàâëåíèÿ òðåáóþò ïî-íîâîìó ïîäîéòè ê îöåíêå èììóíîìîäóëèðóþùèõ ñâîéñòâ íîâûõ è óæå èçâåñòíûõ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ. Ðàíåå îöåíêà èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ áûëà îáÿçàòåëüíà äëÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ, ÿâëÿþùèõñÿ íåïîñðåäñòâåííî èììóíîìîäóëÿòîðàìè.  íàñòîÿùåå âðåìÿ ïåðå÷åíü òàêèõ ñðåäñòâ ðàñøèðÿåòñÿ çà ñ÷åò ìàññîâîãî âíåäðåíèÿ áèîëîãè÷åñêè àêòèâíûõ àäàïòîãåíîâ, à òàêæå ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ, ñïîñîáíûõ âîçäåéñòâîâàòü íà èììóííóþ ñèñòåìó îðãàíèçìà ÷åëîâåêà. 4 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ Ïðîâåäåíèå ýêñïåðèìåíòàëüíîãî (äîêëèíè÷åñêîãî) èñïûòàíèÿ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ òàêæå ïðåòåðïåâàåò èçìåíåíèå, ÷òî ñâÿçàíî ïðåæäå âñåãî ñ ðàñøèðåíèåì èñïîëüçîâàíèÿ ìåòîäîì àíàëèçà in vitro íàðÿäó ñ èñïîëüçîâàíèåì ìåòîäîì àíàëèçà in vivo íà æèâîòíûõ. Ýòî îáúÿñíÿåòñÿ áîëåå âûñîêîé ÷óâñòâèòåëüíîñòüþ, ýêîíîìè÷íîñòüþ è òåõíîëîãè÷íîñòüþ ìåòîäîâ àíàëèçà in vitro, à òàêæå âîçìîæíîñòüþ èñïîëüçîâàòü êëåòî÷íûå ñèñòåìû ÷åëîâå÷åñêîãî ïðîèñõîæäåíèÿ.  òî æå âðåìÿ èññëåäîâàíèÿ in vitro è èññëåäîâàíèÿ in vivo ÿâëÿþòñÿ îáÿçàòåëüíîé ñîñòàâíîé ÷àñòüþ îöåíêè èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ, òàê êàê îòðàæàþò ðàçíûé óðîâåíü ðåàêöèè îðãàíèçìà (êëåòî÷íûé, òêàíåâîé, îðãàíèçìåííûé) íà âíåøíåå âîçäåéñòâèå. Âàæíîé îñîáåííîñòüþ äîêëèíè÷åñêîãî èñïûòàíèÿ èììóíîìîäóëèðóþùèõ ñâîéñòâ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ ÿâëÿåòñÿ îöåíêà èõ âîçäåéñòâèÿ íà ïðàêòè÷åñêè çäîðîâûõ æèâîòíûõ èëè êëåòî÷íûå ñèñòåìû. Ýòî ïîçâîëÿåò îöåíèòü ñïîñîáíîñòü ñàìèõ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ ïðîÿâëÿòü ïðÿìîå èììóíîòðîïíîå äåéñòâèå, âîçìîæíîñòü åãî èñïîëüçîâàíèÿ ñ öåëüþ èììóíîïðîôèëàêòèêè. Ïîñëåäóþùèé êëèíè÷åñêèé ýòàï èçó÷åíèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêîãî ñðåäñòâà ïîçâîëèò îöåíèòü åãî àêòèâíîñòü â óñëîâèÿõ ïàòîëîãè÷åñêîãî ïðîöåññà â îðãàíèçìå ÷åëîâåêà, åãî ñïîñîáíîñòü âûñòóïàòü â êà÷åñòâå èììóíîòåðàïåâòè÷åñêîãî èëè èììóíîêîððèãèðóþùåãî ëåêàðñòâåííîãî ïðåïàðàòà. Íàêîíåö, èñïîëüçîâàíèå èììóíîòðîïíûõ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ â ôàçå âûçäîðîâëåíèÿ ïàöèåíòîâ ïîçâîëÿåò ñóäèòü î åãî àêòèâíîñòè âûñòóïàòü â êà÷åñòâå èììóíîðåàáèëèòàöèîííîãî ôàðìàêîëîãè÷åñêîãî ñðåäñòâà. Îöåíêà èììóíîìîäóëèðóþùèõ ñâîéñòâ âõîäèò â êîìïëåêñ äîêëèíè÷åñêèõ èñïûòàíèé, âêëþ÷àþùèé òàêæå îöåíêó áåçâðåäíîñòè ïðåïàðàòà (ïèðîãåííîñòü, àëëåðãåííîñòü, êàíöåðîãåííîñòü, òåðàòîãåííîñòü, ýìáðèîòîêñè÷íîñòü, ìóòàãåííîñòü), ôàðìàêîêèíåòèêè è ñïåöèôè÷åñêîé áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòè ôàðìàêîëîãè÷åñêîãî ñðåäñòâà. 5 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ Îáùèå ïîëîæåíèÿ èçó÷åíèÿ èììóíîìîäóëèðóþùèõ ñâîéñòâ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ Ìåòîäîëîãèÿ îöåíêè èììóíîìîäóëèðóþùèõ ñâîéñòâ ôàðìàêîëîãè ÷åñêèõ ñðåäñòâ ìàëî îòëè÷àåòñÿ îò êëàññè÷åñêîé, îáùåïðèçíàííîé 1015 ëåò íàçàä. Îíà âêëþ÷àåò ïðåæäå âñåãî îöåíêó âîçäåéñòâèÿ ïðåïàðàòîâ íà Ò-êëåòî÷íûé è Â-êëåòî÷íûé (ãóìîðàëüíûé) èììóíèòåò, ôàãîöèòàðíîå çâåíî èììóíèòåòà, ñèñòåìó êîìïëåìåíòà. Àëëåðãè÷åñêèå ðåàêöèè, ÿâëÿþùèåñÿ ïî ñâîåé ïðèðîäå Ò- èëè Â-êëåòî÷íûìè èììóííûìè ðåàêöèÿìè, òàêæå âêëþ÷åíû â íàñòîÿùèé ïåðå÷åíü èììóíîëîãè÷åñêèõ ìåòîäîâ èñïûòàíèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ, õîòÿ è ìîãóò ðàññìàòðèâàòüñÿ â êà÷åñòâå ñàìîñòîÿòåëüíîãî ðàçäåëà äîêëèíè÷åñêèõ èñïûòàíèé. Èññëåäîâàíèÿ ïðîâîäÿòñÿ â ñðàâíåíèè ñ èçâåñòíûìè àíàëîãàìè èçó÷àåìîãî ôàðìàêîëîãè÷åñêîãî ñðåäñòâà. Ïðè ïðîâåäåíèè èññëåäîâàíèé in vitro øèðîêî èñïîëüçóþò ïîëèêëîíàëüíûå àêòèâàòîðû ëèìôîöèòîâ ÷åëîâåêà. Èõ èñïîëüçîâàíèå â îïòèìàëüíîé è â ñóáîïòèìàëüíîé êîíöåíòðàöèÿõ ïîçâîëÿåò îöåíèòü äåéñòâèå èììóíîìîäóëÿòîðà â óñëîâèÿõ ìàêñèìàëüíîãî è ôèçèîëîãè÷åñêîãî âîçäåéñòâèÿ íà èììóííóþ ñèñòåìó (èììóíîêîìïåòåíòíûå êëåòêè). 6 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ ÈÑÏÛÒÀÍÈÅ ÈÌÌÓÍÎÌÎÄÓËÈÐÓÞÙÅÃÎ ÄÅÉÑÒÂÈß ÔÀÐÌÀÊÎËÎÃÈ×ÅÑÊÈÕ ÑÐÅÄÑÒ 1. Îöåíêà âëèÿíèÿ ïðåïàðàòà íà Â-êëåòî÷íûé (ãóìîðàëüíûé) èììóííûé îòâåò 1.1. Îïðåäåëåíèå àíòèòåëîîáðàçóþùèõ êëåòîê â ñåëåçåíêå ìûøåé Ìûøåé ëèíèè ÑÂÀ âåñîì 20 ± 2 ã, ñàìîê, èììóíèçèðóþò âíóòðèáðþøèííî ýðèòðîöèòàìè áàðàíà (ÝÁ) â ñóáîïòèìàëüíîé äîçå 2×107 â 100 ìêë. Îäíîâðåìåííî ââîäÿò èññëåäóåìûé ïðåïàðàò â äîçå, áëèçêîé ê ðàñ÷åòíîé òåðàïåâòè÷åñêîé, èëè ôèçðàñòâîð.  êà÷åñòâå êîíòðîëÿ òàêæå ââîäÿò ÝÁ â îïòèìàëüíîé äîçå (2×108 ÝÁ). Êàæäàÿ ãðóïïà ìûøåé ñîñòîèò èç 3 îñîáåé. ×åðåç 4 äíÿ ìûøåé çàáèâàþò, ñåëåçåíêè çàáèðàþò, ãîìîãåíèçèðóþò, ñïëåíîöèòû îòìûâàþò äâàæäû è èñïîëüçóþò äëÿ îïðåäåëåíèÿ êëåòîê, îáðàçóþùèõ àíòèòåëà (ÀÎÊ) ê ÝÁ, ïî ìåòîäó Cunningham. Îïðåäåëÿþò ÀÎÊ, ñåêðåòèðóþùèå àíòèòåëà êëàññà Ì. Äëÿ ýòîãî ñìåøèâàþò ïî 100 ìêë âçâåñè ñïëåíîöèòîâ (â êîíöåíòðàöèè îêîëî 10 ìëí/ìë), 100 ìêë 5% âçâåñè ÝÁ è 100 ìêë àäñîðáèðîâàííîãî êîìïëåìåíòà (îáû÷íî â ðàçâåäåíèè 1:2). Ñìåñüþ ìåðíî çàïîëíÿþò ñòåêëÿííûå êàìåðû, êîòîðûå çàïàèâàþò ïàðàôèíîì/âàçåëèíîì è èíêóáèðóþò â òå÷åíèå 1 ÷ ïðè 37îÑ íà ãîðèçîíòàëüíîé ïëîñêîñòè. Çàòåì ïðîâîäÿò âèçóàëüíûé ó÷åò çîí ãåìîëèçà, ñîîòâåòñòâóþùèõ ÀÎÊ. Ïîëó÷åííûå ðåçóëüòàòû âûðàæàþò êîëè÷åñòâîì ÀÎÊ â ïåðåñ÷åòå íà 1 ìëí ñïëåíîöèòîâ. 7 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ 1.2. Îïðåäåëåíèå ãåìàããëþòèíèíîâ â ñûâîðîòêå êðîâè ìûøåé Ìûøåé ëèíèè ÑÂÀ, âåñîì 20 ± 2 ã, ñàìîê, èììóíèçèðóþò âíóòðèáðþøèííî ñóáîïòèìàëüíîé äîçîé àíòèãåíà (12×107 ÝÁ/ìûøü) âìåñòå ñ èññëåäóåìûì ïðåïàðàòîì. Êîíòðîëüíûå ìûøè ïîëó÷àþò ôèçðàñòâîð èëè îïòèìàëüíóþ äîçó àíòèãåíà (1×109ÝÁ). Êàæäàÿ ãðóïïà ìûøåé âêëþ÷àåò ïî 3 îñîáè. ×åðåç 7 äíåé ó ìûøåé èç ðåòðîîðáèòàëüíîãî ñèíóñà çàáèðàþò êðîâü. Ïîñëå ñâåðòûâàíèÿ êðîâÿíîãî ñãóñòêà (ïðè +37îÑ) îòáèðàþò ñûâîðîòêó, òåðìîèíàêòèâèðóþò åå ïðè 56 î Ñ â òå÷åíèå 30 ìèí è èñïîëüçóþò äëÿ âûÿâëåíèÿ ñïåöèôè÷åñêèõ àíòèòåë ê ÝÁ â ðåàêöèè ãåìàããëþòèíàöèè (ÐÃÀ). Ðåàêöèþ ñòàâÿò â ìèêðîïëàíøåòàõ ñ êðóãëîäîííûìè ëóíêàìè ïóòåì ñìåøèâàíèÿ 50 ìêë äâóêðàòíî ðàçâåäåííûõ îáðàçöîâ èññëåäóåìûõ ñûâîðîòîê è 25 ìêë 2% âçâåñè ÝÁ. Ìèêðîïëàíøåòû èíêóáèðóþò â òå÷åíèå 1 ÷ ïðè 37îÑ. Ðåçóëüòàòû îöåíèâàþò ïî øêàëå ++++. Ïîëîæèòåëüíîé ñ÷èòàþò ÐÃÀ íå ìåíåå ++. Ðåçóëüòàòû ÐÃÀ ïðåäñòàâëÿþò â îáðàòíûõ çíà÷åíèÿõ log2 òèòðà ãåìàããëþòèíèíîâ, ãäå òèòðîì ñ÷èòàþò íàèáîëüøåå ðàçâåäåíèå ñûâîðîòêè êðîâè, äàþùåå ïîëîæèòåëüíóþ ðåàêöèþ. 1.3. Îïðåäåëåíèå àíòèòåë ê äðóãèì àíòèãåíàì Ó÷èòûâàÿ, ÷òî ÝÁ âûçûâàþò îòâåò ê ýðèòðîöèòàðíûì (êëåòî÷íûì) àíòèãåíàì, ñëåäóåò òàêæå èñïîëüçîâàòü êàêîé-ëèáî èç ñòàíäàðòèçîâàííûõ òêàíåâûõ, áàêòåðèàëüíûõ èëè âèðóñíûõ àíòèãåíîâ â ñîîòâåòñòâèè ñ èñêîìîé íàïðàâëåííîñòüþ äåéñòâèÿ èññëåäóåìîãî ïðåïàðàòà. Ïåðå÷åíü òàêîâûõ ìîæåò âêëþ÷àòü îâàëüáóìèí, ïðåïàðàòû ÄÍÊ, ñòàôèëîêîêêîâûé àíàòîêñèí, ñòîëáíÿ÷íûé àíàòîêñèí, äèôòåðèéíûé àíàòîêñèí, ãåìàããëþòèíèí âèðóñà ãðèïïà è äð. Íèæå íàìè ïðîâîäèòñÿ îïèñàíèå îöåíêè ó ìûøåé îáðàçîâàíèÿ (àóòî-) àíòèòåë ê ÄÍÊ â ïðèñóòñòâèè îäíîãî èç èññëåäîâàííûõ èììóíîìîäóëÿòîðîâ. 8 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ Ìûøåé ëèíèè Ñ57Bl/6 âåñîì 2326 ã èììóíèçèðóþò âíóòðèáðþøèííî ÄÍÊ, âûäåëåííîé èç êëåòîê ñåëåçåíêè ìûøåé òîé æå ëèíèè ìåòîäîì ôåíîëüíîé ýêñòðàêöèè â äîçå 25 ìêã/ æèâîòíîå. Èììóíèçàöèþ ïðîâîäèëè òðåõêðàòíî 1 ðàç â íåäåëþ. Îäíîâðåìåííî ââîäÿò èññëåäóåìûé ïðåïàðàò â ðàçëè÷íîé äîçèðîâêå äëÿ êàæäîé ãðóïïû æèâîòíûõ.  êà÷åñòâå ïîçèòèâíîãî êîíòðîëÿ èñïîëüçóþò áàêòåðèàëüíûé ëèïîïîëèñàõàðèä (ËÏÑ). ×åðåç íåäåëþ ïîñëå ïîñëåäíåé èììóíèçàöèè êðîâü çàáèðàþò èç ðåòðîîðáèòàëüíîãî ñèíóñà è ïîëó÷àþò ñûâîðîòêó. Òèòð àíòèòåë ê ÄÍÊ îïðåäåëÿþò èììóíîôåðìåíòíûì ìåòîäîì. Äëÿ ýòîãî ìèêðîïëàíøåòû äëÿ èììóíîôåðìåíòíîãî àíàëèçà, ïðåäâàðèòåëüíî îáðàáîòàííûå ïîëè-Ëëèçèíîì (10 ìêã/ìë), ïîêðûâàþò àíòèãåíîì (äâóõöåïî÷å÷íîé ÄÍÊ, 5 ìêã/ìë). Åñëè â êà÷åñòâå àíòèãåíà èñïîëüçóþò îäíîöåïî÷å÷íóþ ÄÍÊ, åå âíîñÿò â êîíöåíòðàöèè 2 ìêã/ìë â ëóíêè ìèêðîïëàíøåò áåç îáðàáîòêè ïîëè-Ë-ëèçèíîì. ×åðåç 1618 ÷ èíêóáàöèè ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå ìèêðîïëàíøåòû îòìûâàþò, â ëóíêè âíîñÿò îáðàçöû èññëåäóåìûõ ìûøèíûõ ñûâîðîòîê (ïåðâîíà÷àëüíîå ðàçâåäåíèå 1:100) è èíêóáèðóþò â òå÷åíèå 1 ÷ ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå ïðè âñòðÿõèâàíèè (íà «øåéêåðå»). Ìèêðîïëàíøåòû îòìûâàþò çàáóôåðåííûì ôèçðàñòâîðîì, ñîäåðæàùèì 0,02% òâèí-20 (Ò-ÇÔÐ). Çàòåì âíîñÿò ðàñòâîð êîíúþãàòà (ìå÷åíóþ ïåðîêñèäàçîé êîçüþ àíòèñûâîðîòêó ïðîòèâ èììóíîãëîáóëèíîâ ìûøåé) è èíêóáèðóþò 1,5 ÷ ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå. Ïîñëå îòìûâêè ÇÔÐ-Ò â ëóíêè ìèêðîïëàíøåòû âíîñÿò ðàñòâîð ñóáñòðàòà (îðòîôåíèëåíäèàìèí, ÎÔÄ). Ðåàêöèþ îñòàíàâëèâàþò 5% ðàñòâîðîì ñåðíîé êèñëîòû. Ó÷åò ðåàêöèè ïðîâîäÿò ïðè 492 íì íà ÈÔÀ-ðèäåðå (ñïåêòðîôîòîìåòðå). 9 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ 1.4. Îïðåäåëåíèå èììóíîãëîáóëèíñåêðåòèðóþùèõ êëåòîê ÷åëîâåêà, èíäóöèðîâàííûõ in vitro Èììóíîãëîáóëèíñåêðåòèðóþùèå êëåòêè (ÈÑÊ) èíäóöèðóþò â êóëüòóðå ëèìôîèäíûõ êëåòîê (ìîíîíóêëåàðîâ ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè, ÌÏÊ) çäîðîâûõ ëþäåé, âûäåëåííûõ íà ãðàäèåíòå ôèêîëë/âåðîãðàôèí ïî ìåòîäó Boyum. Êóëüòèâèðîâàíèå ïðîâîäÿò â ñðåäå RPMI1640, ñîäåðæàùåé 10% ñûâîðîòêè ýìáðèîíîâ êîðîâ (ÑÝÊ) è àíòèáèîòèêè. Êëåòêè êóëüòèâèðóþò â êîíå÷íîé êîíöåíòðàöèè 1 ìëí/ìë â ïëîñêîäîííûõ ìèêðîïëàíøåòàõ â îáúåìå 0,2 ìë â òå÷åíèå 7 ñóò â àòìîñôåðå âîçäóõà ñ 5% ÑÎ2. Îäíîâðåìåííî âíîñÿò èññëåäóåìûé ïðåïàðàò.  êà÷åñòâå ïîëîæèòåëüíîãî êîíòðîëÿ èñïîëüçóþò êëåòêè, àêòèâèðîâàííûå ìèòîãåíîì ëàêîíîñà (ÌË), â êîíöåíòðàöèè 1,0 ìêã/ìë. Êàæäûé âàðèàíò âêëþ÷àåò 3 ïîâòîðà.  êîíöå êóëüòèâèðîâàíèÿ êëåòêè îòìûâàþò 2 ðàçà áåññûâîðîòî÷íîé ñðåäîé, ñîäåðæàùåé àíòèáèîòèêè. ÈÑÊ îïðåäåëÿþò ìèêðîìåòîäîì îáðàòíîãî ãåìîëèòè÷åñêîãî áëÿøêîîáðàçîâàíèÿ. Äëÿ ýòîãî â ëóíêè ïëîñêîäîííûõ ìèêðîïëàíøåò âíîñÿò ïî 60 ìêë âçâåñè ÌÏÊ è 20 ìêë 0,5% âçâåñè ÝÁ, ïîêðûòûõ ñòàôèëîêîêêîâûì áåëêîì À. Ìèêðîïëàíøåòû èíêóáèðóþò â òå÷åíèå 1 ÷ ïðè +37 î Ñ â àòìîñôåðå âîçäóõà ñ 5% ÑÎ 2 . Çàòåì âíîñÿò ïî 10 ìêë àíòèèììóíîãëîáóëèíîâîé êðîëè÷üåé àíòèñûâîðîòêè (1:10) è âíîâü èíêóáèðóþò 1 ÷ ïðè +37îÑ. Äîïîëíèòåëüíî âíîñÿò ïî 10 ìêë êîìïëåìåíòà (1:6) è ñíîâà èíêóáèðóþò 1 ÷ ïðè +37îÑ. Ó÷åò çîí ãåìîëèçà, ñîîòâåòñòâóþùèõ ÈÑÊ, ïðîâîäÿò ïîä èíâåðòèðîâàííûì ìèêðîñêîïîì ïîä óâåëè÷åíèåì â 160 ðàç. Ïîëó÷åííûå ðåçóëüòàòû âûðàæàþò êàê ñîäåðæàíèå ÈÑÊ â êóëüòóðå êëåòîê. 10 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ Äëÿ îïðåäåëåíèÿ ÈÑÊ (è ÀÎÊ) ÷åëîâåêà ìîæíî èñïîëüçîâàòü ìåòîä ELISPOT, îñíîâàííûé íà âûÿâëåíèè «ïÿòåí» îêðàøèâàíèÿ ôèëüòðîâàëüíîé áóìàãè, ïîêðûòîé àíòèòåëàìè ê èììóíîãëîáóëèíàì ÷åëîâåêà èëè àíòèãåíîì, íà ìåñòàõ èíêóáàöèè Â-ëèìôîöèòîâ, ñåêðåòèðóþùèõ èììóíîãëîáóëèíû èëè àíòèòåëà ñîîòâåòñòâåííî. Ìåòîäèêà ïîñòàíîâêè îïèñàíà â äðóãèõ ðóêîâîäñòâàõ. 11 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ 1.5. Îïðåäåëåíèå èììóíîãëîáóëèíîâ, ñåêðåòèðóåìûõ Â-ëèìôîöèòàìè ÷åëîâåêà in vitro Èíäóêöèþ ñåêðåöèè èììóíîãëîáóëèíîâ â êóëüòóðå ëèìôîèäíûõ êëåòîê ÌÏÊ ÷åëîâåêà in vitro ïðîâîäÿò, êàê îïèñàíî â ï. 1.4. ×åðåç 79 äíåé ïîñëå èíêóáàöèè ñ èññëåäóåìûì ïðåïàðàòîì (â òàêîì ñëó÷àå ÷åðåç 34 äíÿ äåëàþò ñìåíó ñðåäû) ñ èëè áåç ïîëèêëîíàëüíîãî Â-êëåòî÷íîãî àêòèâàòîðà (ìèòîãåíà ëàêîíîñà 10 ìêã/ìë, âçâåñè S. aureus Cowan 1 0,01%) ñóïåðíàòàíò êóëüòóð êëåòîê ñîáèðàþò öåíòðèôóãèðîâàíèåì è èñïîëüçóþò äëÿ èçìåðåíèÿ ñåêðåòèðîâàííûõ èììóíîãëîáóëèíîâ (îáû÷íî êëàññà G) èììóíîôåðìåíòíûì ìåòîäîì. Äëÿ ýòîãî íà äíî ëóíîê ìèêðîïëàíøåò âíîñÿò ïî 100 ìêë îïòèìàëüíî ðàçâåäåííûõ (1:3000) êðîëè÷üèõ àíòèòåë ïðîòèâ IgG ÷åëîâåêà (èëè ñïåöèôè÷åñêóþ àíòèñûâîðîòêó) íà 0,1 ìîëü â áèêàðáîíàòíîì áóôåðå, ðÍ 9,6. Èíêóáèðóþò â òå÷åíèå íî÷è ïðè +4îÑ. Ìèêðîïëàíøåòû îòìûâàþò îò íåñâÿçàâøèõñÿ àíòèòåë ñ ïîìîùüþ ÇÔÐ, ñîäåðæàùåãî 0,08% òâèí-20 (ÇÔÐ-Ò).  ëóíêè âíîñÿò ïî 100 ìêë äâóêðàòíî ðàçâåäåííûõ èññëåäóåìûõ êóëüòóðàëüíûõ ñóïåðíàòàíòîâ èëè ñòàíäàðòíîãî ïðåïàðàòà IgG ÷åëîâåêà. Ìèêðîïëàíøåòû èíêóáèðóþò â òå÷åíèå 2 ÷ ïðè +37îÑ, çàòåì îòìûâàþò ÇÔÐ-Ò è âíîñÿò ðàçâåäåííûå (1:50001:10000) êîçüè àíòèòåëà ïðîòèâ IgG ÷åëîâåêà, êîíúþãèðîâàííûå ñ ïåðîêñèäàçîé õðåíà. Ìèêðîïëàíøåòû âíîâü èíêóáèðóþò â òå÷åíèå 1 ÷ ïðè +37îÑ, çàòåì îòìûâàþò ÇÔÐ-Ò è äîáàâëÿþò ÎÔÄ â ôîñôàòíî-öèòðàòíîì áóôåðå (ðÍ 5,0). ×åðåç 515 ìèíóò ðåàêöèþ îñòàíàâëèâàþò âíåñåíèåì 50 ìêë 4 N ðàñòâîðà ñåðíîé êèñëîòû. Ó÷åò ðåàêöèè ïðîâîäÿò ïðè 492 íì íà ÈÔÀ-ðèäåðå (ñïåêòðîôîòîìåòðå). Ñîäåðæàíèå IgG â èññëåäóåìûõ ñóïåðíàòàíòàõ êóëüòóð êëåòîê ÷åëîâåêà ðàññ÷èòûâàþò ãðàôè÷åñêè èëè ñ ïîìîùüþ àäàïòèðîâàííûõ êîìïüþòåðíûõ ïðîãðàìì. 12 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ 1.6. Îïðåäåëåíèå àíòèòåë, ñåêðåòèðóåìûõ  ëèìôîöèòàìè ÷åëîâåêà in vitro Èññëåäîâàíèå ïðîâîäÿò àíàëîãè÷íî ïðèâåäåííîìó â ï. 1.5. Âìåñòî ïîëèêëîíàëüíûõ àêòèâàòîðîâ, âíîñèìûõ âìåñòå ñ èññëåäóåìûì èììóíîìîäóëÿòîðîì, èñïîëüçóåòñÿ îäèí èç ñòàíäàðòíûõ àíòèãåíîâ, óêàçàííûõ â ï. 1.3. Îñîáåííîñòüþ ïîñòàíîâêè ÈÔÀ ÿâëÿåòñÿ èñïîëüçîâàíèå âûáðàííîãî àíòèãåíà äëÿ ïîñàäêè íà ïëàñòèê â áèêàðáîíàòíîì áóôåðå.  êà÷åñòâå êîíòðîëåé àíòèãåíà èñïîëüçóþò íåðîäñòâåííûé àíòèãåí è àíòèñûâîðîòêó ê IgG ÷åëîâåêà. Æåëàòåëüíî èìåòü â êà÷åñòâå ïîçèòèâíîãî êîíòðîëÿ ñûâîðîòêó (ïëàçìó) ÷åëîâåêà, ñîäåðæàùóþ àíòèòåëà ê èññëåäóåìîìó àíòèãåíó. 2. Îöåíêà âëèÿíèÿ ïðåïàðàòà íà Ò-êëåòî÷íûé èììóííûé îòâåò 2.1. Ãèïåð÷óâñòâèòåëüíîñòü çàìåäëåííîãî òèïà Ãèïåð÷óâñòâèòåëüíîñòü çàìåäëåííîãî òèïà (ÃÇÒ) ó ìûøåé-ãèáðèäîâ F1 (ÑÂÀ × Ñ57Bl/6), ñàìîê âåñîì 1820 ã èíäóöèðóþò ââåäåíèåì âíóòðèâåííî 2 ×105 ÝÁ, îäíîâðåìåííî ââîäÿò èññëåäóåìûé ïðåïàðàò â íåñêîëüêèõ äîçàõ. Êàæäàÿ ãðóïïà ìûøåé âêëþ÷àåò ïî 34 îñîáè. Ðàçðåøàþùóþ äîçó ÝÁ (108/ìûøü) ââîäÿò íà 5 ñóò â ïîäóøå÷êó ïðàâîé çàäíåé ëàïû.  êîíòðëàòåðàëüíóþ ëàïó ââîäÿò 0,15 ìîëü ðàñòâîð õëîðèñòîãî íàòðèÿ. Ìåñòíóþ âîñïàëèòåëüíóþ ðåàêöèþ îöåíèâàþò ÷åðåç 24 ÷ ïóòåì èçìåðåíèÿ òîëùèíû ëàï ìèêðîìåòðîì. (Ìîæíî èñïîëüçîâàòü äðóãèå ìåòîäû èçìåðåíèÿ äèàìåòðà, îêðóæíîñòè èëè âåñà ëàï æèâîòíûõ). Èíäåêñ ðåàêöèè (ÈÐ) âû÷èñëÿþò äëÿ êàæäîé ìûøè ïî ôîðìóëå: ÈÐ (%) = Ò (îïûò) Ò (êîíòðîëü) × 100, Ò (êîíòðîëü) ãäå Ò òîëùèíà ïîäóøå÷êè ëàïêè â ìì. 13 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ 2.2. Ðåàêöèÿ «òðàíñïëàíòàò ïðîòèâ õîçÿèíà» Ðåàêöèþ «òðàíñïëàíòàò ïðîòèâ õîçÿèíà» (ÐÒÏÕ) âûçûâàþò ó ìûøåé ãèáðèäîâ F1 (CBAõC57Bl/6) ïî ìåòîäó Ford ñ ñîàâò. ïóòåì èíúåêöèè â ïîäóøå÷êó ïðàâîé çàäíåé ëàïû («îïûòíîé») 2×106 êëåòîê ñåëåçåíêè ìûøåé ðîäèòåëüñêîé ëèíèè (ÑÂÀ).  ïîäóøå÷êó ëåâîé çàäíåé ëàïû («êîíòðîëüíóþ») ââîäÿò òàêîå æå êîëè÷åñòâî ñèíãåííûõ ñïëåíîöèòîâ. Èññëåäóåìûé ïðåïàðàò â íåñêîëüêèõ ðàçâåäåíèÿõ èõ ðàñ÷åòà íà êã âåñà ââîäÿò â ïîäóøå÷êó «îïûòíîé» ëàïû îäíîâðåìåííî ñ êëåòêàìè. ×åðåç 7 ñóò ìûøåé çàáèâàþò è îïðåäåëÿþò ìàññó ïîäêîëåííûõ ëèìôîóçëîâ â «îïûòíîé» è «êîíòðîëüíîé» ëàïàõ. ÈÐ âû÷èñëÿþò ïî ôîðìóëå: ÈÐ = âåñ ëèìôîóçëà «îïûòíîé» ëàïêè âåñ ëèìôîóçëà «êîíòðîëüíîé» ëàïêè Êàæäàÿ ãðóïïà ìûøåé âêëþ÷àåò 34 æèâîòíûõ. 2.3. Ïðîëèôåðàòèâíàÿ àêòèâíîñòü ëèìôîèäíûõ êëåòîê ÷åëîâåêà Ïðÿìóþ ìèòîãåííóþ àêòèâíîñòü ïðåïàðàòà èññëåäóþò â êóëüòóðå ÌÏÊ çäîðîâûõ ëþäåé, âûäåëåííûõ ïî ìåòîäó Boyum. ÌÏÊ â äâóêðàòíîé êîíöåíòðàöèè 2×106 êëåòîê íà ìë âíîñÿò ïî 100 ìêë â ëóíêè ïëîñêîäîííûõ êóëüòóðàëüíûõ ìèêðîïëàíøåò. Äîïîëíèòåëüíî âíîñÿò èññëåäóåìûé ïðåïàðàò â ðàçëè÷íûõ êîíöåíòðàöèÿõ. Êóëüòóðàëüíàÿ ñðåäà RPMI-1640, ñîäåðæàùàÿ 10% ñûâîðîòêè IV ãðóïïû êðîâè ÷åëîâåêà (ÀÂ-ñûâîðîòêè) èëè ñûâîðîòêè ýìáðèîíîâ êîðîâ (ÑÝÊ) è àíòèáèîòèêè (ïåíèöèëëèí 100 ÅÄ/ìë, ñòðåïòîìèöèí 100 ìêã/ ìë). Êëåòêè èíêóáèðóþò â òå÷åíèå 48 ÷ ïðè 37îÑ â àòìîñôåðå âîçäóõà ñ 5% ÑÎ2. Êóëüòóðû êëåòîê ñòàâÿò â 34 ïîâòîðàõ. Ñèíòåç ÄÍÊ â êóëüòóðå ÌÏÊ îöåíèâàþò ïî âêëþ÷åíèþ ìåòèë3 Í-òèìèäèíà, âíîñèìîãî íà ïîñëåäóþùèå 18 ÷ èíêóáàöèè èç ðàñ÷åòà 37 Êáê íà ëóíêó. Êëåòêè ïåðåíîñÿò íà áóìàæíûå ôèëüòðû è îòìûâàþò. Ñ÷åò ðàäèîàêòèâíîñòè ïðîâîäÿò â áåòàñ÷åò÷èêå. 14 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ Èììóíîìîäóëèðóþùåå äåéñòâèå ïðåïàðàòà (ôàðìàêîëîãè÷åñêîãî ñðåäñòâà) îöåíèâàëè ïî èíäåêñó ñòèìóëÿöèè (ÈÑ) ðåàêöèè ïðîëèôåðàöèè ÌÏÊ, êîòîðûé ðàññ÷èòûâàåòñÿ ïî ôîðìóëå: ÈÑ = îïûò / êîíòðîëü, ãäå: îïûò óðîâåíü ñèíòåçà ÄÍÊ (èìï./ìèí) â ÌÏÊ â ïðèñóòñòâèè èññëåäóåìîãî ïðåïàðàòà, à êîíòðîëü óðîâåíü ñèíòåçà ÄÍÊ (èìï./ìèí) â îòñóòñòâèè ïðåïàðàòà. Àëüòåðíàòèâîé ðàäèàöèîííîé ìåòêè ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàíèå ÌÒÒ (äèìåòèëòèàçîëèë äèôåíèëòåòðàçîëèÿ áðîìèäà) èëè åãî ïðîèçâîäíûõ äëÿ îöåíêè èíòåíñèâíîñòè ïðîëèôåðàöèè ëèìôîèäíûõ êëåòîê in vitro. 2.4. Ïîñòàíîâêà êîñòèìóëÿòîðíîãî ïðîëèôåðàòèâíîãî òåñòà Îöåíêó ñïîñîáíîñòè èññëåäóåìîãî ïðåïàðàòà âëèÿòü íà ïðîëèôåðàöèþ ëèìôîöèòîâ ÷åëîâåêà, âûçâàííóþ ïîëèêëîíàëüíûì Ò-êëåòî÷íûì àêòèâàòîðîì ôèòîãåìàããëþòèíèíîì (ÔÃÀ), ïðîâîäÿò â êóëüòóðå ÌÏÊ. Ïðè ýòîì îäíîâðåìåííî ñ èññëåäóåìûì ïðåïàðàòîì â êóëüòóðû ÌÏÊ âíîñÿò îïòèìàëüíóþ (10 ìêã/ìë) èëè ñóáîïòèìàëüíóþ (0,5 ìêã/ìë) êîíöåíòðàöèþ àêòèâàòîðà. Ïîñòàíîâêó ïðîëèôåðàòèâíîãî òåñòà ïðîâîäÿò, êàê îïèñàíî â ï. 3.1. Êóëüòóðû êëåòîê ñòàâÿò â 34 ïîâòîðàõ. Êîíòðîëüíûå âàðèàíòû âêëþ÷àþò ÌÏÊ, êóëüòèâèðîâàííûå òîëüêî â ïðèñóòñòâèè ÔÃÀ. Äðóãîé âàðèàíò ïîñòàíîâêè êîñòèìóëÿòîðíîãî ïðîëèôåðàòèâíîãî òåñòà ïðåäïîëàãàåò îöåíêó äåéñòâèÿ ïðåïàðàòà íà ïðîëèôåðàöèþ ëèìôîèäíûõ êëåòîê ÷åëîâåêà ïîä äåéñòâèåì àëëîãåííûõ êëåòîê-ñòèìóëÿòîðîâ, ñìåøàííûõ â îòíîøåíèè 1:1 èëè 1: 0,02. Ïîñòàíîâêó òåñòà ïðîâîäÿò êàê îïèñàíî â ï. 2.5. Ñìåñü êëåòîê êóëüòèâèðóþò â òå÷åíèå 4 ñóò, çàòåì íà 1618 ÷ âíîñÿò ìåòèë-3Í-òèìèäèí èç ðàñ÷åòà 37 ÊÁê (1 ìèêðîêþðè) íà ëóíêó. Êëåòêè ïåðåíîñÿò íà áóìàæíûå ôèëüòðû è îòìûâàþò. Ñ÷åò ðàäèîàêòèâíîñòè ïðîâîäÿò â áåòà-ñ÷åò÷èêå. 15 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ Èììóíîìîäóëèðóþùåå äåéñòâèå ôàðìàêîëîãè÷åñêîãî ñðåäñòâà îöåíèâàþò ïî ÈÑ (ñì. 2.3.), ãäå êîíòðîëåì ñëóæèò óðîâåíü ÄÍÊ â êóëüòóðå ÌÏÊ, àêòèâèðîâàííûõ ñòèìóëÿòîðîì. 2.5. Îáðàçîâàíèå öèòîòîêñè÷åñêèõ Ò-ëèìôîöèòîâ ÷åëîâåêà in vitro 2.5.1. Ñìåøàííàÿ êóëüòóðà ëèìôîöèòîâ ÷åëîâåêà Öèòîòîêñè÷åñêèå Ò-ëèìôîöèòû ÷åëîâåêà èíäóöèðóþò â àëëîãåííîé îäíîíàïðàâëåííîé ñìåøàííîé êóëüòóðå ëèìôîöèòîâ (ÑÊË). Äëÿ ýòîãî âûäåëÿþò ÌÏÊ îò äâóõ çäîðîâûõ ëþäåé. Êëåòêè îäíîãî èç íèõ èñïîëüçóþò â êà÷åñòâå «ñòèìóëÿòîðîâ». Äëÿ ýòîãî èõ îáëó÷àþò (20 Ãð) èëè îáðàáàòûâàþò ìèòîìèöèíîì Ñ (50 ìêã/ìë, 37°Ñ, 30 ìèí â òåìíîòå), çàòåì òùàòåëüíî îòìûâàþò ïèòàòåëüíîé ñðåäîé RPMI-1640, ñîäåðæàùåé 10% À ñûâîðîòêè. Êëåòêèýôôåêòîðû îäíîãî äîíîðà è êëåòêè-ñòèìóëÿòîðû äðóãîãî äîíîðà â êîíöåíòðàöèÿõ 1 ìëí â ìë ñìåøèâàþò â ñîîòíîøåíèè 1:1 è êóëüòèâèðóþò â ïèòàòåëüíîé ñðåäå RPMI-1640, ñîäåðæàùåé 10% ÀÂ-ñûâîðîòêè (èëè ÝÒÑ) è àíòèáèîòèêè (ïåíèöèëëèí 100 ÅÄ/ìë, ñòðåïòîìèöèí 100 ìêã/ ìë) â òå÷åíèå 5 ñóò (äëÿ îöåíêè ïðîëèôåðàòèâíîãî îòâåòà) èëè 6 7 ñóò (äëÿ îöåíêè îáðàçîâàíèÿ öèòîòîêñè÷åñêèõ Ò-ëèìôîöèòîâ). Èññëåäóåìîå ôàðìàêîëîãè÷åñêîå ñðåäñòâî âíîñÿò â íåñêîëüêèõ ðàçâåäåíèÿõ â ëóíêè ìèêðîïëàòû (èëè êóëüòóðàëüíûå ôëàêîíû), ñîäåðæàùèå êëåòêè-ýôôåêòîðû è ñòèìóëÿòîðû. Ïî îêîí÷àíèþ êóëüòèâèðîâàíèÿ êëåòêè-ýôôåêòîðû îòìûâàþò îäèí ðàç öåíòðèôóãèðîâàíèåì, ðåñóñïåíäèðóþò â êîíöåíòðàöèè 4 ìëí â ìë â ïîëíîé ïèòàòåëüíîé ñðåäå è èñïîëüçóþò äëÿ ïîñòàíîâêè öèòîòîêñè÷åñêîãî òåñòà. 16 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ 2.5.2. Öèòîòîêñè÷åñêèé òåñò Àíòèãåí-ñïåöèôè÷åñêóþ öèòîòîêñè÷íîñòü êëåòîê-ýôôåêòîðîâ, ïîëó÷åííûõ â ÑÊË, îïðåäåëÿþò â öèòîòîêñè÷åñêîì òåñòå ïðîòèâ êëåòîê-ìèøåíåé.  êà÷åñòâå êëåòîê-ìèøåíåé îáû÷íî èñïîëüçóþò íåîáëó÷åííûå ÌÏÊ, èñïîëüçîâàííûå â êà÷åñòâå êëåòîê-ñòèìóëÿòîðîâ â ÑÊË. Êëåòêè-ìèøåíè (23 ìëí/ìë) èíêóáèðóþò â ïîëíîé ïèòàòåëüíîé ñðåäå â òå÷åíèå 3 ñóò ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå, çàòåì âíîñÿò ÔÃÀ (10 ìêã/ìë) è èíêóáèðóþò äîïîëíèòåëüíî â òå÷åíèå 3 ñóò ïðè +37îÑ. Çàòåì èõ îòìûâàþò îäíîêðàòíî öåíòðèôóãèðîâàíèåì è ìåòÿò 51Cr. Äëÿ ýòîãî ê îñàäêó êëåòîê-ìèøåíåé (2 ìëí ëèìôîáëàñòîâ, èíäóöèðîâàííûõ ÔÃÀ, â 0,1 ìë ïîëíîé ïèòàòåëüíîé ñðåäû) âíîñÿò Na51Cr04 (500 ìèêðîêþðè â 0,5 ìë) íà 1 ÷ ïðè +37îÑ. Çàòåì êëåòêè-ìèøåíè îòìûâàþò 3 ðàçà è ðåñóñïåíäèðóþò â ïîëíîé ïèòàòåëüíîé ñðåäå äî êîíöåíòðàöèè 100 òûñ. â ìë.  êðóãëîäîííûå ëóíêè ìèêðîïëàíøåò âíîñÿò ïî 100 ìêë ìå÷åíûõ êëåòîê-ìèøåíåé è 100 ìêë êëåòîê-ýôôåêòîðîâ. Êëåòêè-ýôôåêòîðû ïðåäâàðèòåëüíî ðàçâîäÿò òàê, ÷òîáû ïîëó÷èòü èõ ñîîòíîøåíèå ñ êëåòêàìè-ìèøåíÿìè 80:1, 40:1, 20:1. Âîçìîæíî èñïîëüçîâàòü ñîîòíîøåíèÿ 100: 1, 50:1, 25:1. Êàæäûé âàðèàíò âêëþ÷àåò 34 ïîâòîðà. Ñìåñü êëåòîê öåíòðèôóãèðóþò â ìèêðîïëàíøåòå ïðè 1000 îá./ìèí â òå÷åíèå 5 ìèí, çàòåì èíêóáèðóþò â òå÷åíèå 4 ÷ ïðè +37îÑ.  êà÷åñòâå êîíòðîëåé îöåíèâàþò óðîâíè «ñïîíòàííîãî» ëèçèñà (â ëóíêàõ èíêóáèðóþò ñìåñü êëåòîê-ìèøåíåé â ïèòàòåëüíîé ñðåäå) è «òîòàëüíîãî» ëèçèñà (â ëóíêàõ êëåòêè-ìèøåíè èíêóáèðóþò ñ 0,1 N ðàñòâîðîì ñîëÿíîé êèñëîòû èëè 2% ðàñòâîðîì äîäåöèëñóëüôàòà íàòðèÿ).  êîíöå èíêóáàöèè ìèêðîïëàíøåòó âíîâü öåíòðèôóãèðóþò â òå÷åíèå 510 ìèí ïðè 1000 îá./ ìèí. Èç ëóíîê îòáèðàþò ïî 150 ìêë ñóïåðíàòàíòà è ïåðåíîñÿò â ïëàñòìàññîâûå ïðîáèðêè Ýïïåíäîðôà. Ðàäèîàêòèâíîñòü ïðîá èçìåðÿëè â ãàììà-ñ÷åò÷èêå. (Âîçìîæíî îïðåäåëåíèå ðàäèîàêòèâíîñòè â áåòà-ñ÷åò÷èêå. Äëÿ ýòîãî 100 ìêë ñóïåðíàòàíòà îòáèðàþò èç ëóíîê è ïåðåíîñÿò â ñ÷åòíûå ôëàêîíû ñ 23 ìë ãîìîãåííîé ñèñòåìû, íàïðèìåð, ÆÑ-8). 17 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ Ïðîöåíò ñïåöèôè÷åñêîãî ëèçèñà ïîäñ÷èòûâàëè ïî ôîðìóëå: % ëèçèñà = èìï./ìèí (îïûò)èìï./ìèí (ñïîíò. ëèçèñ) èìï./ìèí (òîòàë. ëèçèñ) èìï./ìèí (ñïîíò. ëèçèñ) × 100 Ñïîíòàííûé ëèçèñ íå äîëæåí ïðåâûøàòü 1520% îò çíà÷åíèÿ òîòàëüíîãî ëèçèñà êëåòîêìèøåíåé. Âìåñòî Na 51 Cr0 4 êëåòêè-ìèøåíè ìîæíî ìåòèòü 125 J-dUTP (éîä-äåçîêñèóðèäèí òðèôîñôàòîì) èëè êàðáîêñèôëþîðåñöåèíîì ñ ïîñëåäóþùèì ó÷åòîì ðåàêöèè íà ãàììàñ÷åò÷èêàõ èëè ëþìèíåñöåíòíîì ìèêðîñêîïå ñîîòâåòñòâåííî. Îöåíêó äåéñòâèÿ èññëåäóåìîãî ïðåïàðàòà ïðîâîäÿò íà îñíîâàíèè ñðàâíåíèÿ çíà÷åíèé % ëèçèñà ó êëåòîê-ýôôåêòîðîâ, ïîëó÷åííûõ â ïðèñóòñòâèè è îòñóòñòâèè èñïûòóåìîãî ôàðìàêîëîãè÷åñêîãî ñðåäñòâà. 3. Îöåíêà âëèÿíèÿ ïðåïàðàòà íà àêòèâíîñòü åñòåñòâåííûõ êèëëåðîâ 3.1. Ïðîëèôåðàòèâíàÿ àêòèâíîñòü åñòåñòâåííûõ êèëëåðíûõ êëåòîê ÷åëîâåêà Îäíèì èç íîâûõ ìåòîäîâ îöåíêè àêòèâíîñòè åñòåñòâåííûõ êèëëåðíûõ (ÅÊ) êëåòîê ÷åëîâåêà ÿâëÿåòñÿ êðàòêîñðî÷íàÿ (â òå÷åíèå 3 äíåé) ïðîëèôåðàöèÿ ëèìôîèäíûõ êëåòîê ÷åëîâåêà ïîä äåéñòâèåì ïðåïàðàòîâ èíòåðëåéêèíà-2 (ÈË-2). Ïîñòàíîâêó òåñòà ïðîâîäÿò, êàê îïèñàíî â ï. 2.3. Ïðè ýòîì àêòèâàöèþ êëåòîê ïðîâîäÿò, ïðåïàðàòîì ðåêîìáèíàíòíîãî ÈË-2 (ðÈË-2) â êîíå÷íûõ êîíöåíòðàöèÿõ 10 è 100 ÌÅ/ìë. Îäíîâðåìåííî â ëóíêè ñ ÌÏÊ âíîñÿò èñïûòóåìûé ïðåïàðàò (íåñêîëüêî ðàçâåäåíèé). ×åðåç 48 ÷ íà ïîñëåäóþùèå 1618 ÷ âíîñÿò ìåòèë3 Í-òèìèäèí èç ðàñ÷åòà 37 ÊÁê (1 ìèêðîêþðè) íà ëóíêó. Êëåòêè ïåðåíîñÿò íà áóìàæíûå ôèëüòðû è îòìûâàþò. Ñ÷åò ðàäèîàêòèâíîñòè ïðîâîäÿò â áåòà-ñ÷åò÷èêå. 18 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ Îöåíêó èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêîãî ñðåäñòâà ïðîâîäÿò íà îñíîâàíèè ðàñ÷åòà ÈÑ, êàê îïèñàíî â ðàçäåëå 2.3. 3.2. Öèòîòîêñè÷åñêàÿ àêòèâíîñòü ÅÊ êëåòîê ÷åëîâåêà Ñòàíäàðòíîé ìîäåëüþ ôóíêöèîíàëüíîé õàðàêòåðèñòèêè ÅÊ êëåòîê ÷åëîâåêà ÿâëÿåòñÿ îïðåäåëåíèå èõ öèòîòîêñè÷åñêîé àêòèâíîñòè ïðîòèâ îïóõîëåâûõ êëåòîê ëèíèè Ê-562 (êëåòêè ýðèòðîëåéêåìèè ÷åëîâåêà), âûñîêî÷óâñòâèòåëüíûõ ê ëèòè÷åñêîìó äåéñòâèþ ÅÊ êëåòîê. 19 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ Äëÿ âûÿâëåíèÿ ìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ èññëåäóåìûõ ïðåïàðàòîâ íà ôóíêöèîíàëüíóþ àêòèâíîñòü ÅÊ êëåòîê ñâåæåâûäåëåííûå ëèìôîèäíûå êëåòêè (ÌÏÊ) çäîðîâûõ ëþäåé èíêóáèðóþò â êîíöåíòðàöèè 23 ìëí/ìë â ïèòàòåëüíîé ñðåäå RPMI-1640, ñîäåðæàùåé 1% ÀÂ-ñûâîðîòêè èëè 1% ÝÒÑ, ñ ðàçëè÷íûìè ðàçâåäåíèÿìè ïðåïàðàòà â òå÷åíèå 4 ÷ â àòìîñôåðå âîçäóõà ñ 5% ÑÎ2 . ( ñëó÷àå îæèäàíèÿ âûñîêîãî ýôôåêòà âîçäåéñòâèÿ ïðåïàðàòà íà àêòèâíîñòü ÅÊ êëåòîê âðåìÿ èíêóáàöèè ìîæíî ñîêðàòèòü äî 1 ÷ è äàæå äî 30 ìèí). Çàòåì êëåòêè îòìûâàþò îäíîêðàòíî öåíòðèôóãèðîâàíèåì è ðåñóñïåíäèðóþò â ñðåäå RPMI-1640 ñ 5% ÀÂ-ñûâîðîòêè èëè ÝÒÑ äî êîíöåíòðàöèé 8, 4 è 2 ìëí/ìë. Îäíîâðåìåííî ãîòîâÿò êëåòêè-ìèøåíè. Äëÿ ýòîãî êëåòêè ëèíèè Ê-562 ìåòÿò 51Cr â òå÷åíèå 1 ÷ è îòìûâàþò, êàê îïèñàíî â ðàçäåëå 2.5.2. Çàòåì â ëóíêè êðóãëîäîííûõ ìèêðîïëàíøåò âíîñÿò ïî 100 ìêë, ñîäåðæàùèõ 10 òûñ. êëåòîêìèøåíåé, è 100 ìêë êëåòîê-ýôôåêòîðîâ (ÌÏÊ çäîðîâûõ ëþäåé, èíêóáèðîâàííûõ ñ èññëåäóåìûì ïðåïàðàòîì). Ïîëó÷àåìîå ñîîòíîøåíèå êëåòîê-ìèøåíåé è êëåòîê-ýôôåêòîðîâ ñîñòàâëÿåò 80:1, 40:1, 20:1. Êàæäûé âàðèàíò âêëþ÷àåò 34 ïîâòîðà. Ìèêðîïëàíøåòó ñî ñìåñüþ êëåòîê öåíòðèôóãèðóþò ïðè 1000 îá./ìèí â òå÷åíèå 5 ìèí, çàòåì èíêóáèðóþò â òå÷åíèå 4 ÷ ïðè +37°Ñ â àòìîñôåðå âîçäóõà ñ 5% ÑÎ2 . Ïîñëå èíêóáàöèè ìèêðîïëàíøåòó âíîâü öåíòðèôóãèðóþò, çàòåì îòáèðàþò ïî 100 èëè 150 ìêë ñóïåðíàòàíòà è ïåðåíîñÿò â ïëàñòìàññîâûå ïðîáèðêè Ýïïåíäîðôà äëÿ ó÷åòà ðàäèîàêòèâíîñòè îáðàçöîâ, êàê îïèñàíî â ï. 2.5.2. Ïîñòàíîâêó êîíòðîëåé ñïîíòàííîãî è «òîòàëüíîãî» ëèçèñà êëåòîê-ìèøåíåé, ó÷åò ðàäèîàêòèâíîñòè, à òàêæå ðàñ÷åò ïðîöåíòà öèòîòîêñè÷íîñòè êëåòîê-ýôôåêòîðîâ ïðîâîäÿò, êàê îïèñàíî â ï. 2.5.2. Öèòîòîêñè÷íîñòü ÅÊ êëåòîê (è äðóãèõ öèòîòîêñè÷åñêèõ êëåòîê) ìîæíî âûðàçèòü â ëèòè÷åñêèõ åäèíèöàõ (ËÅ), ðàññ÷èòûâàåìûõ ïî êîìïüþòåðíîé ïðîãðàììå êàê ñîäåðæàíèå â 1 ìëí êëåòîê-ýôôåêòîðîâ öèòîòîêñè÷åñêèõ êëåòîê, âûçûâàþùèõ 50% ëèçèñ 5 òûñ. (èëè 10 òûñ.) êëåòîê-ìèøåíåé, íàõîäÿùèõñÿ â ëóíêå. 20 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ Äëÿ õàðàêòåðèñòèêè èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ èñïûòóåìîãî ïðåïàðàòà ñðàâíèâàþò óðîâíè öèòîòîêñè÷íîñòè ÌÏÊ, èíêóáèðîâàííûõ ïåðåä ïîñòàíîâêîé öèòîòîêñè÷åñêîãî òåñòà ñ ïðåïàðàòîì èëè áåç íåãî. Àêòèâíîñòü åñòåñòâåííûõ êèëëåðíûõ (ÅÊ) êëåòîê ìûøåé îïðåäåëÿåòñÿ ïî ñïîñîáíîñòè êëåòîê ëèìôîóçëîâ (èëè ñåëåçåíêè) âûçûâàòü ëèçèñ ðàäèîàêòèâíî-ìå÷åíûõ îïóõîëåâûõ êëåòîê ëèíèè YAC-1. Ïîñòàíîâêà òåñòà ïðîâîäèòñÿ àíàëîãè÷íî îïèñàíèþ äëÿ õàðàêòåðèñòèêè ÅÊ êëåòîê ÷åëîâåêà 21 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ 3.3 Àíòèòåëîçàâèñèìàÿ êëåòî÷íàÿ öèòîòîêñè÷íîñòü åñòåñòâåííûõ êèëëåðîâ ÷åëîâåêà Àíòèòåëîçàâèñèìàÿ êëåòî÷íàÿ öèòîòîêñè÷íîñòü (ÀÇÊÖ) ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé äðóãîé òèï öèòîòîêñè÷íîñòè ÅÊ êëåòîê ÷åëîâåêà, íå ñâÿçàííîé ñ èõ ïðÿìîé öèòîòîêñè÷íîñòüþ.  êà÷åñòâå êëåòîê-ìèøåíåé îáû÷íî èñïîëüçóþò êóëüòèâèðóåìûå îïóõîëåâûå êëåòêè ÷åëîâåêà, íå ÷óâñòâèòåëüíûå (èëè ñëàáî÷óâñòâèòåëüíûå) ê ïðÿìîìó öèòîòîêñè÷åñêîìó äåéñòâèþ ÅÊ êëåòîê (Raji, Daudi, U-937, CEM-E5 è äð.). Ïðè îöåíêå äåéñòâèÿ èññëåäóåìûõ ïðåïàðàòîâ èññëåäîâàíèÿ ïðîâîäÿò àíàëîãè÷íî îïèñàíèþ â ï. 3.2. Îñîáåííîñòüþ ïîñòàíîâêè ÀÇÊÖ ÿâëÿåòñÿ ïðåäâàðèòåëüíîå âíåñåíèå àíòèñûâîðîòîê (êðîëè÷üèõ, êîçüèõ), ñîäåðæàùèõ àíòèòåëà ê èñïîëüçîâàííûì îïóõîëåâûì êëåòêàì, íà 30 ìèí ïðè +37°Ñ â ëóíêè êðóãëîäîííûõ ìèêðî-ïëàíøåò ñ ðàäèîàêòèâíî-ìå÷åíûìè îïóõîëåâûìè êëåòêàìè-ìèøåíÿìè. Êîíå÷íîå ðàçâåäåíèå òåðìîèíàêòèâèðîâàííîé àíòèñûâîðîòêè (èëè êîíòðîëüíîé íîðìàëüíîé ñûâîðîòêè òîãî æå âèäà æèâîòíîãî) äîëæíî áûòü íå ìåíåå 1:100, ïðè êîòîðîì îíè íå îáëàäàþò ïðÿìîé öèòîòîêñè÷íîñòüþ ïðîòèâ êëåòîê-ìèøåíåé. Çàòåì êëåòêè-ýôôåêòîðû (ÌÏÊ çäîðîâûõ ëþäåé, ïðåèíêóáèðîâàííûõ ñ èññëåäóåìûì ïðåïàðàòîì) âíîñÿò ê êëåòêàì-ìèøåíÿì òàê, ÷òîáû ïîëó÷èòü ñîîòíîøåíèå Ý/Ì 40:1 è 20:1. (Ñîîòíîøåíèÿ êëåòîê-ýôôåêòîðîâ è êëåòîê-ìèøåíåé ìîæåò áûòü â 2 ðàçà óâåëè÷åíî èëè óìåíüøåíî â çàâèñèìîñòè îò ÷óâñòâèòåëüíîñòè êëåòîêìèøåíåé è ñòåïåíè àêòèâàöèè êëåòîê-ýôôåêòîðîâ èññëåäóåìûì ïðåïàðàòîì). Âðåìÿ èíêóáàöèè êëåòîê-ýôôåêòîðîâ è êëåòîê-ìèøåíåé â ïðèñóòñòâèè ïðîòèâîîïóõîëåâûõ àíòèòåë 6 ÷ ïðè +37îÑ â àòìîñôåðå âîçäóõà ñ 5% ÑÎ2. Êàæäûé âàðèàíò òåñòèðóåìûõ êëåòîê ñòàâÿò â 34 ïîâòîðàõ. Ñïîíòàííûé è «òîòàëüíûé» êîíòðîëè öèòîòîêñè÷íîñòè, à òàêæå ó÷åò ðàäèîàêòèâíîñòè ïðîá è ðàñ÷åò öèòîòîêñè÷íîñòè äëÿ êàæäîãî âàðèàíòà êëåòîêýôôåêòîðîâ ïðîâîäÿò, êàê îïèñàíî â ï. 2.5.2. Ðàñ÷åò «ñïåöèôè÷åñêîé öèòîòîêñè÷íîñòè» (% öèòîòîêñè÷íîñòè êëåòîê-ýôôåêòîðîâ ÀÇÊÖ) ïðîâîäÿò ïî ôîðìóëå: 22 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ % ÖÒÀ ýôôåêòîðîâ ÀÇÊÖ = % ÖÒÀ (+ àíòèñûâîðîòêà) % ÖÒÀ (+ íîðì. ñûâîðîòêè) % ÖÒÀ ýôôåêòîðîâ ÀÇÊÖ ðàññ÷èòûâàåòñÿ äëÿ êàæäîãî âàðèàíòà êëåòîê-ýôôåêòîðîâ (îáðàáîòàííûõ èëè íå îáðàáîòàííûõ èññëåäóåìûì ïðåïàðàòîì). Äîïóñêàåòñÿ ó÷åò öèòîòîêñè÷íîñòè êëåòîê-ýôôåêòîðîâ ÀÇÊÖ ïóòåì îêðàñêè ñ âèòàëüíûìè êðàñèòåëÿìè (òðèïàíîâûé ñèíèé, íåéòðàëüíûé êðàñíûé), à òàêæå ïî äûõàòåëüíîìó ìåòàáîëèçìó êëåòîê-ìèøåíåé (ñ ÌÒÒ è åãî ïðîèçâîäíûìè). Äëÿ õàðàêòåðèñòèêè èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ èñïûòóåìîãî ïðåïàðàòà íà êëåòêèýôôåêòîðû ÀÇÊÖ ñðàâíèâàëè çíà÷åíèÿ % ÖÒÀ äëÿ ÌÏÊ, èíêóáèðîâàííûõ ñ ïðåïàðàòîì ïåðåä âíåñåíèåì ïðîòèâîîïóõîëåâûõ àíòèòåë, è ÌÏÊ, íå èíêóáèðîâàííûõ ñ íèì. 4. Âëèÿíèå ïðåïàðàòà íà ôàãîöèòàðíîå çâåíî èììóíèòåòà 4.1. Îïðåäåëåíèå ôàãîöèòàðíîé àêòèâíîñòè íåéòðîôèëîâ ÷åëîâåêà Äëÿ îöåíêè àíòèáàêòåðèàëüíîé (ôàãîöèòàðíîé, áàêòåðèöèäíîé) àêòèâíîñòè ôàãîöèòîâ ÷åëîâåêà èñïîëüçóþò ïîëèìîðôíî-ÿäåðíûå íåéòðîôèëû (ÏÌÍ) êðîâè ÷åëîâåêà, âûäåëåííûå ïî Boyum íà ãðàäèåíòå ïëîòíîñòè ôèêîëë-âåðîãðàôèí ñ ïîñëåäóþùèì óäàëåíèåì èç îñàäêà, ñîäåðæàùåãî íåéòðîôèëû, ýðèòðîöèòîâ ïóòåì äîáàâëåíèÿ 0,87% ðàñòâîðîì õëîðèñòîãî àììîíèÿ ïðè +37îÑ â òå÷åíèå 57 ìèí è îòìûâàíèåì ïèòàòåëüíîé ñðåäîé, ñîäåðæàùåé 10% ÀÂ-ñûâîðîòêè. ×èñòîòà òàêèõ íåéòðîôèëîâ îáû÷íî ñîñòàâëÿåò 8892%. Âîçìîæíî èñïîëüçîâàòü è äðóãèå ìåòîäû ïîëó÷åíèÿ íåéòðîôèëîâ êðîâè ÷åëîâåêà äëÿ îöåíêè èõ àíòèáàêòåðèàëüíîé àêòèâíîñòè. 23 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ 4.1.1. Ìèêðîñêîïè÷åñêèé ìåòîä îöåíêè ôàãîöèòîçà Âëèÿíèå èññëåäóåìîãî ïðåïàðàòà íà ôàãîöèòîç áàêòåðèé íåéòðîôèëàìè îöåíèâàþò ïóòåì ìèêðîñêîïè÷åñêîãî ó÷åòà ðåçóëüòàòîâ ðåàêöèè. Äëÿ ýòîãî ñìåøèâàþò 1 ìë âçâåñè ÏÌÍ (1 ìëí/ìë), 0,5 ìë âçâåñè áàêòåðèé S. aureus SG 511 (20 ìëí/ìë) è 0,5 ìë ôèçðàñòâîðà, ñîäåðæàùåãî èññëåäóåìûé ïðåïàðàò â ðàçëè÷íûõ êîíöåíòðàöèÿõ. Ñìåñü èíêóáèðóþò ïðè ïîìåøèâàíèè â òå÷åíèå 30 ìèí ïðè +37°Ñ. Ïðèãîòàâëèâàþò ìàçêè íà ñòåêëå, ôèêñèðóþò èõ è îêðàøèâàþò ïî Ðîìàíîâñêîìó Ãèìçà.  ìàçêàõ ïîäñ÷èòûâàþò ïî 200 íåéòðîôèëîâ, ñîäåðæàùèõ èëè íå ñîäåðæàùèõ áàêòåðèè. Ïîëó÷åííûå äàííûå âûðàæàþò â âèäå ôàãîöèòàðíîãî ïîêàçàòåëÿ (% ôàãîöèòîâ (íåéòðîôèëîâ è ìîíîöèòîâ), ñîäåðæàùèõ áàêòåðèè) è ôàãîöèòàðíîãî èíäåêñà (ñðåäíåå ñîäåðæàíèå ôàãîöèòèðîâàííûõ áàêòåðèé â ðàñ÷åòå íà îäèí ôàãîöèò). Âìåñòî áàêòåðèé ìîæíî èñïîëüçîâàòü ÷àñòèöû ëàòåêñà ðàçìåðîì îêîëî 1,21,5 ìêì. 4.1.2. Ðàäèîìåòðè÷åñêèé ìåòîä îöåíêè ôàãîöèòîçà Áàêòåðèàëüíóþ âçâåñü S. aureus SG 511 âûðàùèâàþò â òå÷åíèå 16 ÷ â 10 ìë ìÿñîïåïòîííîãî ïèòàòåëüíîãî áóëüîíà â ïðèñóòñòâèè 9,2 ÌÁê ìåòèë- 3Í-òèìèäèíà. Çàòåì âçâåñü ñòàôèëîêîêêà òðèæäû îòìûâàþò ïðè 3000 îá./ìèí è äîâîäÿò íåôåëîìåòðè÷åñêè äî 1 ìëä ìèêðîáíûõ òåë â ìë. Îïñîíèçàöèþ áàêòåðèé ïðîâîäÿò ïðåäâàðèòåëüíî â òå÷åíèå 30 ìèí â ñðåäå RPMI-1640, ñîäåðæàùåé 10% ñûâîðîòêè IV ãðóïïû êðîâè ÷åëîâåêà. 24 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ Ðåàêöèþ ôàãîöèòîçà ñòàâÿò â êðóãëîäîííîé ìèêðîïëàíøåòå.  ëóíêè âíîñÿò 50 ìêë âçâåñè íåéòðîôèëîâ ñ êîíöåíòðàöèåé êëåòîê 10 ìëí/ìë è 100 ìêë ðàñòâîðà èññëåäóåìîãî ïðåïàðàòà â ðàçëè÷íîé êîíöåíòðàöèè. Êàæäûé âàðèàíò ïîñòàíîâêè òåñòà âêëþ÷àåò 34 ïîâòîðà. ×åðåç 30 ìèí èíêóáàöèè ïðè +37îÑ â ëóíêè äîïîëíèòåëüíî âíîñÿò 50 ìêë âçâåñè îïñîíèçèðîâàííûõ áàêòåðèé (100 ìëí/ìë), ñìåñü âíîâü èíêóáèðóþò ïðè +37îÑ â òå÷åíèå 30 ìèí. Ìèêðîïëàíøåòó îõëàæäàþò íà ëüäó, íå ñâÿçàâøèåñÿ ñ íåéòðîôèëàìè áàêòåðèè òðèæäû îòìûâàþò ðàñòâîðîì Âåðñåíà ïóòåì öåíòðèôóãèðîâàíèÿ ìèêðîïëàíøåòû ïðè 1000 îá./ìèí. Îñàäîê êëåòîê, ôàãîöèòèðîâàâøèõ áàêòåðèé, ðåñóñïåíäèðóþò â ðàñòâîðå Âåðñåíà (0,02% ðàñòâîð ÝÄÒÀ) è ïåðåíîñÿò âî ôëàêîíû ñî ñöèíòèëëÿöèîííîé æèäêîñòüþ (ÆÑ-8 èëè ÆÑ-106). Ðàäèîàêòèâíîñòü ïðîá èçìåðÿþò â áåòà-ñ÷åò÷èêå. Ïðîöåíò ôàãîöèòîçà ïîäñ÷èòûâàëè ïî ôîðìóëå: % ôàãîöèòîçà = ðàäèîàêòèâíîñòü áàêòåðèé â íåéòðîôèëàõ ðàäèîàêòèâíîñòü èíòàêòíûõ áàêòåðèé × 100 Èììóíîìîäóëèðóþùåå äåéñòâèå èñïûòóåìîãî ïðåïàðàòà îöåíèâàþò ïóòåì ñðàâíåíèÿ ïîêàçàòåëåé ôàãîöèòîçà íåéòðîôèëîâ, èíêóáèðîâàííûõ â ïðèñóòñòâèè ïðåïàðàòà è áåç íåãî. 25 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ 4.2. Îïðåäåëåíèå áàêòåðèöèäíîñòè íåéòðîôèëîâ ÷åëîâåêà Áàêòåðèöèäíóþ àêòèâíîñòü íåéòðîôèëîâ ÷åëîâåêà îöåíèâàþò ìèêðî-ìåòîäîì. Äëÿ ýòîãî 0,5 ìëí íåéòðîôèëîâ â ñðåäå RPMI-1640, ñîäåðæàùåé 10% ÀÂ-ñûâîðîòêè, èíêóáèðóþò â ëóíêàõ êðóãëîäîííîé ìèêðîïëàíøåòû â òå÷åíèå 20 ìèí ïðè +37îÑ ñ ïðåäâàðèòåëüíî îïñîíèçèðîâàííûìè áàêòåðèÿìè S. aureus øòàììà SG 511 (5 ìëí ìèêðîáíûõ òåë). Êàæäûé âàðèàíò òåñòà âêëþ÷àåò 34 ïîâòîðà. Çàòåì íåéòðîôèëû äâàæäû îòìûâàþò îò íåñâÿçàâøèõñÿ áàêòåðèé è èíêóáèðóþò 4 ÷ â ïðèñóòñòâèè èñïûòóåìîãî ïðåïàðàòà ïðè +37îÑ â àòìîñôåðå âîçäóõà ñ 5% ÑÎ 2 .  êîíöå èíêóáàöèè ñóïåðíàòàíò óäàëÿþò, êëåòêè ëèçèðóþò áèäèñòèëëèðîâàííîé âîäîé. Ëèçàò êëåòîê ñ âûæèâøèìè áàêòåðèÿìè ïåðåíîñÿò â ëóíêè äðóãîé ìèêðîïëàíøåòû ñ ìÿñî-ïåïòîííûì áóëüîíîì (îáùèé îáúåì ïðîáû 200 ìêë). Ïîñëå ïåðåìåøèâàíèÿ ïî 20 ìêë ïðîáû îòáèðàþò è âûñåâàþò íà ÷àøêè Ïåòðè ñ ïèòàòåëüíûì àãàðîì. ×àøêè Ïåòðè èíêóáèðóþò 24 ÷ ïðè +37îÑ, çàòåì ïðîâîäÿò âèçóàëüíûé ó÷åò âûðîñøèõ áàêòåðèàëüíûõ êîëîíèé. Áàêòåðèöèäíóþ àêòèâíîñòü íåéòðîôèëîâ (ÁÀÍ) õàðàêòåðèçóþò èíäåêñîì áàêòåðèöèäíîñòè (ÈÁ), êîòîðûé ðàññ÷èòûâàþò ïî ôîðìóëå: ÈÁ = (1 Ê4/Ê0) × 100%, ãäå Ê4 êîëè÷åñòâî æèâûõ áàêòåðèé (êîëîíèåîáðàçóþùèõ åäèíèö) ÷åðåç 4 ÷ èíêóáàöèè ñ íåéòðîôèëàìè, Ê0 êîëè÷åñòâî æèâûõ áàêòåðèé ïîñëå ñìåøèâàíèÿ ñ íåéòðîôèëàìè. Èììóíîìîäóëèðóþùåå äåéñòâèå èñïûòóåìîãî ïðåïàðàòà îöåíèâàþò ïóòåì ñðàâíåíèÿ ÈÁ íåéòðîôèëîâ (èëè êîëè÷åñòâà âûðîñøèõ ïîñëå èõ ëèçèñà áàêòåðèàëüíûõ êîëîíèé), èíêóáèðîâàííûõ â ïðèñóòñòâèè ïðåïàðàòà è áåç íåãî. 4.3. Îïðåäåëåíèå õåìîòàêñèñà íåéòðîôèëîâ ÷åëîâåêà  ðàáîòå èñïîëüçóþò äâà êëàññè÷åñêèõ ìåòîäà îöåíêè õåìîòàêñèñà íåéòðîôèëîâ êðîâè ÷åëîâåêà, âûçûâàåìîãî áèîëîãè÷åñêè àêòèâíûìè ïðåïàðàòàìè. 26 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ 4.3.1. Õåìîòàêñèñ íåéòðîôèëîâ â êàìåðå Áîéäåíà Îöåíêó ñïîíòàííîãî è èíäóöèðîâàííîãî õåìîòàêñèñà (íàïðàâëåííîãî äâèæåíèÿ) íåéòðîôèëîâ, âûäåëåííûõ ïî Boyum îò çäîðîâûõ ëþäåé, ïðîâîäèëè â êàìåðàõ Áîéäåíà ñ öåëëþëîçíûì ôèëüòðîì (Synpor, ×åõèÿ) ñ äèàìåòðîì ïîð 2,5 ìêì èëè àíàëîãè÷íûì ôèëüòðîì ôèðìû Nucleopore. Äëÿ îáíàðóæåíèÿ ìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ íà õåìîòàêñèñ íåéòðîôèëîâ èññëåäóåìûé ïðåïàðàò âíîñÿò ïðåäâàðèòåëüíî âî âçâåñü íåéòðîôèëîâ (1 ìëí/ìë) â íåñêîëüêèõ ðàçâåäåíèÿõ íà ïèòàòåëüíîé ñðåäå (íàïðèìåð, RPMI-1640) è èíêóáèðóþò â òå÷åíèå 1 ÷ ïðè +37îÑ. Çàòåì îáðàáîòàííûå è íåîáðàáîòàííûå (êîíòðîëüíûå) êëåòêè îòìûâàþò îäíîêðàòíî. Äëÿ èíèöèàöèè õåìîòàêñèñà íåéòðîôèëîâ â íèæíèå ÿ÷åéêè êàìåðû âíîñÿò õåìîàòòðàêòàíòû: ôîðáîë ìèðèñòàò àöåòàò (ÔÌÀ) â êîíöåíòðàöèè 1,010,0 íã/ìë, ôîðìèë ïåïòèäû (FMLP, Nformyl-met-leu-phe; 1,00,1 ìêã/ìë), 1% ðàñòâîð êàçåèíàòà íàòðèÿ èëè êðîëè÷üþ ñûâîðîòêó, àêòèâèðîâàííóþ çèìîçàíîì, è êîíòðîëüíóþ ïèòàòåëüíóþ ñðåäó. Ïîñëå ñáîðêè êàìåðû Áîéäåíà â îòäåëüíûå ÿ÷åéêè åå âåðõíåãî îòñåêà âíîñÿò âçâåñü îáðàáîòàííûõ ïðåïàðàòîì èëè êîíòðîëüíûõ íåéòðîôèëîâ â ïèòàòåëüíîé ñðåäå. Çàïîëíåííûå êàìåðû Áîéäåíà ïîìåùàþò íà 1 ÷ (èëè 2 ÷) ïðè +37îÑ, çàòåì ôèëüòð èçâëåêàþò, ôèêñèðóþò 3 ìèí 96% ýòèëîâûì ñïèðòîì, îêðàøèâàþò â òå÷åíèå 10 ìèí 1% ðàñòâîðîì òðèïàíîâîãî ñèíåãî, ìåòèëåíîâîãî ñèíåãî èëè ïî Ðîìàíîâñêîìó. Êëåòêè, ìèãðèðîâàâøèå íà íèæíþþ ñòîðîíó ôèëüòðà, ïîäñ÷èòûâàþò â 10 ïîëÿõ çðåíèÿ ìèêðîñêîïà ïîä óâåëè÷åíèåì â 280 ðàç. Ïîêàçàòåëåì õåìîòàêñè÷åñêîé àêòèâíîñòè íåéòðîôèëîâ ñëóæèò õåìîòàêñè÷åñêèé èíäåêñ (ÕÈ), èñ÷èñëÿåìûé ïî ôîðìóëå: ÎÊ ÕÈ = × 100% Î ãäå Î ÷èñëî êëåòîê, ìèãðèðîâàâøèõ ÷åðåç ôèëüòð íà õåìîàòòðàêòàíò, Ê ÷èñëî ñïîíòàííî ìèãðèðîâàâøèõ êëåòîê (â ÿ÷åéêå áåç õåìîàòòðàêòàíòà). 27 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ Ïðè îöåíêå ïðÿìîé õåìîòàêñè÷åñêîé àêòèâíîñòè èñïûòóåìîãî ïðåïàðàòà åãî âíîñÿò (â íåñêîëüêèõ ðàçâåäåíèÿõ) â íèæíèå ÿ÷åéêè êàìåðû, çàòåì â âåðõíèå íåîáðàáîòàííûå íåéòðîôèëû. Ïðîâåäåíèå ýêñïåðèìåíòà è ó÷åò ðåçóëüòàòîâ ïðîâîäÿò, êàê îïèñàíî âûøå.  íàñòîÿùåå âðåìÿ øèðîêî èñïîëüçóþò 48-ëóíî÷íûå ìèêðîêàìåðû äëÿ îïðåäåëåíèÿ õåìîòàêñèñà ëåéêîöèòîâ. 4.3.2. Õåìîòàêñèñ íåéòðîôèëîâ ïîä àãàðîçîé  êà÷åñòâå øèðîêî ðàñïðîñòðàíåííîãî ñåé÷àñ ðàññìàòðèâàåòñÿ ìåòîä îïðåäåëåíèÿ õåìîòàêñèñà íåéòðîôèëîâ ïîä àãàðîçîé. Ðàáîòà ïî çàëèâêå àãàðîçû ïðîâîäèòñÿ â ñòåðèëüíûõ óñëîâèÿõ!  ÷àøêó Ïåòðè äèàìåòðîì 40 ìì, ïðåäâàðèòåëüíî èíêóáèðîâàííóþ ñ ïèòàòåëüíîé ñðåäîé (199, RPMI-1640) â òå÷åíèå 30 ìèí ïðè +4îÑ, äîáàâëÿþò 4,2 ìë ïîäîãðåòîé ñìåñè (1:1) 2% àãàðîçû (Sigma, Serva, ...) c ïèòàòåëüíîé ñðåäîé. Ïîñëå îñòûâàíèÿ àãàðîçû ÷àøêè Ïåòðè õðàíÿò äî 2 íåäåëü ïðè +4îÑ âî âëàæíîé êàìåðå äî ïðîâåäåíèÿ èññëåäîâàíèé õåìîòàêñèñà. Íåïîñðåäñòâåííî ïåðåä ïðîâåäåíèåì èññëåäîâàíèé â àãàðîçå ïðîáîéíèêîì èëè øòàìïîì äåëàþò ñòðîåííûå ëóíêè äèàìåòðîì 2 ìì ñ ðàññòîÿíèåì ìåæäó íèìè 56 ìì. Äëÿ îöåíêè ñïîñîáíîñòè èññëåäóåìîãî ïðåïàðàòà îêàçûâàòü ìîäóëèðóþùåå äåéñòâèå íà õåìîòàêñèñ íåéòðîôèëîâ ÷åëîâåêà êëåòêè ïðåäâàðèòåëüíî èíêóáèðóþò ñ íåñêîëüêèìè ðàçâåäåíèÿìè ïðåïàðàòà â òå÷åíèå 1 ÷ ïðè +37îÑ, çàòåì îòìûâàþò îäíîêðàòíî è âíîñÿò â öåíòðàëüíûå ëóíêè, êàê è êîíòðîëüíûå íåîáðàáîòàííûå íåéòðîôèëû.  öåíòðàëüíûå ëóíêè âíîñÿò ïî 10 ìêë íåéòðîôèëîâ (â êîíöåíòðàöèè 20 ìëí/ìë), â ïðàâûå îäèí èç âûøåïåðå÷èñëåííûõ õåìîàòòðàêòàíòîâ, â ëåâûå êîíòðîëüíóþ ïèòàòåëüíóþ ñðåäó199 èëè RPMI-1640. Ïîñëå ýòîãî ÷àøêó Ïåòðè çàêðûâàþò êðûøêîé, èíêóáèðóþò âî âëàæíîé êàìåðå ïðè +37îÑ â òå÷åíèå 2 ÷. Ìèãðàöèþ íåéòðîôèëîâ ïîä ñëîåì àãàðîçû îñòàíàâëèâàþò ïóòåì äîáàâëåíèÿ ìåòàíîëà è ïîñòàíîâêè ÷àøêè Ïåòðè íà íî÷ü ïðè +4îÑ. Ìåòàíîë óäàëÿþò, äîáàâëÿþò 2% ïàðàôîðìàëüäåãèä â òå÷åíèå 1 ÷ (äëÿ ôèêñàöèè êëåòîê). Çàòåì ôèêñàòîð è 28 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ àãàðîçó àêêóðàòíî óäàëÿþò, âûñóøèâàþò êëåòêè íà äíå ÷àøêè Ïåòðè ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå â òå÷åíèå 2 ÷. Íåéòðîôèëû äîêðàøèâàþò êðàñèòåëÿìè (êðàñêà Ìàé-Ãðþíâàëüäà 2 ìèí, êðàñêà Ðîìàíîâñêîãî 10 ìèí), ïðîìûâàþò âîäîé è îöåíèâàþò ìèêðîñêîïè÷åñêè äëèíó ïðîáåãà êëåòîê, ìèãðèðîâàâøèõ â ñòîðîíó õåìîàòòðàêòàíòà (Î) èëè ïèòàòåëüíîé ñðåäû (Ê). Çíà÷åíèå õåìîòàêñè÷åñêîãî èíäåêñà ðàññ÷èòûâàþò, êàê îïèñàíî âûøå. Îá èììóíîìîäåëèðóþùåì äåéñòâèè èññëåäóåìûõ ïðåïàðàòîâ ñóäÿò ïî èçìåíåíèþ çíà÷åíèé ÕÈ (%) ó îáðàáîòàííûõ íåéòðîôèëîâ ïî ñðàâíåíèþ ñ êîíòðîëüíûìè íåîáðàáîòàííûìè. 4.4. Îöåíêà êèñëîðîäçàâèñèìîãî è -íåçàâèñèìîãî ïóòåé áàêòåðèöèäíîãî äåéñòâèÿ ôàãîöèòîâ ÷åëîâåêà  ïîñëåäíåå âðåìÿ øèðîêî èñïîëüçóþò ìåòîäû îöåíêè ñîñòîÿíèÿ áèîõèìè÷åñêèõ ñèñòåì ôàãîöèòîâ (ïðåæäå âñåãî íåéòðîôèëîâ) äëÿ õàðàêòåðèñòèêè ìåòàáîëè÷åñêîé àêòèâíîñòè êëåòîê. Îöåíêó êèñëîðîäçàâèñèìîãî ïóòè áàêòåðèöèäíîñòè íåéòðîôèëîâ ïðîâîäÿò ïî ïðîäóêöèè ñóïåðîêñèäíûõ àíèîíîâ, âûÿâëÿåìûõ â ÍÑÒ-òåñòå ñ íèòðîñèíèì òåòðàçîëèåì èëè ÌÒÒ-òåñòå ñ åãî ðàñòâîðèìûì ïðîèçâîäíûì. Òàêæå âîçìîæíà îöåíêà êèñëîðîäçàâèñèìîãî ïóòè áàêòåðèöèäíîñòè íåéòðîôèëîâ ïî îöåíêå óðîâíÿ ìèåëîïåðîêñèäàçû, ñèíòåçèðóåìûõ àíèîíîâ êèñëîðîäà, ëþìèíîëçàâèñèìîé õåìèëþìèíåñöåíöèè. Êèñëîðîäíåçàâèñèìûé ïóòü îñóùåñòâëåíèÿ áàêòåðèöèäíîñòè íåéòðîôèëîâ ìîæåò áûòü îõàðàêòåðèçîâàí ïî óðîâíþ ñèíòåçèðóåìîãî íåéòðîôèëàìè NO èëè êàòèîííûõ áåëêîâ. Ìåòîäû ïðèåìëåìû äëÿ îöåíêè èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ èñïûòóåìûõ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ ïóòåì ïðîâåäåíèÿ èññëåäîâàíèé ñ êîíòðîëüíûìè íåîáðàáîòàííûìè è îáðàáîòàííûìè íåéòðîôèëàìè, èíêóáèðîâàííûìè ïðåäâàðèòåëüíî ñ èñïûòóåìûìè ïðåïàðàòàìè ïî îáùåïðèíÿòîé ñõåìå. Îïèñàíèå ìåòîäîâ ïðèâîäèòñÿ â ñïåöèàëüíîé ìåòîäè÷åñêîé ëèòåðàòóðå. 29 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ 5. Îöåíêà âëèÿíèÿ ïðåïàðàòà íà ñèñòåìó êîìïëåìåíòà Èçìåíåíèå àêòèâíîñòè ñèñòåìû êîìïëåìåíòà ïîä äåéñòâèåì èññëåäóåìîãî ïðåïàðàòà îöåíèâàþò íà ìîðñêèõ ñâèíêàõ. Äëÿ ýòîãî îòáèðàþò ãðóïïû ïî 46 ìîðñêèõ ñâèíîê âåñîì 300500 ã. Êàæäîé ãðóïïå ìîðñêèõ ñâèíîê ââîäÿò âíóòðèâåííî èññëåäóåìûé ïðåïàðàò â íåñêîëüêèõ êîíöåíòðàöèÿõ. Êîíòðîëüíîé ãðóïïå æèâîòíûõ ââîäÿò ôèçèîëîãè÷åñêèé ðàñòâîð. Äî ââåäåíèÿ ïðåïàðàòà è ÷åðåç 30 ìèí, 4 ÷ (ìîæíî äîïîëíèòåëüíî ââåñòè 1 ÷ è 24 ÷) ïîñëå ââåäåíèÿ èç óøíîé âåíû æèâîòíûõ çàáèðàþò îáðàçöû êðîâè (50 ìêë), ïîñëå ñâåðòûâàíèÿ êðîâè ïðè +37°Ñ ñûâîðîòêó êðîâè îòáèðàþò öåíòðèôóãèðîâàíèåì, ðàçâîäÿò â 10 ðàç ìåäèíàëâåðîíàëîâûì áóôåðíûì ðàñòâîðîì (ÌÂÁ, ðÍ 7,4) è èñïîëüçóþò â òå÷åíèå 12 ÷ äëÿ îïðåäåëåíèÿ àêòèâíîñòè êîìïëåìåíòà ïî 50% ãåìîëèçó ìèêðîìåòîäîì. Äëÿ ýòîãî â êðóãëîäîííûõ ìèêðîïëàíøåòàõ â êîíå÷íîì îáúåìå 100 ìêë ïðèãîòàâëèâàþò ñåðèéíûå äâóêðàòíûå ðàçâåäåíèÿ ñûâîðîòîê æèâîòíûõ.  êà÷åñòâå îòðèöàòåëüíîãî êîíòðîëÿ èñïîëüçóþò ÌÂÁ, â êà÷åñòâå ïîëîæèòåëüíîãî äèñòèëëèðîâàííóþ âîäó. Âî âñå ëóíêè ìèêðîïëàíøåòû âíîñÿò ïî 100 ìêë ãåìñèñòåìû, ñîñòîÿùåé èç ðàâíûõ îáúåìîâ ðàçâåäåííîé ãåìîëèòè÷åñêîé ñûâîðîòêè è 2% âçâåñè ýðèòðîöèòîâ áàðàíà, èíêóáèðîâàííîé ïðåäâàðèòåëüíî â òå÷åíèå 3040 ìèí ïðè +37°Ñ. Ìèêðîïëàíøåíòû èíêóáèðóþò ïðè +37îÑ â òå÷åíèå 3040 ìèí, öåíòðèôóãèðóþò, ñóïåðíàòàíò (100 èëè 50 ìêë) îòáèðàþò è ïåðåíîñÿò â ëóíêè äðóãîé ìèêðîïëàíøåòû. Ó÷åò ñòåïåíè ãåìîëèçà ïðîâîäÿò íà ìèêðîïëàíøåòî÷íîì ñïåêòðîôîòîìåòðå (ÈÔÀ-ðèäåðå) ïðè ÎÄ405. Ðàñ÷åò ñîäåðæàíèÿ ãåìîëèòè÷åñêèõ åäèíèö â ñûâîðîòêå ïðîâîäÿò ãðàôè÷åñêè. 30 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ Îá èììóíîìîäóëèðóþùåì äåéñòâèè ïðåïàðàòà ñóäÿò ïî èçìåíåíèþ óðîâíÿ êîìïëåìåíòà â ñûâîðîòêå ìîðñêèõ ñâèíîê â áëèæàéøèå (20 ìèí 1 ÷) è ïîçäíèå ñðîêè ïîñëå ââåäåíèÿ èññëåäóåìîãî ïðåïàðàòà â ñðàâíåíèè ñ àíàëîãîì.  êà÷åñòâå àíàëîãà ìîæíî èñïîëüçîâàòü èçâåñòíûé ïðåïàðàò òîé æå ãðóïïû, áàêòåðèàëüíûå ïðîäóêòû (ïèðîãåíàë, ëèïîïîëèñàõàðèä è ò.ä.). 6. Õàðàêòåðèñòèêà ëèìôîòîêñè÷íîñòè ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ  êà÷åñòâå ñïåöèàëüíîãî òåñòà èññëåäîâàíèÿ ëèìôîòîêñè÷íîñòè èñïûòóåìîãî ïðåïàðàòà in vitro èñïîëüçóåòñÿ ñëåäóþùèé ïðîòîêîë. ÌÏÊ êðîâè çäîðîâûõ ëþäåé äâàæäû îòìûâàþò áåññûâîðîòî÷íîé ñðåäîé RPMI-1640, ñîäåðæàùåé àíòèáèîòèêè (ïåíèöèëëèí 100 åä./ìë, + ñòðåïòîìèöèí 100 ìêã/ìë, èëè ãåíòàìèöèí 40 ìêã/ìë) è L-ãëþòàìèí (2 ììîëü), è ðåñóñïåíäèðóþò äî êîíå÷íîé êîíöåíòðàöèè 1 ìëí/ìë.  êóëüòóðû êëåòîê îáúåìîì ïî 0,2 ìë âíîñÿò äîïîëíèòåëüíî ïðåïàðàò â 57 äâóêðàòíûõ ðàçâåäåíèÿõ èñõîäíîãî ðàñòâîðà. ÌÏÊ èíêóáèðóþò ñ èññëåäóåìûì ïðåïàðàòîì â òå÷åíèå 18 ÷ â àòìîñôåðå âîçäóõà ñ 5% ÑÎ2. Êàæäûé âàðèàíò ñòàâèòñÿ â òðåõ ïîâòîðàõ. Ïîñëå îêîí÷àíèÿ èíêóáàöèè êëåòêè ðåñóñïåíäèðóþò, èõ æèçíåñïîñîáíîñòü îöåíèâàåòñÿ ìèêðîñêîïè÷åñêè ñ 0,02% òðèïàíîâîãî ñèíåãî (ïðèãîòîâëåííîãî íà çàáóôåðåííîì ôèçðàñòâîðå, ðÍ 7,4 + 0,05% àçèä íàòðèÿ). ËÄ50 èñõîäíîãî ðàñòâîðà ïðåïàðàòà ðàññ÷èòûâàåòñÿ ãðàôè÷åñêè ìåòîäîì «ïðîáèò»-àíàëèçà è ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé åãî êîëè÷åñòâî (èñõîäíîãî ðàñòâîðà), âûçûâàþùåå 50% -þ ãèáåëü ëèìôîèäíûõ êëåòîê ÷åëîâåêà in vitro. Êîñâåííî î òîêñè÷íîñòè èñïûòóåìîãî ôàðìàêîëîãè÷åñêîãî ñðåäñòâà ìîæíî ñóäèòü ïî ìèêðîñêîïè÷åñêîé (â èíâåðòèðîâàííîì èëè ñâåòîâîì ìèêðîñêîïå) îöåíêå æèçíåñïîñîáíîñòè òåñòèðóåìûõ êëåòîê, êóëüòèâèðóåìûõ in vitro. 31 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ ÕÀÐÀÊÒÅÐÈÑÒÈÊÀ ÀËËÅÐÃÈÇÈÐÓÞÙÈÕ ÑÂÎÉÑÒ ÔÀÐÌÀÊÎËÎÃÈ×ÅÑÊÈÕ ÑÐÅÄÑÒ 1. Îöåíêà àíàôèëàêòîãåííîé àêòèâíîñòè ïðåïàðàòà Îöåíêó àíàôèëàêòîãåííîé àêòèâíîñòè èññëåäóåìîãî ïðåïàðàòà ïðîâîäÿò íà ìîäåëè ëåãî÷íîé àíàôèëàêñèè. Äëÿ ýòîãî ìîðñêèõ ñâèíîê âåñîì îêîëî 300 ã ± 50 ã, ïî 6 îñîáåé â ãðóïïå ñåíñèáèëèçèðóþò ïóòåì ïîäêîæíîãî ââåäåíèÿ ïðåïàðàòà â ðàçëè÷íûõ äîçèðîâêàõ. Ïðåïàðàò ïîâòîðíî ââîäÿò âíóòðèìûøå÷íî ÷åðåç 48 è 96 ÷ â òîì æå êîëè÷åñòâå. Îäíà êîíòðîëüíàÿ ãðóïïà æèâîòíûõ ïîëó÷àåò 0,15 ìîëü ðàñòâîðà õëîðèñòîãî íàòðèÿ, äðóãàÿ îâàëüáóìèí â äîçå äî 5 ìã/îñîáü. ×åðåç 2021 äåíü ïîñëå ïîñëåäíåé èíúåêöèè ìîðñêèì ñâèíêàì ââîäÿò ðàçðåøàþùóþ äîçó ïðåïàðàòà â äîçå 3 ìã/îñîáü. Ðåàêöèþ àíàôèëàêñèè îöåíèâàþò ïî âíåøíèì ïðîÿâëåíèÿì (÷àñòîòà äûõàíèÿ, îäûøêó, äèñêîîðäèíàöèÿ ïîõîäêè, âçúåðîøåííîñòü øåðñòè, ïî÷åñûâàíèå íîñà, ñóäîðîãè, ñìåðòü) â ðàííèå (ïåðâûå 510 ìèí), îòäàëåííûå (2 ÷ íàáëþäåíèÿ) è ïîçäíèå (÷åðåç 18 ÷) ñðîêè. Èíòåíñèâíîñòü ðåàêöèè àíàôèëàêñèè îöåíèâàþò ïî ñèñòåìå ++++ â ñîîòâåòñòâèè ñ ïðåäëîæåíèÿìè Weigle. Ïðè ýòîì îòìå÷àþò ñëåäóþùèå âèçóàëüíûå ïðèçíàêè: ++++ ñóäîðîãè æåâàòåëüíûõ ìûøö è êîíå÷íîñòåé, ïàäåíèå íà áîê, ñàìîïðîèçâîëüíûå ìî÷åèñïóñêàíèå è äåôåêàöèÿ, ñìåðòü â òå÷åíèå 27 ìèí; +++ çóä êîæè (ïî÷åñûâàíèå íîñà è çà óøàìè), îäûøêà, ñóäîðîãè, ñàìîïðîèçâîëüíûå ìî÷åèñïóñêàíèå è äåôåêàöèÿ, ïåðèîäè÷åñêè ïàäåíèå íà áîê; ++ çóä êîæè, îäûøêà, åäèíè÷íûå ñóäîðîãè, ñîõðàíÿþùèåñÿ â òå÷åíèå 12 ÷; + êðàòêîâðåìåííûå çóä êîæè, îäûøêà, âîçìîæíû åäèíè÷íûå ñóäîðîãè, ïðîõîäÿùèå â òå÷åíèå 1 ÷. 32 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ Ðàñ÷åò èíòåíñèâíîñòè àíàôèëàêñèè ïðîâîäÿò ïóòåì ñóììèðîâàíèÿ âñåõ áàëëîâ â ãðóïïå, çàòåì äåëåíèÿ ïîëó÷åííîãî ïîêàçàòåëÿ íà êîëè÷åñòâî ìîðñêèõ ñâèíîê. Äëÿ îïðåäåëåíèÿ èíòåíñèâíîñòè àíàôèëàêñèè äëÿ êàæäîé ãðóïïû æèâîòíûõ åå ïîêàçàòåëü äåëÿò íà ïîêàçàòåëü ïîçèòèâíîãî êîíòðîëÿ (+îâàëüáóìèí) è óìíîæàþò íà 100 (%). Èñïûòóåìûé ïðåïàðàò ñ÷èòàþò êàê ñïîñîáíûé âûçûâàòü àíàôèëàêñèþ ïðè èíòåíñèâíîñòè ðåàêöèè (â áàëëàõ) áîëåå 25% îò ïîëîæèòåëüíîãî êîíòðîëÿ. 2. Îöåíêà êîæíîé àíàôèëàêñèè Ìûøåé ëèíèè BALB/c ñåíñèáèëèçèðóþò âíóòðèáðþøèííî èññëåäóåìûì ïðåïàðàòîì â íåñêîëüêèõ äîçàõ, êîòîðûå ââîäÿò 3 ðàçà ÷åðåç 2830 äíåé. Êàæäàÿ ãðóïïà âêëþ÷àåò 810 ìûøåé (ñàìîê) âåñîì 20 ± 2 ã. ×åðåç 7 äíåé ïîñëå ïîñëåäíåé ñåíñèáèëèçèðóþùåé èíúåêöèè ñòðîãî âíóòðèêîæíî â îáúåìå 25 ìêë ââîäÿò ðàçðåøàþùóþ äîçó äâóêðàòíî ðàçâåäåííîãî ïðåïàðàòà. Îäíîâðåìåííî ââîäÿò âíóòðèâåííî (â õâîñòîâóþ âåíó èëè ðåòðîîðáèòàëüíûé ñèíóñ) 200 ìêë 0,5% ðàñòâîðà ñèíåãî Ýâàíñà. ×åðåç 30 ìèí ìûøü óìåðùâëÿþò è âûðåçàþò ó÷àñòîê êîæè äèàìåòðîì îêîëî 8 ìì, ñîîòâåòñòâóþùèé ïðîêðàøåííîìó ïÿòíó â ìåñòå ââåäåíèÿ ñåíñèáèëèçèðóþùåé äîçû ïðåïàðàòà. Ïðîêðàøåííûé ó÷àñòîê êîæè ïîìåùàþò â ïðîáèðêó ñ 1 ìë 1 N ðàñòâîðà ÊÎÍ, èíêóáèðóþò ïðè +37îÑ â òå÷åíèå 1214 ÷ (íà íî÷ü). Çàòåì â ïðîáèðêó âíîñÿò 9 ìë ëèçèðóþùåé ñìåñè 0,6 N ðàñòâîðà Í3ÐÎ4 è àöåòîíà, âçÿòûõ â ñîîòíîøåíèè 5:13. Ïðîáèðêó èíòåíñèâíî âñòðÿõèâàþò è öåíòðèôóãèðóþò. Íà ñïåêòðîôîòîìåòðå (íàïðèìåð, ÑÔ-46) îïðåäåëÿþò îïòè÷åñêóþ ïëîòíîñòü ñóïåðíàòàíòà ïðè 620 íì. Îäíîâðåìåííî ñòðîÿò êàëèáðîâî÷íóþ êðèâóþ ñ îáðàçöàìè, ñîäåðæàùèìè 210 ìêã êðàñèòåëÿ â ìë ëèçèðóþùåé ñìåñè. Ïî êàëèáðîâî÷íîé êðèâîé ãðàôè÷åñêè îïðåäåëÿþò ñîäåðæàíèå êðàñèòåëÿ â êîæå ñåíñèáèëèçèðîâàííûõ ìûøåé. Ðåçóëüòàòû èçìåðåíèé îáðàáàòûâàþò ñòàòèñòè÷åñêè ïî îòäåëüíûì ãðóïïàì ìûøåé. 33 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ 3. Ïðîäóêöèÿ in vitro èììóíîãëîáóëèíà Å ÷åëîâåêà Êðîâü çäîðîâûõ ëþäåé êóëüòèâèðóþò â ïåíèöèëëèíîâûõ ôëàêîíàõ â ðàçâåäåíèè 1:10 ñî ñðåäîé RPMI-1640 (Sigma, ÑØÀ), ñîäåðæàùåé 10% òåðìîèíàêòèâèðîâàííîé ýìáðèîíàëüíîé òåëÿ÷üåé ñûâîðîòêè, 2 ììîëü (300 ìã/ë) L-ãëþòàìèíà, 40 ìêã/ìë ãåíòàìèöèíà, 25 ÅÄ/ìë ãåïàðèíà. Êëåòêè êðîâè êóëüòèâèðóþò â àòìîñôåðå âîçäóõà ñ 5% ÑÎ2 ïðè +37îÑ â òå÷åíèå 5 ñóò. Ïðè îöåíêå ïðÿìîãî äåéñòâèÿ èññëåäóåìîãî ïðåïàðàòà åãî âíîñÿò â êóëüòóðó êëåòîê êðîâè â íåñêîëüêèõ êîíå÷íûõ êîíöåíòðàöèÿõ. Ïðè îöåíêå êîñòèìóëèðóþùåé àêòèâíîñòè ïðåïàðàòà åãî âíîñÿò â êóëüòóðó êëåòîê êðîâè îäíîâðåìåííî ñ ìèòîãåíîì ëàêîíîñà â êîíå÷íîé êîíöåíòðàöèè 15 ìêã/ìë. Ïî îêîí÷àíèè êóëüòèâèðîâàíèÿ ñóïåðíàòàíò êóëüòóð êëåòîê êðîâè ñîáèðàþò öåíòðèôóãèðîâàíèåì è èñïîëüçóþò äëÿ îïðåäåëåíèÿ òîòàëüíîãî IgE ñ ïîìîùüþ êîììåð÷åñêîãî èììóíîôåðìåíòíîãî íàáîðà (íàïðèìåð, ôèðìû «Hoffman La Roshe»). Ïðîâåäåíèå òåñòà îïðåäåëåíèÿ ñóììàðíîãî IgE îñóùåñòâëÿþò â ñîîòâåòñòâèè ñ èíñòðóêöèåé ôèðìû-èçãîòîâèòåëÿ ñ ó÷åòîì îïèñàíèÿ àâòîðîâ-ðàçðàáîò÷èêîâ. Ïîëó÷åííûå äàííûå âûðàæàþò â ÌÅ/ìë ïî îòíîøåíèþ ê òèòðîâàííîìó ñòàíäàðòó ôèðìû. 34 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ ÎÁÙÈÅ ÐÅÊÎÌÅÍÄÀÖÈÈ ÏÎ ÕÀÐÀÊÒÅÐÈÑÒÈÊÅ ÈÌÌÓÍÎÌÎÄÓËÈÐÓÞÙÈÕ ÑÂÎÉÑÒ ÔÀÐÌÀÊÎËÎÃÈ×ÅÑÊÈÕ ÑÐÅÄÑÒ Îáÿçàòåëüíîé îöåíêå èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ïîäëåæàò ôàðìàêîëîãè÷åñêèå ñðåäñòâà, èñïîëüçóåìûå äëÿ èììóíîêîððåêöèè, èììóíîòåðàïèè, àäàïòîãåíû, îáùåóêðåïëÿþùèå è ïðåïàðàòû äëÿ ïðåâåíòèâíîé òåðàïèè ëèö, ðàáîòàþùèõ â çîíàõ ýêîëîãè÷åñêèõ áåäñòâèé. Ìèíèìàëüíûé ïåðå÷åíü òåñòîâ äëÿ äîêëèíè÷åñêîé îöåíêè èììóíîìîäóëèðóþùåãî è àëëåðãèçèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãèè÷åñêèõ ñðåäñòâ âêëþ÷àåò: îäèí ìåòîä îöåíêè âëèÿíèÿ íà ãóìîðàëüíûé èììóííûé îòâåò, îäèí ìåòîä îöåíêè âëèÿíèÿ íà Ò-êëåòî÷íûé èììóííûé îòâåò, îäèí ìåòîä îöåíêè âëèÿíèÿ íà ñèñòåìó ôàãîöèòîâ èëè ñèñòåìó êîìïëåìåíòà, îäèí ìåòîä îöåíêè àëëåðãèçèðóþùåãî äåéñòâèÿ èññëåäóåìîãî ïðåïàðàòà.  íàñòîÿùåå âðåìÿ îáùåïðèçíàííî, ÷òî áîëüøèíñòâî ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ, äàæå íå îáëàäàþùèõ ïðÿìûì èììóíîòðîïíûì äåéñòâèåì, ñïîñîáíû ïðîÿâëÿòü èììóíîìîäóëèðóþùåå äåéñòâèå. Ïîýòîìó ñëåäóåò èñïîëüçîâàòü ìèíèìàëüíûé íàáîð òåñòîâ äëÿ îöåíêè èììóíîìîäóëèðóþùèõ è àëëåðãèçèðóþùèõ ñâîéñòâ ëåêàðñòâåííûõ ïðåïàðàòîâ, ïðèìåíÿåìûõ äëèòåëüíî, ïàðåíòåðàëüíî, èëè ïðè çàáîëåâàíèÿõ ÷åëîâåêà, ñîïðîâîæäàþùèõñÿ ôîðìèðîâàíèåì èììóíîäåôèöèòíûõ ñîñòîÿíèé. Ýòî ïîçâîëèò îöåíèòü êàê èõ áèîëîãè÷åñêóþ áåçîïàñíîñòü, òàê è ñïîñîáíîñòü âûñòóïàòü â êà÷åñòâå èììóíîêîððåêòîðîâ. Ïðîâåäåíèå äîêëèíè÷åñêèõ (ýêñïåðèìåíòàëüíûõ) èñïûòàíèé ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ òàêæå ïîçâîëèò öåëåíàïðàâëåííî îòîáðàòü (êðîìå îáùåïðèçíàííûõ) ëàáîðàòîðíûå ìåòîäû îöåíêè äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêîãî ñðåäñòâà ó ïàöèåíòîâ âî âðåìÿ åãî êëèíè÷åñêèõ èñïûòàíèé. 35 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ Ðàñøèðåíèå ïåðå÷íÿ èñïîëüçóåìûõ ìåòîäîâ ïî ñðàâíåíèþ ñ ìèíèìàëüíûì òðåáóåòñÿ äëÿ `õàðàêòåðèñòèêè íàïðàâëåííîãî äåéñòâèÿ ýòèõ ñðåäñòâ íà îòäåëüíûå çâåíüÿ ñèñòåìû èììóíèòåòà, ïðåïàðàòîâ, ïðåäíàçíà÷åííûõ äëÿ ïàðåíòåðàëüíîãî ââåäåíèÿ, – ïðåïàðàòîâ ñ ñèëüíûì âûðàæåííûì è î÷åíü ñèëüíûì ìîäóëèðóùèì äåéñòâèåì íà èììóííûå ðåàêöèè in vivo ó æèâîòíûõ è in vitro â êóëüòóðå êëåòîê ÷åëîâåêà. Ðàñøèðåíèå ïåðå÷íÿ ïðåäïîëàãàåò èñïîëüçîâàíèå 23 ðàçíîïëàíîâûõ ìåòîäîâ îöåíêè èììóíîìîäóëèðóþùèõ ñâîéñòâ èñïûòóåìîãî ïðåïàðàòà ïî êàæäîìó èç îáîçíà÷åííûõ çâåíüåâ èììóíèòåòà è àëëåðãèçèðóþùèõ ñâîéñòâ. Ýòî ïîçâîëèò îöåíèòü êàê îñíîâíûå, òàê è äîïîëíèòåëüíûå ýôôåêòû âîçäåéñòâèÿ íà èììóííóþ ñèñòåìó, íàìåòèòü ìåðû ïðåäóïðåæäåíèÿ âîçìîæíûõ îñëîæíåíèé îò èõ ñèñòåìàòè÷åñêîãî ïðèìåíåíèÿ. Ïðîâåäåíèå ñàìèõ äîêëèíè÷åñêèõ èññëåäîâàíèé òðåáóåò ïðèäåðæèâàòüñÿ ïðèíöèïà ïîâòîðíîñòè èññëåäîâàíèé (ýêñïåðèìåíòîâ). Ïðè ýòîì èõ äîëæíî áûòü íå ìåíåå 3 ïðè èññëåäîâàíèè êëåòîê êðîâè ðàçëè÷íûõ çäîðîâûõ ñóáúåêòîâ, è íå ìåíåå 2 (ïðè ïîëó÷åíèè îäíîòèïíûõ ðåçóëüòàòîâ) ïðè ïðîâåäåíèè èññëåäîâàíèé in vivo íà æèâîòíûõ. Âñå ðåçóëüòàòû äîëæíû áûòü ñòàòèñòè÷åñêè îáðàáîòàíû, îáÿçàòåëüíî äîëæíû âêëþ÷àòü çíà÷åíèÿ ïîëîæèòåëüíîãî è îòðèöàòåëüíîãî êîíòðîëåé. Æåëàòåëüíî ïðåäñòàâèòü ðåçóëüòàòû ñðàâíåíèÿ èñïûòóåìîãî ôàðìàêîëîãè÷åñêîãî ñðåäñòâà ñ àíàëîãîì (åñëè òàêîé èìååòñÿ). 36 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè ïî ýêñïåðèìåíòàëüíîìó (äîêëèíè÷åñêîìó) èñïûòàíèþ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ôàðìàêîëîãè÷åñêèõ ñðåäñòâ Ïðè îöåíêå ñòåïåíè èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ ïðåäëàãàåòñÿ ïðèäåðæèâàòüñÿ øêàëû ++++, ãäå îäèí + ñîîòâåòñòâóåò 25% ýôôåêòà. Ïðè ýòîì 0% ýòî çíà÷åíèå îòðèöàòåëüíîãî (áàçîâîãî) êîíòðîëÿ, à 100% çíà÷åíèå ïîëîæèòåëüíîãî êîíòðîëÿ. Äëÿ êàæäîãî ìåòîäà îöåíêè + (025%) ðàññìàòðèâàåòñÿ êàê ñëàáûé ìîäóëèðóþùèé ýôôåêò, ++ (2550%) êàê âûðàæåííûé ìîäóëèðóþùèé ýôôåêò, +++ (5075%) êàê ñèëüíûé âûðàæåííûé ìîäóëèðóþùèé ýôôåêò, ++++ (75100% è áîëåå) ðàññìàòðèâàåòñÿ êàê î÷åíü ñèëüíûé ìîäóëèðóþùèé ýôôåêò èñïûòóåìîãî ôàðìàêîëîãè÷åñêîãî ñðåäñòâà. ( ñëó÷àå ïðåâûøåíèÿ çíà÷åíèé ïîëîæèòåëüíîãî êîíòðîëÿ ìîäóëèðóþùèé ýôôåêò ôàðìàêîëîãè÷åñêîãî ñðåäñòâà ðàññìàòðèâàåòñÿ êàê î÷åíü ñèëüíûé). Ïðè èñïîëüçîâàíèè ôàðìàêîëîãè÷åñêîãî ñðåäñòâà ñðàâíåíèÿ (àíàëîãà) åãî äåéñòâèå òàêæå îöåíèâàåòñÿ ïî ïðåäëàãàåìîé øêàëå. Ïðåäëàãàåìûé ïîäõîä ïîçâîëÿåò ðàíæèðîâàòü èììóíîìîäóëÿòîðû (à òàêæå ôàðìàêîëîãè÷åñêèå ñðåäñòâà ñ äðóãèì îñíîâíûì áèîëîãè÷åñêèì äåéñòâèåì) è îïðåäåëÿòü íåîáõîäèìûé îáúåì î ñíîâíûõ è äîïîëíèòåëüíûõ ìåòîäîâ îöåíêè èõ èììóíîìîäóëèðóþùåãî äåéñòâèÿ in vitro è in vivo. 37 Ïåðåéòè ê îãëàâëåíèþ