Том 13 № 3 - Institute of Experimental Medicine RAMS, St.Petersburg
реклама
2013 C M Y K P 3 b ТОМ 13 2013 № 3 C M Y K ISSN 16084101 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ №3 ТОМ 13 2013 ОФИЦИАЛЬНОЕ ИЗДАНИЕ СЕВЕРОЗАПАДНОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНОПРАКТИЧЕСКИЙ РЕЦЕНЗИРУЕМЫЙ ЖУРНАЛ СевероЗападное отделение Российской академии медицинских наук Научноисследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН Балтийский медицинский образовательный центр Главный редактор: академик РАМН Г. А. Софронов Заместитель главного редактора: академик РАМН Н. А. Беляков Ответственный секретарь: доктор биологических наук А. В. Дмитриев Адрес: 197022, СанктПетербург, Каменноостровский пр., д. 71, СевероЗападное отделение Российской академии медицинских наук, Редколлегия журнала «Медицинский академический журнал» Тел.: (812) 4078332; факс: (812) 4078337 email: medicalacademicjournal@gmail.com; infeklcijaaids@gmail.com Журнал зарегистрирован Территориальным управлением по СанктПетербургу и Ленинградской области Министерства РФ по делам печати, телевидения и средств массовой коммуникации. Свидетельство о регистрации ПИ № 24952 от 17.01.2001 г. Редакционная коллегия: Э. К. Айламазян — академик РАМН, СанктПетербург С. Ф. Багненко — академик РАМН, СанктПетербург В. Б. Васильев — профессор, СанктПетербург В. Р. Вебер — членкорреспондент РАМН, Великий Новгород И. П. Дуданов — членкорреспондент РАМН, СанктПетербург Ю. Д. Игнатов — академик РАМН, СанктПетербург С. А. Кетлинский — членкорреспондент РАМН, СанктПетербург Ю. В. Лобзин — академик РАМН, СанктПетербург В. И. Мазуров — академик РАМН, СанктПетербург Н. А. Майстренко — академик РАМН, СанктПетербург А. О. Марьяндышев — членкорреспондент РАМН, Архангельск А. С. Симбирцев — профессор, СанктПетербург А. Г. Софронов — профессор, СанктПетербург А. Н. Суворов — профессор, СанктПетербург А. А. Тотолян — академик РАМН, СанктПетербург Т. Н. Трофимова — профессор, СанктПетербург Редакционный совет: А. Г. Баиндурашвили — членкорреспондент РАМН, СанктПетербург В. Р. Баранов — членкорреспондент РАМН, СанктПетербург Б. В. Гайдар — академик РАМН, СанктПетербург А. М. Гранов — академик РАМН, СанктПетербург А. Я. Гриненко — академик РАМН, СанктПетербург А. Б. Жебрун — членкорреспондент РАМН, СанктПетербург О. И. Киселев — академик РАМН, СанктПетербург Е. А. Корнева — академик РАМН, СанктПетербург С. В. Лобзин — профессор, СанктПетербург В. А. Медик — членкорреспондент РАМН, Великий Новгород М. М. Одинак — членкорреспондент РАМН, СанктПетербург Л. В. Поташов — членкорреспондент РАМН, СанктПетербург Н. С. Сапронов — членкорреспондент РАМН, СанктПетербург А. А. Скоромец — академик РАМН, СанктПетербург П. И. Сидоров — академик РАМН, Архангельск С. А. Симбирцев — членкорреспондент РАМН, СанктПетербург Р. М. Тихилов — профессор, СанктПетербург П. Д. Шабанов — профессор, СанктПетербург А. В. Шабров — академик РАМН, СанктПетербург Е. В. Шляхто — академик РАМН, СанктПетербург В. Х. Хавинсон — членкорреспондент РАМН, СанктПетербург Н. А. Яицкий — академик РАМН Ю. К. Янов — членкорреспондент РАМН, СанктПетербург ISSN 16084101 M E D I C A L AC A D E M I C JOURNAL №3 Vol. 13 2013 THE OFFICIAL PUBLICATION OF THE NORTHWEST BRANCH OF THE RUSSIAN ACADEMY OF MEDICAL SCIENCES SCIENTIFIC AND PRACTICAL PEERREVIEWED JOURNAL NorthWest Branch of the Russian Academy of Medical Sciences Institute of Experimental Medicine of the NorthWest Branch of the Russian Academy of Medical Sciences Baltic Medical Educational Center Editor in Chief: G. A. Sofronov Full Member of the Russian Academy of Medical Sciences Deputy Editor in Chief: N. A. Belyakov Full Member of the Russian Academy of Medical Sciences Executive Secretary: A. V. Dmitriev Doctor of Biological Sciences Address: 197022, St. Petersburg, Kamennoostrovskiy, 71, NorthWest Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Editorial board «Medical academic journal» Tel.: (812) 4078332; fax: (812) 4078337 email: medicalacademicjournal@gmail.com; infeklcijaaids@gmail.com E d i t o r i a l B oa rd E. K. Ailamazian, full member of the Russian Academy of Medical Sciences, SaintPetersburg S. F. Bagnenko, full member of the Russian Academy of Medical Sciences, SaintPetersburg I. P. Dudanov, corresponding member of the Russian Academy of Medical Sciences, SaintPetersburg Yu. D. Ignatov , full member of the Russian Academy of Medical Sciences, SaintPetersburg S. A. Ketlinskiy, corresponding member of the Russian Academy of Medical Sciences, SaintPetersburg Yu. V. Lobzin, full member of the Russian Academy of Medical Sciences, SaintPetersburg V. I. Mazurov, full member of the Russian Academy of Medical Sciences, SaintPetersburg N. A. Maistrenko, full member of the Russian Academy of Medical Sciences, SaintPetersburg A. O. Maryandyshev, corresponding member of the Russian Academy of Medical Sciences, SaintPetersburg A. S. Simbirtsev, professor, SaintPetersburg A. G. Sofronov, professor, SaintPetersburg A. N. Suvorov, professor, SaintPetersburg A. A. Totolyan, full member of the Russian Academy of Medical Sciences, SaintPetersburg T. N. Trofimova, profesor, SaintPetersburg V. B. Vasiliev, professor, SaintPetersburg V. R. Veber, corresponding member of the Russian Academy of Medical Sciences, Velikiy Novgorod Editorial Council A. G. Baindurashvili — corresponding member of the Russian Academy of Medical Sciences, SaintPetersburg V. R. Baranov, corresponding member of the Russian Academy of Medical Sciences, SaintPetersburg B. V. Gaidar, full member of the Russian Academy of Medical Sciences, SaintPetersburg А. M. Granov, full member of the Russian Academy of Medical Sciences, SaintPetersburg А. Ya. Grinenko, full member of the Russian Academy of Medical Sciences, SaintPetersburg A. B. Zhebrun, corresponding member of the Russian Academy of Medical Sciences, SaintPetersburg O. I. Kiselev, full member of the Russian Academy of Medical Sciences, SaintPetersburg Ye. A. Korneva, full member of the Russian Academy of Medical Sciences, SaintPetersburg S. V. Lobzin, professor, SaintPetersburg V. A. Medic, corresponding member of the Russian Academy of Medical Sciences, Velikiy Novgorod M. M. Odinak, corresponding member of the Russian Academy of Medical Sciences, SaintPetersburg L. V. Potashov, corresponding member of the Russian Academy of Medical Sciences, SaintPetersburg N. S. Sapronov, corresponding member of the Russian Academy of Medical Sciences, SaintPetersburg A. A. Skoromets, full member of the Russian Academy of Medical Sciences, SaintPetersburg P. I. Sidorov, full member of the Russian Academy of Medical Sciences, Архангельск S. A. Simbirtsev, corresponding member of the Russian Academy of Medical Sciences, SaintPetersburg R. M. Tikhilov, professor, SaintPetersburg P. D. Shabanov, professor, SaintPetersburg A. V. Shabrov, full member of the Russian Academy of Medical Sciences, SaintPetersburg Ye. V. Shlyakhto, full member of the Russian Academy of Medical Sciences, SaintPetersburg V. H. Khavinson, corresponding member of the Russian Academy of Medical Sciences, SaintPetersburg N. A. Yaitsky, full member of the Russian Academy of Medical Sciences Yu. K. Yanov, corresponding Member of the Russian Academy of Medical Sciences, SaintPetersburg МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 5 СОДЕРЖАНИЕ РЕДАКЦИОННАЯ СТАТЬЯ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НЕРВНОЙ И ИММУННОЙ СИСТЕМ В НОРМЕ И ПАТОЛОГИИ . . . . . . . . . . . . . . . .7 Е. А. Корнева, С. В. Перекрест АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЦИТОКИНЫ В ПАТОГЕНЕЗЕ ИНФЕКЦИОННЫХ И НЕИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЧЕЛОВЕКА . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18 А. С. Симбирцев ЛЕКЦИЯ АНТИМИКРОБНЫЕ ПЕПТИДЫ В РЕАЛИЗАЦИИ РАЗЛИЧНЫХ ЗАЩИТНЫХ ФУНКЦИЙ ОРГАНИЗМА . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .42 О. В. Шамова, Д. С. Орлов, В. Н. Кокряков, Е. А. Корнева ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ТУЧНЫЕ КЛЕТКИ ТИМУСА КАК ПОСРЕДНИКИ В СИСТЕМЕ НЕЙРОИММУННЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .53 В. В. Гусельникова, Е. Г. Сухорукова, Д. Э. Коржевский, А. В. Полевщиков ПЕПТИДЫ ТИМУСА В РЕГУЛЯЦИИ СТРЕССА . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .64 Н. М. Киселева, А. В. Новоселецкая, А. Н. Иноземцев, И. В. Зимина, В. Я. Арион ИНГИБИРОВАНИЕ НЕЙРОВОСПАЛЕНИЯ РЕДУЦИРУЕТ ДЕГЕНЕРАЦИЮ ДОФАМИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ ЧЕРНОЙ СУБСТАНЦИИ МОЗГА, ИНДУЦИРОВАННУЮ ГИПЕРЭКСПРЕССИЕЙ В НИХ РЕКОМБИНАНТНОГО ГЕНА АЛЬФА-СИНУКЛЕИНА ЧЕЛОВЕКА . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .71 О. А. Вежеева, Т. Н. Сергеева, В. Г. Сергеев ВОЗМОЖНЫЙ МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕХАНИЗМ АНАЛЬГЕТИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА ПЕПТИДНЫХ ФРАГМЕНТОВ ДЕФЕНСИНОВ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .78 В. Б. Плахова, И. В. Рогачевский, Т. Н. Шелых, С. А. Подзорова, Б. В. Крылов ПРОГНОЗ СОХРАНЕНИЯ НЕВРОЛОГИЧЕСКОЙ СИМПТОМАТИКИ К КОНЦУ ПЕРВОГО ГОДА ЖИЗНИ У НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ С ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ . . . . . . . . . . . . .84 Л. В. Кравченко, А. А. Афонин ШИЗОФРЕНИЯ — ФАКТОР, УВЕЛИЧИВАЮЩИЙ РИСК РАЗВИТИЯ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО СИНДРОМА. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА ПОДБОРА ПАР . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .90 Н. Г. Незнанов, И. А. Мартынихин, Д. А. Танянский, О. П. Ротарь, В. Н. Солнцев, Н. А. Соколян, А. О. Конради, А. Д. Денисенко РОЛЬ ОПИАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ В МЕХАНИЗМЕ НЕЙРОМОДУЛИРУЮЩЕГО ВЛИЯНИЯ ЭНДОГЕННОГО АНТИБИОТИКА ДЕФЕНСИНА В ВЕСТИБУЛЯРНОМ ЭПИТЕЛИИ ЛЯГУШКИ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .97 И. В. Рыжова, Т. В. Тобиас, Ю. Н. Андрианов, А. Д. Ноздрачев АГРЕГАЦИЯ ТРОМБОЦИТОВ И ДЕЙСТВИЕ АНТИОКСИДАНТОВ ПРИ ОСТРОМ ПАНКРЕАТИТЕ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .106 Б. Б. Бромберг, Н. А. Майстренко, А. Н. Тулупов, В. Ф. Киричук, Д. С. Криволапов, А. М. Гулько ЗАВИСИМОСТЬ СВОЙСТВ STREPTOCOCCUS PYOGENES ОТ УРОВНЯ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНА RGG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .114 А. В. Дмитриев, M. S. Chaussee НЕКРОЛОГ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .120 6 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 C ON T E N TS EDITORIAL INTERACTIONS OF THE NERVOUS AND IMMUNE SYSTEMS IN HEALTH AND DISEASE . . . . . . . . . . . . . . . .7 E. A. Korneva, S. V. Perekrest ANALYTICAL REVIEW СYTOKINES IN THE PATHOGENESIS OF INFECTIOUS AND NONINFECTIOUS HUMAN DISEASES . . . . .18 А. S. Simbirtsev LECTURE ANTIMICROBIAL PEPTIDES IN THE REAIZATION OF VARIED HOST DEFENSE REACTIONS . . . . . . . . . . .42 O. V. Shamova, D. S. Orlov, V. N. Kokryakov, E. A. Kornerva ORIGINAL ARTICLES THYMIC MAST CELLS AS PARTICIPANTS IN NEURO-IMMUNE INTERACTIONS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .53 V. V. Guselnicova, E. G. Sukhorukova, D. E. Korzhevsky, A. V. Polevschikov PEPTIDES OF THYMUS IN THE REGULATION OF STRESS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .64 N. M. Kiseleva, A. V. Novoseletskaya, A. N. Inozemtsev, I. V. Zimina, V. Ya. Arion INHIBITION OF NEUROINFLAMMATION REDUCES DEGENERATION OF DOPAMINERGIC NEURONS IN THE SUBSTANTIANIGRA INDUCED BY OVEREXPRESSION OF THE RECOMBINANT ALPHA-SYNUCLEINGENE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .71 O. A. Vezheeva, T. N. Sergeeva, V. G. Sergeev A PUTATIVE MOLECULAR MECHANISM OF ANALGESIC EFFECT OF DEFENSIN PEPTIDE FRAGMENTS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .78 V. B. Plakhova, I. V. Rogachevskiy, T. N. Shelykh, S. A. Podzorova, B. V. Krylov PROGNOSIS OF NEUROLOGICAL SYMPTOMATOLOGY PRESERVATION BY THE END OF THE FIRST YEAR OF LIFE IN NEWBORN BABIES, WHO HAD CYTOMEGALOVIRUS INFECTION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .84 L. V. Kravchenko, A. A. Afonin SCHIZOPHRENIA IS A FACTOR INCREASING THE RISKS OF METABOLIC SYNDROME DEVELOPMENT. FINDINGS OF THE RESEARCH INVOLVING PAIR SELECTION METHOD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .90 N. G.Neznanov, I. A. Martynikhin, D. A. Tanyansky, O. P. Rotar’, V. N. Solntsev, N. A. Sokolyan, A. O. Konradi, A. D. Denisyenko THE ROLE OF OPIATE RECEPTORS IN THE MECHANISM OF NEUROMODULATION OF ENDOGENIC ANTIBIOTIC DEFENSINE IN THE FROG VESTIBULAR EPITHELIUM . . . . . . . . . . . . . . .97 I. V. Ryzhova, T. V. Tobias, G. N, Andrianov, A. D. Nozdrachev PLATELET AGGREGATION, AND EFFECT OF ANTIOXIDANTS IN ACUTE PANCREATITIS . . . . . . . . . . . . .106 B. B. Bromberg, N. A. Maistrenko, A. N. Tulupov, V. F. Kiruchuk, D. S. Krivolapov, A. M. Gul`ko DEPENDENCE OF STREPTOCOCCUS PYOGENES PROPERTIES FROM THE RGG GENE TRANSCRIPTIONAL LEVEL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .114 A. V. Dmitriev, M. S. Chaussee NECROLOGY . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .120 7 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 РЕДАКЦИОННАЯ СТАТЬЯ УДК 606:636.4 ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НЕРВНОЙ И ИММУННОЙ СИСТЕМ В НОРМЕ И ПАТОЛОГИИ 1Академик РАМН Е. А. Корнева, 2С. В. Перекрест 1Санкт-Петербургский государственный университет, Россия 2Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН, Санкт-Петербург, Россия INTERACTIONS OF THE NERVOUS AND IMMUNE SYSTEMS IN HEALTH AND DISEASE 2Institute 1Academic RAMS E. A. Korneva, 2S. V. Perekrest 1St.-Petersburg State University, Russia of Experimental Medicine of the North West Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, St.-Petersburg, Russia © Е. А. Корнева, С. В. Перекрест, 2013 г. В статье рассмотрены исторические аспекты становления иммунофизиологии как науки, а также приведен обзор современных исследований взаимодействия нервной и иммунной систем в норме и при патологии. Приводятся новейшие данные, описывающие реакции ЦНС на антигенные стимулы различной природы, а также возможность вовлечения в эти реакции нейронов разной эргичности, в частности орексин-содержащих нейронов гипоталамуса. Кроме того, в статье рассматривается одна из возможных гипотез о пути передачи информации об антигене от иммунной системы к нервной. Ключевые слова: нейроиммунные взаимодействия, антиген, гипоталамус, орексин. The historical aspects of formation of immunophysiology as a sciences as well as the review of modern studies of interactions between nervous and immune systems in health and disease are reviewed in the article. The recent data describing the CNS reactions to antigen stimuli of different nature and possibility of involvement in these reactions of neurons of different ergicity, in particular, orexin-containing hypothalamic neurons are cited. Besides, one of the possible hypotheses about information transduction pathways from immune system to the nervous is observed in the article. Key words: neuroimmune interactions, antigen, hypothalamus, orexin. Изучение проблемы взаимодействия нервной и иммунной систем — одна из крупных и важных проблем фундаментальной биологии и медицины — в последние десятилетия привлекает пристальное внимание исследователей. Интерес обусловлен еще и тем обстоятельством, что расшифровка механизмов взаимодействия этих систем является ключом к пониманию патогенеза многих заболеваний различной природы и основой для поиска способов их лечения. Восприятие нейроиммунофизиологии за последние 50 лет изменилось от «не может быть» до «само собой разумеется, это всем известно», то есть от невероятного до очевидного. Лучше всего это демонстрирует карта мира, на которой отмечены лаборатории, работавшие в этом направлении в 1960-е годы и в настоящее время (рис. 1). Основные этапы развития нейроиммунофизиологии могут быть схематически представлены следующим образом. 1-й этап — появление первых фактов — конец XIX — начало XX века. 2-й этап — период накопления феноменов, демонстрирующих влияние ЦНС на функции иммунной системы — первая половина XX века. 3-й этап — становление иммунофизиологии как научной дисциплины. Изучение механизмов взаимодействия нервной и иммунной систем — вторая половина XX — начало XXI века. 4-й этап (современный) — изучение молекулярно-биологических механизмов взаимодействия нервной и иммунной систем и роли иммунной системы в функциях мозга и изучение нарушений этого взаимодействия при различных формах патологии — конец XX — начало XXI века. Крупным шагом в развитии этого научного направления стало открытие ранее неизвестного явления — влияния определенных структур гипоталамуса на интенсивность иммунного ответа. 8 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 а б Рис. 1. Локализация научных центров, занимавшихся исследованиями в области нейроиммунофизиологии в 60-е годы ХХ века (а) и в настоящее время (б). Важность этого открытия заключается еще и в том, что появилась экспериментальная модель, которая позволила исследовать различные варианты изменений функций иммунной системы при повреждении или раздражении конкретной структуры мозга — заднего гипоталамического ядра. Накопление знаний и демонстрация ряда принципиально важных фактов позволили показать, что мозг реагирует на введение антигена [1–8], лимфоидные органы богато иннервированы [9–13], а клетки иммунной системы имеют на своих мембранах рецепторы к нейромедиаторам [14–20]. Предложенная концепция организации системы нейроэндокринной регуляции функций иммунной системы [4, 21–26] легла в основу дальнейшего поиска механизмов нейроиммунного взаимодействия и обусловила резкую интенсификацию исследований в этой области. Крупным этапом в развитии нейроиммунобиологии явились детальное изучение иннервации лимфоидных органов: не только экстраорганной иннервации, но и распределения нервных волокон и их окончаний внутри органов иммунной системы [9, 27–29]. Сформировалось представление об открытом синапсе, которым оканчиваются нервные волокна. В результате поступления определенных модулирующих сигналов нервные окончания выделяют нейромедиаторы в непосредственной близости от лимфоидных клеток и таким образом «доносят» до иммуноцитов определенные сигналы [11, 30]. Разумеется, при этом клетка должна обладать способностью воспринимать полученную информацию. Это самый главный аспект проблемы. Вот почему обнаружение рецепторов к нейромедиаторам, гормонам, регуляторным пептидам на мембране иммуноцитов явилось важнейшим событием, вехой в развитии нейроиммунобиологии. Открытие рецепторов к нейромедиаторам на мембране лимфоидных клеток объяснило возможность восприятия этими клетками изменений нейромедиаторного микроокружения, а представление об открытом синапсе связало эти компоненты в целостную цепь реализации взаимодействия между нервной и иммунной системами через нейромедиаторы. Регулирующие влияния могут передаваться и гуморально — через изменение уровня гормонов, регулирующих содержание пептидов в крови, притекающей к лимфоидным органам, а в некоторой мере и за счет изменения их кровоснабжения. Своеобразное направление представлено в работах Эдера, касающихся условно-рефлекторного воспроизведения эффекта подавления функций иммунной системы [31–34]. Авторам удалось показать, что, применяя препарат иммунодепрессивного действия циклофосфамид в качестве безусловного сигнала, можно условно-рефлекторно воспроизвести его действие на примере гуморального и клеточноопосредованного иммунного ответа, а также воздействовать на развитие иммунопатологического процесса. Эдер избрал удивительно удачную модель, в которой условно-рефлекторно воспроизводится фармакологический эффект циклофосфана и как результат — подавление функций иммунной системы. Современная биологическая и медицинская наука характеризуется небывало быстрым развитием исследований в области иммунофизиологии, что обусловливает появление потока новой информации, организацию новых лабораторий, журналов, выделение крупных средств на работы этого рода. Причиной интенсификации такого рода, по-видимому, является не только стремление расшифровать загадку «белого пятна», существующую в этой области науки, но и перспективность этого научного направления в смысле возможностей использования полученных знаний в медицине. МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 Действительно, стало очевидным, что не только синдром хронической усталости обусловлен нарушением нейроиммунного взаимодействия, но и в патогенезе ряда заболеваний (развитии рассеянного склероза, мозговой формы СПИДа, течении черепно-мозговой травмы) нарушение этих взаимодействий играет существенную роль. Рассмотреть все линии и результаты развития современных исследований невозможно, слишком широк их спектр и объемен материал. Приведем лишь небольшую часть, демонстрирующую принятые современной наукой способы решения этой проблемы и отражающие их уровень. Развитие методической базы позволило разработать новые подходы в исследовании нейроиммунных взаимодействий, в частности в изучении реакции структур ЦНС на антигенные стимулы. Иммуногистохимическая детекция белка c-Fos — общепризнанного маркера активации — в клетках гипоталамуса позволила определить структуры, вовлеченные в центральные механизмы регуляции нейроиммунных взаимодействий, а также выявить специфический паттерн их реакции на антигенный стимул. Введение таких антигенов, как столбнячный анатоксин и липополисахарид, приводит к активации клеток гипоталамических структур, которая наиболее выражена в переднем (AHN) и паравентрикулярном (PVH) гипоталамическом ядре, латеральной гипоталамической области (LHA) и заднем гипоталамическом поле (PH) [35, 36]. В противоположность ЛПС, такой тимус-зависимый антиген, как стафилококковый энтеротоксин В (SEB), вызывает иной паттерн экспрессии белка c-Fos в структурах ЦНС: преимущественно происходит активация нейронов ядра солитарного тракта и центральной амигдалы при слабом ответе в паравентрикулярном ядре гипоталамуса [36, 37]. Иной паттерн активации гипоталамических структур наблюдается и при введении другого тимус-зависимого антигена — бычьего сывороточного альбумина (БСА). При меньшем количестве c-Fos позитивных клеток наблюдается более выраженная экспрессия его гена в клетках вентромедиального гипоталамического ядра (VMH), LHA и PH, чем при введении ЛПС [38, 39]. Полученные данные позволили говорить о том, что различные патогенные стимулы по-разному влияют на активацию структур мозга, что обусловливается характером развития иммунного ответа на конкретный антиген. Применение маркеров, обладающих способностью к ретроградному (вирус псевдобешенства, фтористое золото) или антероградному (агглютинины 9 пшеницы и фасоли, рабдовирусы) нейрональному транспорту, позволило выявлять определенные пути передачи сигналов между нервной и иммунной системами. Существуют данные, свидетельствующие о наличии путей от нейронов паравентрикулярного ядра гипоталамуса к симпатическим преганглионарным нейронам, а также показан и эфферентный мультисинаптический путь, от нейронов гипоталамуса до симпатических окончаний в селезенке [40, 41]. Специального внимания заслуживают исследования афферентных путей передачи информации от иммунной системы к структурам ЦНС. Впервые в 1994 году W. L. Wan и соавт. продемонстрировали, что индукция синтеза белка c-Fos в клетках паравентрикулярного и супраоптического ядер гипоталамуса в ответ на внутрибрюшинное введение ЛПС блокируется предварительной субдиафрагмальной перерезкой n.vagus. Также было показано, что субдиафрагмальная ваготомия сглаживает изменения поведенческих реакций, вызванных действием ЛПС [42] (Bluthe R. M. et al., 1994), при этом наблюдается отмена характерных гипералгезии и гипертермии [43, 44], причем ЛПСиндуцированная продукция цитокинов в различных органах, в том числе в ЦНС, а также их уровень в крови не изменяются [42, 45–47], т. е. наличие неповрежденного n.vagus необходимо для формирования полноценного ответа ЦНС на введение этого антигена. Однако при высокой дозе ЛПС (1000 мкг/кг) субдиафрагмальная ваготомия не влияет на развитие лихорадки [48]. Следует отметить, что у мышей ваготомия оказывает не столь сильное влияние на проявление ЛПС- и IL-1-индуцированных реакций ЦНС, как у крыс [49]. Частичная блокада проведения сигнала при ваготомии может объясняться тем фактом, что IL-1 и IL-6 могут воздействовать непосредственно на клетки ЦНС в области area postrema и сосудистого органа концевой пластинки [50, 51]. Установлено, что как внутривенное, так и внутрибрюшинное введение IL-1 или ЛПС, а также стафилококкового энтеротоксина B (СЭB) вызывает экспрессию c-Fos белка в чувствительных нейронах n.vagus [52, 53]. Используя свойство фтористого золота к ретроградному транспорту, L. E. Goehler и соавт. (2000) выявили наличие иннервации определенных лимфатических узлов от верхнего и нижнего узлов блуждающего нерва. Особый интерес представляют данные о локализации дендритных клеток (ДК) между волокон n.vagus, а также в area postrema [13, 54]. Наличие широкого спектра рецепторов на мембране ДК и способность к синтезу провоспалительных цитоки- 10 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 нов в ответ на антигенное воздействие может играть ключевую роль при передаче сигнала от иммунной системы к нервной, поскольку расположенные вблизи ДК окончания афферентных волокон блуждающего нерва экспрессируют на своей поверхности рецепторы к различным медиаторам иммунной системы [55]. Кроме того, при введении ЛПС было выявлено увеличение количества перитонеальных макрофагов в соединительной ткани вокруг окончаний n.vagus, а также показано повышение c-Fos-иммунореактивности и экспрессии мРНК IL-1R в нейронах нодозного ганглия блуждающего нерва [56]. Позже в этих клетках были выявлены TLR4 и его мРНК, что предположительно создает основу для активации афферентных волокон n.vagus на уровне нодозного ганглия и может объяснять сохранение реакций ЦНС на введение ЛПС при субдиафрагмальной ваготомии [57]. Как известно, афферентные волокна блуждающего нерва достигают продолговатого мозга, оканчиваясь в дорсальном комплексе n.vagus, в который входят area postrema, ядро солитарного тракта и заднее ядро блуждающего нерва. В ряде работ показано, что во всех перечисленных структурах происходит повышение экспрессии белка c-Fos через 2 часа после введения ЛПС [35, 58–61]. При этом наблюдается и активация вышележащих структур ЦНС: паравентрикулярного ядра гипоталамуса, структур миндалины, а также ядер таламуса. На основе вышеизложенных данных авторы предполагают три возможных мишени поступления информации о повышении уровня цитокинов через n. vagus: к паравентрикулярному ядру гипоталамуса; к ядрам таламуса и к структурам миндалины [13]. Еще одно подтверждение возможного пути передачи информации от иммунной системы через волокна блуждающего нерва к катехоламинергическим нейронам продолговатого мозга и далее к центральным ядрам миндалины получено при помощи мечения нейронов пероксидазой хрена, конъюгированной с агглютинином пшеницы. Показано одновременное выявление белка c-Fos с пероксидазой хрена и тирозин-гидроксилазой в нейронах продолговатого мозга и центральных ядер миндалины при внутрибрюшинном введении ЛПС. После субдиафрагмальной ваготомии количество c-Fos-позитивных клеток в этих структурах снижается [62]. Кроме того, при инактивации дорсального комплекса n. vagus наблюдаемая через 2 часа после внутрибрюшинного введения ЛПС активация нейронов центральных ядер миндалины, концевой полоски, PVH и вентромедиальной преоптической области была значительно снижена. При этом полностью отменялось влияние ЛПС на поведение животных, что говорит о вовлечении дорсального комплекса блуждающего нерва в передачу информации об антигене к структурам, модулирующим социальное поведение [63]. Особый интерес представляют исследования афферентных путей передачи сигнала на моделях бактериального заражения, что представляется более физиологичным, чем введение ЛПС. Показано, что пероральное введение мышам Compylobacter jejuni приводит к значительному увеличению экспрессии гена c-fos в нейронах чувствительного ганглия n.vagus, ядра солитарного тракта и PVH через 1–2 дня после заражения [64, 65]. При этом уровень циркулирующих провоспалительных цитокинов (TNFα, IL-1β, IL-6) в плазме крови не менялся. Исследование поведенческих реакций выявило повышение уровня тревожности у зараженных мышей в открытом поле [66]. Описанная реакция, вероятно, опосредована активацией нейронов PVH, базолатеральных ядер миндалины, ядер концевой полоски и медиальной префронтальной коры. В то же время у контрольных животных, которым вместо C. jejuni вводили изотонический раствор натрия хлорида, проявление тревожного поведения в открытом поле было опосредовано активацией нейронов центральных и базолатеральных ядер миндалины. Приведенные данные предлагают один из возможных механизмов передачи информации об антигене в ЦНС, не исключающий существование других путей афферентации антигенного стимула, что демонстрирует необходимость дальнейшего исследования данной проблемы. Как отмечалось выше, введение антигена приводит к активации различных структур ЦНС, в которых локализованы нейроны различной эргичности, вовлекающиеся в регуляцию цикла сон/бодрствование, пищевого поведения, водно-солевого обмена, стрессорных реакций и т.д., что приводит к изменению многих функций организма и формированию реакций, характерных для инфекционного процесса [37, 67, 68]. В многочисленных исследованиях показано участие различных медиаторных систем в механизмах реализации взаимодействия нервной и иммунной систем. К примеру, показано, что холинергическая система не только участвует в проведении сигнала от иммунной системы в ЦНС, но и регулирует продукцию провоспалительных цитокинов, снижая риск развития септического шока [61, 63–65], а вовлечение катехоламинергической системы (активация катехоламинергических нейронов и усиление секреции катехоламинов) направлено, в первую очередь, на активацию гипоталамо-гипофизарно-надпочечни- МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 ковой оси и формирование стресс-подобных реакций, развитие и поддержание лихорадки, а также на активацию механизмов нейроэндокринной регуляции развивающегося иммунного ответа [36, 66–73]. Антигенное воздействие также влияет на систему моноаминов: после введения ЛПС или провоспалительных цитокинов наблюдаются активация гистаминергических нейронов и повышение метаболизма гистамина в гипоталамусе крыс [67, 74], а также активация транспортеров серотонина, усиление обратного захвата этого нейромедиатора и снижение уровня синтеза его рецепторов, что, в свою очередь, приводит к изменению поведенческих реакций у животных, увеличению степени тревожности и нарушению социального/коммуникативного поведения у потомства [75–77]. Наконец, было продемонстрировано, что для развития комплекса реакций, характерных для продромального синдрома (повышение температуры тела, уровня кортикостеронов в крови, снижение двигательной активности, исследовательского поведения, потребления воды и пищи и т. д.), необходимо сохранение лиганд-рецепторных взаимодействий в системе нейронов, содержащих нейропептид Y (NPY). В то же время их активация необходима для восстановления нарушенных при эндотоксинемии физиологических функций, в частности пищевого поведения [78–80]. В последнее время большое внимание уделяется изучению открытого в 1998 году нейромедиатора орексина [81], участвующего в регуляции многих вегетативных функций (пищевое поведение, цикл сон/бодрствование, терморегуляция, восприятие боли, стресс). Особое место занимает вопрос о возможном участии локализованных в LHA орексин-содержащих нейронов в механизмах реализации реакций ЦНС на антигенный стимул и в формировании системного ответа. Известно, что орексины, являясь нейромедиаторами, принимают участие в модулировании функций нейроэндокринной системы [82], а нарушение интенсивности синтеза орексинов может вызывать изменения функциональной активности нейронов, приводящие к нарушению энергетического обмена, сна, аппетита и других функций [83–86]. Рецепторы к орексинам широко распространены не только в центральной нервной системе [87, 88], но и вне ЦНС, например, на мембранах клеток надпочечников, почек, щитовидной железы, легких, печени, селезенки, а также на стволовых клетках (фенотип CD34+) [40, 89, 90]. Основная масса орексин-содержащих нейронов локализована в области латерального поля гипотала- 11 муса [91–94]. Аксоны орексин-содержащих нейронов проецируются в различные отделы головного и спинного мозга от шейных до крестцовых сегментов [95–99]. Методом ретроградного и антероградного транспорта показано, что отростки орексин-содержащих нейронов определенных областей латерального гипоталамического поля проецируются в различные участки паравентрикулярного ядра гипоталамуса [95, 100, 101]. Отростки орексин-содержащих нейронов обнаружены также в эпендиме мозговых желудочков и эндотелии сосудов [92, 102]. В небольшой концентрации орексины содержатся в крови и спинномозговой жидкости, что позволяет ряду авторов предполагать возможность гуморальной передачи и действия на периферические органы [92, 93, 96, 102]. Также орексины были выявлены в клетках поджелудочной железы, энтерохромаффинных клетках и нейронах, иннервирующих двенадцатиперстную кишку [103, 104]. Поскольку нейроны LHA реагируют на введение антигена, приведенные данные позволяют поднять вопрос о возможном участии системы орексин-содержащих нейронов и самого орексина как нейромедиатора в регуляции иммунных процессов. Хотя некоторые факты, установленные к настоящему времени, свидетельствуют в пользу возможного участия системы орексин-содержащих нейронов и самого орексина в регуляции функций иммунной системы, прямые данные по этому поводу до последнего времени в литературе не были представлены. Лишь в недавних исследованиях было показано, что активация орексин-содержащих нейронов (по белку c-Fos) при исследовательском поведении у крыс значительно снижается после введения ЛПС, в то же время само введение липополисахарида приводит к увеличению количества c-Fos-позитивных орексин-содержащих нейронов в дневное время [72]. Напротив, в ночное время, когда животные активны, введение ЛПС приводило к снижению активации орексин-содержащих нейронов, что совпадало с некоторыми проявлениями продромального синдрома. У мышей, которым после 12-часового голодания давали корм, через 6 часов после введения ЛПС также было продемонстрировано снижение экспрессии гена c-Fos в орексин-позитивных нейронах латеральной гипоталамической области, что коррелировало со сниженным потреблением пищи [105]. Помимо изменения степени активации орексин-содержащих нейронов, при введении липополисахарида в них изменяется содержание орексина, что проявляется в изменении их иммунореактивности и как следствие изменении количества орексин-позитивных нейронов, выявляемых иммуногистохимически 12 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 в гипоталамических структурах на срезах мозга. Динамика этих изменений зависит от дозы введенного антигена. Введение ЛПС в дозе 500 мкг/кг массы тела приводит к снижению количества орексин-позитивных нейронов только через 6 часов после инъекции [106]. Данная доза является достаточно высокой и характеризуется как субсептическая. В отличие от нее, введение ЛПС в дозе 25 мкг/кг вызывает, напротив, увеличение количества орексин-позитивных нейронов через 2 и 4 часа после инъекции [107]. Увеличение или снижение содержания орексина в нейронах свидетельствует об изменении баланса между синтезом и потреблением этого нейропептида, то есть выявленные иммуногистохимически изменения могут быть связаны с превалированием одного из этих процессов над другим (рис. 2, а). реакции дает возможность достаточно определенно судить, какой из указанных механизмов лежит в основе выявленных изменений. Показано, что через 2 часа после введения ЛПС в дозах как 25 мкг/кг, так и 500 мкг/кг массы тела животного, в клетках гипоталамуса увеличивается экспрессия гена препроорексина [108], что отражает увеличение количества мРНК препроорексина и может быть косвенным свидетельством возрастания синтеза орексина в нейронах. Через 4 и 6 часов изменений не наблюдается (рис. 2, б). Сопоставление приведенных данных позволяет говорить о различиях реакций орексин-содержащих нейронов на введение разных доз ЛПС. Хотя в обоих случаях они направлены на увеличение процессов синтеза препроорексина в нейронах, процессы по- Рис. 2. Реакция орексин-содержащих нейронов гипоталамуса на введение различных доз липополисахарида: а — количество орексинпозитивных нейронов в структурах гипоталамуса через 2, 4 и 6 часов после введения липополисахарида (табл. 1); б — экспрессия гена препроорексина в клетках гипоталамуса через 2, 4 и 6 часов после введения липополисахарида (табл. 2). * р<0,05 по сравнению с введением изотонического раствора натрия хлорида. Òàáëèöà 1 Êîëè÷åñòâî îðåêñèí-ïîçèòèâíûõ íåéðîíîâ â ñòðóêòóðàõ ãèïîòàëàìóñà ÷åðåç 2, 4 è 6 ÷àñîâ ïîñëå ââåäåíèÿ ëèïîïîëèñàõàðèäà Ïîêàçàòåëü Ââåäåíèå èçîòîíè÷åñêîãî ðàñòâîðà íàòðèÿ õëîðèäà ËÏÑ â äîçå 25 ìêã/êã ËÏÑ â äîçå 500 ìêã/êã ×åðåç 2 ÷ ×åðåç 4 ÷ ×åðåç 6 ÷ 110,76±6,13 141,07±8,31 134,98±11,19 118,5±3,91 143,71±6,36 120,05±4,92 148,48±9,98 133,04±8,79 110,79±6,73 Òàáëèöà 2 Ýêñïðåññèÿ ãåíà ïðåïðîîðåêñèíà â êëåòêàõ ãèïîòàëàìóñà ÷åðåç 2, 4 è 6 ÷àñîâ ïîñëå ââåäåíèÿ ëèïîïîëèñàõàðèäà Ïîêàçàòåëü Ââåäåíèå èçîòîíè÷åñêîãî ðàñòâîðà íàòðèÿ õëîðèäà ËÏÑ â äîçå 25 ìêã/êã ËÏÑ â äîçå 500 ìêã/êã Определение уровня экспрессии гена препроорексина методом количественной полимеразной цепной ×åðåç 2 ÷ 0,086±0,025 0,311±0,091 0,416±0,102 ×åðåç 4 ÷ 0,140±0,030 0,204±0,070 0,136±0,037 ×åðåç 6 ÷ 0,197±0,083 0,206±0,046 0,164±0,078 требления орексина при введении субсептической дозы идут более интенсивно, сдвигая баланс синтеза МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 и потребления орексина в сторону преобладания его утилизации. Как известно, введение ЛПС приводит к повышению синтеза и высвобождению в экстрацеллюлярное пространство различных цитокинов, которые влияют не только на клетки иммунной системы, но и на нервные клетки, в частности на нейроны гипоталамуса, вызывая их активацию и вовлекая их в регуляцию процессов, участвующих в механизмах развития иммунных реакций [109]. Поскольку введение ЛПС сопровождается повышением температуры, отказом от пищи, сонливостью, а система орексин-содержащих нейронов, как сказано выше, регулирует пищевое поведение, состояние сон/бодрствование, восприятие боли и уровень метаболизма, можно предположить, что все вышеперечисленные проявления в определенной мере опосредованы активацией орексин-содержащих нейронов, проявляющейся усилением его потребления, 13 и обусловлены снижением содержания в них орексина, которое и было показано при введении ЛПС. Комплекс приведенных данных, отражающих наиболее важные и изученные аспекты проявления нейроиммунных взаимодействий, свидетельствует, что в ответ на введение антигена развивается сложная реакция ЦНС, вовлекающая множественные ансамбли нейронов различной эргичности, отвечающие за регуляцию многих вегетативных функций и обеспечивающие комплексные изменения в организме в ходе формирования реакции на антиген и развития инфекционного процесса. Создание целостной картины комплекса реакций мозга на антигенный стимул, основанное на изучении процессов нейроиммунных взаимодействий, и прояснение центральных механизмов взаимной регуляции нервной и иммунной систем будут способствовать расшифровке патогенеза многих заболеваний, а также разработке новых способов их терапии. Литература 1. Броун Г. Р., Могутов С. С., Кан Г. С. Роль некоторых структур гипоталамуса в регуляции иммунобиологических процессов при иммунизации организма вакциной БЦЖ. // Бюл. эксперим. биол. и мед.— 1970.— Т. 70, № 7.— С. 74–78. 2. Клименко В. М., Корнева Е. А. Нейрональная активность гипоталамуса и гомеостатические реакции // Мат. конф. Общества физиологов и патофизиологов ГДР. Халле.— 1974.— С. 17–18. 3. Besedovsky H. O., Sorkin E., Felix D., Haas H. Hypothalamic changes during the immune response // Eur. J. immunol.— 1977.— Vol. 7.— P. 323–325. 4. Корнева Е. А., Клименко В. М., Шхинек Э. К. Нейрогормональное обеспечение иммунного гомеостаза.— Л.: Наука, 1978.— 248 с. 5. Григорьев В. А. Влияние экспериментальной модуляции функционального состояния гипоталамуса на развитие иммунного ответа // Физиол. журн. им. И. М. Сеченова.— 1981.— Т. 67, № 3.— С. 463–467. 6. Rivest S., Torres G., Rivier C. Differential-effects of central and peripheral injection of interleukin-1-beta on brain c-fos expression and neuroendocrine function // Brain res.— 1992.— Vol. 587, № 1.— P. 13–23. 7. Chang S. L., Ren T., Zadina J. E. Interleukin-1 activation of FOS proto-oncogene protein in the rat hypothalamus // Brain Res.— 1993.— Vol. 617.— P. 123–130. 8. Ericsson A., Kovacs K. J., Sawchenko P. E. A functional anatomical analysis of central pathways subserving the effects of interleukin-1 on stressrelated neuroendocrine neurons // J Neurosci.— 1994.— Vol. 14.— P. 897–913. 9. Bulloch K. Neuroanatomy of lymphoid tissue: a review // Neural modulation of immunity.— N. Y., 1985.— P. 111–140. 10. Vizi E. S, Orso E., Osipenko O. N. et al. Neurochemical, electrophysiological and immunocytochemical evidence for a noradrenergic link between the sympathetic nervous system and thymocytes // Neurosci.— 1995.— Vol. 68.— P. 1263–1276. 11. Felten S. Y., Olschowka J. J. Noradrenergic sympathetic innervation of the spleen: II. Tyrosine hydroxylase (TH)-positive nerve terminals form synaptic-like contacts on lymphocytes in the splenic white pulp // Neurosci. Res.— 1987.— Vol. 18.— P. 37–48. 12. Denes A., Boldogkoi Z., Uhereczky G. Central automatic control of the bone marrow: multisynaptic tract trasing by recombinant pseudorabies virus // Neurosci.— 2005.— Vol. 134, № 3.— P. 947–963. 13. Goehler L. E. Gaykema R. P. H., Maier S. E., Watkins L. R. Vagal afferents innervate deep cervical and iliac lymph nodes in the rat // Soc. neurosci. abstr.— 2000.— Vol. 26.— P. 1184. 14. Cake M. N., Litwak G. The glucocorticoid receptops // Biochemical actions of hormones. / Ed.G. Litwak.— N. Y.: Acad. Press, 1975.— Vol. 3.— P. 317–390. 15. Werb Z., Foley R., Munck A. Interaction of glucocorticoids with macrophages. Identification of glucocorticoid receptors in monocytes and macrophages // J. Exр. Med.— 1978.— Vol. 147.— P. 1684–1694. 16. Helderman J. H., Strom T., Strannegard O. J. Specific insulin binding site on T and B lymphocytes as a marker of cell activation // Nature.— 1978.— Vol. 274.— P. 62–63. 14 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 17. Russel D. N., Matrision L., Kibler R. Prolactin receptor on human lymphocytes and their modulation by cyclosporine // Biochem. biophys. res. commun.— 1984.— Vol. 121.— P. 899–906. 18. Richman D. P., Arnason B. G. Nicotinic acetylcholine receptor:evidence for a functionally distinct receptor of human lymphocytes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.— 1979.— Vol. 76.— P. 4632–4635. 19. Hasum E., Chang K. J., Cuatrecasas P. Specific nonopiat receptors for beta endorphins. // Nature.— 1979.— Vol. 205.— P. 1033–1035. 20. Stanisz A., Scicchitano R., Payan D., Bienenstock J. In vitro studies of immunoregulation by substance P and somatostatin // Ann. NY Acad. Sci.— 1987.— Vol. 496.— P. 217–255. 21. Корнева Е. А., Хай Л. М. Влияние разрушения участков гипоталамической области на процесс иммуногенеза. // Физиол. журн.— 1963.— Т.49, № 1.— С. 42–48. 22. Лесников В. А., Аджиева С. Б., Исаева Е. Н. Гипоталамическая модуляция гемопоэтической функции костного мозга // Сб. I Всесоюз. Иммунол. Съезда. Тез. Т. 1.— М., 1989.— С. 331. 23. Munck A., Guyre P. M. Glucocorticoids and immune function // Psychoneuroimmunology / еds. R. Ader, D. Felten, N. Cohen.— N. Y.: Acad. press inc.— 1991.— P. 447–513. 24. Bateman A., Singh A., Kral T., Solomon S. The immunehypothalamic-pituitary-adrenal axis // Endocr Rev.— 1989.— Vol. 10.— P. 92–111. 25. Snow E. С. Insulin and growth hormone function as minor growth factors that–potentiate lymphocyte activation // J. immunol.— 1985.— Vol. 135.— P.776s–778s. 26. Berczi I., Nagy E. Effects of hypophysectomy on immune function // Psychoneuroimmunology. Ed. 2 / еds. Ader, D. Felten, N. Cohen.— N. Y.: Acad. press inc. 1991.— P. 339–375. 27. Bulloch K., Cullen M. R., Schuartz R. H., Longo D. L. Development of innervation within syngenic thymus tissue transplanted under the kidney capsule of the nude mause: a light and ultrastructural microscope study // J. Neurosci. Res.— 1987.— Vol. 8, № 1.— P. 16–27. 28. Ballou L. R., Laulederkind S. J. F., Rosloniec E. F., Raghow R. Ceramide signaling and the immune response // Biochim. Biophys. Acta.— 1996.— Vol. 1301.— P. 273–287. 29. Felten D. L., Felten S. Y., Belinger D. L. Noradrenergic sympathetic neural interactions with the immune system: structure and function // Immunol. Rev.— 1987.— Vol. 100.— P. 225–260. 30. Jankovic B. D., Spector N. H. Effect on the immune system of lesioning and stimulation of the nervous system: neuroimmunomodulation // Enkephalins and endorphins: Stress and immune system / еd. N. P. Plotnikoff et al.— N. Y.; London, 1986.— P. 189–220. 31. Долин А. О., Крылов В. Н. Экспериментальное изучение роли коры головного мозга в иммунном ответе тела. // Журн. высшей нервной деятельности.— 1952.— Т. 11, № 4.— С. 547–560. 32. Danzer R., Bluthe R.-M., Laye S. et al. Cytokines and Sickness Behavior // Annals of New York Acad. Sci.— 1998.— Vol. 840.— P. 586–590. 33. Dressler K. A., Mathias S., Kolesnick R. N. Tumor necrosis factor-alpha activates sphingomyelin signal transduction pathway in a cell-free system // Science.— 1992.— Vol. 255.— P. 1715–1718. 34. Dorshkind K., Horseman N. D. Anterior pituitary hormones, hormones, stress, and immune system homeostasis // Bioassays.— 2001.— Vol. 23, № 3.— P. 288–294. 35. Elmquist J. K., Ackermann M. R., Register K. B. et al. Induction of Fos-like immunoreactivity in the rat brain following Pasteurella multocida endotoxin administration // Endocrinology.— 1993.— Vol. 133.— P. 3054–3057. 36. Gaykema R. P. A., Goehler L. E., Armstrong C. B. et al. Differential FOS expression rat brain induced by lipopolisaccharide and staphylococcal enterotoxin B // Neuroimmunomodulation.—1999.— Vol. 6.— P. 220. 36. Zhang Y.-H., Lu J., Elmquist J. K. et al. Lipopolysaccharide activates specific populations of hypothalamic and brainstem neurons that project to the spinal cord // J. of Neurosci.— 2000.— Vol. 20, № 17.— P. 6578–6586. 37. Goehler L. E. Gaykema P. R. A., Hansen K. Staphylococcal enterotoxin B induces fever, brain c-Fos expression, and serum corticosterone in rats // Am. J. Physiol. Regulatory Integrative Comр. Physiol.— 2001.— Vol. 280.— P. R1434–R439. 37. Корнева Е. А., Казакова Т. Б., Носов М. А. Экспрессия c-fos мРНК и c-Fos-подобных белков в клетках гипоталамических структур при введении антигена. // Аллергология и иммунология.— 2001.— № 1.— C. 37–44. 38. Перекрест С. В., Гаврилов Ю. В., Абрамова Т. В. и др. Активация клеток гипоталамических структур при введении антигенов различной природы (по экспрессии c-fos гена) // Медицинская иммунология.— 2006.— Т. 8, № 5–6.— С. 631 636. 39. Гаврилов Ю. В., Перекрест С. В., Новикова Н. С. Экспрессия c-Fos белка в клетках различных структур гипоталамуса при электроболевом раздражении и введении антигенов // Физиологический журнал им. И. М. Сеченова.— 2006.— Т. 92, № 10.— С. 1195–1203. 40. Zhang S., Blache D., Vercoe P. E. Expression of orexin receptors in the brain and peripheral tissues of the male sheep // Regul. Pept.— 2005.— Vol. 124.— P. 81–87. 41. Cano G., Sved A. F., Rinaman L. Characterization of the central nervous system innervation of the rat spleen using viral transneuronal tracing. // J. of comр. neurol.— 2001.— Vol. 439.— P. 1–18. МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 15 42. Bluthe R. M., Walter P., Parnet C. R. et al. Lipopolysaccharide induces sickness behavior in rats by a vagal mediated mechanism // Acad. Sci. III.— 1994.— Vol. 317.— P. 499–503. 43. Watkins L. R., Goehler L. E., Relton J. K. et al. Blockade of interleukin-1-induced fever by subdiaphragmatic vagotomy; evidence for vagal mediation of immune brain communication // Neurosci. lett.— 1995.— Vol. 183.— P. 27–31. 44. Watkins L. R., Wiertelak E. P., Goehler L. E. Neurocircuitry of illness–induced hyperalgesia // Brain Res.— 1994.— Vol. 639.— P. 283–299. 45. Laye S., Bluthe R. M., Kent S. et al. Subdiaphragmatic vagotomy blocks induction of IL-1 beta mRNA in mice brain in response to peripheral LPS // Am. J. Рhysiol.— 1995.— Vol. 268.— P. R1327–R1331. 46. Hansen M. K., Nguyen K. Т., Fleshner M. et al. Effects of vagotomy on serum endotoxin, cytokines, and corticosterone after intraperitoneal lipopolysaccharide // Am. J. Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol.— 2000.— Vol. 278, № 2.— P. R331–R336. 47. Van Dam A. M., Bol J. G., Gaykema R. P. A. et al. Vagotomy does not inhibit high dose lipopolysaccharide-induced interleukin-1beta immunoreactivity in rat brain and pituitary gland // Neurosci. Lett.— 2000.— Vol. 285, № 3.— P. 169–172. 48. Azab A. N., Kaplanski J. Vagotomy attenuates the effect of lipopolysaccharide on body temperature of rats in a dose-dependent manner // Innate Immunity.— 2001.— Vol. 7, № 5.— P. 359–364. 49. Hermann G. E., Emch G. S., Tovar C. A., Rogers R. С. C-Fos generation in the dorsal vagal complex after systematic endotoxin is not dependent on the vagus nerve // Am. J. Physiol. Regulatory Integrative Comр. Physiol.— 2001.— Vol. 280.— P. R289–R299. 49. Wieczorek M., Swiergiel A. H., Pournajafi-Nazarloo H., Dunn A. J. Physiological and behavioral responses to interleukin-1beta and LPS in vagotomized mice // Physiol. Behav.— 2005.— Vol. 85, № 4.— P. 500–511. 50. Konsman J. P., Luheshi G. N., Bluthe R. M., Dantzer R. The vagus nerve mediates behavioural depression, but not fever, in response to peripheral immune signals; a functional anatomical analysis // Eur. J. Neurosci.— 2000.— Vol. 12, № 12.— P. 4434–4446. 52. Goehler L. E., Gaykema P. R. A., Hammach S. E. et al. Interleukin-1 induces c-Fos immunoreactivity inprimary afferent neurons of the vagus nerve // Soc. neurosci. abstr.— 1998.— Vol. 804.— P. 306–310. 53. Gaykema R. P. A., Goehler L. E., Bol F. J. H. et al. Bacterial endotoxin induces Fos immunoreactivity in primary afferent neurons of the vagus nerve // Neuroimmunomodulation 1998.— Vol. 5.— P. 234–240. 54. Goehler L. E., Erisir A., Gaykema R. P. A. Neural-immune interface in the rat area postrema // Neuroscience.— 2006.— Vol. 140, № 4.— P. 1415–1434. 55. Ek M., Kurosawa M., Lundeberg T., Ericsson A. Activation of vagal afferents after intravenous injection of interleukin-1b: role of endogenous prostaglandins // J. Neurosci.— 1998.— Vol. 18.— P. 9471–9479. 56. Lu X. Y., Yang G. Z., Sun H. С. The activation of vagus afferent in response to lipopolysaccharide the role of interleukin-1 // Sheng Li Xue Bao.— 2002.— Vol. 54, № 2.— P.111–114. 57. Hosoi T., Okuma Y., Matsuda T., Nomura Y. Novel pathway for LPS-induced afferent vagus nerve activation: possible role of nodose ganglion // Auton. Neurosci.— 2005.— Vol. 120, № 1–2.— P. 104–107. 58. Elmquist J. K., Saper C. B. Activation of neurons projecting to the paraventricular hypothalamic nucleus by intravenous lipopolysaccharide // J. of comр. neurol.— 1996.— Vol. 374, № 3.— P. 315–331. 59. Elmquist J. K., Scammell T. E., Jacobson C. D., Saper C. B. Distrubution of Fos–like immunoreactivity in the rat brain following intravenous lipopolysaccharide administration // J. of ComP. Neurol.— 1996.— Vol. 371, № 1.— P. 85–103. 60. Day H. E., Akil H. Differential pattern of c-fos mRNA in rat brain following central and systemic administration of interleukin-1-beta: implications for mechanism of action // Neuroendocrinology.— 1996.— Vol. 63, № 3.— P. 207–218. 60. Sagar S. M., Price K. J., Kasting N. W., Sharp F. R. Anatomic patterns of Fos immunostaining in rat-brain following systemic endotoxin administration // Brain res. bul.—1995.— Vol. 36, № 4.— P. 381–392. 61. Gaykema R. P., Balachandran M. K., Godbout J. P. et al. Enhanced neuronal activation in central autonomic network nuclei in aged mice following acute peripheral immune challenge // Auton Neurosci.— 2007.— Vol. 131, № 1–2.— P. 137–142. 62. Ge X., Yang Z., Duan L., Rao Z. Evidence for involvement of the neural pathway containing the peripheral vagus nerve, medullary visceral zone and central amygdaloid nucleus in neuroimmunomodulation // Brain Res.— 2001.— Vol. 914, № 1–2.— Р. 149–158. 63. Gaykema R. P. A., Goehler L. E. Ascending caudal medullary catecholamine pathways drive sickness-induced deficits in exploratory behavior: brain substrates for fatigue? // Brain Behav Immun.— 2011.— Vol. 25, № 3.— P. 443–460. 63. Marvel F. A., Chen C. С., Badr N. et al. Reversible inactivation of the dorsal vagal complex blocks lipopolysaccharide-induced social withdrawal and c-Fos expression in central autonomic nuclei // Brain Behav. Immun.— 2004.— Vol. 18, № 2.— P. 123–134. 64. Gaykema R. P. A., Goehler L. E., Lyte M. Brain response to cecal infection with Campylobacter jejuni: analysis with Fos immunohistochemistry // Brain Behav. Immun.— 2004.— Vol. 18, № 3.— P. 238–245. 64. Pavlov V. A., Wang H., Czura C. J. et al. The Cholinergic Anti-inflammatory Pathway: A Missing Link in Neuroimmunomodulation // Molecular Med.— 2003.— Vol. 9, № 5–8.— P. 125–134. 16 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 65. Gallowitsch-Puerta M., Pavlov V. A. Neuro-immune interactions via the cholinergic anti-inflammatory pathway // Life Sci.— 2007.— Vol. 80, № 24–25.— P. 2325–2329. 65. Goehler L. E., Gaykema R. P. A., Opitz N. et al. Activation in vagal afferents and central autonomic pathways: early responses to intestinal infection with Campylobacter jejuni // Brain Behav. Immun.— 2005.— Vol. 19, № 4.— P. 334–344. 66. Goehler L. E., Park S.-M., Opitz N. et al. Campylobacter jejuni infection increases anxiety-like behavior in the holeboard: possible anatomical substrates for viscerosensory modulation of exploratory behavior // Brain Behav. Immun.— 2008.— Vol. 22, № 3.— P. 354–366. 66. Tkacs N. С., Strack A. M. Systemic endotoxin induces fos-like immunoreactivity in rat spinal sympathetic regions // J. of the autonomic nervous system.— 1995.— Vol. 51, № 1.— P. 1–7. 67. Elenkov I. J., Wilder R. L., Chrousos G. P., Vizi E. S. The sympathetic nerve — an integrative interface between two supersystems: the brain and the immune system // Pharmacol. Rev.— 2000.— Vol. 52, № 4.— P. 595–638. 67. Gaykema R. P. A., Park S. M., McKibbin C. R., Goehler L. E. Lipopolysaccharide suppresses activation of the tuberomammillary histaminergic system concomitant with behavior: a novel target of immune-sensory pathways // Neuroscience.— 2008.— Vol. 152, № 1.— P. 273–287. 68. Park S.-M., Gaykema R. P. A., Goehler L. E. How does immune challenge inhibit ingestion of palatable food? Evidence that systemic lipopolysaccharide treatment modulates key nodal points of feeding neurocircuitry // Brain Behav. Immun.— 2008.— Vol. 22, № 8.— P.1160–1172. 68. Vizi E. S., Elenkov I. J. Nonsynaptic noradrenaline release in neuro-immune responses // Acta Biol Hung.— 2002.— Vol. 53, № 1–2.— P. 229–244. 69. Mori K., Kaneko Y. S., Nakashima A. et al. Effect of peripheral lipopolysaccharide injection on dopamine content in murine anterior olfactory nucleus // J. Neural. Transm.— 2003.— Vol. 110, № 1.— P. 31–50. 70. Hollis J. H., Lightman S. L., Lowry C. A. Lipopolysaccharide has selective actions on sub-populations of catecholaminergic neurons involved in activation of the hypothalamic–pituitary-adrenal axis and inhibition of prolactin secretion // J. of Endocrinology.— 2005.— Vol. 184.— P. 393–406. 71. Kaneko Y. S., Mori K., Nakashima A. et al. Peripheral injection of lipopolysaccharide enhances expression of inflammatory cytokines in murine locus coeruleus: possible role of increased norepinephrine turnover // J. Neurochem.— 2005.— Vol. 94, № 2.— P. 393–404. 72. Gaykema R. P. A., Goehler L. E. Lipopolysaccharide challenge-induced suppression of Fos in hypothalamic orexin neurons: Their potential role in sickness behavior // Brain, Behavior, and Immunity.— 2009.— Vol. 23.— P. 926–930. 73. Ota A., Mori K., Kaneko Y. S. et al. Peripheral lipopolysaccharide administration affects the olfactory dopamine system in mice // Ann. N. Y. Acad. Sci.— 2008.— Vol. 1148.— P. 127–135. 74. Chiba S., Itateyama E., Oka K. et al. Hypothalamic Neuronal Histamine Modulates Febrile Response but Not Anorexia Induced by Lipopolysaccharide // Exp. Biol. Med.— 2005.— Vol. 230, № 5.— P. 334–342. 75. Baharnoori M., Bhardwaj S. K., Srivastava L. K. Neonatal behavioral changes in rats with gestational exposure to lipopolysaccharide: a prenatal infection model for developmental neuropsychiatric disorders // Schizophrenia Bulletin.— 2010.— Aug 30. [Epub ahead of print]. 76. Zhu Ch.-B., Lindler K. M., Owens A. W. Interleukin-1 receptor activation by systemic lipopolysaccharide induces behavioral despair linked to MAPK regulation of CNS serotonin transporters // Neuropsychopharmacology.— 2010.— Vol. 35.— P. 2510–2520. 77. Lin Y.-L., Lin S.-Y., Wang S. Prenatal lipopolysaccharide exposure increases anxiety-like behaviors and enhances stress-induced corticosterone responses in adult rats // Brain, Behavior, and Immunity.— 2012.— Vol. 26, № 3.— P. 459–468. 78. Kim Y. W., Kim K. H., Ahn D. K. et al. Time-course changes of hormones and cytokines by lipopolysaccharide and its relation with anorexia // J. Physiol. Sci.— 2007.— Vol. 57, № 3.— P. 159–165. 79. Painsipp E., Herzog H., Holzer P. Implication of neuropeptide-Y Y2 receptors in the effects of immune stress on emotional, locomotor and social behavior of mice // Neuropharmacology.— 2008.— Vol. 55, № 1.— P. 117–126. 80. Edelsbrunner M. E., Herzog H., Holzer P. Evidence from knockout mice that peptide YY and neuropeptide Y enforce murine locomotion, exploration and ingestive behaviour in a circadian cycle- and gender-dependent manner // Behaviour Brain Research.— 2009.— Vol. 203, № 1.— P. 97–107. 81. Sakurai T., Amemiya A., Ishii M. et al. Orexins and orexin receptors: a family of hypothalamic neuroprptides and G protein-coupled receptors that regulate feeding behavior // Cell.— 1998.— Vol. 92.— P. 573–585. 82. Date Y., Ueta Y., Yamashita H. et al. Orexins, orexigenic hypothalamic peptides, interact with autonomic, neuroendocrine and neuroregulatory systems // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.— 1999.— Vol. 96.— P. 748–753. 83. Van den Pol A. N., Gao X. B., Obrietan K. et al. Presynaptic and postsynaptic actions and modulation of neuroendocrine neurons by a new hypothalamic peptide, hypocretin/orexin // J. Neurosci.— 1998.— Vol. 18.— P. 7962–7971. 84. Van den Pol A. N. Narcolepsy: a neurodegenerative disease of the hypocretin system? // Neuron.— 2000.— Vol. 27.— P. 415–418. 85. Beuckmann C., Yanagisawa M. Orexins: from neuropeptides to energy homeostasis and sleep/wake regulation. // J. Mol. Med.— 2002.— Vol. 80, № 6.— P. 329–342. 86. Van den Top M., Nolan M. F., Lee K. et al. Orexin induce increased excitability and synchronization of rat sympathetic preganglionic neurons // J. Physiol.— 2003.— Vol. 549, Pt. 3.— P. 809–821. МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 17 87. Trivedi P., Yu H., MacNeil D. J. et al. Distribution of orexin receptor mRNA in the rat brain // FEBS Letters.— 1998.— Vol. 438.— P. 71–75. 88. Chen J., Randeva H. S. Genomic organization of mouse orexin receptors: characterization of two novel tissue-specific splice variants // Mol. Endocrinol.— 2004.— Vol. 18, № 11.— P. 2790–2804. 89. Randeva H. S., Karteris E., Grammatopoulos D., Hillhouse E. W. Expression of orexin-A and functional orexin type 2 receptors in the human adult adrenals: implications for adrenal function and energy homeostasis // J. Clin. Endocrinol. Metabolism.— 2001.— Vol. 86, № 10 — P. 4808–4813. 90. Steidl U., Bork S., Schaub S. et al. Primary human CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells express functionally active receptors of neuromediators // Blood.— 2004.— Vol. 104.— P. 81–88. 91. De Lecea L., Kilduff T. S., Peyron C. et al. The hypocretins: hypothalamus–specific peptides with neuroexcitatory activity // Proc Natl Acad Sci USA.— 1998.— Vol. 95.— P. 322–327. 92. Sakurai S., Nishijima T., Takahashi S. et al. Low plasma orexin A levels were improved by continuous positive airway pressure treatment in patients with severe obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome // Chest.— 2005.— Vol. 127.— P. 731–737. 93. Peyron C., Tighe D. K., van den Pol A. N. et al. Neurons containing hypocretin (orexin) project to multiple neuronal systems // J. Neuroscience.— 1998.— Vol. 18, № 23.— P. 9996–10015. 94. Shainidze K. Z., Novikova N. S. Immunoreactivity of Hypothalamic Orexin-Containing Neurons in Rats in Movement Restriction and Cooling // Neurosci. Behav. Physiol.— 2011.— Vol. 41, Iss. 2.— P. 213–221. 95. Thakkar M. M., Winston S., McCarley R. W. Orexin-A containing lateral hypothalamic neurons project both in the cholinergic basal forebrain and subcoereleus pontine reticular formation: a retrograde tracing study // Sleep.— 2001.— Vol. A141.— P. 24. 96. Chen C. Т., Dun S. L., Kwok E. H. et al. Orexin A-like immunoreactivity in the rat brain // Neurosci. Lett.— 1999.— Vol. 260.— P. 161–164. 97. Nambu T., Sakurai T., Mizukami K. et al. Distribution of orexin neurons in the adult rat brain // Brain Res.— 1999.— Vol. 827.— P. 243–260. 98. Van den Pol A. N. Hypothalamic hypocretin (orexin): robust innervation of the spinal cord // J. Neurosci.— 1999.— Vol. 19, № 8.— P. 3171–3182. 99. Date Y., Mondal M. S., Matsukura S. et al. Distribution of orexin/hypocretin in the rat median eminence and pituitary // Brain. Res. Mol. Brain. Res.— 2000.— Vol. 76.— P. 1–6. 100. Larsen P. J., Hay-Schmidt A., Mikkelsen J. D. Efferent connections from the lateral hypothalamic region and the lateral preoptic area to the hypothalamic paraventricular nucleus of the rat // J. Comp. Neurol.—1994.— Vol. 342.— P. 299–319. 101. Haj-Dahmane S., Shen R.-Y. The wake-promoting peptide orexin-B inhibits glutamatergic transmission to dorsal raphe nucleus serotonin neurons through retrograde endocannabinoid signaling // J. Neurosci.— 2005.— Vol. 25, № 4.— P. 896–905. 102. Kummer M., Neidert S. J., Johren O., Dominiak P. Orexin (hypocretin) gene expression in rat ependymal cells // Neuroreport.— 2001.— Vol. 12.— P. 2117–2120. 103. Kirchgessner A. L., Liu M.-L. Orexin synthesis and response in the gut // Neuron.— 1999.— Vol. 21, № 4.— P. 941–951. 104. Naslund E., Ehrstrom M., Ma J. et al. Localization and effects of orexin on fasting motility in the rat duodenum // Am. J. Physiol. Gastrointest Liver Physiol.— 2002.— Vol. 282.— P. G470–G479. 105. Becskei C., Riediger H., Hernadfalvy D. A. et al. Inhibitory effects of lipopolysaccharide on hypothalamic nuclei implicated in the control of food intake.// Brain. Behav. Immun. 2008.— Vol. 22, № 1.— P. 56–64. 106. Perekrest S. V., Abramova T. V., Novikova N. S. et al. Changes in immunoreactivity of Orexin-A-Positive Neurons after an Intravenous Lipopolysaccharide injection // Medical Science Monitoring.— 2008.— Vol. 14, № 7.— Р. BR127–133. 107. Perekrest S. V., Abramova T. V., Novikova N. S. Comparative analysis of the responses of orexin-containing neurons to administration of different doses of lipopolysaccharide // Neurosci. and Behav. Physiol.— 2011.— Vol. 41, Iss. 2.— P. 206–212. 108. Perekrest S. V., Shainidze K. Z., Loskutov Yu. V. et al. Immunoreactivity of orexin-containing neurons in the hypothalamus and the level of expression of the preproorexin gene in these cells after administration of lipopolysaccharide // Neurosci. and Behav. Physiol.— 2013.— Vol. 43, Iss. 2.— P. 256–260. 109. Ma X. С., Oliver J., Horvath E., Phelps C. P. Cytokine and adrenal axis responses to endotoxin // Brain Res.— 2000.— Vol. 861.— P. 135–142. 110. Gaykema R. P. A., Daniels T. E., Shapiro N. J. et al. Immune challenge and satiety-related activation of both distinct and overlapping neuronal populations in the brainstem indicate parallel pathways for viscerosensory signaling // Brain Res.— 2009.— Vol. 19, № 1294.— P. 61–79. 111. Wan W., Wetmore L., Sorenson C. M. Neural and biochemical mediators of toxin and stress-induced c-fos expression in the rat brain // Brain Res. Bull.— 1994.— Vol. 34.— P. 7–14. Поступила в редакцию: 23.07.2013 г. Контакт: Корнева Елена Андреевна. korneva_helen@mail.ru 18 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР УДК 616-085:615.37 ЦИТОКИНЫ В ПАТОГЕНЕЗЕ ИНФЕКЦИОННЫХ И НЕИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЧЕЛОВЕКА А. С. Симбирцев Государственный НИИ особо чистых биопрепаратов ФМБА России, Санкт-Петербург СYTOKINES IN THE PATHOGENESIS OF INFECTIOUS AND NONINFECTIOUS HUMAN DISEASES А. S. Simbirtsev State Research Institute of Highly Pure Biopreparations of the Federal Medico-Biological Agency, St.-Petersburg © А. С. Симбирцев, 2013 г. Цитокины — это семейство полипептидных молекул, синтезируемых клетками организма и регулирующих эмбриогенез, ряд нормальных физиологических функций, защитные реакции при внедрении патогенов, а также развитие большинства патологических процессов, включая иммунопатологию, канцерогенез, сердечно-сосудистые нарушения и другие. В ходе изучения патогенеза этих состояний стало очевидно, что при гиперпродукции цитокинов данные эндогенные медиаторы могут превратиться из факторов защиты в факторы развития патологии. При инфекционных заболеваниях повышенный синтез цитокинов обусловлен взаимодействием патоген-ассоциированных молекулярных структур с рецепторами врожденного иммунитета, существующими для распознавания патогенов и запускающими развитие воспалительной защитной реакции в тканях. При развитии целого ряда неинфекционных заболеваний, включая аутоиммунные, аллергические и иные иммунопатологические процессы, цитокины также служат медиаторами формирования воспалительных изменений в тканях. При аутовоспалительных состояниях, в том числе при метаболическом синдроме, увеличение синтеза цитокинов происходит вследствие связывания рецепторами врожденного иммунитета эндогенных молекул опасности, синтезируемых клетками при хронических нарушениях гомеостаза организма. В обоих случаях цитокины вызывают целый ряд изменений в органах и тканях, приводящих к формированию клинических симптомов заболеваний человека. Научные изыскания в данной области привели к созданию цитокиновой теории развития заболеваний, согласно которой именно цитокины являются главными причинами развития патологии. В связи с этим в клинической практике кроме цитокиновой терапии, где препараты рекомбинантных цитокинов применяются для восполнения недостатка эндогенных медиаторов либо для изменения их нарушенного баланса, активно развивается сравнительно новое направление лечения, названное антицитокиновой терапией. Оно направлено на удаление избытка эндогенных цитокинов, выступающих в качестве факторов развития и прогрессирования патологических состояний. Ключевые слова: цитокины в патогенезе заболеваний человека, метаболический синдром. Cytokines — family of polypeptide molecules, that are produced by tissue cells and regulate embryogenesis, some normal physiological functions, defense reactions to pathogens, and several pathological processes including immunopathology, carcinogenesis, heart and vascular pathology, etc. Different experiments led to conclusion that in case of hyperproduction cytokines instead of defense factors can become the mediators of pathology. During infections elevated cytokine synthesis followed with tissue inflammation depends on the pathogen associated molecular patterns binding to the pattern recognition innate immunity receptors. In noninfectious diseases like autoimmune, allergic, and other immunopathologic conditions cytokines also induce tissue inflammatory changes. In autoinflammatory diseases including metabolic syndrome elevated cytokine synthesis is due to endogenous danger molecules binding to pattern recognition receptors. In both cases cytokines can induce tissue and organ changes with the following development of the human disease clinical symptoms. Scientific studies in this field led to the so called cytokine theory of diseases, according to which cytokines are the main reason for pathology development. Due to this theory there are two principal variants of cytokine usage in clinical practice: cytokine therapy when recombinant cytokines are used to cure cytokine deficiency or their changed balance; and anticytokine therapy for inhibition of hyper produced endogenous cytokines. Key words: cytokines in the pathogenesis of human diseases, metabolic syndrome. МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 Введение. Цитокины — это семейство полипептидных молекул, синтезируемых клетками организма и регулирующих эмбриогенез, ряд нормальных физиологических функций, защитные реакции при внедрении патогенов, а также развитие большинства патологических процессов, включая иммунопатологию, канцерогенез, сердечно-сосудистые нарушения и другие [1]. Цитокины служат медиаторами межклеточного сигналинга, взаимодействуя со специфическими рецепторами с очень высокой аффинностью, благодаря чему действие цитокинов как местно, так и системно проявляется в наномолярных концентрациях. Цитокины синтезируются клетками различных тканей человека в ответ на экзогенные стимулы, такие как патоген-ассоциированные молекулярные структуры (паттерны) практически всех типов микроорганизмов, химические и физические повреждающие факторы, а также при воздействии ряда эндогенных молекул, концентрация которых возрастает при развитии многих заболеваний [2, 3]. В последнем случае цитокины принимают участие в развитии патологических процессов, включая иммунопатологию, канцерогенез, нарушения в сердечно-сосудистой системе и др. Рассмотрим более подробно, как цитокины регулируют эти процессы и как могут становиться проводниками патологических изменений в органах и тканях. Общие принципы запуска и регуляции развития воспаления цитокинами. Воспалительная реакция — основа тканевого ответа на внедрение патогенов и воздействия многих повреждающих факторов, включая механические нарушения целостности тканей (травмы), а также химические и физические воздействия, например ожоги любого происхождения. Наш организм постоянно встречается с огромным числом патогенов, способных вызвать тяжелые инфекции в отсутствие адекватного иммунного ответа. Пример подобного развития событий — иммунодефицит при СПИДе, когда на фоне значительно сниженной иммунологической реактивности наблюдается развитие оппортунистических инфекций, в норме контролируемых иммунной системой. От нормальной работы иммунной системы зависит исход постоянного взаимодействия с патогенами. В настоящее время защитные реакции условно подразделяются на два основных типа: врожденный и приобретенный иммунитет. Первой линией борьбы с инфекционными агентами служит система врожденного иммунитета, благодаря его существованию мы от рождения имеем огромный арсенал защитных механизмов противодействия самым разным патогенам. Запуск реакций врожденного иммунитета происходит достаточно быстро и связан с распознаванием па- 19 тогенов специфическими молекулами, получившими название рецепторов врожденного иммунитета. Какие именно структуры патогенов распознаются нашими клетками, какие рецепторы участвуют в этом процессе и каков путь внутриклеточного сигналинга, ведущего к экспрессии генов цитокинов и активации воспаления, стало известно лишь в последние годы. Во многом это связано с описанием структурных компонентов различных патогенов, названных патоген-ассоциированными молекулярными паттернами (pathogen-associated molecular patterns — PAMP) [2], которые являются консервативными, абсолютно необходимыми для обеспечения жизнедеятельности микроорганизмов, а поэтому не подвергающимися серьезным мутационным изменениям, и общими у многих разновидностей патогенов для обеспечения минимального числа требуемых рецепторов, гены которых экспрессируются без процесса соматической рекомбинации, как происходит в случае антител и Т-клеточных рецепторов. Примерами молекулярных паттернов патогенов служат липополисахариды (ЛПС), пептидогликаны и флагеллин бактерий, вирусные РНК и ДНК, а также ДНК, богатая CpolyG-последовательностями, что характерно для ДНК бактерий. Рецепторы, распознающие указанные структуры или паттерны микроорганизмов, получили название паттерн-распознающих рецепторов (ПРР). ПРР представляют собой группу различных по строению и локализации молекул, обладающих способностью взаимодействовать с PAMP микроорганизмов с целью их прямой нейтрализации либо для запуска каскада провоспалительных реакций, в конечном итоге направленных на блокирование жизнедеятельности, дезинтеграцию и удаление патогена из организма. Известные сегодня ПРР могут быть разделены на три основных типа. 1. Растворимые циркулирующие молекулы, такие как компоненты системы комплемента, взаимодействующие с микроорганизмами и запускающие начальные этапы альтернативного либо лектинового путей активации комплемента, приводящей к лизису бактерий; острофазовые белки (С-реактивный белок, сывороточный амилоид Р и др.); коллектины (mannose-binding lectin и др.). 2. Клеточные мембранные рецепторы, экспрессированные на мембране клетки либо находящиеся в составе мембран фаголизосом, где они также связывают PAMP фагоцитированных микроорганизмов. Эти рецепторы по аналогии с толл-белками насекомых названы толл-подобными рецепторами (Toll-like receptors, TLR) млекопитающих. Дело в том, что мембранный рецепторный белок толл-клеток Drosophila melanogaster запускает активацию ка- 20 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 скада внутриклеточных сигнальных молекул, завершающегося синтезом антимикробных пептидов, чрезвычайно важных для защиты насекомых от патогенов [4]. Точная идентификация и локализации гена, кодирующего рецептор TLR4, ответственный за чувствительность к ЛПС у мышей и человека, проведена с использованием метода позиционного клонирования [5]. Вслед за этим последовало открытие нескольких толл-подобных рецепторов клеток млекопитающих и человека. У человека TLR представляют собой семейство молекул, состоящее из 11 индивидуальных рецепторов, обозначаемых TLR-1, TLR-2 и т. д. [6]. TLR в состоянии распознать практически все основные типы патогенов, включая различные типы бактерий, вирусы, грибы, простейшие и паразиты. Выяснилось, что толл-белки и связанный с ними активационный сигнальный путь являются одной из наиболее древних эволюционно консервативных рецепторных и сигнальных систем, служащих для распознавания патогенов и активации защитных реакций [4–6]. Развитие этих работ привело к описанию принципов функционирования всей системы распознавания патогенов клетками млекопитающих [7]. Цикл этих исследований отмечен награждением Брюса Бойтлера Нобелевской премией 2011 года в области медицины. 3. Внутриклеточные цитоплазматические рецепторы, распознающие патоген-ассоциированные молекулярные паттерны патогенов после их попадания в цитоплазму клетки. К ним относятся NOD-подобные рецепторы [8], которые в настоящее время обозначаются NLR (nucleotide-binding domain leucine-rich repeat containing receptors), а также MDA-5 и RIG-I-like RNA helicases (RLHs). Общим свойством всех клеточных (мембранных и цитоплазматических) ПРР является взаимодействие с PAMP и проведение активационного сигнала, указывающего на присутствие патогена и ведущего к активации защитных реакций. После связывания соответствующих лигандов все ПРР претерпевают конформационные изменения, нужные для освобождения сайтов взаимодействия с клеточными адаптерными молекулами и запуска каскада передачи сигнала [9]. Стимуляция клеток через различные ПРР может проходить с участием адаптерного белка MyD88, семейства киназ IRAK, внутриклеточного фактора TRAF6, ведущего к активации важнейшего транскрипционного фактора NFκB и его транслокации в ядро. NFκB прямо связывается с промотерными участками целого ряда генов, кодирующих молекулы, активирующие и регулирующие развитие воспалительной реакции, включая гены цитокинов. Второй важнейший путь сигналинга связан с индукцией экспрессии целого ряда так называемых генов, индуцируемых интерфероном (interferoninducible), обычно экспрессирующихся при развитии противовирусного ответа (рис. 1). Следовательно, распознавание PAMP любых разновидностей патогенов приводит по крайней мере к двум принципиально важным типам реакций врожденного иммунитета: антибактериальной защите с развитием воспалительной реакции в тканях и к противовирусному ответу, где воспаление дополняется синтезом ИФН I типа — основным противовирусным медиатором врожденного иммунитета. Важно, что данный универсальный внутриклеточный сигнальный механизм функционирует при активации соответствующими PAMP разных ПРР. Следовательно, разные патогены после взаимодействия своих PAMP со специфическими рецепторами врожденного иммунитета могут вызвать развитие одинакового пути активации воспалительного ответа. На молекулярном уровне это подтверждено данными о различиях во внеклеточных доменах TLR, обеспечивающих специфичность распознавания PAMP, и напротив, очень большом сходстве строения внутриклеточных участков, нужных для проведения активационного сигнала [10]. Одним из важнейших событий в реализации клеточного ответа на молекулярные структуры патогенов является синтез одновременно нескольких семейств цитокинов, среди которых главными в развитии воспаления служат провоспалительные цитокины, в частности цитокины семейства ИЛ-1. Развитие воспаления обеспечивается синтезом комплекса провоспалительных и других цитокинов, стимулирующих большинство дальнейших событий в развитии воспалительной реакции и активации различных типов клеток, участвующих в поддержании и регуляции воспаления (табл. 1). Активация врожденного иммунитета вызывает развитие комплекса регулируемых цитокинами провоспалительных реакций, приводящих к уничтожению и элиминации патогена. Вслед за этим происходит активация противовоспалительных сигналов, нужных для завершения воспаления. Эти сигналы необходимы не только для возврата защитных реакций к нормальному гомеостатическому состоянию, но также для развития репаративных процессов и для недопущения гиперреактивности и повреждения собственных тканей. Активация ПРР ведет не только к синтезу провоспалительных цитокинов и активации воспаления, но также вызывает усиление продукции антивоспалительных и регуляторных цитокинов, РАИЛ, ИЛ-10, ИЛ-4, ИЛ-13, а также появление регуляторных CD4+CD25+ Т-лимфоцитов, однако МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 21 Рис. 1. Сигнальные пути клеточных паттерн-распознающих рецепторов. TIR домены — Toll-IL-1 Receptor; адапторная молекула MyD88 — myeloid differentiation primary response protein 88; киназа IRAK-4 — IL-1 receptor associated kinase; TRAF6 — TNF receptor associated factor 6; транскрипционный фактор NFκB — nuclear factor κB; TRIF — TIR-domain-containing adaptor protein inducing IFNβ; TBK1 — TRAF-family binding kinase 1; транскрипционный фактор IRF3 — Interferon responsive factor 3. если антивоспалительные цитокины индуцируются слишком рано и в больших концентрациях, это может вызвать состояние иммуносупрессии [11]. Очень важно, что мембранные и цитоплазматические ПРР способны также реагировать на отдельные эндогенные молекулы, образующиеся при повреждении тканей и клеточном стрессе. Эта небольшая группа молекул путем взаимодействия с ПРР обеспечивает передачу сигнала опасности и вследствие этого получила общее название danger-associated molecular patterns (DAMPs), или молекулы опасности. Ранее считалось, что ПРР способны распознавать только структуры патогенов, существенно отличающиеся от молекул синтезируемых клетками организма, следуя главному принципу работы иммунной системы, отличающей «свое» от «чужого». Однако строение некоторых ПРР дает возможность этим рецепторам взаимодействовать и с эндогенными молекулами, служащими сигналом развития клеточного стресса и повреждения тканей. Это позволяет системе рецепторов врожденного иммунитета распознавать патоло- гические изменения в тканях, происходящие независимо от инфекции, и реагировать на них развитием стерильного воспаления, например при ишемии тканей, отложении солей мочевой кислоты при подагре, при появлении белков теплового шока или при травмах и в ряде других случаев [12]. Следует еще раз подчеркнуть, что молекулы, стимулирующие запуск стерильного воспаления, являются эндогенными и принципиально отличаются от PAMP микроорганизмов, однако весь последующий внутриклеточный сигналинг, синтез провоспалительных цитокинов и развитие воспаления одинаковы в обоих случаях и могут приводить к однотипным тканевым изменениям, ведущим к патологии (рис. 2). Таким образом, и экзогенные патогены и некоторые эндогенные молекулы опасности способны вызвать сходные клеточные и тканевые реакции. Этот принципиальный момент важен для всего последующего изложения роли цитокинов в патогенезе целого ряда заболеваний, вызванных развитием тканевого воспаления вне инфекционного процесса. 22 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 Òàáëèöà 1 Ôóíêöèè êëåòîê, àêòèâèðóåìûå â ðåçóëüòàòå âçàèìîäåéñòâèÿ PAMP ñ ÏÐÐ ¹ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Ôóíêöèè êëåòîê ïðè àêòèâàöèè ÏÐÐ Ðîëü â çàùèòíûõ ðåàêöèÿõ Èíäóêöèÿ ñèíòåçà ïðîâîñïàëèòåëüíûõ öèòîêèíîâ ñåìåéñòâ ÈË-1, ÈË-6, ÔÍÎ Èíäóêöèÿ ñèíòåçà èíòåðôåðîíîâ 1 òèïà Èíäóêöèÿ ñèíòåçà è ýêñïðåññèè ðåöåïòîðîâ ÈË-8 è äðóãèõ õåìîêèíîâ Àêòèâàöèÿ ýêñïðåññèè ãåíà èíäóöèáåëüíîé NO-ñèíòàçû (iNOS) è ãåíåðàöèè NO Ñèíòåç ñâîáîäíûõ ôîðì êèñëîðîäà Àêòèâàöèÿ öèêëîîêñèãåíàçû è ëèïîîêñèãåíàçû Àêòèâàöèÿ ìåñòíîãî âîñïàëåíèÿ è ñèñòåìíîãî îñòðîôàçîâîãî îòâåòà Ïðîòèâîâèðóñíàÿ çàùèòà Ïðèâëå÷åíèå ðàçëè÷íûõ òèïîâ êëåòîê â î÷àã âîñïàëåíèÿ è ìèãðàöèÿ â ëèìôîèäíûå îðãàíû Óíè÷òîæåíèå ïàòîãåíîâ, ðàñøèðåíèå ñîñóäîâ äëÿ óëó÷øåíèÿ êðîâîñíàáæåíèÿ, ïðèâîäÿùåå ê îòåêó Óíè÷òîæåíèå ïàòîãåíîâ Ñèíòåç íèçêîìîëåêóëÿðíûõ ìåäèàòîðîâ âîñïàëåíèÿ (ïðîñòàãëàíäèíîâ è ëåéêîòðèåíîâ). Ðàñøèðåíèå êàïèëëÿðîâ (àðòåðèîë) äëÿ óñèëåíèÿ ïðèòîêà êðîâè â îáëàñòü î÷àãà âîñïàëåíèÿ, èíäóêöèÿ ëèõîðàäêè, ðåãóëÿöèÿ àêòèâàöèè ëèìôîöèòîâ Ñòèìóëÿöèÿ ýêñïðåññèè íà ïîâåðõíîñòè ýíäîòåëèÿ Óñèëåíèå ïðèêðåïëåíèÿ ëåéêîöèòîâ (ãëàâíûì îáðàçîì ìîëåêóë àäãåçèè (VCAM-1, E-ñåëåêòèí) íåéòðîôèëüíûõ ãðàíóëîöèòîâ) ê ýíäîòåëèþ è òðàíñìèãðàöèè â òêàíè ñ öåëüþ óâåëè÷åíèÿ ÷èñëà ëåéêîöèòîâ äëÿ áîðüáû ñ ïàòîãåíîì â î÷àãå âîñïàëåíèÿ Àêòèâàöèÿ ýêñïðåññèè ãåíà ôîñôîëèïàçû À2. Ñèíòåç Èíäóêöèÿ ïðîêîàãóëÿíòíîé àêòèâíîñòè. Óñèëåíèå ôàêòîðà, àêòèâèðóþùåãî òðîìáîöèòû ñâåðòûâàíèÿ êðîâè â ìåëêèõ ñîñóäàõ â çîíå î÷àãà âîñïàëåíèÿ äëÿ áëîêàäû ðàñïðîñòðàíåíèÿ ïàòîãåíà è îñòàíîâêè êðîâîòå÷åíèÿ ïðè òðàâìàõ Àêòèâàöèÿ ìåòàáîëèçìà ñîåäèíèòåëüíîé òêàíè, ïðî- Ëèçèñ è óäàëåíèå ïîâðåæäåííûõ ó÷àñòêîâ ñîåäèíèëèôåðàöèè ôèáðîáëàñòîâ è ïðîäóêöèþ èìè ïðîñòàã- òåëüíîé è êîñòíîé òêàíè, çàæèâëåíèå ðàí äëÿ ðåãåëàíäèíîâ, êîëëàãåíàçû, ìåòàëëîïðîòåèíàç, íåéíåðàöèè òêàíåé è âîññòàíîâëåíèÿ èõ öåëîñòíîñòè òðàëüíûõ ïðîòåàç è äð. ôåðìåíòîâ Àêòèâàöèÿ ñèíòåçà êîëîíèåñòèìóëèðóþùèõ ôàêòîðîâ Ñòèìóëÿöèÿ êðîâåòâîðåíèÿ Èíäóêöèÿ ñèíòåçà öèòîêèíîâ ñåìåéñòâà ÈË-12 Äèôôåðåíöèðîâêà Ò-ëèìôîöèòîâ Èíäóêöèÿ äèôôåðåíöèðîâêè äåíäðèòíûõ êëåòîê Óñèëåíèå ïðåäñòàâëåíèÿ àíòèãåíîâ è èíäóêöèÿ äèôôåðåíöèðîâêè Ò-ëèìôîöèòîâ Èíäóêöèÿ ýêñïðåññèè àíòèãåíîâ ãèñòîñîâìåñòèìîñòè è Óñèëåíèå ïðåäñòàâëåíèÿ àíòèãåíîâ è èíäóêöèÿ äèôêîñòèìóëÿòîðíûõ ìîëåêóë CD40, CD80/CD86 (B7) ôåðåíöèðîâêè Ò-ëèìôîöèòîâ Рис. 2. Распознавание структур патогенов и эндогенных молекул опасности рецепторами врожденного иммунитета. Ключевая роль ИЛ-1 и инфламмасом в развитии воспаления. В ряду первых генов, экспрессирующихся в ответ на распознавание структур патоге- нов рецепторами врожденного иммунитета, стоят гены цитокинов семейства интерлейкина-1 (ИЛ-1). Именно их экспрессия, активный синтез и секреция определяют ход дальнейших событий в развитии воспалительной реакции, активации каскада синтеза других цитокинов и медиаторов иммунитета, стимуляции функций антигенпредставляющих клеток и лимфоцитов, нужных для взаимодействия механизмов врожденного и приобретенного иммунитета, а также для вовлечения других систем в организацию комплекса защитных реакций в полном объеме. Эксперименты с рекомбинантными высокоочищенными препаратами показали, что у ИЛ-1 существует не менее 50 различных биологических функций, где мишенями служат клетки практически всех органов и тканей. Столь широкий спектр биологической активности сводится при внимательном анализе к одному ясному выводу: ИЛ-1 является главным МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 медиатором развития местной воспалительной реакции и острофазового ответа на уровне организма. Именно с этой точки зрения становятся понятными все его, на первый взгляд, необъяснимо разные биологические функции [13]. ИЛ-1 вместе с другими цитокинами стимулирует развитие целого комплекса защитных реакций организма, направленных на ограничение распространения инфекции, элиминацию внедрившихся микроорганизмов и восстановление целостности поврежденных тканей. При остром воспалении быстрое, но кратковременное увеличение его синтеза критически необходимо для развития всего комплекса защитных реакций для удаления патогена. Но следует помнить, что механизм действия ИЛ-1 связан с развитием тканевого воспаления, и хроническое превышение его физиологического уровня может привести к патологическим изменениям в тканях [14]. Такое хроническое увеличение синтеза ИЛ-1 известно в трех случаях: 1) при хроническом инфекционном воспалении; 2) при хроническом воспалительном процессе на фоне аллергии, аутоиммунных реакций, а также вызванном эндогенными молекулами опасности; 3) при наследственных аутовоспалительных процессах, связанных с генетическими дефектами белков в составе инфламмасомы и нарушением контроля над гиперпродукцией ИЛ-1β. Семейство ИЛ-1 состоит из 11 гомологичных по аминокислотной последовательности белков, которые, несмотря на высокую степень гомологии, обладают достаточно разными функциями. Среди них наиболее известны ИЛ-1α, ИЛ-1β и ИЛ-18, обладающие провоспалительными свойствами, рецепторный антагонист ИЛ-1 (РАИЛ), блокирующий взаимодействие ИЛ-1α и ИЛ-1β со специфическими рецепторами, и ИЛ-33, активирующий аллергическое воспаление. ИЛ-1β и ИЛ-18 в отличие от ИЛ1α, активно секретируются клетками человека в окружающую среду, причем их внутриклеточный процессинг протекает нестандартным путем с участием фермента ИЛ-1-конвертазы (или каспазы-1), превращающего как предшественник ИЛ-1β, так и предшественник ИЛ-18 в зрелые биологически активные секреторные формы с молекулярной массой около 18 кДа. У ИЛ-1β нет типичного сигнального пептида, нужного для обычного пути секреции. Молекула предшественника должна быть конвертирована в секреторную форму с помощью ИЛ-1-конвертазы. ИЛ-1-конвертаза (IL-1 converting enzyme, ICE) или каспаза-1 является сериновой протеазой и представляет собой гетеродимер, состоящий из двух различных полипептидных цепей с молекулярной массой 10 и 20 кДа [15]. Данный фермент специфичен в от- 23 ношении ИЛ-1β и ИЛ-18, а также активен в отношении еще одного члена семейства ИЛ-1 — IL-1F7, но не действует на предшественник ИЛ-1α. Предшественник ИЛ-1β не обладает биологической активностью, поэтому посттрансляционный процессинг путем расщепления каспазой-1 с образованием зрелой формы с молекулярной массой 18 кДа является обязательным условием для формирования биологически активного ИЛ-1β. В ходе продукции ИЛ-1β биологически неактивная молекула предшественника сначала накапливается в цитозоле, а затем перемещается в специализированные секреторные лизосомы, где находится неактивная форма каспазы-1 — прокаспаза-1 [16]. Далее происходит активация прокаспазы-1 с образованием биологически активного фермента под влиянием нескольких цитоплазматических белков, формирующих так называемую инфламмасому [17]. Инфламмасомы представляют собой цитоплазматические гетерогенные белковые комплексы, распознающие молекулярные паттерны патогенов и эндогенные молекулы опасности и обеспечивающие перевод прокаспазы-1 в активное состояние для процессинга предшественников ИЛ-1β и ИЛ-18 и образования их биологически активных форм, далее секретируемых из клеток. Инфламмасома не является внутриклеточной органеллой, а представляет собой функциональное образование или так называемую платформу из нескольких цитоплазматических белков. Прежде всего, это группа из 22 внутриклеточных цитоплазматических NOD-подобных белков, включая 14 NLRP белков, 5 NLRC белков, NAIP, NLRX и CIITA [18, 19], которые в ходе изучения имели разные названия, но в настоящее время имеют единую классификацию [8]. Таким образом, инфламмасомы гетерогенны по своему составу. В настоящее время известны несколько разных цитоплазматических белковых комплексов, проявляющих активность инфламмасом и отвечающих за образование биологически активной каспазы-1. Наиболее изучены инфламмасомы, сформированные с участием белка из группы NOD-подобных цитоплазматических паттерн-распознающих рецепторов — NLRP3, ранее известных также под другими названиями: Nalp3, cryopyrin, CIAS1, PYPAF1, CLR1.1. Этот тип инфламмасом активируется под влиянием целого ряда бактериальных производных (ЛПС, МДП, бактериальные РНК), а также ряда эндогенных молекул (кристаллы мочевой кислоты, βамилоид) и экзогенных веществ (асбест, кремний, адъюванты на основе солей алюминия) [20, 21]. Второй из известных типов инфламмасом — NLRP1-инфламмасома, активирующаяся под воз- 24 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 действием МДП, летального токсина Bacillus anthracis и некоторых других компонентов бактерий. Белок NLRP1 ранее назывался Nalp1, DEFCAP, NAC, CARD7 или CLR17.1. Для этого типа инфламмасомы показано, что очищенные цитоплазматические белки NLRP1, ASC и прокаспаза-1 in vitro в присутствии МДП формируют олигомерные комплексы, т. е. действительно, происходит связывание МДП, способное вызвать в клетке активацию всего описанного комплекса [22, 23]. Третий вариант инфламмасомы сформирован с участием белка NLRC4 (другие прежние названия: IPAF, CARD12, CLR2.1, CLAN), относящегося к NOD-подобным цитоплазматическим белкам и распознающего главным образом флагеллин. Активация этого типа инфламмасом может происходить независимо от распознавания флагеллина мембранными рецепторами TLR5, указывая на существование двух независимых путей распознавания этой микробной структуры: с помощью мембранных TLR5 и с помощью цитоплазматического белка NLRC4/IPAF. К активаторам NLRC4 инфламмасом относятся грамотрицательные бактерии: Salmonella, Shigella, Legionella и Pseudomonas. Возможно также существование специализированных инфламмасом для распознавания нуклеиновых кислот (AIM2 инфламмасомы), играющих важную роль при активации ответа и на бактериальные и на вирусные патогены [24]. Внутриклеточные NLR, так же как и мембранные TLR, взаимодействуют с молекулярными структурами микроорганизмов, что приводит к активации двух принципиально важных путей внутриклеточного сигналинга: 1) активация транскрипционного фактора NF-κB, его транслокация в ядро и запуск экспрессии генов цитокинов семейства ИЛ-1 и других провоспалительных цитокинов; 2) активация внутриклеточных белков, входящих в состав инфламмасомы, приводящая к образованию биологически активной каспазы-1 [25]. Таким образом, для продукции клетками биологически активного ИЛ-1β требуется как минимум два сигнала. Первый сигнал генерируется при взаимодействии компонентов патогена либо эндогенных молекул опасности с мембранными или внутриклеточными паттерн-распознающими рецепторами, обеспечивающими через NF-κB индукцию экспрессии гена и появление в цитоплазме неактивного предшественника ИЛ-1β. Второй сигнал связан с активацией инфламмасом, переводом прокаспазы-1 в активное состояние для обеспечения процессинга ИЛ-1β в биологически активную секреторную форму (рис. 3). Молекулярный процессинг ИЛ-1β с участием инфламмасом принципиально важен для противоинфекционной защиты организма. Knockout мыши с дефектными генами каспазы-1 или генами белков, составляющих инфламмасому, имели пониженную способность развивать воспалительную реакцию при внедрении патогенов и противоинфекционную резистентность [26]. Цитокины при нормальном и патологическом ответе на инфекцию. Экспериментальное блокирование ряда провоспалительных цитокинов путем направленного удаления генов либо с помощью моноклональных антител или растворимых рецепторов приводит к снижению резистентности животных к инфекциям, вызванным различными грамотрицательными и грамположительными микроорганизмами, указывая на важную роль цитокинов в противоинфекционной защите. И в экспериментальных и в клинических исследованиях продемонстрировано, что практически любой инфекционный процесс сопровождается активацией синтеза ИЛ-1, появлением белков этого семейства в тканях и увеличении уровней в циркуляции. Повышение концентрации провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНО и ИЛ-8, в тканях служит маркером местного воспалительного ответа при гнойно-деструктивных процессах и коррелирует с выраженностью местной воспалительной реакции [27–29]. Рис. 3. Схема активации синтеза и процессинга ИЛ-1β. Пояснения в тексте. При ответе на внедрение патогенов и травмы продукция ИЛ-1 и других провоспалительных цитокинов начинается в зоне первого контакта клеток-про- МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 дуцентов с микроорганизмами, т. е. местно в области повреждения кожи и слизистых оболочек и в региональной лимфоидной ткани. В связи с этим и первые проявления биологического действия ИЛ1 сводятся к активации местных защитных реакций, а именно: локальной гиперемии, отеку, инфильтрации тканей лейкоцитами [30], вызывая развитие воспаления со всеми его классическими проявлениями. Провоспалительное действие ИЛ-1 направлено на индукцию экспрессии нескольких основных групп генов и активацию процессов, играющих ключевые роли в развитии воспалительной реакции как местно в тканях, так и на системном уровне (см. табл. 1). На местном уровне цитокины семейства ИЛ-1 ответственны за все последовательные этапы развития адекватного ответа на внедрение патогена, обеспечение его локализации и удаления, а затем восстановления поврежденной структуры тканей, где бы ни развивалась воспалительная реакция. В случае несостоятельности местных защитных реакций воспаление продолжает развиваться, возрастает синтез цитокинов, они попадают в кровоток, и их действие проявляется на системном уровне. Начинается следующий этап воспаления — системная воспалительная реакция или острофазовый ответ на уровне организма. В этом случае провоспалительные цитокины оказывают влияние практически на все органы и системы организма, участвующие в формировании защитных реакций и в регуляции гомеостаза. На уровне целостного организма цитокины обеспечивают «сигнал тревоги», означающий, что настало время включить все резервы и перестроить работу всех систем организма для выполнения одной, но важнейшей для выживания задачи — борьбы с внедрившимся патогеном. При этом цитокины осуществляют связь между иммунной, нервной, эндокринной, кроветворной и другими системами и служат для их вовлечения в организацию и регуляцию единой защитной реакции. Видимо, такая система регуляции сформировалась эволюционно и несет безусловные выгоды для оптимального защитного ответа макроорганизма, поэтому нельзя ограничить понятие защитных реакций только участием механизмов врожденного и приобретенного иммунитета. В единой защитной реакции участвует весь организм и все системы, на первый взгляд не относящиеся к поддержанию иммунитета. И при развитии местного воспаления, и при острофазовом ответе на уровне организма, важную роль для нормальной регуляции гомеостаза играют количественные показатели синтеза цитокинов, в первую очередь провоспалительных, клетками различных органов и тканей. На местном уровне 25 длительное превышение физиологического уровня продукции цитокинов ведет к нарушениям нормальной структуры тканей и нарушениям нормального физиологического процесса регенерации с невозможностью полноценного восстановления строения органов и тканей, например формированием рубцов кожи, цирроза печени и пр. На системном уровне даже кратковременное неконтролируемое превышение физиологических уровней провоспалительных цитокинов может приводить к необратимым нарушениям гомеостаза, что наблюдается при развитии сепсиса и септического шока. В основе иммунопатогенеза сепсиса лежит системная воспалительная реакция на инфицирование микроорганизмами, сопровождающаяся активацией лейкоцитов, синтезом цитокинов и других медиаторов. При сепсисе местное воспаление не справляется с патогеном, и развивается системный воспалительный ответ организма на инфекцию. Это послужило основой для введения термина «синдром системного воспалительного ответа» (SIRS — systemic inflammatory response syndrome), применяемого для обозначения воспалительного ответа на уровне организма при различных состояниях, включая сепсис с бактериемией, а также состояниях без определяемой бактериемии, таких как травма и острые воспалительные заболевания отдельных органов, например острый панкреатит [31, 32]. Синтез большинства цитокинов, участвующих в регуляции воспаления, возрастает при развитии сепсиса и коррелирует с уровнями других лабораторных тестов, тяжестью клинических проявлений и исходом заболевания. Лабораторные данные определения уровней цитокинов свидетельствуют о том, что чем выше были уровни провоспалительных цитокинов (ФНО, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8) при поступлении больных с диагнозом «сепсис» в отделение интенсивной терапии, тем выше оказался уровень смертности [33]. В высоких концентрациях провоспалительные цитокины способны вызывать нейроэндокринные изменения, нарушения терморегуляции, активацию эндотелия, приводящую к увеличению выхода жидкости в ткани, расширению сосудов и снижению артериального давления (коллапс), диссеминированному внутрисосудистому свертыванию крови (ДВС-синдром), полиорганной недостаточности и гибели больного. Среди провоспалительных цитокинов перечисленные патологические изменения способен вызывать ФНО. Именно этот цитокин чаще всего называют «медиатором смерти». Введение рекомбинантного ФНО животным воспроизводит практически все симптомы септического шока и в высоких дозах вызывает их гибель. ФНО стал первым цитокином, об- 26 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 наруженным в повышенных концентрациях у больных с септицемией и менингококковым сепсисом. Уровень ИЛ-1β также оказался повышен в плазме крови больных сепсисом, однако это обнаружено не во всех исследованиях, тогда как ИЛ-1α вообще обнаруживался значительно реже. Самые высокие уровни ИЛ-1β выявлены у больных с менингококковым сепсисом. У них концентрации ИЛ-1β коррелировали с выраженностью бактериемии, тяжестью клинических проявлений и развитием септического шока. Другой член семейства ИЛ-1 — ИЛ-18 также оказался повышен у больных с сепсисом, и его уровень коррелировал с клиническими проявлениями сепсиса. Наиболее высокая степень корреляции с клинической картиной сепсиса получена при исследованиях уровней ИЛ-6 и ИЛ-10. Именно концентрация в плазме крови ИЛ-6 соответствовала клинической картине сепсиса по шкале APACHE II и могла быть критерием для прогнозирования исхода заболевания. Уровень этого цитокина также хорошо коррелировал с другими маркерами септического процесса: С-реактивным белком, компонентом комплемента С3а, лактатом и ФНО. В целом результаты изучения содержания различных цитокинов в плазме крови больных сепсисом, свидетельствуют, что при сепсисе возрастает содержание в плазме большинства провоспалительных цитокинов, многих хемокинов, колониестимулирующих факторов и других медиаторов, синтезируемых различными типами активированных клеток [33]. Важно, что антивоспалительные цитокины (ИЛ-10, РАИЛ и ТРФβ) и растворимые рецепторы ФНО и ИЛ-6 тоже синтезируются в повышенных количествах при сепсисе. Средние уровни ИЛ-10 и РАИЛ выше при септическом шоке по сравнению с сепсисом и выше у умерших больных по сравнению с выжившими. В целом наиболее высокие уровни ИЛ-10 встречаются у больных с наименее благоприятным течением сепсиса и плохим прогнозом, причем чем выше соотношение уровней ИЛ-10 и ФНО, тем хуже прогноз [34]. Данные о гиперпродукции антивоспалительных цитокинов у больных сепсисом привели к появлению понятия «синдром компенсаторного антивоспалительного ответа» (compensatory anti-inflammatory response syndrome — CARS). Считается, что CARS развивается вслед за системной воспалительной реакцией, выполняя функции ограничения гиперпродукции воспалительных цитокинов и системного воспаления, но у некоторых больных это может приводить к состоянию иммуносупрессии. При сепсисе могут последовательно развиваться две противоположные реакции: SIRS, а затем CARS. SIRS при выраженной гиперпродукции ци- токинов может закончиться развитием септического шока в течение нескольких часов. В то же время чем ярче проявления CARS и глубже подавление синтеза и активности провоспалительных защитных цитокинов, тем выше вероятность перехода инфекционного процесса во вторичное иммунодефицитное состояние с развитием гнойно-воспалительных осложнений, хронического септического состояния. Результаты изучения динамики изменений уровней цитокинов у больных позволяют заключить, что для сепсиса характерно двухстадийное развитие. На первой стадии наблюдается резкое увеличение синтеза провоспалительных цитокинов — «цитокиновый шторм», а далее происходит истощение их синтеза. Согласно клиническим данным, часть больных с сепсисом погибает в первые дни его развития в результате гиперпродукции цитокинов и острого развития системного воспалительного ответа. Однако у другой части больных, переживших эту острую фазу развития сепсиса, в последующие дни развивается иммуносупрессивное состояние, проявляющееся неспособностью далее бороться с первичной, вызвавшей септическое состояние, инфекцией. Кроме того, у таких пациентов возможно присоединение вторичной госпитальной инфекции, с которой в норме их иммунная система могла бы успешно справиться [35]. В данной ситуации вновь возможна активизация септического процесса с исходом в септический шок. Если CARS по своей выраженности менее глубок, вслед за ним следует возврат к исходному уровню синтеза цитокинов, нормальному функционированию иммунной системы и выздоровление больного. Возникновение септического шока и развитие патологических изменений в органах как следствие резкого повышения уровней провоспалительных цитокинов поставило вопрос о возможности терапевтического воздействия на систему цитокинов при сепсисе, а именно проведения антицитокиновой терапии, направленной на блокирование биологической активности или удаление цитокинов из циркуляции. Это стало поворотным моментом в изучении биологических функций цитокинов в целом, так как в данном случае цитокины из медиаторов защиты превратились в медиаторы патологии и стали не средствами, а мишенями патогенетически обоснованной терапии сепсиса. Основанием для формулирования концепции антицитокиновой терапии и начала клинических испытаний антицитокиновых препаратов у больных сепсисом послужили экспериментальные данные об увеличении их уровней в плазме крови больных и успешные опыты по блокированию цитокинов при экспериментальном сепсисе у животных. Уже более 30 лет назад были предприняты первые попытки проведения МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 иммуносупрессивной терапии больных с сепсисом, вызывающей подавление синтеза цитокинов, с использованием глюкокортикоидных гормонов, которые применяются в клинической практике и по сей день. В экспериментах на животных помимо удаления ФНО показана возможность применения блокады ИЛ-1, ИЛ-6, хемокинов и других медиаторов для предотвращения развития септического шока. В первую очередь это касается ИЛ-1, для блокады которого используется естественно существующий ингибитор — рецепторный антагонист ИЛ-1 (РАИЛ), являющийся по значимости второй после ФНО мишенью проведения антицитокиновой терапии. В качестве антицитокиновых препаратов в клинической практике используются гуманизированные или полностью человеческие моноклональные антитела против цитокинов, растворимые рецепторы и химерные конструкции рецепторов и Fc-фрагментов антител, связывающие цитокины, и природные ингибиторы, получаемые в виде рекомбинантных препаратов. Несмотря на ясные экспериментальные данные об эффективности блокады цитокинов для предотвращения септического шока на моделях у животных, клинические испытания всех без исключения вариантов антицитокиновой терапии не дали положительных результатов. Хотя в отдельных пилотных исследованиях получены обнадеживающие клинические данные, результаты проведения мультицентровых плацебоконтролируемых клинических испытаний на большом числе больных не привели к увеличению показателей выживаемости при сепсисе. Одной из возможных причин неудачи проведения такой терапии является изначально неправильная посылка из-за несоответствия мышиной модели индукции септического шока при введении ЛПС или ФНО и реальной картине развития сепсиса у человека. Другим объяснением отсутствия клинического эффекта при антицитокиновой терапии больных сепсисом может быть неправильный подход к ее проведению в плане удаления или блокирования лишь одного из провоспалительных цитокинов. Возможно другие провоспалительные цитокины, формирующие цитокиновую сеть при сепсисе полностью сохраняют биологическую активность и обусловливают развитие симптоматики сепсиса. Косвенным подтверждением этой гипотезы служат результаты успешного применения низких доз препаратов стероидных гормонов при сепсисе, как известно, подавляющих синтез сразу нескольких эндогенных цитокинов. С другой стороны, антицитокиновая терапия имеет несомненный успех при лечении аутоиммунных и аутовоспалительных заболеваний, в частности ревматоидного артрита, где назначение любого из 27 антицитокиновых препаратов (анти-ФНО или анти-ИЛ-1) приводит к явному клиническому улучшению и свидетельствует о взаимосвязи биологической активности провоспалительных цитокинов при формировании цитокиновой сети. Однако наиболее вероятным объяснением служит признание совершенно иной — защитной — роли цитокинов при сепсисе, а не только попытка представить их в качестве медиаторов развития патологических изменений в тканях. Видимо, цитокины нужно блокировать в очень короткий промежуток времени, когда они могут вызвать развитие септического шока. В другое время их удаление из организма может нанести вред больному, так как приведет к нарушению противоинфекционной защиты. Наличие иммунодефицита в определенный период развития сепсиса ставит вопрос и о возможности применения иммуностимулирующей терапии при сепсисе, в том числе иммуностимулирующей терапии цитокинами, например, рекомбинантными препаратами ИЛ-1 и ИЛ-2, но с обязательным учетом клинической стадии сепсиса и уровней эндогенных цитокинов. Безусловно, цитокины служат важнейшими факторами иммунопатогенеза сепсиса. Однако именно при сепсисе для системы цитокинов впервые продемонстрирована применимость философского закона перехода количества в качество, когда физиологические уровни цитокинов выполняют защитные функции по борьбе с инфекционными агентами, но повышение их концентраций приводит к совершенно иным биологическим эффектам и может вызвать патологию и даже гибель организма. По-видимому, роль цитокинов в патогенезе сепсиса двояка, а их биологические эффекты, как уже указывалось, зависят от концентрации в циркуляции и в тканях. Цитокины в патогенезе ревматоидного артрита. Ревматоидный артрит (РА) — яркий пример неинфекционного заболевания, где целый ряд цитокинов играет существенную роль в развитии тканевого воспаления и формировании клинических симптомов поражения суставов. Несмотря на то, что этиология большинства аутоиммунных заболеваний остается неизвестной, многие аспекты их иммунопатогенеза изучены достаточно подробно. Помимо безусловного влияния генетических факторов, например носительства определенных генов главного комплекса гистосовместимости, для развития многих аутоиммунных процессов большое значение имеют цитокины, регулирующие все стороны иммунологической реактивности. При развитии иммунопатологических процессов нарушения в работе иммунной системы и клинические проявления во многом зависят от баланса клонов Тх1 и Тх2, а также Тх17, основанного на соотношении 28 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 продукции ими нескольких семейств цитокинов. Активация одного из типов Т-хелперных клонов может направить иммунный ответ по определенному пути развития и вызвать формирование иммунопатологических состояний, в частности связанных с проявлениями аутоиммунитета. Ревматоидный артрит — аутоиммунное заболевание, поражающее главным образом синовиальную оболочку, хрящевую и костную ткань суставов. Цитокины являются одними из главных медиаторов развития патологических изменений в ткани суставов при РА, выступая в роли посредников между активацией иммунной системы в результате индукции аутоиммунитета, развитием хронического воспалительного процесса и деструкцией суставов. Аутоиммунные нарушения при развитии РА возникают задолго до клинических проявлений поражения суставов и заключаются в формировании аутоантител к IgG, известных под названием «ревматоидные факторы» и аутоантител к циклическим цитруллинированным пептидам, коллагену II типа и гликопротеину 39. Эта «досуставная» стадия иммунопатогенеза РА может продолжаться несколько лет, причем механизмы нарушения толерантности Т- и В-лимфоцитов, ведущие к развитию аутоиммунных нарушений, остаются нераскрытыми. Вслед за этим у генетически предрасположенных индивидуумов начинается развитие суставной фазы заболевания, собственно суставных клинических проявлений РА. Тканевые проявления в области суставов начинаются с гиперплазии синовиальной оболочки. В норме она содержит единичные клетки, но при развитии аутоиммунного воспаления становится инфильтрированной синовиальными фибробластами, активированными макрофагами, тучными клетками, CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитами, В-лимфоцитами, НКи НКТ-клетками. Все эти типы клеток активированы участием в аутоиммунном воспалении и синтезируют целый спектр провоспалительных и иммунорегуляторных цитокинов и хемокинов. Именно цитокины в настоящее время считаются основными факторами иммунопатогенеза РА на стадии суставных проявлений [36]. Синтезируемые цитокины в первую очередь действуют местно в области суставной сумки, усиливая проявления воспалительной реакции и привлекая в данную зону другие клетки. В то же время повышенный синтез цитокинов в области воспаленного сустава может приводить к хроническому возрастанию их концентрации в кровотоке и к развитию системных проявлений биологического действия. Хроническое увеличение уровня ИЛ-1, ФНО и ИЛ-6 в циркуляции приводит к развитию нарушения метаболизма костной ткани на уровне организма, ведущего к появлению клинических признаков остеопороза трубчатых костей. ИЛ-6 стимулирует синтез острофазовых белков в печени, а ФНО вмешивается в метаболизм липидов, вызывая кахексию. Хронически высокий уровень провоспалительных цитокинов также вызывает центральные нарушения, связанные с развитием депрессии и снижением познавательной активности. Центральную роль в патогенезе РА играют Т-лимфоциты, запускающие развитие тканевых проявлений РА в синовиальной оболочке суставов. Первоначальные исследования, проведенные на модели хронического коллаген-индуцированного артрита у мышей и крыс, позволили предположить, что развитие артрита связано в первую очередь с популяцией Т-лимфоцитов хелперов 1 типа (Тх1), активация которых приводит к синтезу ИЛ-2, ИФНγ и ФНО. Однако опыты на knockout мышах, искусственно лишенных генов данных цитокинов, не подтвердили эту гипотезу. Оказалось, что удаление генов ИФНγ или рецептора ИФНγ приводило к усилению проявлений артрита, а не к лечебному эффекту, как это ожидалось. Примерно то же получилось в экспериментах с удалением гена субъединицы р35 ИЛ-12 — цитокина, стимулирующего дифференцировку Тх1 [37]. Следовательно развитие артрита не зависит от субпопуляции Тх1, более того, цитокины этих Т-хелперных клонов могут даже защищать животных от симптомов артрита. Ситуация прояснилась после открытия нового типа Т-хелперных клонов — Т-хелперов, синтезирующих цитокины семейства ИЛ-17 (Тх17). Проведенные эксперименты показали, что мыши, лишенные гена ИЛ-23 (р19), индуцирующего дифференцировку Тх17, либо гена самого ИЛ-17 резистентны к развитию экспериментального коллаген-индуцированного артрита [38]. Таким образом, Т-клеточные клоны Тх17 могут оказаться важными индукторами артрита. У больных РА в синовиальной оболочке обнаружены плазмацитоидные и миелоидные дендритные клетки, которые вместе с синовиальными макрофагами синтезируют широкий спектр цитокинов, способных индуцировать дифференцировку наивных Т-лимфоцитов в любом направлении. В синовиальной жидкости при анализе экспрессии генов цитокинов по уровню мРНК и при иммуноцитохимическом анализе показано, что клетки синовиальной оболочки синтезируют ИЛ-12 и ИЛ-18, направляющие дифференцировку Т-лимфоцитов в сторону Тх1, ИЛ-4 — в сторону Тх2, а также ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-23 для развития Тх17. В отличие от экспериментов на животных, где доказана патогенетическая роль Тх17 в развитии артрита, у больных РА пока отсутствуют убедительные доказательства преиму- МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 щественной активации одного из типов Т-хелперов. Тем не менее в целом активация CD4+ Т-лимфоцитов хелперов аутоантигенами соединительной ткани суставов считается доказанной, и Тх17, безусловно, принимают активное участие в этом процессе. Синовиальные Т-лимфоциты активируют тканевое воспаление за счет синтеза цитокинов, главным образом цитокинов семейства ИЛ-17. Цитокины этого семейства стимулируют созревание и функциональную активацию нейтрофильных гранулоцитов, моноцитов и синовиальных фибробластов, синтез ими провоспалительных цитокинов и хемокинов, продукцию простагландинов и металлопротеиназ. Провоспалительные цитокины (семейства ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО) запускают каскад активирующих сигналов, приводящих к значительному усилению воспалительной реакции и вовлечению в развитие воспаления практически всех без исключения клеток, находящихся в синовиальной оболочке. Параллельно за счет синтеза различных хемокинов происходит активное привлечение в ткани практически всех типов лейкоцитов из сосудистого русла, которые активируются под влиянием синтезируемых цитокинов. Тем самым замыкается положительная петля обратной связи, приводящая к еще большей активации воспаления в ткани сустава. Синтез цитокинов и индукция воспаления при РА тесно связаны с разрушением хрящевой и костной ткани в области суставов. При развитии воспаления суставов под влиянием провоспалительных цитокинов происходит активация хондроцитов, переходящих в активное катаболическое состояние, характеризующееся синтезом матриксных металлопротеиназ, коллагеназы и других ферментов, разрушающих хрящевую ткань [39]. Помимо различных субпопуляций Т-лимфоцитов хелперов в синовиальной оболочке и синовиальной жидкости больных РА обнаружены регуляторные Т-лимфоциты (Трег) с фенотипом FoxP3+CD4+CD25+, однако их функциональная активность существенно снижена, и эти клетки не способны подавить развитие аутоиммунного воспаления при РА. Возможно, такое подавление Трег связано с прямым или опосредованным действием ФНО и других провоспалительных цитокинов, так как после проведения антицитокиновой терапии (анти-ФНО) функциональная активность Трег, выделенных из полости суставов восстанавливалась [40]. Более того, обнаружено, что у Трег, выделенных от больных РА, активность транскрипционного фактора FoxP3 и, соответственно, иммуносупрессорная активность Трег специфически блокирована путем дефосфорилирования по сайту Ser418 ферментом протеинфосфатазой 1, чья экспрессия в синовиальных клетках стимулирует- 29 ся ФНО. Сниженная функция Трег у больных РА коррелировала с увеличением числа CD4+ Т-лимфоцитов, синтезирующих ИЛ-17 и ИФН-γ [41]. Таким образом, ФНО не только обладает прямым провоспалительным действием, но способен также подавлять функции Трег лимфоцитов. Не менее важна и роль цитокинов семейства ИЛ-1 (ИЛ-1α, ИЛ-1β и ИЛ-18), экспрессия которых тоже обычно повышена у больных РА. Доказательством значения ИЛ-1 служит то, что в опытах на knockout мышах удаление гена естественного ингибитора ИЛ-1 — РАИЛ — приводило к спонтанному развитию эрозивного артрита по механизму активации функций Тх17 [42]. По сути это вело к нарушению нормального баланса в семействе ИЛ-1 и возможности проявления действия агонистов. Сейчас данные наблюдения подтверждены у человека. Оказалось, что у лиц с достаточно редкой мутацией регуляторных белков в составе инфламмасомы, приводящей к гиперпродукции ИЛ-1β, развивается спонтанная системная воспалительная реакция, сопровождающаяся развитием симптомов артрита [43]. Роль ИЛ-1 в патогенезе РА доказана и великолепными результатами проведения антицитокиновой терапии у больных с использованием препаратов РАИЛ. Удивительным кажется то, что и блокирование ФНО, и блокирование ИЛ-1, а как показали последние клинические исследования, также ИЛ-6 и ИЛ-17 у больных РА приводят к практически одинаковым клиническим эффектам, заключающимся в значительном улучшении клинической симптоматики. Таким образом, в результате развития аутоиммунного процесса при РА происходит значительное изменение синтеза нескольких групп цитокинов, приводящее к формированию аутоиммунного воспаления, патологических изменений суставов и клинической картины заболевания. Наибольшее значение в иммунопатогенезе РА имеют следующие группы провоспалительных цитокинов: цитокины семейства ИЛ-1 (ИЛ-1α, ИЛ-1β, ИЛ-18 и, вероятно, ИЛ-36); цитокины семейства ФНО, ИЛ-6, цитокины, продуцируемые Тх17, прежде всего ИЛ-17А и ИЛ-17F, определяющие тип развития тканевого воспаления и запускающие синтез ИЛ-1 и ФНО. Перечисленные цитокины самостоятельно либо посредством индукции синтеза других медиаторов активируют функциональную активность всех типов клеток, участвующих в развитии воспаления и поражения суставов. Цитокины — ведущие медиаторы развития патологии при метаболическом синдроме. В 1988 г. G. Reaven описал симптомокомплекс, включавший гиперинсулинемию, нарушение толерантности к глю- 30 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 козе, гипертриглицеридемию, низкий уровень липопротеинов высокой плотности и артериальную гипертензию, объединив их под названием «синдром X», который в дальнейшем получил название «метаболический синдром». Описанные нарушения связаны единым происхождением — первичной инсулинорезистентностью (снижением ответа инсулинчувствительных тканей на инсулин при его достаточной концентрации) и сопутствующей компенсаторной гиперинсулинемией, служащей причиной возникновения и развития метаболических, гемодинамических и органных нарушений, приводящих в конечном итоге к развитию сахарного диабета 2-го типа, атеросклероза и ишемической болезни сердца. Метаболический синдром — это комплекс метаболических, гормональных и клинических нарушений, являющихся факторами риска развития сердечно-сосудистых заболеваний, клинической манифестации в виде сахарного диабета, артериальной гипертензии и атеросклеротических поражений сосудов. Важнейший компонент метаболического синдрома — увеличение массы жировой ткани, в основном по типу абдоминального ожирения. Жировая ткань способствует развитию инсулинорезистентности, так как существует прямая зависимость между степенью развития абдоминально-висцеральной жировой ткани и выраженностью инсулинорезистентности, однако пока окончательно не изучены все возможные причины и механизмы развития инсулинорезистентности при абдоминальном ожирении, не все составляющие метаболического синдрома можно четко связать и объяснить инсулинорезистентностью. Возможно, в развитии метаболического синдрома участвуют некоторые цитокины, активно синтезируемые клетками жировой ткани. Адипокины. Действительно, существует особая группа цитокинов, не связанных ни структурно, ни функционально, но синтезируемых клетками жировой ткани и поэтому названных адипоцитокинами или адипокинами. К адипокинам относятся лептин, адипонектин, резистин, ретинол-связывающий протеин 4 (retinol-binding protein 4, RBP4), липокалин 2, ангиопоэтин-подобный белок, а также ряд известных цитокинов из других семейств, которые могут синтезироваться клетками жировой ткани: ФНО, ИЛ-6, ИЛ-18, хемокины CCL2, CXCL5 и некоторые другие медиаторы [44]. Интерес к адипокинам возник в связи с ростом в мире числа людей, страдающих ожирением и взаимосвязанными метаболическими нарушениями и сердечно-сосудистыми заболеваниями. При ожирении соотношение клеток жировой ткани и остальных клеток организма существенно возрастает, соответственно повышается и уровень продукции адипокинов, попадающих в циркуляцию и способных оказать влияние на целый ряд физиологических процессов. В жировой ткани адипокины синтезируются тремя основными группами клеток: 1) собственно адипоцитами; 2) фибробластами, представляющими собой клетки стромы жировой ткани и потенциально способными дифференцироваться в адипоциты; 3) макрофагами, особенно интенсивно инфильтрирующими жировую ткань при ожирении. Двумя основными цитокинами, синтезируемыми адипоцитами и обладающими важнейшими регуляторными функциями, являются лептин и адипонектин [45]. Их рецепторы широко распространены на клетках сердечно-сосудистой и иммунной систем. Экспрессия гена в жировой ткани и уровень лептина в кровотоке коррелируют с массой тела. Концентрация лептина в плазме периферической крови при ожирении может достигать нескольких десятков нанограмм в миллилитре. Продукция лептина возрастает под действием ФНО и других провоспалительных цитокинов, инсулина и эстрогенов. Люди с очень редким генетическим дефектом, связанным с отсутствием лептина, имеют повышенный аппетит и страдают ожирением. У них выявлены выраженная гиперлипидемия, гиперинсулинемия, резистентность к инсулину, нейроэндокринные и иммунные нарушения. У таких больных это состояние может быть частично скорректировано введением лептина. Лептин может проявлять свое действие непосредственно в месте синтеза в жировой ткани и попадая в циркуляцию, где он достигает гипоталамуса, регулирует синтез тиротропина и влияет на энергетический обмен. Лептин также участвует в процессах заживления ран путем активации неоангигенеза и важен для нормального функционирования плаценты. Центральное действие лептина заключается в снижении аппетита. С одной стороны, это может служить механизмом отрицательной обратной связи в регуляции формирования жировых запасов. С другой стороны, лептин может быть одним из медиаторов действия провоспалительных цитокинов, как известно, снижающих аппетит, действуя через ЦНС. Синтез лептина, но не адипонектина индуцируется провоспалительными цитокинами, ФНО и ИЛ-1. Возможно и существование еще одной петли отрицательной обратной связи. При ожирении растет синтез адипоцитами и уровень ФНО в плазме, но ФНО является известным фактором, вызывающим снижение массы тела и даже истощение (кахексию). Отсюда одно из его первых названий — кахектин. Свое действие ФНО оказывает, 31 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 стимулируя активность фермента липопротеинлипазы, препятствующей усвоению жирных кислот и накоплению нейтральных липидов в адипоцитах, приводя к снижению запасов жира в организме. Уровни ФНО и ИЛ-6 возрастают в плазме периферической крови лиц, страдающих ожирением, но снижаются при уменьшении массы тела [46, 47]. Лептин служит митогенным фактором и стимулирует пролиферацию целого ряда клеток: клетокпредшественников гемопоэза, клеток эндотелия, нормальных и трансформированных эпителиальных клеток. Одновременно лептин проявляет антиапоптотическое действие. По-видимому, синтез лептина в развивающейся жировой ткани нужен для процесса неоваскуляризации. Повышенный синтез лептина и увеличение его уровня в циркуляции может создавать выгодные условия для роста опухолей, где развитие новых сосудов критично для инвазивного роста. Именно поэтому ожирение может быть и блокирует индуцированный лептином синтез ФНО макрофагами. Резистин также снижает резистентность к инсулину и усиливает утилизацию глюкозы клетками различных тканей. Истинные адипокины, синтезируемые адипоцитами, оказывают влияние на тканевое воспаление и иммунологические реакции путем взаимодействия со специфическими рецепторами, экспрессируемыми многими клетками иммунной системы. Естественно, этим действием обладают провоспалительные и другие цитокины, синтезируемые адипоцитами и различными другими клетками в составе жировой ткани. Лептин, адипонектин и резистин главным образом оказывают иммуномодулирующее действие и влияют на сосуды, эндотелий и гладкомышечные клетки. Действие адипокинов на основные физиологические процессы, суммированное в таблице 2, свидетельствует о существовании по крайней мере двух цитокинов, лептина и адипонектина с противополоÒàáëèöà 2 Âëèÿíèå àäèïîêèíîâ íà íåêîòîðûå ôèçèîëîãè÷åñêèå ïðîöåññû îðãàíèçìà Àäèïîêèíû Âëèÿíèå íà èììóííóþ ñèñòåìó Âëèÿíèå íà ñîñóäû Âëèÿíèå íà ìåòàáîëè÷åñêèå ïðîöåññû Ëåïòèí Ïðîâîñïàëèòåëüíîå äåéñòâèå. Àêòèâàöèÿ ýíäîòåëèÿ, ïðèâîäÿùàÿ Âûçûâàåò ãèïåðëèïèÀêòèâàöèÿ ôóíêöèé ëåéêîöèòîâ, ê ôóíêöèîíàëüíûì íàðóøåíèÿì, äåìèþ, ãèïåðèíñóëèÍÊ êëåòîê, Ò-ëèìôîöèòîâ (Òõ1), óñèëåíèå ðàçâèòèÿ àòåðîñêëåðîçà. íåìèþ, ðåçèñòåíóñèëåíèå ñèíòåçà ïðîâîñïàëèòåëü- Óðîâåíü â ïëàçìå êîððåëèðóåò ñ ïî- òíîñòü ê èíñóëèíó íûõ öèòîêèíîâ (ÔÍÎ, ÈË-6) âûøåííûì àðòåðèàëüíûì äàâëåíèåì Àäèïîíåêòèí Àíòèâîñïàëèòåëüíîå äåéñòâèå. Ïðîòåêòèâíîå äåéñòâèå íà ñîñóäû. Ïðåäîòâðàùàåò ðåçèñÏîäàâëåíèå àêòèâàöèè êëåòîê èìÓðîâåíü â ïëàçìå îòðèöàòåëüíî òåíòíîñòü ê èíñóëèíó, ìóííîé ñèñòåìû è ñèíòåçà ïðîâîñ- êîððåëèðóåò ñ óðîâíåì ëèïèäîâ óñèëèâàåò óòèëèçàöèþ ïàëèòåëüíûõ öèòîêèíîâ. Óâåëè÷å- íèçêîé ïëîòíîñòè ãëþêîçû íèå ñèíòåçà ÈË-10 фактором риска для развития рака именно за счет повышенного синтеза ангиогенных адипокинов [48], и в этом может заключаться причина роста заболеваемости раком при метаболическом синдроме. В отличие от лептина синтез адипонектина в жировой ткани отрицательно коррелирует с массой тела и подавляется при ожирении. В норме уровень адипонектина в плазме в сравнении с другими цитокинами очень высокий — 5–10 мг/мл. У тучных людей уровни циркулирующего адипонектина снижены. Функции адипонектина в целом противоположны биологическому действию лептина. В основном это противовоспалительное, антидиабетическое и защитное в отношении сосудов действие. Физиологическая роль адипонектина сводится к усилению чувствительности клеток к действию инсулина либо предотвращению резистентности к инсулину. Адипонектин также стимулирует функции эндотелия жным типом биологической активности, уровень которых в плазме прямо зависит от степени развития либо просто объема жировой ткани в организме. Ожирение часто сопровождается изменениями состояния эндотелия, сосудистыми нарушениями и симптомами системного воспалительного ответа, вызванного дисрегуляцией синтеза цитокинов, главным образом уникальных цитокинов, синтезируемых клетками самой жировой ткани. Эти изменения могут служить одним из объяснений резкого увеличения числа сердечно-сосудистых заболеваний у лиц с избыточной массой тела. Главный вывод по изучению адипокинов заключается в том, что увеличение объема жировой ткани сопровождается синтезом провоспалительных цитокинов (адипокинов), стимулирующих воспалительные изменения в тканях. Формирование хронического воспаления служит причиной развития патологии, сопутствующей ожи- 32 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 рению (более подробно механизмы этих процессов рассмотрены ниже). По-видимому, жировая ткань больше не может считаться просто органом сохранения запасов энергии. Скорее, это настоящий эндокринный и иммунный орган со своими функциями, проявляющимися в регуляции физиологии организма и в развитии нарушения обменных процессов и сердечно-сосудистой патологии. Более точные молекулярные механизмы участия цитокинов в патогенезе нарушений при метаболическом синдроме стали проясняться при изучении их влияния на развитие стерильного воспаления под влиянием эндогенных DAMP, концентрация которых резко возрастает в тканях и в циркуляции при развитии этого состояния. Несмотря на отсутствие видимых признаков инфекции либо аутоиммунной природы длительной активации клеток иммунной системы, хроническое воспаление при ожирении является триггером формирования патологических процессов при этом состоянии, включая диабет 2-го типа, атеросклероз, дисфункции нервной системы и вторичное иммунодефицитное состояние. Как описано выше, эти процессы напрямую связаны с адипокинами, активно секретируемыми клетками жировой ткани. Вновь оказывается, что тогда как синтез цитокинов при инфекции является защитным механизмом, при ожирении они могут стать причиной формирования патологии, и это связано с активацией их синтеза при взаимодействии паттерн-распознающих рецепторов с DAMP. При ожирении DAMP представлены свободными жирными кислотами, кристаллами мочевой кислоты, β-амилоидом, соединениями кремния и рядом других эндогенных молекул, концентрация которых значительно возрастает при метаболическом синдроме. При этом, некоторые DAMP, например свободные жирные кислоты, взаимодействуют с мембранными толл-подобными рецепторами, тогда как многие другие способны связываться с цитоплазматическими рецепторами в составе инфламмасомы и активировать продукцию биологически активных ИЛ-1β и ИЛ-18 с последующим развитием классической воспалительной реакции [49]. Авторы продемонстрировали, что экспериментальное блокирование функции инфламмосом у животных приводит к снижению синтеза провоспалительных цитокинов в жировой ткани и печени, подавлению воспаления и снижению резистентности к инсулину. Следовательно, инфламмасомы воспринимают эндогенные DAMP и участвуют в развитии хронического воспаления при ожирении и метаболическом синдроме и в формировании инсулинорезистентности. Особенно ярко это проявляется при анализе роли инфламмасом и ИЛ-1 в развитии сахарного диабета. Диабет. Развитие диабета 1-го типа связано с аутоиммунными механизмами деструкции клеток островков поджелудочной железы, тогда как диабет 2-го типа характеризуется развитием аутовоспалительного процесса с появлением вначале резистентности тканей к инсулину с последующим нарушением основной функции β-клеток островков и снижением синтеза инсулина [50]. Патогенез диабета 2-го типа безусловно связан с ожирением и хроническим вялотекущим воспалительным процессом, сопровождающимся синтезом провоспалительных цитокинов, в том числе ИЛ-1. ИЛ-1β давно известен в качестве медиатора, индуцирующего апоптоз β-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы, что приводит к развитию диабета 1-го типа [51]. В биопсийном материале поджелудочной железы больных диабетом 2-го типа обнаружена повышенная продукция ИЛ-1β, причем увеличение уровня глюкозы служит индуцирующим фактором для синтеза ИЛ-1β, который способен запускать апоптоз β-клеток. Таким образом, усиление местной продукции ИЛ-1β клетками островков Лангерганса может приводить к прогрессивному нарушению инсулинсинтезирующей функции поджелудочной железы [52]. У больных диабетом 2-го типа на фоне метаболического синдрома ИЛ-1 также может служить фактором раннего начала и более быстрой прогрессии нарушений функции поджелудочной железы. Открытие процессинга ИЛ-1β с участием инфламмасом дало существенный толчок в понимании механизма участия данного цитокина в развитии патологии. Выяснилось, что при диабете созревание биологически активного ИЛ-1β происходит главным образом с участием одного из известных типов инфламмасом — NLRP3 инфламмасом, состоящих из цитоплазматического белка NLRP3 (nucleotide-binding domain, leucine-rich-containing family, pyrin domain-containing-3), распознающего как структуры патогенов, так и эндогенные молекулы опасности; белка ASC (apoptosis associated speck-like protein containing a CARD) и прокаспазы-1 [53]. Именно NLRP3-инфламмасомы служат сенсорами метаболических нарушений, отвечая активацией синтеза ИЛ-1β, развитием хронического воспалительного процесса в ткани поджелудочной железы, что приводит к нарушению синтеза инсулина клетками Лангерганса и общему повышению резистентности к инсулину при метаболическом синдроме. Общая схема развития диабета 2-го типа при метаболическом синдроме может быть представлена следующим образом (рис. 4). Ожирение приводит к метаболическому стрессу, появлению и повышению концентрации в циркуля- МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 33 Рис. 4. Роль цитокинов в патогенезе диабета 2-го типа при метаболическом синдроме. ции и в ткани поджелудочной железы свободных жирных кислот, липопротеинов низкой плотности, βамилоида, холестерина, солей мочевой кислоты (уратов натрия), пирофосфата кальция и ряда других молекул, которые относятся к группе эндогенных молекул опасности. Это приводит, с одной стороны, к их связыванию толл-подобными рецепторами с запуском синтеза ИЛ-1β и других провоспалительных цитокинов и, с другой стороны, к взаимодействию с цитоплазматическими сенсорами DAMP, активации инфламмасомы и процессингу предшественника ИЛ-1β в биологическую активную форму с последующим развитием тканевого воспаления и повреждением клеток Лангерганса [54, 55]. В то же время клетки избыточно развившейся жировой ткани сами синтезируют несколько провоспалительных цитокинов и главный адипокин — лептин. Лептин, достигая ткани поджелудочной железы, способен дополнительно стимулировать синтез ИЛ-1β и подавлять синтез рецепторного антагониста ИЛ-1, меняя соотношение в системе ИЛ-1 в сторону продукции провоспалительного медиатора [56]. У больных диабетом 2-го типа блокирование ИЛ-1 путем введения препарата РАИЛ анакинры уже дало положительные клинические результаты [57]. В клинических испытаниях продемонстрировано, что антагонисты ИЛ-1 (анакинра, моноклональные антитела против ИЛ-1) вызывают снижение уровня глюкозы в крови, повышают секрецию инсулина. Антагонисты ФНО не обладают таким действием, подтверждая специфичность ИЛ-1-зависимо- го механизма развития диабета. В настоящее время проводятся клинические испытания анакинры и у больных сахарным диабетом 1-го типа. Атеросклероз. В настоящее время существует точка зрения, согласно которой в развитии атеросклероза основное значение имеет воспаление в области стенки сосуда, связанное с нарушениями липидного обмена и вызванное главным образом липопротеинами низкой плотности (ЛПНП). Отложения ЛПНП в стенке артерий приводят к образованию атеросклеротических бляшек — главного морфологического признака развития атеросклероза сосудов. В процессе отложения ЛПНП происходит активация синтеза эндотелиальными и гладкомышечными клетками хемокина MCP-1, основной функцией которого является привлечение в ткани макрофагов. Привлечение в область отложения ЛПНП макрофагов под действием MCP-1 является важнейшим фактором дальнейшего развития атеросклеротической бляшки. Привлеченные макрофаги, пытаясь очистить стенку сосуда от избытка липидов, активно захватывают холестерин и ЛПНП с помощью так называемых рецепторов-мусорщиков (scavenger receptors) и постепенно превращаются в пенистые клетки. Атеросклеротические бляшки содержат наполненные липопротеинами пенистые клетки, а также макрофаги, находящиеся на разных стадиях активации, тучные клетки и лимфоциты. Развитие воспаления, лежащее в основе распада бляшек и нарушения целостности стенки сосудов, связано с типичным механизмом активации клеточных Toll-подобных рецепторов 34 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 (TLR) и индукции синтеза каскада провоспалительных цитокинов. В области бляшки TLR экспрессируются моноцитами, макрофагами, эндотелиальными, дендритными и тучными клетками. Откладывающиеся в области атеросклеротической бляшки окисленные ЛПНП могут служить эндогенными лигандами TLR, главным образом TLR-4. Лигандами TLR в зоне бляшки также служат белки теплового шока и компоненты микроорганизмов, проникающих в бляшки, например ЛПС или белки хламидий, которые, как сейчас считается, таким способом могут участвовать в развитии атеросклероза. Взаимодействие всех этих лигандов с TLR приводит к активации стандартного сигнального пути с участием NF-κB, приводящего к синтезу провоспалительных цитокинов, хемокинов, молекул адгезии, различных типов протеаз, простагландинов, кислородных и азотных радикалов [58]. Как и в случае диабета 2-го типа, в развитии воспаления в стенке сосуда по описанному механизму активации рецепторов врожденного иммунитета принимают участие ЛПНП и холестерин, служащие в данном случае главными эндогенными молекулами опасности, активирующими тканевое воспаление путем синтеза провоспалительных цитокинов [54]. Дальнейшее развитие воспалительной реакции представляет собой основное проявление врожденного иммунитета и приводит к активации процесса формирования бляшки, привлечению новых клеток, полному закрытию просвета сосуда или переходу бляшки в стадию распада с образованием тромбов, также способных закупорить сосуды по ходу кровотока и вызвать серьезные осложнения. Развитие атеросклеротической бляшки проходит также с участием Т-лимфоцитов хелперов (CD4+), секретирующих ИЛ-2, ИФНγ и ФНО [59]. Эти цитокины служат дополнительными факторами активации макрофагов, лимфоцитов и увеличения воспалительной реакции в зоне бляшки, усиливая процессы ее роста и распада. Основными проатерогенными цитокинами являются ИЛ-12, ИЛ-18 и ИФНγ. Все они связаны с дифференцировкой Т-лимфоцитов хелперов 1-го типа, роль которых в развитии атеросклероза считается твердо установленной [60]. Возможно, в патогенезе атеросклероза также активно участвуют цитокины Т-хелперов 17 и некоторые цитокины Т-хелперов 2 типа, например ИЛ-4 [60]. Активация эндотелиальных клеток является важной составляющей развития воспалительного процесса. Под действием провоспалительных цитокинов эндотелиоциты экспрессируют адгезионные молекулы ICAM-1, VCAM-1, поверхностные E- и P-селектины, играющие ключевую роль в прикреплении лейкоцитов и тромбоцитов к поверхности эндотелия и их экстравазации. Т-лимфоциты и макрофаги секретируют несколько цитокинов, вызывающих активацию гладкомышечных клеток сосудов и индукцию апоптоза этих клеток. К ним относятся ИФНγ, ФНО, Fas-лиганд и ИЛ-1α. Апоптоз гладкомышечных клеток приводит к сокращению их числа в зоне атеросклеротической бляшки, снижению уровня синтеза белков экстраклеточного матрикса, предрасполагающего к снижению плотности и развитию процесса распада бляшки. Кроме того, апоптотические гладкомышечные клетки синтезируют тканевой фактор, стимулирующий тромбообразование. Цитокины при ишемии тканей (на примере инфаркта миокарда). Накапливается все больше данных, что эндогенные молекулы опасности — DAMP (см. выше) продуцируются клетками поврежденных тканей миокарда при ишемии-реперфузии и вызывают развитии воспаления [3, 61, 62]. В экспериментах на животных выяснено, что повреждение тканей в ответ на ишемию с последующей реперфузией связано с активацией синтеза цитокинов клетками ишемизированных тканей с последующей активацией резидентных макрофагов и нейтрофильных гранулоцитов [63]. Первоначально описанные как рецепторы врожденного иммунитета, необходимые для защиты от патогенов, толл-подобные рецепторы взаимодействуют не только со структурами микроорганизмов, но и с DAMP, запуская одинаковый внутриклеточный путь сигналинга, приводящий к синтезу провоспалительных цитокинов и формированию типичной тканевой воспалительной реакции [64]. Поврежденные и погибшие в результате ишемии миокарда кардиомиоциты выбрасывают в межклеточное пространство белок теплового шока 60 (БТШ60), белок HMGB1 (high mobility group protein B1), гиалуроновую кислоту, фибронектин и кардиомиозин. Все они служат эндогенными DAMP и являются лигандами толл-подобных клеточных рецепторов [65]. Механизмы повреждения после активации толл-подобных рецепторов заключаются в развитии асептического воспаления без участия патогенов и сводятся к выбросу кислородных радикалов, дегрануляции лейкоцитов с выходом в ткани протеолитических ферментов и эластазы, активной продукции метаболитов арахидоновой кислоты, в частности простагландинов и фактора, активирующего тромбоциты [66]. Среди цитокинов важная роль в механизмах развития повреждения тканей при гипоксии с последующей реперфузией отводится хемокинам, активирующим гранулоциты, главным образом ИЛ-8. Реперфузия органов после временной ишемии происходит при инфаркте миокарда, спазмах мозговых МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 сосудов, мультиорганной недостаточности при сепсисе и ряде других состояний. Во всех случаях восстановление кровотока в тканях вызывает гораздо большие повреждения, чем в период ишемии, и механизм этого явления во многом связан с повышенным синтезом хемокинов, вызывающих привлечение и активацию нейтрофильных гранулоцитов и генерацию ими кислородных радикалов, повреждающих ткани. Участие ИЛ-8 в этом процессе доказано в эксперименте, когда введение антител к эндогенному ИЛ-8 при искусственной ишемии-реперфузии легких у кролика приводило к резкому снижению накопления нейтрофилов и отсутствию симптомов повреждения ткани [67]. Большинство цитокинов в норме конститутивно не экспрессируются в тканях сердца. Провоспалительные цитокины ФНО, ИЛ-1β и ИЛ-6 начинают синтезироваться в сердце в ответ на повреждение миокарда, например, при инфаркте в течение первых часов после наступления ишемии. При легкой степени ишемии, как в случае нестабильной стенокардии, синтез провоспалительных цитокинов может вернуться к исходному уровню через несколько дней. При инфаркте с повреждением ткани синтез цитокинов может продолжаться несколько недель и соответствовать процессу длительного заживления ткани и формирования рубца. Повышенные уровни некоторых цитокинов в плазме крови могут служить прогностическим критерием при стенокардии. Так, уровень ИЛ-6 в циркуляции положительно коррелировал с более неблагоприятным прогнозом при нестабильной стенокардии и при инфаркте миокарда. У этих же больных оказались повышены уровни ИЛ-7, ИЛ-8 и растворимой формы CD40 лиганда [68]. Само изменение интенсивности кровотока в ишемизированном миокарде посредством участия механосенсоров уже может служить сигналом к началу синтеза провоспалительных цитокинов. В экспериментах у крыс синтез ИЛ-6 и ФНО в центральной зоне ишемии миокарда начинался уже через 30 мин [69]. Затем гипоксия приводит к росту уровня кислородных радикалов в ткани, осмотическим нарушениям и повреждению мембран клеток. Все эти процессы связаны с запуском синтеза провоспалительных цитокинов клетками в зоне ишемии. При этом активируется синтез цитокинов в окружающих зону ишемии тканях сердца за счет одной из характерных черт биологии цитокинов — способности усиливать синтез самих себя по принципу положительной обратной связи. Кроме того, цитокины привлекают в зону инфаркта различные типы лейкоцитов из кровотока, которые служат дополнительным источником их синтеза. В результате происходит еще большее усиление ло- 35 кальной продукции провоспалительных медиаторов в ткани сердца. Таким образом, синтезируемые при развитии асептического воспаления цитокины служат эндогенными медиаторами развития постишемических нарушений в ткани миокарда, ведущих к серьезным нарушениям сердечной деятельности с клиническими проявлениями всего симптомокомплекса инфаркта миокарда. Однако вряд ли следует рассматривать роль цитокинов в этом процессе только с одной стороны, как медиаторов патологии. Провоспалительные цитокины, синтезируемые в ткани сердца при инфаркте, могут обладать двумя основными свойствами. Первое связано с описанной на примере ИЛ-8 активацией нейтрофилов и других клеток, синтезом ими повреждающих ткани факторов с развитием очага некроза. Второе, напротив, заключается в цитопротективном действии провоспалительных цитокинов. Так действует ИЛ-1, оказывающий антиапоптотическое действие на нейтрофилы. ИЛ-6 также имеет цитопротективные свойства посредством активации клеток через рецепторный комплекс, включающий субъединицу gp130. Активирующим влиянием на клетки через рецептор II типа (p75) обладает и ФНО, хотя через рецептор I типа (p55) он индуцирует апоптоз клеток. Суммарный вектор действия этих провоспалительных цитокинов во многом зависит от их концентрации в тканях. Высокая концентрация в ранней стадии инфаркта ведет к активации описанных выше механизмов повреждения тканей. Однако более низкие уровни локального синтеза абсолютно необходимы для правильного развития процессов регенерации поврежденных тканей и восстановления нормальной функции органа. В связи с этим и должно строиться клиническое применение рекомбинантных цитокинов. Видимо, на первом этапе развития острого инфаркта миокарда требуется быстрое применение ингибиторов провоспалительных цитокинов (антицитокиновой терапии в виде имеющихся препаратов антител к ФНО либо рецепторного антагониста ИЛ-1). В настоящее время с этой целью также используются препараты статинов, блокирующие синтез провоспалительных цитокинов, либо ингибиторы ангиотензин-конвертирующего фермента. Это может привести к снижению повреждения тканей, вызванного местной гиперпродукцией провоспалительных цитокинов. Однако после купирования острого периода целесообразным представляется назначение препаратов рекомбинантных цитокинов в низких физиологических дозах, что позволит усилить и ускорить процессы регенерации миокарда. Уже описано успешное применение при инфаркте миокарда Г-КСФ, стимулирующего не толь- 36 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 ко костномозговое кроветворение, но и функциональную активность лейкоцитов [70]. Считается также, что Г-КСФ и ГМ-КСФ могут с успехом применяться у больных с инфарктом миокарда за счет способности усиливать неоангиогенез и вызывать мобилизацию стволовых клеток из костного мозга [71]. Среди рекомбинантных цитокинов весьма перспективным для лечения больных с инфарктом миокарда представляется применение эритропоэтина (ЭПО). Несмотря на главную роль ЭПО как фактора активации эритропоэза, исследования последних лет выявили целый ряд негематологических эффектов этого цитокина. Функционально активный рецептор ЭПО обнаружен на клетках сердечно-сосудистой системы, включая эндотелиальные клетки и кардиомиоциты. Исследования при экспериментальном инфаркте миокарда продемонстрировали, что применение ЭПО снижает площадь инфаркта и интенсивность апоптоза кардиомиоцитов и стимулирует неоваскуляризацию. Первые клинические испытания показали безопасность применения ЭПО у больных с инфарктом миокарда, однако для окончательного суждения о его эффективности требуются дальнейшие широкие клинические исследования [72]. Роль цитокинов в развитии патологии (в свете теории цитокин-опосредованных заболеваний). Приведенные данные указывают на важную роль цитокинов в патогенезе широкого круга как инфекционных, так и неинфекционных заболеваний человека главным образом с участием механизмов врожденного иммунитета. Общепринятый взгляд на иммунную систему, сформировавшийся в эпоху доминирования инфекционной иммунологии, заключается в том, что иммунитет в любых его проявлениях полезен для организма, так как защищает от патогенов. Трудно было представить, что сам организм может разрушать собственные клетки или производить молекулы, вызывающие патологические изменения в органах и тканях и даже способные вызвать гибель. Изучение роли цитокинов вначале при сепсисе, а затем и при ряде соматических заболеваний как раз доказало такую возможность, перевернув старые представления и послужив основой для появлении теории цитокин-опосредованных заболеваний. Цитокиновая теория развития заболеваний [14, 73] гласит, что эндогенные цитокины могут вызывать симптомы патологических изменений в органах, оказывать повреждающее действие на ткани, как это происходит в случае ФНО при сепсисе, в случае других цитокинов при аутоиммунном и аллергическом воспалении, а также при аутовоспалительных состояниях, как это наблюдается при метаболическом синдроме. Однако эта теория несколько смещает акценты в пра- вильном понимании истинной роли цитокинов в регуляции основных физиологических процессов в организме, в частности при развитии иммунопатологии. Действительно, при повышенной продукции цитокины опосредуют целый ряд патологических изменений в тканях при сепсисе, ревматоидном артрите, диабете, атеросклерозе, инфаркте миокарда и других заболеваниях человека, о чем говорилось выше. Да, цитокины являются одними из основных медиаторов развития патологии, и это нужно помнить при изучении патогенеза болезней и назначения терапии, в том числе иммунотерапии и цитокинотерапии. Но цитокины ли являются первичными медиаторами патологии? Действие цитокинов — всего лишь финальный аккорд в сложном иммунопатогенезе большинства заболеваний, исключая наследственные нарушения цитокиновой регуляции. Цитокины — мощный инструмент иммунной системы, а не первичная причина болезней. Участие цитокинов в патогенезе многих болезней — подтверждение их ключевой роли как медиаторов межклеточного взаимодействия, особенно медиаторов врожденного иммунитета. Эволюционно продукция цитокинов — это ответ на инфекцию. У всех организмов действует схема: патоген — паттерн-распознающие рецепторы — синтез провоспалительных цитокинов, запускающих воспаление. Но, видимо, эволюционно развитие мощного цитокинового ответа и гиперпродукция цитокинов никогда не должны были служить причиной развития патологии тканей. Изначально синтез цитокинов нужен для организации и развития противоинфекционного воспалительного ответа на местном уровне и при необходимости — системного воспалительного ответа, нужного для блокирования и удаления попавшего в организм патогена. Патологическая гиперпродукция цитокинов при этом возможна в основном в двух случаях: 1) отсутствие адекватного ответа против патогена со стороны приобретенного иммунитета и нарушение правильного баланса между двумя ветвями развития защитных реакций, приводящее к длительному активному персистированию патогена и неконтролируемому синтезу цитокинов, 2) особая природа патогена, связанная с очень быстрым размножением и активным противодействием развитию защитных реакций. Не исключено, что гибель отдельной особи в последнем случае служит для прекращения распространения патогена в популяции. Еще в 60-х годах XX века было высказано предположение, что выраженная системная реакция больного при сепсисе связана не с самим патогеном, а в большей степени с ответом организма, обусловленным эндогенными факторами и связанным с активацией иммунной системы [74, 75]. Ключом для 37 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 понимания всего каскада эндогенных реакций на инфекцию, приводящих к септическому шоку, послужили эксперименты Брюса Бойтлера, продемонстрировавшего ведущую роль ФНО в гибели животных от экспериментального септического шока. В этих опытах введение мышам ЛПС приводило к развитию явлений септического шока и гибели, однако если животным на фоне ЛПС вводили нейтрализующие антитела к эндогенному ФНО, явления септического шока были существенно меньше и гибели не наблюдалось [76]. Характер действия цитокинов в организме зависит от их уровней. Цитокины в низких концентрациях нужны для правильного формирования местного воспаления, более высокие дозы вызывают развитие защитной системной воспалительной реакции, но патологически высокие концентрации приводят к состоянию септического шока и гибели организма (табл. 3). В тех случаях, когда уровни цитокинов превышают физиологические концентрации, они становятся уже не медиаторами защиты, а медиаторами развития патологии, и в некоторых случаях — медиаторами «смерти». ИЛ-1. Появление данных цитокинов в кровотоке сразу приводит к увеличению синтеза стероидных гормонов, причем ИЛ-1 и другие провоспалительные цитокины как вызывают усиление синтеза релизинг-факторов, так и стимулируют продукцию стероидов клетками коры надпочечников. Стероидные гормоны, известные как одни из наиболее мощных иммуносупрессоров, блокируют экспрессию генов цитокинов и не позволяют их уровню превысить предельные значения. Это является эффективным механизмом отрицательной обратной связи для контроля гиперпродукции цитокинов. Следующий уровень контроля связан с постоянной циркуляцией в плазме специфических блокаторов цитокинов, например РАИЛ. В отличие от индуцибельного синтеза ИЛ-1, РАИЛ конститутивно синтезируется в организме и постоянно присутствует в плазме крови в концентрации до 1 нг/мл. Таким образом, любое увеличение уровня ИЛ-1 заведомо встречает противодействие в виде предсуществующего циркулирующего ингибитора, играющего роль своеобразного буфера. Для ИЛ-18 также описан специфический сывороточный ингибитор, который Òàáëèöà 3 Äîçîâàÿ çàâèñèìîñòü áèîëîãè÷åñêèõ ýôôåêòîâ ïðîâîñïàëèòåëüíûõ öèòîêèíîâ îò èõ êîíöåíòðàöèé â òêàíÿõ è â öèðêóëÿöèè Âàðèàíòû ïðîäóêöèè öèòîêèíîâ Áèîëîãè÷åñêèå ýôôåêòû öèòîêèíîâ Ëîêàëüíûé ñèíòåç â òêàíÿõ Àêòèâàöèÿ ëåéêîöèòîâ è èõ ïðèâëå÷åíèå â òêàíè, óñèëåíèå ôàãîöèòîçà è ïðîäóêöèè êèñëîðîäíûõ ðàäèêàëîâ. Àêòèâàöèÿ ýíäîòåëèÿ è óñèëåíèå ýêñïðåññèè ìîëåêóë àäãåçèè Ñòèìóëÿöèÿ ñèíòåçà öèòîêèíîâ è õåìîêèíîâ Óâåëè÷åíèå ìåòàáîëèçìà ñîåäèíèòåëüíîé òêàíè Àêòèâàöèÿ ðåãåíåðàöèè Ëèõîðàäêà Óâåëè÷åíèå ñèíòåçà è äåéñòâèå íà óðîâíå Óâåëè÷åíèå óðîâíåé ñòåðîèäíûõ ãîðìîíîâ îðãàíèçìà Ëåéêîöèòîç Óâåëè÷åíèå ñèíòåçà îñòðîôàçîâûõ áåëêîâ Âûñîêèå óðîâíè öèòî- Ñíèæåíèå ñîêðàòèìîñòè ìèîêàðäà è ãëàäêîìûøå÷íûõ êèíîâ â öèðêóëÿöèè êëåòîê ñîñóäîâ Óâåëè÷åíèå ïðîíèöàåìîñòè ýíäîòåëèÿ Íàðóøåíèÿ ìèêðîöèðêóëÿöèè â îðãàíàõ Ñíèæåíèå àðòåðèàëüíîãî äàâëåíèÿ Ãèïîãëèêåìèÿ Увеличение уровней цитокинов в циркуляции не может продолжаться бесконтрольно, так как это приводит к патологии. В связи с этим в организме существуют несколько физиологических систем контроля над уровнем прежде всего провоспалительных цитокинов, членов семейства ФНО и семейства Êëèíè÷åñêèå ïðîÿâëåíèÿ Ìåñòíîå òêàíåâîå âîñïàëåíèå Ñèíäðîì ñèñòåìíîãî âîñïàëèòåëüíîãî îòâåòà Ïàòîëîãè÷åñêîå âîñïàëåíèå Ñåïòè÷åñêèé øîê Ãèáåëü îðãàíèçìà обладает способностью связывать этот цитокин и блокировать его биологическую активность. Кроме того, существуют растворимые рецепторы ФНО, ИЛ-1, ИЛ-6, синтезируемые клетками для связывания избытка провоспалительных цитокинов и предотвращения их взаимодействия с мембранны- 38 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 ми рецепторами. Экспрессия генов и синтез растворимых рецепторов запускается при развитии воспаления, т. е. усиливается вместе с увеличением синтеза цитокинов, что служит еще одним элементом контроля, направленного на недопущение превышения их физиологических концентраций. Все эти совершенно разные физиологические системы регуляции обеспечивают разносторонний контроль и позволяют предотвратить возрастание уровней цитокинов и избежать развития патологических изменений, обусловленных их гиперпродукцией. Существование описанного многоуровневого контроля убеждает, что эти механизмы очень эффективны и видимо формировались эволюционно вместе с развитием систем цитокинового ответа на инфекцию. Формирование этих систем — свидетельство необходимости контроля над синтезом цитокинов, значит, для выживания этот контроль нужен не меньше, чем сам синтез цитокинов. Это подтверждается и последствиями мутаций в генах рецепторов ФНО и цитоплазматических систем контроля синтеза ИЛ-1, в том числе генов белков, входящих в состав инфламмасомы, приводящих к развитию системного воспаления, лихорадки, периодической болезни [77, 78]. Цитокины представляют собой прежде всего медиаторы защиты и, если они становятся медиаторами развития патологии, значит происходит сбой в интеграции различных защитных и регуляторных механизмов, как это видно на примере сепсиса, где дефект в развитии и регуляции противоинфекционного иммунного ответа в целом ведет к гиперактивации реакций врожденного иммунитета и синтеза цитокинов, которые вызывают патологию. То же можно проследить при развитии аутоиммунных состояний и при аллергии. Повышенный синтез цитокинов — всего лишь следствие неправильного ответа приобретенного иммунитета на собственные антигены, т. е. сбой происходит не в работе цитокинов, а в других механизмах, приводящих к аутоиммунитету. Цитокины всего лишь инструмент реализации иммунного ответа, и он работает исключительно слаженно и хорошо и при сепсисе, и при аутоиммунной патологии, и при аллергии. При аллергии причина развития аллергического воспаления в тканях — тоже неправильная работа приобретенного иммунитета, генетически обусловленный неправильный ответ на аллергены, затем поляризация Т-клеточных реакций. Опять цитокины выступают в роли инструмента в руках измененного ответа приобретенного иммунитета. То, что задумано природой и отработано в течение миллионов лет эволюции для защиты от паразитов, превраща- ется в тяжелую клиническую патологию, затрагивающую миллионы людей. Поэтому цитокиновая теория развития патологии при болезнях человека — это всего лишь описание одной важной части, но не всего их иммунопатогенеза. Тем не менее важнейшая роль цитокинов в патогенезе заболеваний человека, проиллюстрированная приведенными выше примерами, послужила основой формирования нового направления терапии, названного антицитокиновой терапией и направленного на удаление из организма или блокирование биологической активности эндогенных цитокинов при аутоиммунных, аутовоспалительных, аллергических и некоторых инфекционных болезнях. Антицитокиновая терапия уже нашла широкое применение в клинической практике в виде утвержденных протоколов для лечения таких заболеваний, как ревматоидный артрит, ювенильный артрит, псориатический артрит, спондилоартрит, болезнь Крона и др. Кроме того, в настоящее время уже получены положительные результаты применения антицитокиновой терапии в ходе проведении клинических испытаний при лечении больных с диабетом 2-го типа, увеитами, псориазом, гломерулонефритом, рассеянным склерозом, сердечной недостаточностью, острым миелолейкозом, бронхиальной астмой. Некоторые препараты, например рецепторный антагонист ИЛ-1, могут быть использованы для лечения нескольких групп заболеваний, причиной которых служат разные факторы, но в основе патогенезе лежит тканевое воспаление. Применение подобных препаратов в медицине может стать своеобразной терапевтической платформой, на основе которой можно развивать современные подходы к лечению, в том числе персонализированную терапию, основанную на изучении индивидуальных уровней цитокинов и генетических особенностей цитокиновой регуляции. В настоящее время продолжаются клинические испытания по десяткам разнообразных препаратов для блокирования цитокинов. В отдельных случаях антицитокиновая терапия дает очень хороший терапевтический эффект, например при РА, наследственных нарушениях в работе инфламмасом, например, при периодической болезни и других подобных состояниях. Однако в иных случаях, например при антицитокиновой терапии сепсиса, данный подход пока не приносит ожидаемых результатов и требует дополнительных исследований. Возможно, это обусловлено тем, что антицитокиновая терапия при большинстве инфекционных, аллергических и аутоиммунных заболеваниях является всего лишь симптоматическим лечением, а не искоренением причины заболеваний. МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 39 Литература 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. Кетлинский С. А., Симбирцев А. С. Цитокины.— СПб.: Фолиант, 2008.— 552 с. Medzhitov R., Janeway C. Innate immunity: the virtues of a nonclonal system of recognition // Cell.— 1997.— Vol. 91.— P. 295–298. Matzinger P. The danger model: a renewed sense of self // Science.— 2002.— Vol. 296.— P.301–305 Lemaitre B. The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults // Cell.— 1996.— Vol. 86.— P. 973–983. Poltorak A., He X., Smirnova I. et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57Bl/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene // Science.— 1998.— Vol. 282.— P. 2085–2088. Zarember K., Godowski P. Tissue expression of human Toll-like receptors and differential regulation of Toll-like receptor mRNAs in leukocytes in response to microbes, their products, and cytokines // J. Immunol.— 2002.— Vol. 168.— P. 554–561. Beutler B. Microbe sensing, positive feedback loops, and the pathogenesis of inflammatory diseases // Immunol. Rev.— 2009.— Vol. 227.— P. 248–263. Ting J., Lovering R., Alnemri E. et al. The NLR gene family: a standard nomenclature // Immunity.— 2008.— Vol. 28.— P. 285–287. Akira S., Takeda K. Toll-like receptor signaling // Nature Rev. Immunol.— 2004.— Vol. 4.— P. 499–511. Gay N., Keith F. Drosophila Toll and IL-1 receptor // Nature.— 1991.— Vol. 351.— P. 355–356. Caramalho I., Lopes-Carvalho T., Ostler D. et al. Regulatory T-cells selectively express Toll-like receptors and are activated by lipopolysaccharide // J. Exp. Med.— 2003.— Vol. 197.— P. 403–411. Kono H., Rock K. How dying cells alert the immune system to danger // Nat. Rev. Immunol.— 2008.— Vol. 8.— P.279–289 Симбирцев А. С. Интерлейкин-1. Физиология, патология, клиника.— СПб.: Фолиант, 2011.— 480 с. Dinarello C. Immunological and Inflammatory Functions of the Interleukin-1 Family // Ann. Rev. Imm.— 2009.— Vol. 27.— P. 519–550. Wilson K. P., Black J. A., Thomson J. A. et al. Structure and mechanism of interleukin-1 beta converting enzyme // Nature.— 1994.— Vol. 370.— P. 270–273. Andrei C., Dazzi C., Lotti L. et al. The secretory route of the leaderless protein interleukin 1beta involves exocytosis of endolysosome-related vesicles // Mol. Biol. Cell.— 1999.— Vol. 10.— P. 1463–1475. Tschopp J., Martinon F., Burns K. NALPs: a novel protein family involved in inflammation // Nat. Rev. Mol. Cell Biol.— 2003.— Vol. 4.— P. 95–104. Martinon F., Tschopp J. Inflammatory caspases and inflammasomes: master switches of inflammation // Cell Death Differ.— 2007.— Vol. 14.— P. 10–22. Ye Z., Ting J. NLR, the nucleotide-binding domain leucine-rich repeat containing gene family // Curr. Opin. Immunol.— 2008.— Vol. 20.— P. 3–9. Pedra J., Cassel S., Sutterwala F. Sensing Pathogens and Danger Signals by the Inflammasome // Curr. Opin. Immunol.— 2009.— Vol. 21, № 1.— P. 10–16. Cassel S., Sutterwala F. Sterile inflammatory responses mediated by the NLRP3 inflammasome // Eur. J. Immunol.— 2010.— Vol. 40, № 3.— P. 607–611. Faustin B., Lartigue L., Bruey J. et al. Reconstituted NALP1 inflammasome reveals two-step mechanism of caspase-1 activation // Mol. Cell.— 2007.— Vol. 25.— P. 713–724. Hsu L., Ali S., McGillivray S. et al. A NOD2-NALP1 complex mediates caspase-1-dependent IL-1beta secretion in response to Bacillus anthracis infection and muramyl dipeptide // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.— 2008.— Vol. 105.— P. 7803–7808. Miao E., Alpuche-Aranda C., Dors M. et al. Cytoplasmic flagellin activates caspase-1 and secretion of interleukin 1beta via Ipaf // Nat. Immunol.— 2006.— Vol. 7.— P. 569–575. Martinon F., Burns K., Tschopp J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL1β // Mol. Cell.— 2002.— Vol. 10.— P. 417–426. Netea M. G., Nold-Petry C. A., Nold M. F. et al. Differential requirement for the activation of the inflammasome for processing and release of IL1beta in monocytes and macrophages // Blood.— 2009.— Vol. 113.— P. 2324–2335. Соловьев М. М., Симбирцев А. С., Петропавловская О. Ю. и др. Препарат «Беталейкин» в лечении гнойно-воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области // Terra Medica.— 2003.— № 2.— С.14–16 Саламатов А. В., Баринов О. В., Синенченко А. Г. и др. Эффективность рекомбинантного ИЛ-1 бета в лечении гнойно-деструктивных заболеваний легких и плевры // Цитокины и воспаление.— 2006.— Т. 5, № 4.— С. 39–45. Азнабаева Л. Ф., Шарипова Э. Р., Арефьева Н. А., Зайнуллина А. Г. Иммуногенетические особенности продукции интерлейкина-1 бета при затяжной и хронической (рецидивирующей) форме бактериального воспаления верхних дыхательных путей (гнойного риносинусита) // Медицинская иммунология.— 2007.— Т. 9, № 4–5.— С. 535–540. Beck G., Habicht G. S., Benach J. L., Miller F. Interleukin-1: a common endogenous mediator of inflammation and the local Shwartzman reaction // J. Immunol.— 1986.— Vol. 136.— P. 3025–3031. 40 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 31. Bone R., Sprung C., Sibbald W. Definitions for sepsis and organ failure // Crit. Care Med.— 1992.— Vol. 20.— P. 724–726. 32. Levy M., Fink M., Marshall J. et al. 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference // Crit. Care Med.— 2003.— Vol. 31.— P. 1250–1256. 33. Cavaillon J.-M., Adib-Conquy M., Fitting C. Cytokine cascade in sepsis // Scand. J. Infect. Dis.— 2003.— Vol. 35.— P. 535–544. 34. Van Dissel J., van Langevelde P., Westendorp R. et al. Anti-inflammatory cytokine profile and mortality in febrile patients // Lancet.— 1998.— Vol. 351.— P. 950–953. 35. Monneret G. How to identify systemic sepsis-induced immunoparalysis // Adv. Sepsis.— 2005.— Vol. 4.— P. 42–49. 36. McInnes I., Schett G. Cytokines in the pathogenesis of rheumatoid arthritis // Nat. Rev. Immunol.— 2007.— Vol. 7.— P. 429–442. 37. Schulze-Koops H., Kalden J. The balance of Th1/Th2 cytokines in rheumatoid arthritis // Best Pract. Res. Clin. Rheumatol.— 2001.— Vol. 15.— P. 677–691. 38. Lubberts E., Koenders M., van den Berg W. The role of T-cell interleukin-17 in conducting destructive arthritis: lessons from animal models // Arthritis Res. Ther.— 2005.— Vol. 7.— P. 29–37. 39. Zhu S., Qian Y. IL-17/IL-17 receptor system in autoimmune disease // Clin.Science.— 2012.— Vol. 122.— P. 487–511. 40. Ehrenstein M., Evans J., Singh A. et al. Compromised function of regulatory T cells in rheumatoid arthritis and reversal by anti-TNF alpha therapy // J. Exp. Med.— 2004.— Vol. 200.— P. 277–285. 41. Nie H., Zheng Y., Li R. et al. Phosphorylation of FOXP3 controls regulatory T cell function and is inhibited by TNF-a in rheumatoid arthritis // Nature Med.— 2013.— Vol. 19.— P. 322–328. 42. Horai R., Saijo S., Tanioka H. Development of chronic inflammatory artropathy resembling rheumatoid arthritis in interleukin-1 receptor antagonist deficient mice // J. Exp. Med.— 2000.— Vol. 191.— P. 313–320. 43. Hoffman H., Rosengren S., Boyle D. et al. Prevention of cold-associated acute inflammation in familial cold autoinflammatory syndrome by interleukin-1 receptor antagonist // Lancet.— 2004.— Vol. 364.— P. 1779–1785. 44. Ouchi N., Parker J., Lugus J., Walsh K. Adipokines in inflammation and metabolic disease // Nat.Rev.Immunol.— 2011.— Vol. 11.— P. 85–97. 45. Lau D., Dhillon B., Yan H. et al. Adipokines: molecular links between obesity and atherosclerosis // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol.— 2005.— Vol. 288.— P. 2031–2041. 46. Bastard J., Jardel C., Bruckert E. et al. Elevated levels of interleukin-6 are reduced in serum and subcutaneous adipoise tissue of obese women after weight loss // J. Clin. Endocrinol. Metab.— 2000.— Vol. 85.— P. 3338–3342. 47. Dandona P., Weinstock R., Thusu K. et al. Tumor necrosis factor-α in sera of obese patients: fall with weight loss // J.Clin.Endocrinol.Metab.— 1998.— Vol. 83.— P. 2907–2910. 48. Vona-Davis L., Rose D. Adipokines as endocrine, paracrine, and autocrine factors in breast cancer risk and progression // Endocrine-Related Cancer.— 2007.— Vol. 14.— P. 189–206. 49. Vandanmagsar B., Youm Y.-H., Ravussin A. et al. The NLRP3 inflammasome instigates obesity–induced inflammation and insulin resistance // Nature Med.— 2011.— Vol. 17.— P. 179–188. 50. McGonagle D., McDermott M. A proposed classification of the immunological diseases // PLoS Med.— 2006.— Vol. 3.— P. e297 51. Mandrup-Poulsen T. Apoptotic signal transduction pathways in diabetes // Biochem. Pharmacol.— 2003.— Vol. 66.— P.1433–1440. 52. Maedler K., Sergeev P., Ris F. et al. Glucose-induced beta-cell production of IL-1beta contributes to glucotoxicity in human pancreatic islets // J. Clin. Invest.— 2002.— Vol. 110.— P. 851–860. 53. Schroder K., Tschopp J. The inflammasomes // Cell.— 2010.— Vol. 140.— P. 821–832. 54. De Nardo D., Latz E. NLRP3 inflammasomes link inflammation and metabolic disease // Trends Immunol.— 2011.— Vol. 32.— P. 373–379. 55. Grant R., Dixit W. Mechanisms of disease: inflammasome activation and the development of type 2 diabetes // Front. Immunol.— 2013.— Vol. 4.— P. 50. 56. Donath M., Shoelson S. Type 2 diabetes as an inflammatory disease // Nat. Rev. Immunol.— 2011.— Vol. 11.— P. 98–107. 57. Larsen C., Faulenbach M., Vaag A. et al. Interleukin-1-receptor antagonist in type 2 diabetes mellitus // N. Engl. J. Med.— 2007.— Vol. 356.— P. 1517–1526. 58. Monaco C., Paleolog E. Nuclear factor kappa B: a potential therapeutic target in atherosclerosis and thrombosis // Cardiovasc.Res.— 2004.— Vol. 61.— P. 671–682. 59. Frostegard J., Ulfgren A., Nyberg P. et al. Cytokine expression in advanced human atherosclerotic plaques: dominance of pro-inflammatory (Th1) and macrophage–stimulating cytokines // Atherosclerosis.— 1999.— Vol. 145.— P. 33–43. 60. Lahoute C., Herbin O., Mallat Z., Tedgui A. Adaptive immunity in atherosclerosis: mechanisms and future therapeutic targets // Nat. Rev. Cardiology.— 2011.— Vol. 8.— P. 348–358. 61. Frangogiannis N. The immune system and cardiac repair // Pharmacol.Res.— 2008.— Vol. 58.— P. 88–111. 62. Arslan F., de Kleijn D., Pasterkamp G. Innate immune signaling in cardiac ischemia // Nature Reviews Cardiology.— 2011.— Vol. 8.— P. 292–300. МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 41 63. Vinten-Johansen J. Involvement of neutrophils in the pathogenesis of lethal myocardial reperfusion injury // Cardiovasc. Res.— 2004.— Vol. 61.— P. 481–497. 64. Ionita M., Arslan F., de Kleijn D., Pasterkamp G. Endogenous inflammatory molecules engage Toll–like receptors in cardiovascular disease // J. Innate. Immun.— 2010.— Vol. 2.— P. 307–315. 65. Tsan M., Gao B. Endogenous ligands of Toll-like receptors // J. Leukoc. Biol.— 2004.— Vol. 76.— P. 514–519. 66. Jordan J., Zhao Z., Vinten-Johansen J. The role of neutrophils in myocardial ischemia–reperfusion injury // Cardiovasc.Res.— 1999.— Vol. 43.— Р. 860–878. 67. Sekido N., Mukaida N., Harada A. et al. Prevention of lung reperfusion injury in rabbits by a monoclonal antibody against IL-8 // Nature.— 1993.— Vol. 365.— P. 654–657. 68. Lindahl B., Toss H., Siegbahn A. et al. Markers of myocardial damage and inflammation in relation to long-term mortality in unstable coronary artery disease // New Engl. J. Med.— 2000.— Vol. 343.— Р. 1139–1147. 69. Deten A., Volz H., Briest W. Zimmer H. Cardiac cytokine expression is up-regulated in the acute phase after myocardial infarction. Experimental studies in rats // Cardiovasc. Res.— 2002.— Vol. 55.— Р. 329–340. 70. Takano H., Ohtsuka M., Akazawa H. et al. Pleiotropic effects of cytokines on acute myocardial infarction: G-CSF as a novel therapy for acute myocardial infarction // Curr. Pharmacol. Descriptions.— 2003.— Vol. 9.— Р. 1121–1127. 71. Kovacic J., Muller D., Graham R. Actions and therapeutic potential of G-CSF and GM-CSF in cardiovascular disease // J. Mol. Cell. Cardiol.— 2007.— Vol. 42.— P. 19–33. 72. Lipsic E., Schoemaker R., van der Meer P. et al. Protective effects of erythropoietin in cardiac ischemia: from bench to bedside // J. Am. Coll. Cardiol.— 2006.— Vol. 48.— P. 2161–2167. 73. Tracey K. Physiology and immunology of the cholinergic antiinflammatory pathway // J. Clin. Invest.— 2007.— Vol. 117.— P. 289–296. 74. Bennett I. et al. The effectiveness of hydrocortisone in the management of severe infection // JAMA.— 1963.— Vol. 183.— P. 462–465. 75. Davis C., Brown K., Douglas H. et al. Prevention of death from endotoxin with antisera. I. The risk of fatal anaphylaxis to endotoxin // J. Immunol.— 1969.— Vol. 102.— P. 563–572. 76. Tracey K., Fong Y., Hesse D. et al. Anti-cachectin/TNF monoclonal antibodies prevent septic shock during lethal bacteraemia // Nature.— 1987.— Vol. 330.— P. 662–664. 77. Martinon F., Tschopp J. Inflammatory caspases and inflammasomes: master switches of inflammation // Cell Death Differ.— 2007.— Vol. 14.— P. 10–22. 78. Симбирцев А. С. Достижения и перспективы использования рекомбинантных цитокинов в клинической практике // Медицинский академический журнал. — 2013. Т. 13, № 1. — С. 7–22. Поступила в редакцию: 22.04.2013 г. Контакт: Симбирцев А. С. simbirtsev@hpb-spb.com Внимание читателя! В приложении к журналу «ВИЧинфекция и иммуносупрессии» вышел сборник научных работ «Оказание помощи женщинам и детям с ВИЧинфекцией», № 3/2013 г. / Под ред. Н. А. Белякова и А. В. Самариной.— СПб.: Балтийский медицинский образовательный центр.— 2013.— 166 с. Подробная информация: http://hiv%spb.ru; e%mail: infeklcijaaids@gmail.com; телефон: (812) 407%83%37 42 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 ЛЕКЦИЯ УДК 618.1 АНТИМИКРОБНЫЕ ПЕПТИДЫ В РЕАЛИЗАЦИИ РАЗЛИЧНЫХ ЗАЩИТНЫХ ФУНКЦИЙ ОРГАНИЗМА О. В. Шамова, Д. С. Орлов, В. Н. Кокряков, академик РАМН Е. А. Корнева Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН, Санкт-Петербург, Россия Санкт-Петербургский государственный университет, Россия ANTIMICROBIAL PEPTIDES IN THE REAIZATION OF VARIED HOST DEFENSE REACTIONS O. V. Shamova, D. S. Orlov, V. N. Kokryakov, academic RAMS E. A. Kornerva Institute of Eхperimental medicine NWB RAMS, St.-Petersburg, Russia St.-Petersburg State University, Russia © Коллектив авторов, 2013 г. Катионные антимикробные пептиды (АМП) фагоцитов и клеток барьерных эпителиев являются одними из ключевых молекул врожденного иммунитета, обеспечивающих противоинфекционную защиту организма. Однако известно, что кроме антимикробного действия АМП проявляют и широкий спектр эффектов в отношении собственных клеток организма. Это дает основание рассматривать данные пептиды не только как антимикробные, но и как возможные биомодуляторные соединения. В обзоре рассматриваются различные виды биологической активности АМП, принадлежащих к разным структурным классам, в том числе пептидов, впервые выделенных авторами из лейкоцитов животных (протегринов, бактенецинов ChBac5, ChBac3.4). АМП обладают высокой антимикробной, липополисахарид-связывающей активностью, ряд пептидов проявляет цитотоксическую активность в отношении опухолевых и нормальных клеток человека in vitro, некоторые пептиды оказывают ранозаживляющее действие. АМП из семейства дефенсинов обладают кортикостатической активностью: ингибируют стимулированный адренокортикотропным гормоном стероидогенез в клетках коркового слоя надпочечников in vitro, а также, как показано авторами, дефенсины и протегрин 3 снижают индуцированное адренокортикотропным гормоном или стрессом повышение уровня кортикостерона в крови экспериментальных животных. Описанные в литературе и полученные авторами данные свидетельствуют в пользу концепции АМП как многофункциональных молекул, участвующих во взаимодействии систем врожденного и приобретенного иммунитета, а также иммунной и нейроэндокринной систем. Ключевые слова: врожденный иммунитет, антимикробные пептиды, дефенсины, протегрины, бактенецины. Cationic antimicrobial peptides (AMPs) of phagocytes and epithelial cells are the key effector molecules of the innate immune system, providing the anti-infective host defense. Besides the antimicrobial action AMPs exert a broad spectrum of varied effects towards host cells giving a ground for considering these peptides as possible biomodulatory molecules. The review outlines different types of the biological activity of structurally diverse AMPs, including those discovered by us in the leukocytes of animals (protegrins, bactenecins ChBac5, ChBac3.4). AMPs posses the potent antimicrobial and lipopolysaccharide-binding activity; some of them are cytotoxic for tumor and normal human cells in vitro, while others demonstrate the wound healing action. AMPs of the defensin family display the corticostatic activity: they inhibit stimulated by adrenocorticotropic hormone (ACTH) steroidogenesis in adrenal cells in vitro. We also showed that defensins and protegrin 3 abolish ACTH- or stress-induced increase of the corticosterone level in blood of experimental animals. Taken together, the described in the literature and our own data contribute to the idea that AMPs are the multifunctional molecules participating in the interaction between the innate and adaptive immune systems as well as between immune and neuroendocrine systems. Key words: innate immunity, antimicrobial peptides, defensins, protegrins, bactenecins. Исследование молекулярных механизмов реализации функций системы врожденного иммунитета привлекает все больше внимания, поскольку эта система не только обеспечивает неотложный ответ организма на вторжение патогенных микроорганизмов, но и участвует во многих других жизненно важных МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 физиологических процессах, направленных на адаптацию организма к различным неблагоприятным воздействиям [1–8]. Одними из ключевых эффекторных молекул системы врожденного иммунитета являются катионные пептиды, содержащиеся преимущественно в лизосомоподобных гранулах нейтрофилов и клетках барьерных эпителиев. Эти пептиды были открыты как соединения, обладающие выраженной антимикробной активностью [9–11], поэтому за ними закрепилось название «антимикробные пептиды» (АМП). АМП имеют разнообразные первичные структуры и различные конформации молекул. Одна из классификаций АМП основана на различиях в их вторичной структуре и разделяет известные пептиды на несколько основных групп: — линейные пептиды, имеющие конформацию α-спирали (магейнин, L-37 и др.); — линейные пептиды, имеющие в составе молекулы повышенное содержание той или иной аминокислоты — обогащенные пролином пептиды (апидаецины, дрозоцин, мечниковины и другие АМП беспозвоночных; бактенецины, PR-39, профенин), в том числе АМП с конформацией поли-L-пролиновой спирали II типа (бактенецин 5 быка и др.), а также обогащенные триптофаном, гистидином или глицином пептиды; — цистинсодержащие пептиды, имеющие одну, две или более дисульфидных связей и содержащие в составе молекул β-слои (ареницины, протегрины, дефенсины и др.); — макроциклические пептиды (θ-дефенсины RTD-1, -2, -3; PhD1, PhD3). У млекопитающих описаны две основные группы антимикробных пептидов — дефенсины и кателицидины. Семейство дефенсинов включает цистинсодержащие пептиды, имеющие структурное сходство. К этой группе относятся α-дефенсины, содержащиеся, в основном, в лизосомоподобных гранулах фагоцитов [12], в клетках Панета [13]; β-дефенсины, присутствующие в клетках барьерных эпителиев [14]; θ-дефенсины, обнаруженные в лейкоцитах некоторых приматов [15, 16] Семейство кателицидинов включает пептиды с разнообразными первичными структурами. Однако они объединены в одно семейство, учитывая то обстоятельство, что все эти АМП образуются из молекул-предшественниц [17], в состав которых входит полипептидный фрагмент, гомологичный белку кателину (т. е. ингибитору катепсина L, который был впервые выделен из лейкоцитов свиньи [18]). Кателицидины содержатся в гранулах фагоцитов, клетках различных барьерных эпителиев [19]. К этой группе относятся линейные пептиды с конформацией α-спирали (LL-37 лейкоцитов человека и др.), обогащенные пролином 43 пептиды бактенецины, АМП с конформацией β-шпильки (протегрины и др.). Хотя АМП открыли как соединения с выраженными антимикробными свойствами, впоследствии было показано, что некоторые пептиды обладают более широким спектром биологической активности: стимулируют хемотаксис макрофагов, нейтрофилов, незрелых дендритных клеток [20, 21]; дегрануляцию тучных клеток [22], увеличивают проницаемость сосудов и стимулируют их рост [23]; влияют на функциональную активность и метаболизм тромбоцитов [24] связывают бактериальный липополисахарид [25]; влияют на процессинг ИЛ-1 [26], ингибируют индуцированный адренокортикотропным гормоном стероидогенез в клетках коркового слоя надпочечников, а также индуцированный α-меланоцит-стимулирующим гормоном синтез альдостерона клетками надпочечников [27]. Цель настоящего обзора — освещение литературных и полученных авторами данных о многообразных биологических эффектах природных АМП, подтверждающих представление о них как о полифункциональных соединениях и возможных регуляторных молекулах, участвующих во взаимодействии систем врожденного и приобретенного иммунитета, а также иммунной и нейроэндокринной систем. Характер действия АМП на эукариотические клетки во многом зависит от концентраций этих веществ и состава среды. Антимикробные эффекты АМП реализуются при действии пептидов в диапазоне концентраций 1–10 мкмоль. В концентрациях, в несколько раз больших, чем необходимые для проявления антимикробных эффектов, многие АМП проявляют токсическое действие в отношении собственных клеток организма — как нормальных, так и трансформированных. В норме концентрация АМП в плазме крови невысока и составляет 10–40 нмоль, но при различных формах патологии (инфекционном процессе, дистрессе и др.) происходит высвобождение во внеклеточное пространство содержимого лизосомоподобных гранул нейтрофилов — клеток, являющихся доминирующей фракцией лейкоцитов крови, а также одним из основных источников АМП во внутренней среде организма. В результате концентрация этих веществ в крови может повышается на один-два порядка. При этом часть пептидов связывается с белками плазмы крови, теряя свою биологическую активность. Ниже рассмотрены различные виды функциональной активности АМП. Антимикробная активность. Антимикробная активность α-дефенсинов в основном реализуется в фаголизосомах нейтрофильных гранулоцитов, в то время как пептиды из семейства кателицидинов 44 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 в большей степени осуществляют антимикробную функцию в плазме крови после секреции их из клеток во внеклеточное пространство [28]. Спектр антимикробной активности АМП зависит от их структуры. Некоторые пептиды имеют широкий спектр антибиотического действия и активны в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий. Другие АМП имеют более ограниченный спектр антимикробного действия — как, например, обогащенные пролином пептиды, преимущественно активные в отношении грамотрицательных бактерий. Ряд АМП обладает фунгицидной активностью: αдефенсины кролика и человека, β-дефенсины человека, гистатины, протегрины и другие пептиды [4, 7, 29]. Многие пептиды проявляют выраженную антимикробную активность в отношении штаммов микроорганизмов, устойчивых к большинству антибиотических препаратов, применяемых в медицине [30, 31]. Эти свойства пептидов обусловлены механизмом их антимикробного действия. Несмотря на огромное структурное разнообразие описанных к настоящему времени природных АМП, все они, как правило, представляют собой катионные и амфипатические молекулы, в которых пространственно разобщены гидрофильные и гидрофобные группы аминокислотных остатков. Наличие положительного заряда позволяет им электростатически связываться с анионными компонентами мембран микробных клеток (анионными фосфолипидами, липополисахаридами, тейхоевыми кислотами), а благодаря гидрофобным свойствам — встраиваться в липидные бислои мембран. Результатом встраивания АМП в липидную мембрану обычно бывает нарушение ее структурной целостности, приводящее к гибели бактериальных клеток, хотя характер наблюдаемых эффектов взаимодействия пептидов с мембраной различен и зависит от структур АМП. Для большинства АМП именно мембраны являются основной мишенью антимикробного действия, что и обусловливает быстроту этого воздействия и затрудненность формирования резистентности к нему у микроорганизмов. Один из типичных представителей пептидов с выраженной мембранолитической активностью — протегрин 1, выделенный нами из лейкоцитов свиньи [32]. Этот пептид характеризуется широким спектром антимикробной активности: минимальные ингибирующие рост микроорганизмов концентрации пептида составляют 0,5–4 мкмоль для большинства исследованных штаммов грамотрицательных и грамположительных бактерий, грибов и оболочечных вирусов [9, 32, 33]. Однако некоторые АМП инактивируют микроорганизмы без существенного повреждения их цито- плазматической мембраны, а преимущественно действуют путем нарушения различных процессов жизнедеятельности бактерий — синтеза нуклеиновых кислот, белка, процессов фолдинга белка, образования клеточной стенки и других ключевых процессов [28]. Так, например, для линейных обогащенных пролином пептидов, в том числе бактенецинов, основной мишенью антимикробного действия является бактериальный белок теплового шока DnaK, который вовлечен в шаперон-связанный белковый фолдинг. Cвязываясь с DnaK, пептиды ингибируют его АТФ-азную активность, что приводит к накоплению белков с нарушенной конформацией и гибели клетки [34]. Для многих пептидов, в том числе дефенсинов, показано наличие нескольких мишеней антимикробного действия: они повреждают мембраны бактериальных клеток, а также нарушают внутриклеточные процессы [35]. Исследованные нами пептиды из семейства бактенецинов (ChBac5, ChBac3.4 и др.), как и описанные в литературе обогащенные пролином АМП [36], осуществляли антимикробное действие без существенного нарушения барьерной функции цитоплазматической мембраны бактерий [33], при этом из изученных бактенецинов относительно более выраженное повреждающее действие на цитоплазматическую мембрану E.coli проявлял пептид ChBac3.4. Этот пептид имел и несколько более широкий спектр антимикробного действия по сравнению с остальными бактенецинами, которые были активны преимущественно против грамотрицательных бактерий [33]. Кроме прямого антибактериального действия АМП, осуществляемого при инфекционном процессе, одним из важных функциональных проявлений пептидов является их свойство связывать липополисахарид (ЛПС), представляющий собой структурный компонент наружной мембраны грамотрицательных бактерий. Показано что АМП связывают (нейтрализуют) свободный ЛПС, что может играть важную защитную роль при сепсисе, развивающемся при инфекционных процессах, вызываемых грамотрицательными бактериями [28]. Связывание антимикробных пептидов с ЛПС, находящимся в составе наружной мембраны бактерий, происходит на первой стадии контакта пептидов с микроорганизмами, и от характера этого связывания во многом зависит эффективность антимикробного действия АМП. Хотя резистентность бактерий к природным АМП наблюдается нечасто, в некоторых случаях одной из причин более высокой устойчивости бактерий к пептидам являются модификации в структуре компонентов бактериальных мембран, в частности в структуре ЛПС у грамотрицатель- МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 ных штаммов. Так, изучение нами ЛПС-связывающей активности протегрина оказалось важным для понимания причин устойчивости некоторых бактерий к его антимикробному действию. Хотя спектр активности пептида широк, существуют некоторые бактерии, устойчивые к его действию. К числу таких микроорганизмов принадлежит Burkholderia cepacia — бактерия, которая обнаруживается в легких больных муковисцидозом, хронической гранулематозной болезнью, что считают одной из причин неблагоприятного исхода этих заболеваний [37]. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) PG1 для этой бактерии составляет 32 мкмоль, в то время как его МИК для большинства других бактерий, например Pseudomonas aeruginosa, находится в диапазоне 1–3 мкмоль. С использованием протегрина, меченного 125I, нами показано, что с поверхностью бактерии Pseudomonas aeruginosa, чувствительной к антимикробному действию пептида, связывается большее количество молекул PG-1, чем с наружной мембраной резистентной бактерии Burkholderia cepacia [37], которая, по данным литературы [38], имеет модификацию в липиде А: модифицирована одна из фосфатных групп в остатках глюкозамина вследствии включения 4-амино-4-дезоксиарабинозы. Нами установлено, что PG1 связывается с липидом А P. aeruginosa с большей аффиннстью, чем с липидом А B. сepacia, что позволяло предположить, что различия в связывании PG1 c поверхностью бактерии P. aeruginosa и B. сepacia могут объясняется различиями в аффинности связывания пептида с липополисахаридом этих бактерий [37]. Таким образом, в микромолярных концентрациях АМП проявляют антимикробную и липополисахарид-связывающую активности. В более высоких концентрациях (10 и более мкмоль) они могут быть токсичными для клеток макроорганизма. Цитотоксическая активность в отношении эукариотических клеток. АМП нейтрофилов млекопитающих — α-дефенсины — в концентрациях 6–30 мкмоль цитотоксичны для нормальных и трансформированных клеток в культуре [39]. α-Дефенсины человека HNР-1–3 лизировали ряд культивируемых опухолевых клеток (К-562, L-929, клетки карциномы ротовой полости) [39, 40], а также нормальные клетки — лимфоциты, нейтрофилы [39] и эндотелиальные клетки [41] человека, тимоциты и спленоциты мыши [39]. Цитотоксическая активность показана и для многих других АМП: додекапептида, индолицидина, ВМАР 27, BMAP-28 нейтрофилов быка [42, 43], кателицидина человека LL-37 [44], цекропинов гемолимфы насекомых [45], бревенина и магейнина из кожи лягушек [46, 47] и других пептидов. Для некоторых пептидов на- 45 блюдалась селективность их цитотоксического действия в отношении опухолевых клеток по сравнению с нетрансформированными, что позволило ряду авторов рассматривать АМП в качестве возможных противоопухолевых агентов [48, 49]. Механизм цитотоксической активности остается недостаточно изученным. Известно, что он во многом зависит от структуры пептидов, как и в случае их антимикробного действия. Показано, что линейный пептид из лейкоцитов быка ВМАР-28 инициирует апоптоз опухолевых (K-562, U-937) и нормальных (активированных лимфоцитов человека) клеток [43]; а АМП человека LL-37 индуцирует апоптоз в клетках эпителия дыхательных путей [50]. Дефенсины человека вызывают клеточную гибель в основном не по пути апоптоза, а по пути некроза [51]. С другой стороны, есть работы, в которых сообщается о свойстве пептида LL-37 и β-дефенсинов человека, а также пептида PR-39 свиньи ингибировать процесс апоптоза нейтрофильных гранулоцитов [52, 53], хотя природа наблюдаемых явлений пока не ясна. Нами показано, что мембраноактивный пептид PG1 оказывает цитотоксическое действие в отношении различных типов культивируемых опухолевых клеток, а также ряда нормальных клеток (нейтрофилы, мононуклеары человека и др.) в диапазоне концентраций, превышающих антимикробные (3–30 мкмоль) [33, 54]. При этом большинство изучаемых бактенецинов, которые не вызывали нарушения структурной целостности мембран бактерий, не проявляли существенных токсических эффектов в отношении эукариотических клеток, за исключением бактенецина ChBac3.4, обладающего повышенным, по сравнению с другими бактенецинами, свойством повреждать цитоплазматическую мембрану E.coli, который демонстрировал цитотоксическое действие в отношении ряда опухолевых и, в несколько меньшей степени, нормальных культивируемых клеток [33, 55]. Действие PG1 осуществлялось за короткий промежуток времени, цитотоксические эффекты ChBac3.4 были более отсрочены. Цитотоксическое действие бактенецина ChBac3.4 в концентрациях 10–20 мкмоль на клетки К-562 (клетки эритроидного лейкоза человека) и U-937 (клетки гистиоцитарной лимфомы человека) осуществлялось преимущественно в результате инициации апоптоза при действии пептида, а в концентрации 40 мкмоль — некроза. Механизм повреждающего действия мембраноактивного пептида PG1 не был связан с индукцией апоптоза в клетках-мишенях [55]. Хотя цитотоксическое действие многих АМП в отношении опухолевых клеток установлено, роль пептидов в обеспечении противоопухолевой защиты 46 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 организма остается невыясненной. Несмотря на некоторую селективность их токсических эффектов в отношении трансформированных клеток, большинство АМП повреждают и нормальные клетки. Цитотоксическое действие АМП нейтрофильных гранулоцитов на собственные клетки организма может реализовываться в очагах воспаления, где скапливается большое количество фагоцитов и происходит секреция содержимого их гранул, в том числе и АМП, в межклеточное пространство, создавая опасность повреждения окружающих клеток и тканей. Однако существуют возможные механизмы ограничения таких повреждающих воздействий, обусловленные взаимодействием антимикробных пептидов с белками плазмы крови, приводящим к нейтрализации цитотоксической активности пептидов. Для дефенсинов человека показано, что эти пептиды избирательно связываются с белками из семейства ингибиторов сериновых протеиназ (серпинов), а также с некоторыми другими ингибиторами протеиназ, например α2-макроглобулином; причем в результате такого связывания не только отменяются цитотоксические эффекты дефенсинов, но и снижается ингибирующее действие белков плазмы в отношении протеиназ [56]. Нами показано, что цитотоксическое действие PG1 и, в меньшей степени ChBac3.4, тоже снижается в присутствии белкасерпина — α1-антитрипсина [57]. При этом протегрин, дефенсины, но не бактенецины, ингибировали антипротеазную активность серпина α1-антитрипсина. Получены также данные, свидетельствующие о свойстве дефенсинов модулировать биологическую активность кортикостероид-связывающего глобулина [57], являющегося представителем семейства серпинов и участвующего в механизмах реализации функций гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы. Однако влияние АМП на функциональную активность серпинов проявляется лишь при их эквимолярных соотношениях, т. е. в норме АМП не влияют на активность серпинов. Эти эффекты могут наблюдаться при высокой концентрации пептидов, которая достигается в плазме крови только при развитии патологических процессов (воспалительном, инфекционном, дистрессе). Таким образом, цитотоксическое действие АМП на нормальные и опухолевые клетки может снижаться в присутствии белков-серпинов. Однако кроме прямого токсического действия, АМП могут проявлять и опосредованный противоопухолевый эффект, стимулируя функциональную активность естественных киллерных клеток. Влияние АМП на цитотоксическое действие естественных киллерных клеток. Циркулирующие в кровяном русле или присутствующие в различных тканях нейтрофилы находятся в окружении других клеток системы врожденного и адаптивного иммунитета, в частности тех, которые на настоящий момент рассматриваются как основные участники противоопухолевой защиты организма — естественные киллерные клетки и цитотоксические Т-лимфоциты. Осуществляя свои защитные функции, они могут оказаться в непосредственном контакте с биологически активными молекулами, секретируемыми нейтрофилами. Данные о влиянии белковых факторов, секретируемых нейтрофильными гранулоцитами, в том числе АМП, на функциональную активность естественных киллерных клеток практически отсутствуют в литературе. Нами показано, что PG1 и ChВас5 модулируют цитотоксическую активность спленоцитов крысы в отношении двух типов клеток-мишеней: К562 и U-937 в культуре. При добавлении пептидов в нетоксических концентрациях (2 мкмоль) к клеткам-мишеням за 30 мин до внесения спленоцитов возрастала цитотоксическая активность спленоцитов по сравнению с контрольными пробами, где клетки-мишени инкубировали со спленоцитами без пептидов, а также пробами, в которых клетки-мишени инкубировали с пептидами, но без добавления спленоцитов [58]. При этом действие PG1 более выражено, чем действие ChВас5. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют в пользу предположения о возможном вовлечении АМП в механизмы противоопухолевой защиты, опосредованные их влиянием на функциональную активность спленоцитов, в состав которых входят естественные киллерные клетки и цитотоксические Т-лимфоциты. Влияние АМП на пролиферацию эукариотических клеток. Если в концентрациях, сопоставимых или превышающих необходимые для реализации антимикробной активности, многие АМП имеют токсическое действие в отношении клеток макроорганизма, то в низких концентрациях они могут проявлять противоположные эффекты — стимулировать пролиферативную активность эукариотических клеток. Так, α-дефенсины человека HNP-1, -2, -3 в концентрациях 2–9 мкмоль стимулировали пролиферативную активность эпителиальных клеток мыши и мышиных фибробластов линии NIH 3T3 [59, 60]. В концентрациях более 10 мкмоль пептиды вызывали гибель тех же клеток. Обогащенный пролином пептид PR-39 тоже стимулировал пролиферацию клеток в культуре, а также ускорял процесс регенерации тканей у экспериментальных животных [61]. Нами подобное свойство продемонстрировано для обогащенного пролином пептида бактенецина ChBac5, который оказывал стимулирующее дейст- МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 вие на пролиферативную активность фибробластов кожи человека, инкубировавшихся в течение 72 ч в присутствии ChBac5 [62]. Действие АМП на процесс заживления ран. Для ряда АМП установлено ранозаживляющее действие. Так, на модели кожной раны у крыс продемонстрировано, что применение α-дефенсинов нейтрофилов кролика ускоряло процесс заживления раны у экспериментальных животных [63]. При поражении кожного покрова у человека в области раневого дефекта наблюдался повышенный уровень кателицидина hCAP18/LL-37. Наибольшей величины концентрация кателицидина достигала через 48 ч после повреждения кожи и снижалась по мере заживления раны. hCAP18/LL-37 детектировался как в воспалительном инфильтрате, так и эпителиальных клетках. На моделях ex vivo показано, что добавление в среду антител к пептиду LL-37, блокирующих его биологическую активность, ингибирует процесс ре-эпителизации. У пациентов с хроническими язвами практически не детектировался кателицидин в эпителиальных клетках, окружающих язвы [64]. Авторы предполагают, что пептид играет важную роль в процессе заживления ран и снижение его уровня может приводить к нарушению реэпителизации и развитию хронических язв. Ранозаживляющее действие продемонстрировано и для обогащенного пролином пептида из лейкоцитов свиньи PR-39 [61]. Нами показано, что применение бактенецина ChBac5 влияет на динамику заживления ран у экспериментальных животных. Обработка полнослойных кожных ран у мышей 10 мкмоль раствором ChBac5 приводила к более быстрому уменьшению площади раневого дефекта по сравнению с контрольной группой животных [62]. В целом можно заключить, что секретируемые нейтрофилами и клетками барьерных эпителиев биологически-активные соединения пептидной природы вызывают разнонаправленные и зависимые от их концентрации эффекты при развитии воспалительных процессов. С одной стороны, они могут оказывать повреждающее действие на ткани, окружающие очаг воспаления, а также стимулировать экспрессию генов некоторых провоспалительных факторов в эпителиях (например, эпителиях дыхательных путей), что приводит к развитию ряда заболеваний. С другой стороны, учитывая, что токсическое действие АМП, в частности дефенсинов нейтрофильных гранулоцитов, нейтрализуется в присутствии серпинов и α2-макроглобулина, можно предположить, что эти пептиды играют важную роль в процессах репарации тканей. Ранозаживляющее действие АМП в сочетании с их антибактериальной активностью свидетельствует 47 о перспективности изучения возможности практического применения препаратов, созданных на основе знания структур пептидов, для коррекции патологических процессов при ранениях. О перспективности создания лекарственных средств на базе АМП свидетельствует и иммуномодулирующая активность, продемонстрированная для многих природных АМП. Иммуномодулирующая активность АМП. Одним из наиболее обстоятельно изученных аспектов влияния АМП на клетки иммунной системы является их хемотаксическая активность. Так, α- и β-дефенсины человека вызывают хемотаксис моноцитов, незрелых дендритных клеток человека, наивных CD4+CD45RA+ и CD8+ Т-лимфоцитов человека in vitro [22, 65]. Установлено, что хемотаксическая активность β-дефенсинов опосредована их взаимодействием с хемокиновым рецептором CCR6 или CCR2 [66, 67]. Наряду с прямым хемотаксическим действием, дефенсины проявляли и опосредованные эффекты, стимулируя продукцию различных хемокинов и цитокинов. При добавлении α-дефенсинов к моноцитам, активированным форбол-миристат ацетатом, в них повышался уровень экспрессии ФНОα и ИЛ-1β, а ИЛ-10 снижался [68]. β-Дефенсины стимулировали миграцию кератиноцитов, а также продукцию макрофагального хемоаттрактантного белка 1 (МСР-1), макрофагального воспалительного белка 3-α (MIP-3α), ИЛ-6, ФНО-α [69]. Кателицидин человека LL-37 демонстрировал хемотаксическую активность для моноцитов, нейтрофилов, тучных клеток и T-лимфоцитов. Это свойство пептида обусловлено его взаимодействием с одним из рецепторов, которые распознают формилметиониновые пептиды бактерий (FPRL-1) [70]. С другой стороны, показано, что кателицидин индуцирует транскрипцию и секрецию хемокинов, таких как ИЛ-8 и моноцитарных хемоаттрактантных протеинов-1 и -3 (МСР-1 и МСР-3), что способствует мобилизации различных клеток иммунной системы, участвующих в противоинфекционной защите организма [71]. Еще одним свойством АМП, обусловливающим их иммуномодулирующее действие, является способность ряда пептидов стимулировать функциональную активность тучных клеток, при активации которых происходит высвобождение широкого спектра молекул, выполняющих функции медиаторов различных воспалительных реакций. Показано, что как α-, так и β-дефенсины человека вызывают дегрануляцию тучных клеток [72, 73], взаимодействуя с неустановленным пока рецептором, связанным с G-белками. Таким образом, дефенсины, вызывая выброс гистамина тучными клетками, инициируют 48 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 различные процессы; в частности, повышение проницаемости сосудов, что способствует инфильтрации тканей очага воспаления нейтрофилами и моноцитами. Кателицидин человека LL-37 тоже обладает этим видом активности [72], хотя не имеет структурного сходства с дефенсинами. Как и дефенсины, LL-37 индуцирует высвобождение гистамина тучными клетками, а также секрецию ими ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-1β [74]. Таким образом, АМП нейтрофилов и барьерных эпителиев могут участвовать в развитии процесса локального воспаления, вызывая хемотаксис и дегрануляцию тучных клеток [72]. Действие АМП на различные типы лимфоцитов может быть прямым или опосредованным [75]. Так, АМП оказывают действие на функциональную активность дендритных клеток, которые, в свою очередь, модулируют активность лимфоцитов. Кателицидины и дефенсины продуцируются и самими иммунокомпетентными клетками, которые в ходе развития иммунного ответа могут выделять эти молекулы, в результате чего создаются условия для реализации иммуномодулирующей активности АМП [76]. Модулирующее влияние дефенсинов и кателицидина LL-37 на дендритные клетки (ДК) изучено наиболее детально. Показано, что кателицидин LL-37, βдефенсины (hBD1, hBD2, hBD3) вызывают хемотаксис незрелых ДК по рецептор-опосредованному механизму [66] и далее индуцируют их дифференцировку [77]. Установлено, что в присутствии a-дефенсина человека HNP-1 или β-дефенсина hBD-1 повышается экспрессия костимуляторных молекул CD80, CD86, CD40 на поверхности ДК, а также маркеров созревания ДК (CD83 и HLA-DR) [78]. Эти пептиды также стимулировали продукцию провоспалительны цитокинов ФНО-α, ИЛ-6, ИЛ-12 но не влияли на продукцию ИЛ-10. Участие дефенсинов и кателицидина LL-37 в анализируемых взаимодействиях в настоящее время рассматривается в качестве связующего молекулярного звена механизмов врожденного и адаптивного иммунитета [76]. Несмотря на относительно большое количество работ, посвященных исследованию влияния дефенсинов и кателицидина человека на иммунокомпетентные клетки, наблюдается определенная противоречивость этих данных, и однозначного мнения о характере действия АМП на эти клетки пока не сложилось. С одной стороны, АМП демонстрируют провоспалительные эффекты, так как инициируют хемотаксис моноцитов, нейтрофилов, тучных клеток, лимфоцитов и других клеток, а также индуцируют продукцию этими клетками ряда провоспалительных цитокинов. С другой стороны, они проявляют и противовоспалительные эффекты, так как нейтрализуют липополисахарид, а также в ряде случаев могут снижать продукцию провоспалительных факторов. Так, кателицидин LL-37 ингибирует выделение ФНО-α моноцитами человека, стимулированными введением в культуральную среду липополисахарида [79]. В целом, в отличие от антимикробной и цитотоксической активности АМП, которая в большинстве случаев не связана с взаимодействием пептидов с какими-либо рецепторами, в основе их иммуномодулирующего действия обычно лежат рецептор-опосредованные механизмы. Еще одним видом биологической активности АМП, обусловленной их связыванием с определенными рецепторами, является их кортикостатическая активность. Кортикостатическая активность дефенсинов. Кортикостатической активностью было названо свойство ряда α-дефенсинов ингибировать стимулированную адренокортикотропным гормоном (АКТГ) продукцию кортикостерона клетками коркового слоя надпочечников крыс in vitro [27]. Благодаря этому свойству некоторые изоформы дефенсинов кролика, для которых оно было впервые показано, получили второе название — кортикостатины [27]. Минимальная эффективная концентрация кортикостатина-1 (дефенсин NP-3а), действующая на стимулированную АКТГ продукцию кортикостерона, составляла 5нМ (20 нг/мл), полностью стероидогенез подавлялся при концентрации пептида 500 нмоль. Этот дефенсин ингибировал также индуцированный АКТГ синтез альдостерона клетками надпочечников крыс, но не оказывал влияния на стимулированную ангиотензином II продукцию альдостерона [80], хотя и ингибировал синтез альдостерона, вызываемый введением в среду α-меланоцитстимулирующего гормона [80]. α-Дефенсины кролика проявляли кортикостатическую активность в различной степени. Так, наибольшую кортикостатическую активность проявлял пептид NP-3а, несколько меньшую — NP-3b, в то время как некоторые дефенсины, в частности NP-5, были значительно менее активны. Оказалось, что для проявления данного вида активности важно присутствие двух остатков аргинина на С-конце молекулы пептида, а также трех остатков аргинина, располагающихся у дефенсина NP-3a в положениях 6, 7, 8, в то время как наличие или отсутствие N-концевых остатков аргинина не влияет на кортикостатическое действие пептидов [80]. Кроме аргинина, существенную роль для проявления кортикостатических свойств играет N-концевой остаток глицина. Показано, что кортикостатическая активность дефенсина NP-3a обусловлена их конкурентным связыванием с «якорной» последовательностью участка МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 рецептора АКТГ, что приводит к блокированию взаимодействия гормона с этим рецептором [80]. Чтобы оценить возможность реализации кортикостатической активности дефенсинов на уровне целостного организма, было исследовано, присутствуют ли они в органах, прямо или опосредованно связанных с регуляцией стероидогенеза надпочечниками. Дефенсин NP-3a обнаружен в костном мозге, селезенке, кишечнике, надпочечниках, гипофизе и гипоталамусе кролика [81]. Уровень NP-3a в плазме крови кроликов составлял в норме около 8 нг/мл и повышался до 185 нг/мл при инфекционной патологии. В экспериментах in vitro примерно 5000-кратный избыток NP-3a требовался для существенного подавления активирующего действия АКТГ на клетки надпочечников. Учитывая, что уровень пептида в плазме крови при развитии патологических процессов в 1000–2000 раз превышает концентрацию АКТГ, существует вероятность, что дефенсин in vivo может модулировать эффекты гормона, даже при условии частичного его связывания с белками плазмы [81]. Нами установлено, что введение дефенсинов крысам и мышам вызывает снижение АКТГ-индуцированного повышения уровня кортикостерона в крови экспериментальных животных. Показано, что введение суммарных фракций дефенсинов кролика и крысы в дозах 1 и 10 мкг/г массы тела животного, или индивидуальных фракций дефенсинов кролика NP-3a, NP-3b в дозах 50 и 50 нг/г массы тела вызывает снижение АКТГ-индуцированого повышения уровня кортикостерона в сыворотке крови экспериментальных животных [82]. Эти же фракции дефенсинов (NP-3a, NP-3b) проявляли наиболее высокую кортикостатичесекую активность в экспериментах in vitro, проведенных Zhu и соавт. [27]. В литературе кортикостатическая активность была 49 описана лишь для одного структурного класса АМП — дефенсинов. Нами на модели in vivo исследованы аналогичные эффекты протегринов, первичная структура молекул которых имеет некоторое структурное сходство с N-концевыми участками молекул дефенсинов-кортикостатинов. Показано, что при введении мышам протегрина PG-3 (но не PG1 и PG2) в дозе 50 нг/г массы тела наблюдается снижение АКТГ-индуцированого повышения уровня кортикостерона в сыворотке крови экспериментальных животных. Протегрин PG3 имеет наибольшее структурное сходство с корткостатическим дефенсином NP-3a по сравнению с PG1 и PG2 и отличается наличием дополнительного остатка глицина (в положении 3) в N-концевой части молекулы. Кроме того, нами показано, что инъекция дефенсинов приводит к снижению в 1,5–2 раза уровня кортикостерона в крови мышей, повышенного под действием стресса, а также отменяет иммуносупрессию, вызванную введением высоких доз глюкокортикоидов или стрессом у крыс [82–85]. Таким образом, данные литературы и результаты проведенных авторами исследований свидетельствуют в пользу концепции о многофункциональности антимикробных пептидов как молекулярных факторов врожденного иммунитета и важной роли этих соединений в качестве эндогенных биомодуляторов, участвующих во взаимодействии систем врожденного и адаптивного иммунитета, а также иммунной и нейроэндокринной систем при реализации защитных реакций организма в ходе развития различных патологических процессов (инфекция, дистресс и др.). * * * Работа поддержана грантами РФФИ № 13-04-02102а; 12-04-01573а; 12-04-01498а. Литература 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Пигаревский В. Е. Зернистые лейкоциты и их свойства.— М.: Медицина, 1978.— 128 с. Маянский А. Н., Маянский Д. Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге.— Новосибирск: Наука, 1989.— 344 с. Корнева Е. А. Введение в иммунофизиологию.— СПб.: ЭЛСБИ-СПб, 2003.— 48 с. Кокряков В. Н. Очерки о врожденном иммунитете.— СПб.: Наука, 2006.— 261 c. Черешнева М. В., Черешнев В. А. Иммунологические механизмы локального воспаления // Медицинская иммунология.— 2011.— Т. 13, № 6.— С. 557–568. Klebanoff S., Clark R. The neutrophil: function and clinical disorder.— Amsterdam: North Holland, 1978.— 810 p. Lehrer R., Lu W. α-Defensins in human innate immunity // Immunol. Rev.— 2012.— Vol. 245.— P. 84–112. Hancock R. E., Nijnik A., Philpott D. J. Modulating immunity as a therapy for bacterial infections // Nat Rev Microbiol.— 2012.— Vol. 10, №. 4.— P. 243–254. Lehrer R., Ganz T., Selsted M., Babior B. et al. Neutrophils and host defense // Ann Intern Med.— 1988.— Vol. 109, № 2.— P. 127–142. Zasloff M. Magainins, a class of antimicrobial peptides from Xenopus skin: isolation, characterization of two active forms and partial cDNA sequence of a precursor // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.— 1985.— Vol. 84.— P. 5449–5453. 50 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 11. Boman H. G., Faye I., Gudmundsson G. H. et al. Cell-free immunity in Cecropia. A model system for antibacterial proteins // Eur. J. Biochem.— 1991.— Vol. 201.— P. 23–31. 12. Lehrer R., Lichtenstein A., Ganz T. Defensins: antimicrobial and cytotoxic peptides of mammalian cells // Annu. Rev. Immunol.— 1993.— Vol. 11.— P. 105–128. 13. Ouellette A., Lualdi J. A novel mouse gene family coding for cationic, cysteine-rich peptides. Regulation in small intestine and cells of myeloid origin // J. Biol. Chem.— 1990.— Vol. 265.— P. 9831–9837. 14. McCray P. Jr, Bentley L. Human airway epithelia express a beta-defensin // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.— 1997.— Vol. 16.— P. 343–349. 15. Tang Y., Yuan J., Osapay G., Osapay K. et al. A cyclic antimicrobial peptide produced in primate leukocytes by the ligation of two truncated alphadefensins // Science.— 1999.— Vol. 5439.— P. 498–502. 16. Leonova L., Kokryakov V., Aleshina G. et al. Circular minidefensins and posttranslational generation of molecular diversity // J. Leukoc. Biol.— 2001.— Vol. 70.— P. 461–464. 17. Zanetti M., Gennaro R., Romeo D. Cathelicidins: a novel protein family with a common proregion and a variable C-terminal antimicrobial domain // FEBS Lett.— 1995.— Vol. 374.— P. 1–5. 18. Kopitar M., Ritonja A., Popovic T. et al. A new type of low-molecular mass cysteine proteinase inhibitor from pig leukocytes // Biol Chem HoppeSeyler.— 1989.— Vol. 370.— P. 1145–1151. 19. Zanetti M. Cathelicidins, multifunctional peptides of the innate immunity // J. of Leukocyte Biology.— 2004.— Vol. 75.— P. 39–47. 20. Huang H., Ross C., Blecha F. Chemoattractant properties of PR-39, a neutrophil antibacterial peptide // J. Leukoc. Biol.— 1997.— Vol. 61.— P. 624–629. 21. Biragyn A., Surenhu M., Yang D. et al. Mediators of innate immunity that target immature, but not mature, dendritic cells induce antitumor immunity when genetically fused with nonimmunogenic tumor antigens // J. Immunol.— 2001.— Vol. 167.— P. 6644–6653. 22. Territo M., Ganz T., Selsted M., Lehrer R. Monocyte-chemotactic activity of defensins from human neutrophils // J. Clin. Invest.— 1989.— Vol. 84.— P. 2017–2020. 23. Li J., Post M., Volk R. et al. PR39, a peptide regulator of angiogenesis // Nat. Med.— 2000.— Vol. 6.— P. 49–55. 24. Tkachenko S., Kokryakov V., Ashmarin I., Kubatiev A. Antimicribial proteins of neutrophils as regulates of platelet activity // Int. J. Immunotherapy.— 1994.— Vol. 10.— P. 159–162. 25. Hancock R., Chapple D. Peptide antibiotics // Antimicrobials Agents and Chemotherapy.— 1999.— Vol. 43.— P. 1317–1323. 26. Perregaux D., Bhavsar K., Contillo L. et al. Antimicrobial peptides initiate IL–1 beta posttranslational processing: a novel role beyond innate immunity // J. Immunol.— 2002.— Vol. 168.— P. 3024–3032. 27. Zhu Q., Hu K., Mulay S. Isolation and structure of corticostatin peptides from rabbit fetal and adult lung // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.— 1988.— Vol. 85.— P. 592–596. 28. Jenssen H., Hamill P., Hancock R. Peptide Antimicrobial Agents // Clinical Microbiology Reviews.— 2006.— Vol.— 19. P. 491–511. 29. Nijnik A., Hancock R. Host defence peptides: antimicrobial and immunomodulatory activity and potential applications for tackling antibiotic-resistant infections // Emerg. Health Threats J.— 2009.— Vol. 2.— e1.doi:10.3134/ehtj.09.001. 30. Mechkarska M., Ahmed E., Coquet L. et al. Antimicrobial peptides with therapeutic potential from skin secretions of the Marsabit clawed frog Xenopus borealis (Pipidae) // Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol.— 2010.— Vol. 152, №. 4.— P. 467–472. 31. Wang J., Wong E., Whitley J. et al. Ancient antimicrobial peptides kill antibiotic-resistant pathogens: Australian mammals provide new options // PLoS One.— 2011.— Vol. 6, № 8.— e24030. 32. Kokryakov V., Harwig K., Panyutich E. et al. Protegrins: leicocyte amtimicrobial peptides combine features of corticostatic defensins and tachyplesins // FEBS Lett.— 1993.— Vol. 327.— P. 231–236. 33. Shamova O., Orlov D., Stegemann C. et al. ChBac3. 4: A novel proline-rich antimicrobial peptide from goat leukocytes // International Journal of Peptide Research and Therapeutics.— 2009.— Vol. 15, № 1.— P. 31–35. 34. Kragol G., Lovas S., Varadi G. et al. The antibacterial peptide pyrrhocoricin inhibits the ATPase actions of DnaK and prevents chaperone-assisted protein folding // Biochemistry.— 2001.— Vol. 40.— P. 3016–3026. 35. Liu S., Zhou L., Lakshminarayanan R., Beuerman R. W. Multivalent Antimicrobial Peptides as Therapeutics: Design Principles and Structural Diversities // Int J Pept Res Ther.— 2010.— Vol. 16.— P. 199–213. 36. Gennaro R., Zanetti M., Benincasa M. et al. Pro-rich Antimicrobial Peptides from Animals: Structure, Biological Functions and Mechanism of Action // Current Pharmaceutical Design.— 2002.— Vol. 8.— P. 763–778. 37. Albrecht M. T., Wang W., Shamova O. et al. Binding of protegrin–1 to Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia // Respiratory Research.— 2002.— Vol. 3. № 1 (18).— http://respiratory-research. com/content/pdf/RR-3-1-18. 38. Gunn J., McCoy A., Tran L. et al. Identification and characterization of Burkholderia cepacia mutants sensitive to antimicrobial peptides // abstr A92. p. 22 In Abstracts of the American Society for Microbiology: 101st General Meeting.— 2001.— abst. r A92:22. 39. Lichtenstein A., Ganz T., Selsted M. E., Lehrer R. I. In vitro tumor cell cytolysis mediated by peptide defensins of human and rabbit granulocytes // Blood.— 1986.— Vol. 68.— P. 1407–1410. МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 51 40. McKeown S., Lundy F., Nelson J. et al. The cytotoxic effects of human neutrophil peptide-1 (HNP-1) and lactoferrin on oral squamous cell carcinoma (OSCC) in vitro // Oral Oncol.— 2006.— Vol. 42.— P. 685–690. 41. Okrent D., Lichtenstein A., Ganz T. Direct cytotoxicity of polymorphonuclear leukocyte granule proteins to human lung-derived cells and endothelial cells // Am Rev Respir Dis.— 1990.— Vol. 141, № 1.— P. 179–185. 42. Radermacher S. W., Schoop V. M., Schluesener H. J. Bactenecin, a leukocytic antimicrobial peptide, is cytotoxic to neuronal and glial cells // J. Neurosci Res.— 1993.— Vol. 36, №. 6.— P. 657–662. 43. Risso A., Braidot E., Sordano M. et al. BMAP-28, an antibiotic peptide of innate immunity, induces cell death through opening of the mitochondrial permeability transition pore // Mol. Cell Biol.— 2002.— Vol. 22.— P. 1926–1935. 44. Okumura K., Itoh A., Isogai E. et al. C-terminal domain of human CAP18 antimicrobial peptide induces apoptosis in oral squamous cell carcinoma SAS-H1 cells // Cancer Lett.— 2004.— Vol. 212.— P. 185–194. 45. Hui L., Leung K., Chen H. M. The combined effects of antibacterial peptide cecropin A and anti-cancer agents on leukemia cells // Anticancer Res.— 2002.— Vol. 22.— P. 2811–2816. 46. Ghavami S., Asoodeh A., Klonisch T. et al. Brevinin-2R(1) semi-selectively kills cancer cells by a distinct mechanism, which involves the lysosomal-mitochondrial death pathway // J. Cell. Mol. Med.— 2008.— Vol. 12.— P. 1005–1022. 47. Lehmann J., Retz M., Sidhu S. et al. Antitumor activity of the antimicrobial peptide magainin II against bladder cancer cell lines // Eur Urol.— 2006.— Vol. 50.— P. 141–147. 48. Kaas Q., Westermann J., Henriques S. T., Craik D. J. Antimicrobial Peptides in Plants // In: Antimicrobial Peptides: Discovery, Design and Novel Therapeutic Strategies.— 2010.— 250 p. 49. Al-Benna S., Shai Y., Jacobsen F., Steinstraesser L. Oncolytic activities of host defense peptides // Int. J. Mol. Sci.— 2011.— Vol. 12, № 11.— P. 8027–8051. 50. Barlow P., Li Y., Wilkinson T., Bowdish D. et al. The human cationic host defense peptide LL–37 mediates contrasting effects on apoptotic pathways in different primary cells of the innate immune system // J. Leukoc. Biol.— 2006.— Vol. 80.— P. 509–520. 51. Hoskin D., Ramamoorthy A. Studies on anticancer activities of antimicrobial peptides // Biochim Biophys Acta.— 2008.— Vol. 1778.— P. 357–375. 52. Nagaoka I., Suzuki K., Murakami T. et al. Evaluation of the effect of a-defensin human neutrophil peptides on neutrophil apoptosis // Int. J. Mol. Med.— 2010.— Vol. 26.— P. 925–934. 53. Ramanathan B., Wu H., Ross C., Blecha F. PR-39, a porcine antimicrobial peptide, inhibits apoptosis: involvement of caspase-3 // Dev. Comp. Immunol.— 2004.— Vol. 28.— P. 163–169. 54. Шамова О. В., Сакута Г. А, Орлов Д. С. и др. Действие антимикробных пептидов из нейтрофильных гранулоцитов на опухолевые и нормальные клетки в культуре // Цитология.— 2007.— Т. 49, № 12.— C. 1000–1010. 55. Шамова О. В., Орлов Д. С., Пазина Т. Ю. и др. Изучение молекулярно-клеточных основ цитотоксического действия антимикробных пептидов на опухолевые клетки // Фундаментальные исследования.— 2012.— № 5 (часть 1).— С. 207–212. 56. Panyutich A., Hiemstra P., van Wetering S., Ganz T. Human neutrophil defensin and serpins form complexes and inactivate each other // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.— 1995.— Vol. 12, № 3.— P. 351–357. 57. Шамова О. В., Орлов Д. С., Ямщикова Е. В., Кокряков В. Н. Изучение взаимодействия антимикробных пептидов с белками из семейства ингибиторов сериновых протеиназ // Фундаментальные исследования.— 2011.— № 9.— C. 344–348. 58. Шамова О. В., Орлов Д. С., Кокряков В. Н. Эффекты антимикробных пептидов нейтрофильных гранулоцитов на функциональную активность спленоцитов // Сборник тезисов III Международной научно-практической конференции «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли». 17–19 мая.—Казань, 2012.— C. 108–109. 59. Murphy C., Foster B., Mannis M. et al. Defensins are mitogenic for epithelial cells and fibroblasts // J. Cell Physiol.— 1993.— Vol. 155.— P. 408–413. 60. Otte J. M., Werner I., Brand S. et al. Human beta defensin 2 promotes intestinal wound healing in vitro // J. Cell Biochem.— 2008.— Vol. 104, № 6.— P. 2286–2297. 61. Chan Y., Gallo R. PR-39, a syndecan-inducing antimicrobial peptide, binds and affects p130(Cas) // J. Biol. Chem.— 1998.— Vol. 273.— P. 28978–28985. 62. Ямщикова Е. В., Орлов Д. С., Пазина Т. Ю. и др. Влияние антимикробного пептида бактенецина 5 и его укороченных фрагментов на пролиферацию фибробластов кожи человека, и на процесс заживления ран у экспериментальных животных // Современные проблемы науки и образования.— 2012.— № 3.— URL: www. science-education. ru/103-6127. 63. Кудряшов Б. А., Ляпина Л. А., Мазинг Ю. А. и др. Действие дефенсина на процесс заживления асептической кожной раны и на проницаемость кровеносных сосудов // Бюл. экспер. биол. мед.— 1990.— Т. 59, № 4.— С. 391–393. 64. Heilborn J. D., Nilsson M. F., Kratz G. et al. The cathelicidin anti-microbial peptide LL-37 is involved in re-epithelialization of human skin wounds and is lacking in chronic ulcer epithelium // J. Invest. Dermatol.— 2003.— Vol. 120.— P. 379–389. 52 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 65. Yang D., Chen Q., Chertov O., Oppenheim J. J. Human neutrophil defensins selectively chemoattract naive T and immature dendritic cells // J. Leukoc Biol.— 2000.— Vol. 68.— P. 9–14. 66. Yang D., Chertov O., Bykovskaia S. et al. Beta-defensins: linking innate and adaptive immunity through dendritic and T cell CCR6 // Science.— 1999.— Vol. 286.— P. 525–528. 67. Rohrl J., Yang D., Oppenheim J., Hehlgans T. Human beta-defensin 2 and 3 and their mouse orthologs induce chemotaxis through interaction with CCR2 // J. Immunol.— 2010.— Vol. 184.— P. 6688–6694. 68. Chaly Y., Paleolog E., Kolesnikova T. et al. Neutrophil alpha-defensin human neutrophil peptide modulates cytokine production in human monocytes and adhesion molecule expression in endothelial cells // Eur. Cytokine Netw.— 2000.— Vol. 11.— P. 257–266. 69. Niyonsaba F., Ushio H., Nakano N. et al. Antimicrobial peptides human beta-defensins stimulate epidermal keratinocyte migration, proliferation and production of proinflammatory cytokines and chemokines // J. Invest. Dermatol.— 2007.— Vol. 127, № 3.— P. 594–604. 70. De Y., Chen Q., Schmidt A. P., Anderson G. et al. LL-37, the neutrophil granule- and epithelial cell-derived cathelicidin, utilizes formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) as a receptor to chemoattract human peripheral blood neutrophils, monocytes, and T cells // J. Exp. Med.— 2000.— Vol. 192.— P. 1069–1074. 71. Bowdish D., Davidson D., Lau Y. et al. Impact of LL-37 on anti-infective immunity // J. Leukoc. Biol.— 2005.— Vol. 77.— P. 451–459. 72. Niyonsaba F., Someya A., Hirata M. et al. Evaluation of the effects of peptide antibiotics human beta-defensins- 1/-2 and LL-37 on histamine release and prostaglandin D(2) production from mast cells // Eur. J. Immunol.— 2001.— Vol. 31.— P. 1066–1075. 73. Niyonsaba F., Iwabuchi K., Matsuda H. et al. Epithelial cell-derived human beta-defensin–2 acts as a chemotaxin for mast cells through a pertussis toxin-sensitive and phospholipase C-dependent pathway // Int. Immunol.— 2002.— Vol. 14.— P. 421–426. 74. Yoshioka M., Fucuishi N., Kubo Y. et al. Human Cathelicidin CAP18/LL-37 Changes Mast Cell Function toward Innate Immunity // Biol. Pharm. Bull.— 2008.— Vol. 31, № 2.— P. 212–216. 75. Lai Y., Gallo R. L. AMPed up immunity: how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense // Trends Immunol.— 2009.— Vol. 30.— P. 131–141. 76. Wuerth K., Hancock R. E. W. New insights into cathelicidin modulation of adaptive Immunity // Eur. J. Immunol.— 2011.— Vol. 41.— P. 2817–2819. 77. Davidson D. J., Currie A. J., Reid G. S. The cationic antimicrobial peptide LL-37 modulates dendritic cell differentiation and dendritic cellinduced T cell polarization // J. of Immunology.— 2004.— Vol. 172, № 2.— P. 1146–1156. 78. Presicce P., Giannelli S., Taddeo A. et al. Human defensins activate monocyte-derived dendritic cells, promote the production of proinflammatory cytokines, and up-regulate the surface expression of CD91 // J. Leukoc Biol.— 2009.— Vol. 86, № 4.— P. 941–948. 79. Mookherjee N., Brown K., Bowdish D. et al. Modulation of the TLR-mediated inflammatory response by the endogenous human host defense peptide LL-37 // J. Immunol.— 2006.— Vol. 176, № 4.— P. 2455–2464. 80. Solomon S. Corticostatins // Trends Endocrinol Metab.— 1993.— Vol. 4, № 8.— Р. 260–264. 81. Tominaga T., Fukata J., Hayashi Y. et al. Distribution and characterization of immunoreactive corticostatin in the hypothalamic-pituitary-adrenal axis // Endocrinology.— 1992.— Vol. 130, № 3.— P. 1593–1598. 82. Шамова О. В., Лесникова М. П., Кокряков В. Н. и др. Действие дефенсинов на уровень кортикостерона в крови и иммунный ответ при стрессе // Бюл. экспер. биол. мед.— 1993.— Т. 115, № 6.— C. 646–649. 83. Шамова О. В., Орлов Д. С., Лесникова М. П. и др. Отмена дефенсином иммуносупрессии, обусловленной стрессом или введением высоких доз гидрокортизона // Успехи физиол. наук.— 1995.— № 1.— С. 113–114. 84. Фомичева Е. А., Пиванович И. Ю., Шамова О. В., Немирович-Данченко Е. А. Глюкокортикоидные гормоны в реализации иммуномодулирующего действия дефенсинов // Российский физиол. журн. им. Сеченова.— 2002.— Т. 88, № 4.— С. 496–502. 85. Korneva E. A., Rybakina E. G., Kokryakov V. N. et al. Interleukin 1β and defensins in thermoregulation, stress and immunity // Annals of NY Acad. Sci.— 1997.— Vol. 81.— Р. 465–474. Поступила в редакцию: 22.07.2013 г. Контакт: Шамова Ольга Валерьевна. oshamova@yandex.ru Подписка на 2014 год открыта Наш подписной индекс — 5 7 9 9 9 53 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ УДК 612.821;591.51 ТУЧНЫЕ КЛЕТКИ ТИМУСА КАК ПОСРЕДНИКИ В СИСТЕМЕ НЕЙРОИММУННЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ 2В. В. Гусельникова, 1Е. Г. Сухорукова, 1Д. Э. Коржевский, 1,2,3А. В. Полевщиков 1Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН, Санкт-Петербург, 2Санкт-Петербургский государственный университет, Россия 3Дальневосточный федеральный университет, г. Владивосток, Россия Россия THYMIC MAST CELLS AS PARTICIPANTS IN NEURO-IMMUNE INTERACTIONS 1Institute 2V. V. Guselnicova, 1E. G. Sukhorukova, 1D. E. Korzhevsky, 1,2,3A. V. Polevschikov of Experimental Medicine of the North-West branch of the Russian Academy of Medical Sciences, St.-Petersburg, Russia 2St.-Petersburg State University, Russia 3Far Eastern Federal University, Vladivostok, Russia © Коллектив авторов, 2013 г. Целью работы стало изучение популяции тучных клеток тимуса в норме и при акцидентальной трансформации. Работа выполнена на тимусах 60 нелинейных мышей с использованием методов гистохимии и иммуногистохимии. Для индукции акцидентальной трансформации тимуса половозрелым мышам вводили 2,5 мг гидрокортизона; срезы окрашивали толуидиновым синим и альциановым синим-сафранином. Для выявления нервных терминалей в тимусе половозрелых животных применяли иммуногистохимическую реакцию на синаптофизин или тирозингидроксилазу с докраской альциановым синим. В тимусе половозрелых животных ТК локализованы исключительно в пределах капсулы, септ, субкапсулярно и периваскулярно. После акцидентальной трансформации тучные клетки проходят ряд этапов созревания непосредственно в тимусе, перемещаясь по мере созревания от мозгового вещества к капсуле и септам тимуса. В тимусе мыши тучные клетки колокализованы с терминалями нервных волокон, часть из которых обеспечивает катехоламинергическую иннервацию. Полученные результаты могут быть свидетельством важной роли тимических ТК и взаимодействий ТК–нерв в норме и при стресс-индуцированной атрофии тимуса. Ключевые слова: тучные клетки, нервные терминали, тимус, нейроиммунные взаимодействия. Studying of thymic mast cells population in normal state and after stress-induced atrophy was a background of this work. Work is performed on 60 thymus of white outbred mice with using of histochemistry and immunohistochemistry methods. Adult mice were given a single injection of 2,5 mg of hydrocortisone for induction of thymic accidental transformation; sections were stained with toluidine blue and alcian blue-safranin. Immunohistochemical reactions for the synaptophysin or tyrosine hydroxylase with alcian blue stain were used for identification of nerve terminals in adult thymus. In adult animals MCs were observed only in the connective tissue of the capsule, interlobular septa, subcortex and perivascular space. Mast cells mature in thymus after accidental transformation. The localization of developing mast cells was changing from medullar and cortical to capsular. A morphological proximity between nerve terminals and mast cells have been observed in normal adult thymus. Some of these nerves are catecholaminergic. Possible important role of thymic mast cells and mast cells-nerves interaction in normal state and after accidental transformation is discussed. Key words: mast cells, nerve terminals, thymus, neuro-immune interactions. Введение. Постановка проблемы взаимодействия трех интегративных систем организма — нервной, эндокринной и иммунной — и поиск морфологических основ межсистемных коммуникаций связаны с исследованиями И. Г. Савченко, Е. С. Лондона и С. Н. Метальникова, выполненными на рубеже XIX — начала ХХ вв. Работы Г. Селье по физиологии стресса привели к открытию гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, одним из главных объектов влияния которой является тимус. Принципиально новым направлением в изучении механизмов нейроиммунных взаимодействий, определив- 54 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 шим характер исследований в иммунофизиологии на многие годы, стали работы Е. А. Корневой, впервые показавшей в 1963 г. влияние локального повреждения определенных структур гипоталамуса на параметры иммунного ответа [1]. Однако, несмотря на многолетние исследования, вопрос о морфологических и физиологических основах эфферентной и афферентной сигнализации между нервной и иммунной системами остается открытым. В данном контексте тимус, как центральный орган иммунного надзора, является объектом всестороннего изучения. В результате морфологических и физиологических исследований было установлено, что эфферентная иннервация тимуса имеет симпатический и парасимпатический характер. Источниками иннервации тимуса принято считать блуждающий нерв и симпатические нервы, связанные с верхним шейным и звездчатым ганглиями [2, 3]. При этом отмечена выраженная иннервация капсулы, септ, соединительнотканных прослоек по ходу сосудов, связанных прежде всего с корковым веществом тимуса при слабой иннервации мозгового вещества тимической дольки [4, 5]. Важно отметить, что катехоламинергические, адренергические и пептидергические, но не холинергические нервные терминали располагаются в непосредственной близости от стенок сосудов, тучных и хромаффинных клеток [6]. Роль тучных клеток при этом заслуживает пристального внимания. Описанные П. Эрлихом еще в 1877 году тучные клетки (ТК) в настоящее время вновь являются предметом масштабных исследований в гистологии, физиологии, иммунологии и клинической медицине. Это связано с тем, что, несмотря на интенсивное изучение ТК и накопленный материал по их морфологии и ультраструктуре, фенотипической и функциональной гетерогенности, механизмах дегрануляции и роли в аллергических реакциях I типа, многие вопросы, связанные с гистогенезом и функциями тучных клеток, продолжают оставаться открытыми. Долгое время тучные клетки изучались только применительно к развитию аллергических реакций I типа. Ключевая роль ТК в патогенезе аллергических заболеваний не вызывает сомнений, однако данные клетки широко распространены и в нормальных (невоспаленных, неинфицированных, неповрежденных) органах [7]. Наряду с распространением в барьерных тканях, постоянно контактирующих с разнообразными антигенами (кожа, ЖКТ, дыхательные пути), ТК в не меньшем количестве представлены в тимусе, который, согласно современной иммунологической теории, должен быть полностью изолирован от контакта с антигеном. Возможно, локализация тучных клеток в определенных участках тимической дольки может оказаться существенной в рамках изучения вопросов иммунофизиологии тимуса. Целью данной работы стало изучение популяции тучных клеток тимуса в норме и в условиях восстановления органа после акцидентальной трансформации, а также сопоставление расположения тучных клеток и терминалей нервных волокон в тимусе. Материалы и методы исследования. Объектом исследования служили беспородные белые мыши возрастом 1–2 мес. Всего в работе использовано 60 животных. Тимус извлекали после цервикальной дислокации, фиксировали в жидкости Карнуа (6 частей 100% этанола : 3 части хлороформа : 1 часть ледяной уксусной кислоты) или в смеси СФУ (6 частей 96% этанола : 3 части концентрированного раствора формальдегида : 1 часть ледяной уксусной кислоты) и после стандартной гистологической проводки заливали в парафин. Толщина срезов составляла 5 мкм. Для индукции акцидентальной трансформации тимуса половозрелым мышам опытной группы однократно внутрибрюшинно вводили 2,5 мг гидрокортизона (Gedeon Richter, Венгрия). Животных умерщвляли через 48 ч после инъекции. Для выявления ТК разной степени зрелости срезы тимуса мышей опытной и контрольной групп окрашивали раствором альцианового синего — сафранина, приготовленного на Уолполовском буфере рН 1,42 (30 мин) с последующей докраской ядер гематоксилином Майера (30 с). Для одновременного выявления ТК и нервных терминалей в тимусе половозрелых мышей использовали поликлональные кроличьи антитела к синаптофизину (Dako, Дания; Monosan, Нидерланды) или тирозингидроксилазе (Abcam, Великобритания), в качестве вторичных реагентов — HRP Conjugate из набора Reveal Polyvalent HPR DAB Detection System SPD-015 (Spring Bioscience, США). Для выявления продукта реакции применяли коммерческий 3'3-диаминобензидин (Spring Bioscience, США). Для идентификации тучных клеток срезы подкрашивали коммерческим раствором альцианового синего (BioVitrum, Россия), после чего часть срезов дифференцировали в ледяной уксусной кислоте (10–15 с). Результаты и их обсуждение. На препаратах тимуса половозрелых животных тучные клетки были выявлены исключительно в пределах капсулы, септ, субкапсулярных и периваскулярных пространств. Эти клетки имели сферическую, овальную или вытянутую форму и сравнительно крупные размеры (15–25 мкм в длину). Цитоплазма данных клеток была заполнена многочисленными плотно упакованными метахроматически окрашенными гранулами, часто экранирующими ядро (рис. 1). МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 Через 48 ч после введения гидрокортизона тучные клетки в тимусе были идентифицированы также Рис. 1. Тучная клетка (стрелка) в пределах капсулы тимуса половозрелой мыши. Окраска толуидиновым синим. Масштаб 10 мкм. Ув.×100, иммерсионное масло. в пределах капсулы, септ, субкапсулярных пространств и соединительной ткани вокруг кровеносных сосудов. Данные клетки имели морфологические характеристики, сходные с ТК тимуса животных интактной группы. Однако наряду с описанной выше типичной локализацией и морфологией ТК в данной точке обнаруживали не характерное для тучных клеток постнатального тимуса сосредоточение в составе глубокого коркового и мозгового вещества. Эти «нетипичные» ТК всегда имели сравнительно небольшие размеры (8–12 мкм) и разнообразную форму (овальную, вытянутую, веретеновидную, треугольную, сферическую и т. п.) и лежали в виде вкраплений среди лимфоцитов и эпителиальных клеток тимуса (рис. 2). Ранее нами было показано, что сходная локализация и морфология характерны для тучных клеток эмбрионального тимуса [8]. Обнаружив данное сходство с эмбриональными ТК, мы решили оценить степень зрелости тучных клеток тимуса в условиях восстановления органа после акцидентальной трансформации. Для этого была использована методика двойного окрашивания ТК альциановым синим и сафранином, суть действия которой заключается в том, что при рН1,42 альциановый синий связывается с не- или слабосульфатированным гепарином в составе незрелых гранул ТК, в то время как сафранин — с высокосульфатированным гепарином, содержащимся в зрелых гранулах ТК. При окрашивании срезов тимуса альциановым синим и сафранином было обнаружено, что через 48 ч после инъекции гидрокортизона ТК в тимусе формируют гетерогенную по гистохимическим характеристикам популяцию (рис. 3). Данная гетероген- 55 ность выражается в том, что гранулы одних тучных клеток связывают сафранин и окрашены в красный цвет (Saf+ гранулы; см. рис. 3, в), в то время как гранулы других ТК синие из-за сродства их компонентов к альциановому синему (Alc+ гранулы; см. рис. 3, а); наконец, присутствуют ТК, гранулы которых связывают одновременно оба красителя, что придает цитоплазме данных клеток сине-фиолетовый или красновато-фиолетовый оттенок (рис. 3, б). На основании описанных выше особенностей окрашивания, а также с учетом таких морфологических характеристик, как клеточная форма и размер, среди тучных клеток тимуса в точке 48 ч можно выделить 4 морфотипа, которые соответствуют четырем стадиям зрелости ТК. ТК стадии I (ТК I) лежат в мозговом веществе, на кортикально-медуллярной границе и в глубоких слоях запустевшего коркового вещества среди лимфоцитов и эпителиальных клеток тимуса; субкапсулярно, в пределах капсулы и септ ТК I обнаружены Рис. 2. Тучная клетка (стрелка) в пределах запустевшего коркового вещества тимуса мыши через 48 ч после введения гидрокортизона. Окраска толуидиновым синим. Масштаб 10 мкм. Ув.×40. не были. Тучные клетки данной стадии характеризуются треугольной, часто выраженной овальной формой, размерами около 8–10 мкм, а также наличием в цитоплазме плотно упакованных гранул, окрашенных в синий цвет вследствие сродства их компонентов исключительно к альциановому синему (см. рис. 3, а). ТК стадии II (ТК II) локализуются на кортикально-медуллярной границе, в глубоком корковом веществе и субкапсулярной зоне. Эти клетки часто имеют овальную или вытянутую, иногда сферическую форму и размеры около 9–11 мкм. Среди цитоплазматических гранул ТК II более половины составляют Alc+ гранулы, вместе с гранулами промежуточного (между синим и красным) фиоле- 56 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 а б в г Рис. 3. Тучные клетки разной степени зрелости в тимусе половозрелой мыши. Окраска альциановым синим — сафранином. Масштаб 10 мкм. Ув.×100, иммерсионное масло: а — тучная клетка стадии I (стрелка) в мозговом веществе тимуса через 48 ч после введения гидрокортизона; б — тучная клетка стадии II (стрелка 1) и стадии III (стрелка 2) в глубоком корковом веществе тимуса через 48 ч после введения гидрокортизона; в — тучная клетка стадии IV (стрелка) в субкапсулярном пространстве тимуса мыши через 48 ч после введения гидрокортизона; г — тучная клетка стадии IV (стрелка) в пределах капсулы тимуса интактной мыши. тового оттенка, обусловливающие общее темное окрашивание цитоплазмы этих клеток; Saf+ гранулы в ТК II единичны (см. рис. 3, б, стрелка 1). ТК стадии III (ТК III), как и клетки двух предыдущих стадий, присутствуют на границе коркового и мозгового вещества и в глубоком корковом веществе тимуса, но преимущественно локализованы субкапсулярно. Клетки данной стадии имеют округлую или овальную форму и размеры около 9–12 мкм. Все ТК III характеризуются преобладанием в цитоплазме Saf+ гранул, что обусловливает в большей степени красноватое окрашивание их цитоплазмы; Alc+ гранулы в ТК III немногочисленны (см. рис. 3, б, стрелка 2). ТК стадии IV (ТК IV) локализованы в пределах коркового вещества и субкапсулярных пространств тимуса, а также являются основной стадией для ТК капсулы и септ. Размеры данных клеток варьируют от 10 до 20 мкм. Все ТК IV имеют округлую, оваль- ную или удлиненную форму и содержат исключительно Saf+ гранулы, что придает цитоплазме данных клеток ярко-красную или коричневато-красную окраску (рис. 3, в). При окрашивании срезов тимуса интактных животных альциановым синим и сафранином, цитоплазма тучных клеток неизменно окрашивалась сафранином в красный или коричнево-красный цвет, что свидетельствует о принадлежности данных клеток к ТК IV. Выявленные тучные клетки характеризовались сферической или вытянутой формой и сравнительно крупными размерами (15–25 мкм в длину) и были локализованы в пределах капсулы, септ, субкапсулярных и периваскулярных пространств тимуса (рис. 3, г). Подобная локализация была характерна также для нервных волокон тимуса, выявленных иммуногистохимическим методом с использованием антител к синаптофизину и тирозингидроксилазе (рис. 4). МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 Синаптофизин является главным интегральным белком мембран синаптических пузырьков. Вместе с синапсинами, синаптином, синаптотагмином и др. он входит в группу белков, которые участвуют в регуляции и осуществлении синаптической передачи. Будучи белком мембраны синаптических везикул, а 57 жены в пределах капсулы, септ, субкапсулярных пространств и вокруг кровеносных сосудов и часто находились в колокализации с тучными клетками тимуса (рис. 4, б). В литературе представлены многочисленные данные о локализации тучных клеток в постэмбриональ- б Рис. 4. Тучная клетка (стрелка 2) и терминали нервных волокон (стрелка 1) в тимусе половозрелой мыши. Масштаб 10 мкм. Ув.×100, иммерсионное масло: а — иммуногистохимическая реакция на синаптофизин с докраской альциановым синим и последующей дифференцировкой в ледяной уксусной кислоте; б — иммуногистохимическая реакция на тирозингидроксилазу с докраской альциановым синим без дифференцировки. синаптофизин используется как специфический маркер синапсов. В тимусе идентифицируемые по интенсивному окрашиванию реактивом в темно-коричневый или черный цвет, синаптофизин-положительные терминали (СФПТ) были обнаружены в пределах соединительной ткани капсулы и септ органа, субкапсулярно и вокруг кровеносных сосудов, где часто формировали сплетения. Тучные клетки четко выявлялись за счет интенсивного окрашивания их цитоплазматических гранул альциановым синим в бирюзовато-синий цвет. На препаратах позитивные по синаптофизину нервные терминали часто располагались в непосредственной близости от тучных клеток, что создавало впечатление существования в тимусе контактов между СФПТ и ТК (рис. 4, а). Тирозингидроксилаза — ферментный маркер нейронов катехоламинергических систем, использующих дофамин или норадреналин в качестве нейромедиаторов. Биосинтез катехоламинов имеет одну высокоспецифическую реакцию — гидроксилирование тирозина с образованием L-3,4-диоксифенилаланин (L-ДОФА), катализируемое тирозингидроксилазой, в связи с чем считается, что локализация тирозингидроксилазы картирует места синтеза катехоламинов. При окрашивании срезов тимуса антителами к тирозингидроксилазе с подкраской альциановым синим позитивные по ферменту нервные терминали, как и в случае с СФПТ, были обнару- ном тимусе земноводных, птиц, млекопитающих [9–11], однако эти сведения противоречивы и часто приводятся без обсуждения возможного функционального значения обнаруженной локализации ТК. В рамках нашего исследования показано, что полученные результаты лишь частично согласуются с ранее описанными данными о распределении ТК в постнатальном тимусе мыши. Согласно литературным данным, в тимусе взрослых животных тучные клетки преимущественно располагаются в соединительнотканной капсуле и междольковых септах [11]. В пределах тимусных долек, по одним данным, ТК в норме также обнаруживаются и в этом случае располагаются в виде вкраплений среди лимфатических и стромальных клеток [12], по другим — локализация ТК среди лимфоидных клеток связана лишь с определенными условиями. Так, большое количество тучных клеток обнаружено в корковом веществе у мышей линии NZB, в медулле у цыплят с мускульной дистрофией и в случае индуцированной анемии [13]. Результаты нашей работы показывают, что в тимусе взрослых мышей тучные клетки обнаруживаются исключительно в пределах капсулы, септ, субкапсулярных и периваскулярных пространств, и такая локализация ТК сохраняется на протяжении всего постнатального онтогенеза. Здесь важно отметить, что значение подобной локализации тучных клеток на сегодняшний день не получило удовлетво- 58 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 рительного объяснения. С этой точки зрения существенными являются полученные нами данные о локализации в тимусе нервных волокон и выявленная колокализация нервных окончаний с ТК. Полученные в работе результаты свидетельствуют о том, что положительные по синаптофизину терминали преимущественно расположены именно в пределах соединительной ткани капсулы и септ тимуса, а также субкапсулярно и вокруг кровеносных сосудов, что в норме совпадает с локализацией ТК в постнатальном тимусе мыши. Это обстоятельство может оказаться существенным для решения ряда вопросов. Несмотря на то, что тучноклеточная популяция тимуса является объектом пристального внимания со стороны исследователей, до сих пор неясным остается вопрос о функциях тимических ТК. В тимусе отмечают сравнительно высокое содержание тучных клеток — порядка 8–9 кл/0,01 мм2 [14]. Данное обстоятельство вместе с тем фактом, что ТК экспрессируют более 20 видов высоко активных молекул, может указывать на возможность значительного вклада тучных клеток в течение ряда процессов, происходящих в тимусе. В настоящее время показано, что ТК тимуса способны принимать активное участие в процессах тимопоэза, влияя на межклеточные взаимодействия, проницаемость гемато-тимического барьера и миграцию лимфоцитов [15]. При этом не до конца понятными остаются механизмы, обеспечивающие выборочное выделение тучными клетками определенных медиаторов в различных условиях. Факт колокализации ТК и нервных окончаний в тимусе позволяет по-новому взглянуть на проблему. В литературе представлены данные о том, что ТК, находящиеся в непосредственной близости от терминалей нервных волокон, часто демонстрируют ультраструктурные особенности активации и частичного запустения гранул, что является следствием выборочной секреции их компонентов [16]. Данный процесс частичной дегрануляции, описанный для ТК сравнительно недавно, выражается в секреции компонентов гранул тучных клеток в отсутствие морфологической картины классической дегрануляции ТК, которая наблюдается в ходе аллергических реакций немедленного типа. Посредством данного механизма разные молекулы в пределах одной гранулы могут быть секретированы независимо друг от друга. Так, показано, что при стимуляции блуждающего нерва в тканях кишечника наблюдается значительное увеличение содержания гистамина в отсутствие признаков классической дегрануляции ТК [17]. Экспериментально доказано, что серотонин может быть секретирован тучными клетками независимо от гистамина [18]. Основываясь на этих дан- ных, можно предположить, что именно сигналы нервной системы определяют, какие медиаторы будут секретированы тучными клетками в окружающие ткани в тех или иных условиях. Интересен тот факт, что по крайней мере часть нервных терминалей, колокализованных в тимусе с тучными клетками, как нами показано, принадлежат к катехоламинергической нервной системе. Именно катехоламинергические системы, использующие дофамин или норадреналин в качестве нейромедиатора, играют важную роль в регуляции различных физиологических процессов и поведенческих актов, а также являются ключевыми системами, обеспечивающими реакцию организма на различные стрессорные воздействия. Тимус, в свою очередь, как известно, чрезвычайно чувствителен к действию стрессорных факторов. Под действием ионизирующей радиации, введения стероидных гормонов и т. п. происходит прогрессирующее снижение массы, объема и функциональной активности тимуса. Такой ответ на различные неблагоприятные воздействия принято называть стресс-индуцированной инволюцией или акцидентальной трансформацией тимуса. Данный процесс сопровождается исчезновением митотических структур, встречающихся в норме, значительным уменьшением количества double-positive (DP) CD4+CD8+ Т-клеток и увеличением числа апоптотических телец в кортикальной части тимуса. В отличие от возрастной инволюции, последствия акцидентальной трансформации полностью устраняются после отмены действия стресс-индуцирующего фактора [19]. Здесь следует отметить, что хотя начало изучению такой инволюции тимуса было положено работами Г. Селье еще в 1930 году, механизмы и биологическое значение этого явления до сих пор не до конца ясны. Не менее интересным с этой точки зрения является и процесс восстановления тимуса после акцидентальной трансформации. Сравнительно недавно было показано, что в регенерации тимуса после атрофии существенную роль могут играть тучные клетки. Так, T. Marinova и соавт. [20] обнаружили, что ТК тимуса человека, в норме локализованные в пределах капсулы, септ и субкапсулярных пространств и экспрессирующие фактор роста нервов (NGF), в ходе атрофии, вызванной различными инфекциями, значительно увеличиваются количественно, распределяются по всей строме тимуса и характеризуются увеличением секреции NGF. Более широкое распределение NGF-иммунопозитивных ТК во всех областях тимуса и увеличенная экспрессия NGF положительно коррелируют со степенью инволюционных изменений, что, по мнению авторов, является свидетельством важной роли МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 NGF/ТК-взаимодействий в процессах инволюции тимуса. Действительно, in vitro показано, что NGF проявляет себя как фактор, способствующий выживанию и дифференцировке тучных клеток [21]. Однако здесь существенным может быть и другой аспект — именно NGF считается одним из ключевых участников взаимодействий между ТК и нервными волокнами. В связи с этим кажется вполне вероятным, что взаимодействие ТК — нерв также может вносить определенный вклад в процессы, происходящие при стресс-индуцированной инволюции тимуса. Полученные нами данные по изменению количества и локализации тучных клеток в тимусе при акцидентальной трансформации согласуются с экспериментальными данными, предоставленными T. Marinova и соавт. [20]. На модели введения гидрокортизона в данной работе было показано изменение локализации тучных клеток в тимусе мыши в ходе акцидентальной трансформации, при которой данные клетки выявлялись во всей паренхиме органа, что в норме не свойственно тучным клеткам постнатального тимуса. Первые изменения в морфологии и локализации тучных клеток были обнаружены нами через 48 ч после введения гидрокортизона. Факт появления ТК в нетипичной для постнатального тимуса локализации через 2 сут интересен в рамках предоставленных экспериментальных данных о том, что время полного созревания перитонеальных ТК у крыс составляет 48 ч. В серии экспериментов по стимуляции образования ТК путем многократного промывания брюшной полости крысы изотоническим раствором натрия хлорида [22] было показано, что 48 ч — минимальный интервал между смывами, в течение которого возможно формирование всех четырех стадий созревания тучных клеток, выявляемых в реакции альциановый синий — сафранин, что и доказывает 48-часовой период созревания ТК. При одновременном окрашивании срезов тимуса альциановым синим и сафранином было обнаружено, что через 48 ч после инъекции гидрокортизона ТК в тимусе формируют гетерогенную по гистохимическим характеристикам популяцию. Гетерогенность выражается в том, что гранулы одних тучных клеток связывают сафранин и окрашены в красный цвет (Saf+ гранулы), в то время как гранулы других ТК синие из-за сродства их компонентов к альциановому синему (Alc+ гранулы); наконец, присутствуют ТК, гранулы которых связывают одновременно оба красителя, что придает цитоплазме данных клеток сине-фиолетовый или красновато-фиолетовый оттенок. На основании особенностей окрашивания, а также с учетом таких морфологических характеристик, как клеточные форма и размер, в точке 48 ч нами было выделено 4 морфо- 59 типа тучных клеток, которые соответствуют разным стадиям созревания этих клеток. S. Spicer в 1960 году постулировал, что окрашивание альциановый синий — сафранин выявляет степень сульфатированности гепарина — обязательного компонента гранул ТК. Главным фактором, определяющим гистохимические свойства гепарина, является полианионный характер его молекулы, формирующийся за счет наличия большого количества кислых групп сульфата, расположенных вдоль полимерной цепи. Согласно данным литературным запасание гепарина в гранулах ТК включает в себя несколько этапов: синтез несульфатированного предшественника полисахарида, его накопление и параллельное присоединение сульфата к его аминогруппам, приводящее к формированию химически зрелого высокосульфатированного гепарина [23]. При использованном окрашивании альциановый синий обнаруживает определенную степень сродства к несульфатированному либо слабо сульфатированному предшественнику (чем меньше сульфата, тем больше сродство), который не связывается с сафранином, в то время как сафранин, наоборот, связывается исключительно с высокосульфатированным гепарином. Исходя из этого можно предположить, что те ТК, которые характеризуются наличием Alc+ гранул (стадии I, II, III), содержат предшественник гепарина, обедненный N-сульфатом или с полным его отсутствием. Те же клетки, которые имеют Saf+ гранулы (стадии II, III, IV), содержат высокосульфатированный зрелый гепарин. Наличие гранул с промежуточным фиолетовым окрашиванием является тогда свидетельством присутствия в гранулах как несульфатированного предшественника полисахарида, так и зрелого гепарина, а относительное количество этих гранул может отражать этапность процесса созревания ТК. На основании этих данных можно сделать вывод о том, что в процессе восстановления тимуса после акцидентальной трансформации в нем идет процесс созревания тучных клеток. Факт созревания тучных клеток в ходе акцидентальной трансформации непосредственно в тимусе оказывается интересным в рамках обсуждения проблемы, касающейся характера ответа ТК на стресс. На участие тучных клеток в развитии стресс-реакции обратил внимание еще Г. Селье. В настоящее время накоплены многочисленные экспериментальные данные, свидетельствующие об участии тучных клеток в формировании адаптивных реакций организма в ответ на действие различных экстремальных факторов [14]. При этом ряд исследователей считают, что ответ ТК на нарушения гомеостаза вследствие воздействия этих факторов носит неспецифичес- 60 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 кий характер и является неотъемлемым компонентом в развитии стресс-реакции при адаптации организма к изменившимся условиям [7]. Реакция ТК на действие стрессорных факторов при этом определяется как однонаправленная, проявляющаяся в большой или меньшей степени в зависимости от типа воздействия и специфики органа, выраженная в тотальной дегрануляции, уменьшении синтетической активности и перераспределении тучных клеток между тканями. Увеличение количества ТК при различных патологических состояниях (в том числе при стрессе), как правило, считают следствием усиления пролиферации предсуществующих зрелых ТК конкретной ткани либо миграции и перераспределения ТК между разными органами [7, 24]. Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что появление новых ТК в тимусе после акцидентальной трансформации связано с их созреванием in situ, что, в свою очередь, ставит вопрос о природе данных предшественников. На протяжении длительного времени было получено множество интересных, но не до конца ясных сведений об участии тимуса в развитии ТК [25]. G. Csaba на основании своих исследований заключил, что тимус принимает существенное участие в формировании тучных клеток и является главным органом мастоцитопоэза у взрослых животных. Согласно его гипотезе, ТК формируются в тимусе из ретикулярных клеток, а также из средних и больших тимоцитов. M. Staemmler и J. Lehner привлекли внимание к тому факту, что тимус, в отличие от других паренхиматозных органов, может быть чрезвычайно богат тучными клетками. J. Lehner также предположил, что постепенное уменьшение лимфоидной ткани в процессе дегенерации тимуса главным образом объясняется процессом общей гетеропластической дифференцировки лимфоцитов в ТК. H. Ginsburg, в работе которого детально прослежены этапы тучноклеточной трансформации клеток тимуса в культуре, подчеркивает возможную роль этого органа в образовании предшественников ТК. По мнению автора, эти предшественники связаны с «блуждающими» лимфатическими клетками соединительной ткани. Своеобразным продолжением работ H. Ginsburg стало исследование эффектов тканевых повреждений и удаления тимуса. Так, K. Krishna отметил снижение количества ТК и содержания гистамина при тканевом повреждении в непосредственной близости от травмированной области и незначительные изменения (или отсутствие изменений) данных характеристик в удаленных областях, в то время как после тимэктомии наблюдалось увеличение количества ТК и гистамина в отдаленных областях (особенно в брюшине). Это, по мнению автора, может означать, что удаление тимуса неясным образом ведет к активации или выходу предшественников ТК или что некий регулирующий развитие тучных клеток фактор управляется тимусом и поэтому временно исчезает после удаления органа [25]. С учетом этих данных показанная принципиальная возможность созревания ТК непосредственно в тимусе у взрослых животных может быть значимой в рамках гипотезы тимического происхождения тучных клеток, согласно которой именно тимус является одним из главных органов мастоцитопоэза у взрослых животных, а предшественниками ТК могут служить Т-лимфоциты [25, 26]. Данной гипотезе не противоречит тот факт, что после опустошения тимуса под действием повреждающих факторов (стероидов, ионизирующего излучения) мобилизуются именно внутритимусные источники экстренного восстановления органа. Существенно, что восстановление тимуса после акцидентальной трансформации реализуется через образование γδТ-лимфоцитов, а по временным параметрам начальные этапы восстановления популяции лимфоцитов тимуса совпадают с появлением «нетипичных» тучных клеток в органе. Интересно также то, что в начальном периоде после заселения тимуса эмбрионов в нем развиваются тимоциты, также содержащие в составе Т-клеточного рецептора γ- и δ-цепи [15]. Для тимуса мыши в процессе его восстановления после акцидентальной трансформации имеет место определенный вектор в распределении тучных клеток разной степени зрелости (таблица). Так, ТК I локализуются в мозговом веществе, на кортикально-медуллярной границе и в глубоких слоях коркового вещества и не выявляются в периферических компартментах органа, в то время как ТК IV, наоборот, локализованы вне мозгового вещества, преимущественно субкапсулярно, в составе капсулы и септ, редко — в корковом веществе и на границе кортексмедулла; переходные формы — ТК II и ТК III — присутствуют во всех перечисленных локализациях за исключением мозгового вещества. Такое пространственное распределение тучных клеток разной степени зрелости в тимусе в ходе восстановления органа после акцидентальной трансформации создает впечатление определенной пространственной направленности процесса дифференцировки тучных клеток — их появления и начала созревания в мозговом и глубоком корковом веществе тимуса с последующим перемещением по мере созревания в сторону капсулы. Важно отметить, что гистологическая картина данного процесса оказывается сходной с таковой при переходе от эмбрионального тимуса к постнатальному. Локализация наиболее 61 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 Òàáëèöà Ïðîñòðàíñòâåííîå ðàñïðåäåëåíèå òó÷íûõ êëåòîê ðàçíûõ ñòàäèé çðåëîñòè â òèìóñå ìûøè ÷åðåç 48 ÷ ïîñëå ââåäåíèÿ ãèäðîêîðòèçîíà Ñòàäèè ñîçðåâàíèÿ ÒÊ ÒÊ I (ìàêñèìàëüíî íåçðåëûå) ÒÊ II ÒÊ III ÒÊ IV (ìàêñèìàëüíî çðåëûå) Êîðêîâîå âåùåñòâî Ìîçãîâîå Êîðòèêàëüíî-ìåäóëëÿðãëóáîêîå êîðêîâîå ñóáêàïñóëÿðíîå âåùåñòâî íàÿ ãðàíèöà âåùåñòâî ïðîñòðàíñòâî + — — — + + + — незрелых тучных клеток (ТК I) в тимусе в ходе восстановления после акцидентальной трансформации совпадает с расположением ТК в эмбриональном органе, а локализация максимально зрелых ТК (ТК IV) — с расположением тучных клеток в постнатальном тимусе в норме, а также с локализацией в тимусе нервных окончаний. Колокализация с нервными терминалями именно зрелых ТК вместе с тем фактом, что по мере своего со- + + + + — + + + Êàïñóëà è ñåïòû — — — + тивных веществ. Медиаторы ТК, в свою очередь, обладают разнонаправленным действием и влияют как на сами нервные клетки-источники нейропептидов, так и на клетки окружающих тканей (рис. 5). Не исключено, что в данной системе взаимодействий ТК являются посредниками, которые переводят сигналы нервной системы с языка нейропептидов на язык цитокинов. В таком контексте тучные клетки могут быть рассмотрены как эффекторные и, возмо- Рис. 5. Возможные механизмы взаимодействия тучных клеток и терминалей нервных волокон. ЦНС — центральная нервная система; CGRP — белок, связанный с кальцитониновым геном; H — гистамин; 5HT2A – серотонин 2а; NGF– фактор роста нервов; NK-1 — нейрокинин 1; PAR — рецептор, активированный протеазами; TNFR — рецептор TNF; trk — тирозинкиназный рецептор нейротропина. зревания ТК, по-видимому, направленно перемещаются в места локализации нервных волокон в тимусе, может быть косвенным свидетельством важной роли взаимодействия ТК-нерв для процесса акцидентальной трансформации. Известно, что функционально зрелые ТК отвечают на воздействие нейропептидов, как правило, выделением из гранул биологически ак- жно, амплифицирующие сигналы, поступающие от нервной системы в норме и при стрессе. Поскольку на нервных терминалях представлены рецепторы для молекул, секретируемых ТК, возникает вопрос, являются ли ТК только клетками-мишенями, которые воспринимают эфферентные сигналы от ЦНС, или они могут быть также клетками, генерирующими аф- 62 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 ферентные сигналы от тимуса к ЦНС (см. рис. 5). Хотя в настоящее время это предположение является гипотезой, ее основанием могут служить данные о наличии многочисленных рецепторов для факторов, секретируемых ТК, на нервных терминалах. Выводы. 1. В постнатальном тимусе мыши тучные клетки обнаруживаются исключительно в пределах капсулы, септ, субкапсулярных и периваскулярных пространств. 2. После индуцированной введением гидрокортизола акцидентальной трансформации тучные клетки проходят ряд этапов созревания непосредственно в тимусе. 3. В процессе эмбрионального созревания и формирования постнатального тимуса, а также после акцидентальной трансформации тучные клетки перемещаются по мере созревания от мозгового и глубокого коркового веществ тимуса к капсуле и септам органа. 4. В постнатальном тимусе мыши тучные клетки колокализованы с терминалями нервных волокон, часть которых являются катехоламинергическими. * * * Работа поддержана грантами Санкт-Петербургского государственного университета № 1.38.80.2012 и ДВО РАН № 12-I-П7-05. Литература 1. Корнева Е. А., Хай Л. М. Влияние разрушения участков гипоталамической области на процесс иммуногенеза // Физиол. журнал СССР.— 1963.— Т. 49, № 1.— С. 42–48. 2. Пуговкин А. П. Морфофункциональные основы обеспечения нейрогуморальной регуляции функций иммунной системы // Иммунофизиология / под ред. Е. А. Корневой.— СПб.: Наука, 1993.— С. 37–66. 3. Bulloch K. Neuroanatomy of lymphoid tissue: a review // Neural modulation of immunity / Proc. Int. Symp. / Eds. R. Guillemin, M. Cohn.— N. Y., 1985.— P. 111–141. 4. Felten D. L., Felten S. Y., Carlson S. L. et al. Noradrenergic and peptidergic innervation of lymphoid tissue // J. Immunol.— 1985.— Vol. 135, № 2.— P. 755S–765S. 5. Livnat S., Felten S. Y., Carlson S. L. et al. Involvement of peripheral and central catecholamine systems in neural-immune interactions // J. Neuroimmunol.— 1985.— Vol. 10, № 1.— P. 5–30. 6. Williams J. M., Peterson R. G., Shea P. A. et al. Sympathetic innervation of murine thymus and spleen: evidence for a functional link between the nervous and immune systems // Brain Res. Bull.— 1981.— Vol. 6, № 1.— P. 83–94. 7. Юшков Б. Г., Черешнев В. А., Климин В. Г., Арташян О. С. Тучные клетки: физиология и патофизиология.— М.: Медицина, 2011.— 237 с. 8. Гусельникова В. В., Синицина В. Ф., Королькова Е. Д. и др. Локализация тучных клеток в тимусе мыши на разных этапах онтогенеза // Морфология.— 2012.— Т. 141, № 2.— С. 40–45. 9. Befus A. D., Johnston N., Nielsen L. et al. Thymic mast cell deficiency in avian muscular dystrophy // Thymus.— 1981.— Vol. 3, № 6.— P. 369–376. 10. Bigaj J., Urbanska-Stopa M., Plyrycz B. Argentaffin mast cell in the thymus of the frog // Folia Histochem. Cytobiol.— 1999.— Vol. 29, № 1.— P. 45–47. 11. Bodey B., Calvo W., Prummer O. et al. Development and histogenesis of the thymus in dog: a light and electron microscopical study // Dev. Com. Immunol.— 1987.— Vol. 11, № 1.— P. 227–238. 12. Lorton D., Bellinger D. L., Felten S. Y., Felten D. L. Substance P innervation of the rat thymus // Peptides.— 1990.— Vol. 11.— P. 1269–1275. 13. Kendall M. D. Hemopoiesis in the thymus // Dev. Immunol.— 1995.— Vol. 4, № 1.— P. 157–168. 14. Арташян О. С., Юшков Б. Г., Храмцова Ю. С. Морфологические аспекты участия тучных клеток в формировании общего адаптационного синдрома // Таврический медико-биологический вестник.— 2012.— Т. 15, № 3.— С. 22–25. 15. Кветной И. М., Ярилин А. А., Полякова В. О., Князькин И. В. Нейроиммуноэндокринология тимуса.— СПб.: ДЕАН, 2005.— 160 с. 16. Rychter J. W., Nassauw L. van, Timmermans J. P. et al. CGRP1 receptor activation induces piecemeal release of protease-1 from mouse bone marrow-derived mucosal mast cells // Neurogastroenterol. Motil.— 2011.— Vol. 23, № 2.— P. 57–68. 17. Gottwald P., Hewlett B. R., Lhotak S., Stead R. H. Electrical stimulation of the vagus nerve modulates the histamine content of mast cells in the rat jejunal mucosa // Neuroreport.— 1995.— Vol. 7.— P. 313– 317. 18. Vliagoftis H., Dimitriadou V., Theoharides T. C. Progesterone triggers selective mast cell secretion of 5-hydroxytryptamine // Int. Arch. Allergy Appl. Immunol.— 1990.— Vol. 93.— P. 113–119. 19. Старская И. С., Кудрявцев И. В., Полевщиков А. В. Морфологический анализ и динамика гидрокортизон-индуцированной атрофии тимуса // Медицинский академический журнал.— 2012.— Т. 12, № 3.— С. 94–96. МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 63 20. Marinova T., Philipov S., Aloe L. Nerve Growth Factor immunoreactivity of mast cells in acute involuted human thymus // Inflammation.— 2007.— Vol. 30, № 1–2.— P. 38–43. 21. Aloe L., DeSimone R. NGF primed spleen cells injected in brain of developing rats differentiate into mast cells // Int. J. Dev. Neuroscience.— 1989.— Vol. 7.— P. 565–573. 22. Desaga J. F., Parwaresch M. R., Muller-Hermelink H. K. Die Zytochemische Identifikation der Mastzellvorstuffen bei der Ratte // Z. Zellforsch.— 1971.— Vol. 121.— P. 292–300. 23. Spicer S. S. A correlative study of the histochemistry properties of rodent acid mucopolysaccharides // J. Histochem. Cytochem.— 1960.— Vol. 8.— P. 18–35. 24. Chen Z., Wang G., Luo H. et al. Chronic stress induced proliferation and activation of mast cells of gastric antrum in rats // Wuhan University Journal of Natural Sciences.— 2008.— Vol. 13, № 2.— P. 247–251. 25. Гусельникова В. В., Пронина А. П., Назаров П. Г., Полевщиков А. В. Происхождение тучных клеток: современное состояние проблемы // Вопросы морфологии XXI века.— 2010.— Вып. 2.— C. 108–115. 26. Ginsburg H. The in vitro differentiation and culture of normal mast cells from the mouse thymus // Ann. N. Y. Acad. Sci.— 1963.— Vol. 103, № 1.— P. 20–39. Поступила в редакцию: 15.07.2013 г. Контакт: Гусельникова Валерия Владимировна. (812) 328-96-87 Внимание читателя! Готовится к изданию сборник научных работ «Нейронауки и ВИЧ-инфекция» / Под ред. Н. А. Белякова и Т. Н. Трофимовой.— СПб.: Балтийский медицинский образовательный центр.— 2014.— 200 с. Заявки направлять на электронный адрес: infeklcijaaids@gmail.com 64 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 УДК 613.98;612.67/.68 ПЕПТИДЫ ТИМУСА В РЕГУЛЯЦИИ СТРЕССА 1,3Н. М. Киселева, 2,3А. В. Новоселецкая, 2А. Н. Иноземцев, 3И. В. Зимина, 3В. Я. Арион 1Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н. И. Пирогова, Москва, 2Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, Россия 3НИИ физико-химической медицины, Москва, Россия Россия PEPTIDES OF THYMUS IN THE REGULATION OF STRESS 1,3N. M. Kiseleva, 2,3A. V. Novoseletskaya, 2A. N. Inozemtsev, 3I. V. Zimina, 3V. Ya. Arion 1Russian National Research Medical University named after N. I. Pirogov, Moscow, Russia 2Lomonosov Moscow State University, Russia 3Scientific Research Institute of Physico-Chemical Medicine, Moscow, Russia © Коллектив авторов, 2013 г. Целью настоящего клинико-экспериментального исследования явилось изучение роли пептидов тимуса в регуляции стресса. На первом этапе исследования нами проанализированы уровни сывороточной тимической активности (СТА) в 112 парах мать–ребенок в момент родового стресса. Контрольным показателем служил уровень СТА здоровых небеременных женщин детородного возраста (n=10). Только у здоровых рожениц с неотягощенным анамнезом при физиологически протекающей беременности имела место адекватная реакция организма на родовой стресс в виде повышения исследуемого показателя. Следующим этапом исследования было изучение действия препарата полипептидов тимуса тактивина на поведение, обучение и способность противостоять стрессу у экспериментальных животных. Исследования проведено на 400 крысах линии Wistar. Препарат увеличивал ориентировочно-исследовательское поведение животных и оказывал мнемотропный эффект, сопоставимый с действием классического ноотропного препарата пирацетама. На моделях нарушения памяти показано, что тактивин улучшает воспроизведение реакции избегания в условиях эмоционального стресса. Данный эффект был сопоставим с влиянием ноотропного препарата пирацетама и отличен от эффекта анксиолитика диазепама. Данные, полученные в исследовании, позволяют говорить о стресслимитирующей активности полипептидов тимуса. Ключевые слова: пептиды тимуса, тактивин, эмоциональный стресс, поведение, условный рефлекс, стресспротекторное действие. The aim of this clinical and experimental research is the examination of the role of peptides of thymus in the regulation of stress. At the first stage of research, levels of serum thymic activity (STA) in 112 mother-child pairs have been analyzed in the moment of birth stress. Level of STA of healthy non pregnant women of childbearing age has been taken as the reference rate (n=10). Only healthy parturient women with non-compromised history of physiologically progressing pregnancy had adequate reaction of the organism to the birth stress in the form of the increase of the level of the examined indicator. The next stage of the research was the study of the influence of thymus polypeptide drug tactivin on the behavior, training and ability to resist stress in the experimental animals. The research has been carried out on 510 rats of Wistar line. The drug has been increasing orientative-exploratory behavior of animals and has been exerting mnemotropic effect comparable to the effect of classic nootropic drug piracetam. On the basis of models of memory impairments, it was shown that tactivin improves reproduction of avoidance response in conditions of emotional stress. This effect was comparable to the influence of nootropic drug piracetam and was different from the effect of anxiolytic diazepam. The data received as the result of this research lead to the declaration of stress-limiting activity of polypeptides of thymus. Key words: peptides of thymus, tactivin, emotional stress, behavior, reflex, stressprotective action. Введение. В настоящее время обсуждается вопрос о взаимодействии иммунной, нервной и эндокринной систем. Возникло новое направление нейроиммуноэндокринологии. Современные исследования показывают, что центральная нервная система испытывает влияние со стороны иммунной системы. Продукты иммунокомпетентных клеток — цитокины — обладают нейротропной активностью, участвуют в физиологических механизмах памяти, регуляции сна, активности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы, реализации стресс-реакции [1–5]. В основу данной работы легло предположение, что тимус, а следовательно и продуцируемые им пептиды, играют существенную роль не только в регуляции иммунной системы, но и в адаптации организма в целом при любых стрессорных воздействиях, запуская МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 различные клеточные и молекулярные каскады, оказывая влияние на все органы и системы, и в первую очередь изменяя активность нейронов ЦНС [6]. Материалы и методы исследования. Проведен анализ уровня сывороточной тимической активности в 112 парах мать–дитя в момент родового стресса. В качестве группы сравнения оценивали уровень исследуемого показателя у здоровых небеременных женщин (n=10). В зависимости от состояния здоровья, особенностей соматического и акушерско-гинекологического анамнеза и течения беременности матери были разделены на четыре группы: 1-я группа (n=19) — здоровые матери с неотягощенным анамнезом и нормально протекавшей беременностью; 2-я группа (n=14) — матери с отягощенным соматическим и/или акушерско-гинекологическим анамнезом, настоящая беременность у которых протекала также нормально; 3-я группа (n=20) — матери с благоприятным соматическим и акушерско-гинекологическим анамнезом, но с осложненным течением беременности в виде раннего токсикоза и/или повышенного тонуса матки; 4-я группа (n=59) — матери с отягощенным соматическим и/или акушерско-гинекологическим анамнезом и осложненным течением беременности, в числе которых такие же осложнения, как у матерей детей 3-й группы. Группой сравнения (5-я группа — n=10) служили здоровые небеременные женщины. Статистически значимых различий в возрасте женщин не было. Уровень сывороточной тимической активности определяли по методу J. Bach [7] в модификации V. Ya. Arion и соавт. [8]. Кровь для исследования забирали у женщин из кубитальной вены сразу после рождения ребенка. У детей исследовали пуповинную кровь, при заборе которой избегали смешивания с кровью матери. Статистическая обработка результатов исследования проводилась методом вариационной статистики с определением средней арифметической (М), стандартного отклонения (σ), стандартной ошибки средней (m). Достоверность различий определялась по критерию Стьюдента (t). Экспериментальное исследование проводилось на 400 крысах Вистар массой 180–200 г. Все животные содержались в стандартных условиях вивария с 12-часовым циклом день-ночь со свободным доступом к пище и воде. Перед началом эксперимента всех животных тестировали в открытом поле для создания идентичных по поведению групп. После тестирования животные делились на четыре группы: 1-ю группу составили контрольные животные, которым вводили изотонический раствор натрия хлорида; 2-я группа получала полипептидный препарат тимуса в дозе 0,5 мг/кг; 3-я группа — эталонный 65 ноотропный препарат пирацетам в дозе 300 мг/кг; 4-я группа — эталонный анксиолитический препарат диазепам в дозе 0,5 мг/кг. Все препараты вводились внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл. Перед началом экспериментов тактивин и изотонический раствор натрия хлорида вводили 5 дней, в последующем через день на протяжении всего опыта. Предварительного курса диазепама и пирацетама не проводили. Через 5 дней после первого тестирования животных вновь тестировали в открытом поле на фоне действия препаратов. Кроме того, проводили тестирование в приподнятом крестообразном лабиринте и светло-темной камере. После проведения тестов у животных вырабатывали условные рефлексы: пищевой условный рефлекс [9], условный рефлекс пассивного избегания, условный рефлекс активного избегания. После достижения животными критерия обученности (80% реакций избегания) у животных формировали эмоциональный стресс. Для этого в работе использовали два приема обратимых функциональных нарушений реакции избегания, которые вызывались внезапными изменениями условий опыта: сбой [10] и пространственную переделку навыка [11]. За 45 мин до проведения функциональных нарушений животным вводили препараты. Статистическую обработку полученных данных проводили с применением программы STATISTICA 6.0 (Statsoft, США), используя непараметрический критерий Вилкоксона. Результаты исследования. На первом этапе исследования проанализирован уровень сывороточной тимической активности в парах мать–дитя при родовом стрессе (табл. 1). У матерей 1-й группы уровень исследуемого показателя был статистически значимо выше, чем аналогичный показатель у здоровых небеременных женщин. Таким образом, полученные нами результаты подтвердили данные, выявленные ранее в 1991 году И. Ф. Лабунец и соавт. [12], что уровень сывороточной тимической активности повышается перед родами. Обращает на себя внимание факт, что у матерей 1-й группы уровень данного показателя в сыворотке крови, взятой из кубитальной вены сразу после рождения ребенка, был статистически значимо выше, чем у матерей 2-й, 3-й и 4-й групп с патологическим и/или отягощенным течением беременности. На втором этапе исследования был проведен анализ действия полипептидов тимуса тактивина на поведение животных в условиях с разной степенью стессогенности. В поведенческих тестах при повторном тестировании в «открытом поле» препарат снижал уровень страха, что проявлялось в сопоставимом с действием эталонных препаратов уменьшении 66 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 Òàáëèöà 1 Ðàñïðåäåëåíèå çíà÷åíèé ñûâîðîòî÷íîé òèìè÷åñêîé àêòèâíîñòè â ïóïîâèííîé êðîâè äîíîøåííûõ íîâîðîæäåííûõ äåòåé è â êðîâè èõ ìàòåðåé, âçÿòîé èç êóáèòàëüíîé âåíû ñðàçó ïîñëå ðîæäåíèÿ ðåáåíêà Ãðóïïà 1-ÿ ãðóïïà — çäîðîâûå ðîæåíèöû 2-ÿ ãðóïïà — ðîæåíèöû ñ îòÿãîùåííûì àíàìíåçîì 3-ÿ ãðóïïà — ðîæåíèöû ñ ðàííèì òîêñèêîçîì è/èëè ãèïåðòîíóñîì ìàòêè 4-ÿ ãðóïïà — ðîæåíèöû ñ îòÿãîùåííûì àíàìíåçîì è ñ ðàííèì òîêñèêîçîì è/èëè ãèïåðòîíóñîì ìàòêè å (2±3±4)* 5-ÿ ãðóïïà — çäîðîâûå íåáåðåìåííûå æåíùèíû Óðîâåíü çíà÷èìîñòè ðàçëè÷èÿ ïîêàçàòåëåé * Ñðåäíåå Óðîâåíü ñûâîðîòî÷íîé òèìè÷åñêîé àêòèâíîñòè (log2 N), M±m ×èñëî íàáëþäåíèé æåíùèíû äåòè Óðîâåíü çíà÷èìîñòè ðàçëè÷èÿ ïîêàçàòåëåé â ïàðàõ ìàòü-ðåáåíîê, ð 19 14 3,9±0,3 2,1±0,3** 2,8±0,3 2,7±0,2 ð<0,05 ð>0,05 20 2,5±0,2** 3,3±0,2 ð<0,01 59 2,2±0,1** 2,7±0,1 ð<0,001 93 10 2,3±0,2** 2,6±0,1** 2,9±0,25 ð>0,05 ð<0,001, ïî ñðàâíåíèþ ñ 1 ãðóïïîé ð>0,05 çíà÷åíèå óðîâíÿ ÑÒÀ âî 2-é, 3-é è 4-é ãðóïïàõ, âçÿòûõ âìåñòå. нахождения животных в периферических секторах и увеличении ориентировочно-исследовательской активности. На фоне тактивина уменьшалось количество норковых реакций, что также свидетельствует об уменьшении тревоги (рис. 1). В приподнятом крестообразном лабиринте и тесте «светло-темнового» выбора препарат не проявил выраженных анксиолитических свойств, однако жи- обучению. Особенно выраженно действие тактивина на обучение проявлялось на начальном этапе, чему, видимо, способствовало уменьшение чрезмерно высокого эмоционального напряжения животных, вызываемого новой обстановкой и более частым электроболевым воздействием. При тестировании через 24 ч после формирования у животных условного рефлекса пассивного избегания Рис. 1. Поведение животных в открытом поле (% по отношению к результатам первого тестирования). * р<0,05 относительно контроля. вотное в лабиринте и темном отсеке «светло-темновой» камеры чувствовали себя комфортно, что проявлялось в четком последовательном груминге, достигающем своих финальных стадий. Более высокая двигательная активность на фоне тактивина и пирацетама во всех перечисленных тестах сочеталась с более быстрой выработкой как оборонительных (рис. 2, 3), так и пищевых условных рефлексов, т. е. такое поведение способствовало латентный период захода в темный отсек увеличился во всех группах животных при этом статистически значимых отличий между животными, получавшими тактивин, изотонический раствор натрия хлорида и диазепам не обнаруживалось. Животные, получавшие пирацетам, при тестировании через 24 ч, 48 ч, 1 и 2 нед в темный отсек не входили, что отражалось в максимально большом значении латентного периода 180 с. Под действием тактивина наблюдалось отсро- МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 Рис. 2. Доля положительных реакций (%) при выработке пищевого условного рефлекса у крыс. * р<0,05 по сравнению с контролем. Рис. 3. Динамика формирования условного рефлекса активного избегания. *р<0,05 относительно контроля. ченное действие на память. Через неделю латентный период захода животного в темный отсек на фоне полипептидов тимуса статистически значимо (р<0,001) превышал контрольный уровень (107,8±3,3 с и 96,1±4,5 c) и этот эффект сохранялся через две недели (106,9±3,2 с и 95,0±5,2 c). У животных, получавших диазепам, латентный период перехода в темный отсек не отличался от контрольных животных на протяжении всего опыта (24 ч — 126,9±2,8 с; 48 ч — 100,0±3,3 с; 1-я неделя — 98,3±4,1 с; 2 недели — 98,7±3,3). Следовательно, тактивин, в отличие от диазепама и подобно пирацетаму, оказал положительное влияние на память. Это позволяет заключить, что полипептиды тимуса обладают ноотропоподобными свойствами. В процессе выработки пищевого условного рефлекса количество положительных реакций увеличивалось во всех группах (рис. 2). К концу опыта все группы животных достигали критерия обученности (80% и более положительных реакций). Животные, получавшие тактивин и пирацетам, во все дни экспериментов статистически значимо превышали уровень обучения контрольных животных, а группа животных, получавших диазепам, обучалась значимо хуже в 1–4-й дни эксперимента. 67 Полученные нами данные свидетельствуют, что процесс обучения в группах, получавших тактивин и пирацетам, происходил значительно быстрее, чем в контрольной, на протяжении 300 предъявлений условного и безусловного стимулов (рис. 3). Первые реакции избегания, а также 5 и 10 реакций избегания подряд у животных указанных групп также появлялись раньше. В то же время анксиолитический препарат диазепам удлинял процесс обучения относительно контроля (рис. 3). Одним из проявлений ускорения тактивином процесса обучения было уменьшение латентного периода перехода в другую часть камеры под действием условного сигнала. Во все дни эксперимента животным на фоне действия тактивина, так же как на фоне действия ноотропного препарата, требовалась меньшая продолжительность действия условного сигнала для совершения реакции, в отличие от контрольной группы животных. Таким образом, тактивин, так же как ноотропный препарат, ускоряет формирование условного рефлекса активного избегания. Как и в поведенческих тестах, на фоне обучения, в частности при формировании условного рефлекса активного избегания, под влиянием тактивина мы наблюдали четкий последовательный груминг, доходящий до финальных стадий, что свидетельствовало о более спокойном, комфортном состоянии животного. При наблюдении за животными при формировании данного рефлекса мы обратили внимание, что на фоне тактивина и пирацетама животные в межсигнальном периоде предпочитали находиться возле отверстия или в центре камеры, у них наблюдались элементы исследовательской активности, тогда как животные контрольной группы находились почти неподвижно в углах камеры далеко от отверстия. Следующим этапом нашей работы стало изучение влияния исследуемого препарата на эмоциональный стресс, вызываемый обратимыми функциональными нарушениями реакции избегания, обусловленными сбоем и переменой местоположения отверстия (табл. 2). Тактивин предупредил развитие сбоя, превысив по своей активности ноотропный препарат и анксиолитик, которые лишь уменьшили его последствия. Нарушение реакции избегания при перемене местоположения отверстия на фоне тактивина и пирацетама уменьшилось в 2 и 2,3 раза соответственно, в контрольной группе количество реакций избегания уменьшилось в 3 раза, а на фоне действия диазепама этот показатель был даже ниже, чем в контрольной группе. При этом на фоне эмоционального стресса у животных, получавших тактивин, так же как у животных, получавших эталонные препараты пирацетам и диазепам, мы не наблюдали реакций, 68 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 Òàáëèöà 2 Âëèÿíèå òàêòèâèíà íà âîñïðîèçâåäåíèå óñëîâíîé ðåàêöèè àêòèâíîãî èçáåãàíèÿ ïîñëå îáðàòèìûõ ôóíêöèîíàëüíûõ íàðóøåíèé Ðåàêöèè èçáåãàíèÿ, % Ôóíêöèîíàëüíîå íàðóøåíèå Ñáîé ðåàêöèè èçáåãàíèÿ Âåùåñòâî Êîíòðîëü (n=50) Òàêòèâèí (n=50) Ïèðàöåòàì (n=30) Äèàçåïàì (n=30) Ïåðåìåíà ìåñ- Êîíòðîëü, (n=55) òîïîëîæåíèÿ Òàêòèâèí (n=50) îòâåðñòèÿ Ïèðàöåòàì (n=30) Äèàçåïàì (n=30) * ð<0,05 îòíîñèòåëüíî äî ÔÍ ïîñëå ÔÍ 16–20 1–5 6–10 11–15 16–20 92,0±7,3 99,8±0,2 99,8±0,2 90,0±6,7 86,1±4,1 99,8±0,2 99,8±0,2 99,8±0,2 28,0±7,3# 99,8±0,2* 80,0±3,3#* 85,0±7,7#* 32,0±8,5# 49,0±3,1#* 43,8±2,8#* 35,0±4,6# 76,0±6,3# 96,0±5,1* 73,3±4,8 80,0±6,8# 44,0±9,7# 74,2±7,3* 60,0±6,4#* 51,0±8,6# 76,0±4,3# 88,8±4,6* 93,3±3,9* 70,0±5,4 60,0±4,3 77,5±4,1* 93,3±3,7* 55,0±5,8# 80,0±7,0 87,9±4,8 99,8±0,2* 90,0±5,8 48,0±9,3# 79,2±4,7* 96,1±3,5* 58,0±5,2# êîíòðîëÿ; # ð<0,05 îòíîñèòåëüíî ñðåäíåé âåëè÷èíû äî ÔÍ. характерных для срыва высшей нервной деятельности, наблюдаемые в контрольной группе. Обсуждение результатов. На первом этапе исследования нас привлек интегральный показатель деятельности тимуса — сывороточная тимическая активность. Данный биотест в настоящее время является единственным методом для выявления иммуноактивных молекул тимуса, циркулирующих в крови [13]. Повышение уровня СТА перед родами и сохранение его высокого значения после естественных родов было отмечено ранее [12]. Если предположить, что при первой фазе любого стресса, а не только инфекционного, тимус отвечает усилением функции, то более высокий уровень сывороточной тимической активности у здоровых рожениц является адекватной реакцией на родовой стресс. Уровень исследуемого показателя у рожениц с осложненным течением первой половины беременности и/или на фоне ремиссии хронических заболеваний был ниже, чем у здоровых рожениц. Это может косвенно свидетельствовать об истощении функции тимуса у данной категории рожениц. При изучении функции любой железы можно использовать ее гормон. При введении гормона в интактный организм возникает картина усиленной работы эндокринного органа. Для изучения функции тимуса можно использовать его полипептиды, которые, как считается, обладают гормональной активностью. В настоящей работе исследовалось действие комплексного полипептидного препарата тимуса тактивина, широко применяемого в клинической практике иммуномодулятора. Его действие на иммунную систему хорошо известно и не вызывает сомнения, нас же интересовала способность тактивина усиливать стрессоустойчивость организма. Следующим этапом исследования явилось изучение антистрессорной активности тактивина в экспериментальных моделях, где участие иммунитета в классическом понимании было бы незначительным. На наш взгляд, модели поведения животных в новой обстановке, обучение и формирование эмоционального стресса путем обратимых функциональных нарушений памяти хорошо соответствуют поставленной цели. Новая обстановка является несомненно стрессовым фактором как для животных, так и для человека. Изучая действие препаратов на поведение животных в новой для них обстановке, можно судить об их возможной стресс-протективной способности. В поведенческих тестах мы наблюдали, что на фоне действия полипептидов тимуса животные чувствовали себя более комфортно в новых для себя условиях. Более высокий уровень ориентировочно-исследовательского поведения на фоне тактивина обеспечивает животное знанием об окружающей среде и является существенным психологическим механизмом адаптации высших позвоночных. По данным ряда авторов, с количественными показателями ориентировочно-исследовательского поведения коррелирует также индивидуальная устойчивость к эмоциональному стрессу. При этом повышенную эмоциональную реактивность связывают с низкой двигательной активностью и повышенной дефекацией и наоборот [14–19]. Наши данные демонстрируют, что и ноотропный препарат пирацетам, и анксиолитик диазепам, и полипептидный препарат тимуса тактивин уменьшили нарушение выработанного навыка при сбое реакции избегания. При этом также отсутствовали реакции, характерные для срыва высшей нервной деятельности. Одинаковое влияние выглядит как парадокс, поскольку анксиолитики относят к препаратам депримирую- МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 щего типа, а ноотропные препараты и, видимо, тактивин — к средствам стимулирующего типа. Основой для объяснения этого феномена служат двусторонние отношения между эмоциональным напряжением, возникающим при сбое, и решением задачи [20]. Анксиолитик уменьшает эмоциональное напряжение, следствием чего является улучшение воспроизведения избегания после сбоя. При этом он не может улучшить избегания после пространственной переделки, поскольку требуется усвоение нового навыка. Ноотропные препараты и тактивин улучшают решение задачи как при сбое, так и при перемене местоположения отверстия, оптимизируя аналитико-синтетическую деятельность и активируя интегративные возможности ЦНС. Уменьшение ноотропными препаратами дефицита информации, вызываемого изме- 69 нением условий опыта при функциональных нарушениях памяти, приводит к снижению эмоционального стресса, выражающемуся в уменьшении или отсутствии генерализованной активности. Следовательно, в используемых методиках тактивин проявил стресспротекторную активность, приводящую к улучшению адаптации животных к условиям опыта. Анализируя литературные данные и результаты собственных исследований, можно заключить, что гормоны и полипептиды тимуса являются естественными функциональными антагонистами стресс-системы. Под действием гормонов и полипептидов тимуса повышается устойчивость организма к различным стрессогенным воздействиям, а сам тимус вследствие этого является, помимо центрального органа иммунной системы, органом стресс-лимитирующей системы. Литература 1. Арушанян Э. Б., Бейер Э. В. Взаимосвязь психоэмоционального состояния и иммунной системы // Успехи физиол. наук.— 2004.— Т. 35, № 4.— С. 49–64. 2. Девойно Л. В., Идова Г. В., Альперина Е. Л. Психонейроиммуномодуляция: поведение и иммунитет. Роль «нейромедиаторной установки мозга».— Новосибирск: Наука, 2009.— 168 с. 3. Dantzer R., Wollman E. E. Relationships between the brain and the immune system // J. Soc. Biol.— 2003.— Vol. 197, № 2.— P. 81–88. 4. Quan N., Banks W. A. Brain-immune communication pathways // Brain, Behavior, and Immunity.— 2007.— Vol. 21, № 6.— P. 727–735. 5. Wrona D. Neural-immune interactions: an integrative view of the bidirectional relationship between the brain and immune systems // J. Neuroimmunology.— 2006.— Vol. 172.— P. 38–58. 6. Киселева Н. М., Иноземцев А. Н. Возможная роль тимуса в работе стресс-лимитирующей системы // Иммунопатология, аллергология, инфектология.— 2010.— № 3.— С. 13–20. 7. Bach J.-F., Bach M.-A., Charreire J. et al. The circulation thymic factor (TF). Biochemistry, physiology, biological activities, and clinical application // Biological activity of thymic hormones / D. W. van Bekkum.— Kooyker Sci Publ., 1975.— P. 145–158. 8. Arion V. Ya., Moskvina S. N., Zimina I. V., Lopuchin Yu. M. Evaluation of thymic functional state by non-invasive method // Russian J. Immunol.— 2001.— Vol. 6, № 1.— P. 77–80. 9. Меринг Т. А. Условнорефлекторная деятельность в процессе старения у белых крыс // Журн. высш. нерв. деят.— 1988.— Т. 38, № 4.— С. 667–673. 10. Иноземцев А. Н., Прагина Л. Л. Обратимое нарушение реакции избегания как методическое средство для изучения действия психотропных препаратов на высшую нервную деятельность // Журн. высш. нервн. деят.— 1989.— Т. 39, № 4.— С. 764–766. 11. Иноземцев А. Н., Прагина Л. Л. Методические приемы стрессогенных воздействий для исследования ноотропных влияний на обучение и память // Вест. Моск. ун-та. Сер. 16. Биология.— 1992.— № 4.— С. 23–31. 12. Лабунец И. Ф., Гриневич Ю. А., Коханевич Е. В. Состояние эндокринной функции вилочковой железы при нормальном и осложненном течении беременности //Акушерство и гинекология — 1991.— № 7.— С. 37–39. 13. Mezza C., Mocchegiani E., Pagani S. et al. Relationship between thymulin and growth hormone secretion in healthy human neonates // Am. J. Perinatol.— 2007.— Vol. 24, № 4.— P. 227–233. 14. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Дж. П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения.— М.: Высшая школа, 1991.— С. 175–189. 15. Герштейн Л. М. Роль нейромедиаторов и белков в генетико-функциональной организации мозга животных // Онтогенез.— 2001.— Т. 32.— С. 35–40. 16. Герштейн Л. М., Камышева А. С., Чеботарёва Т. Л. и др. Морфохимическая характеристика мозга крыс линии Вистар, различающаяся по локомотивной активности в открытом поле. // Журн. высшей нервн. деят.— 1991.— Т. 41, № 2.— С. 300–305. 17. Гуляева Н. В., Левшина И. П. Соотношение индивидуально-типологических особенностей поведения и состояние липидной компоненты церебральных мембран при стрессе. // Индивидуальный мозг: Структурные основы индивидуальных особенностей поведения.— М.: Наука, 1993.— С. 82–91. 70 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 18. Маркель А. Л. К оценке основных характеристик поведения крыс в тесте «открытого поля» // Журн. высш. нерв. деят.— 1981.— Т. 31, № 2.— С. 301–307. 19. Юматов Е. А., Мещерякова О. А. Прогнозирование устойчивости к эмоциональному стрессу на основе индивидуального тестирования поведения // Журн. высш. нервн. деят.— 1990.— Т. 40, № 3.— С. 575–583. 20. Иноземцев А. Н. Биологические предпосылки защитных механизмов при срывах высшей нервной деятельности // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 16. Биология.— 2009.— № 2.— С. 3–8. Поступила в редакцию: 15.07.2013 г. Контакт: Киселева Нина Михайловна. kiseleva.67@mail.ru Внимание читателя! Выходит в свет 2%е издание пособия для людей, принимающих решение «ВИЧ/СПИД сегедня и рядом» / Под ред. Н.А.Белякова, А.Г.Рахмановой.— СПб.: Балтийский медицинский образо% вательный центр, 2013 г.— 110 с. http://hiv%spb.ru; Подробная информация: e%mail: infeklcijaaids@gmail.com; телефон: (812) 407%83%37 71 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 УДК 612.017.1 ИНГИБИРОВАНИЕ НЕЙРОВОСПАЛЕНИЯ РЕДУЦИРУЕТ ДЕГЕНЕРАЦИЮ ДОФАМИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ ЧЕРНОЙ СУБСТАНЦИИ МОЗГА, ИНДУЦИРОВАННУЮ ГИПЕРЭКСПРЕССИЕЙ В НИХ РЕКОМБИНАНТНОГО ГЕНА АЛЬФА-СИНУКЛЕИНА ЧЕЛОВЕКА О. А. Вежеева, Т. Н. Сергеева, В. Г. Сергеев Удмуртский государственный университет, г. Ижевск, Россия INHIBITION OF NEUROINFLAMMATION REDUCES DEGENERATION OF DOPAMINERGIC NEURONS IN THE SUBSTANTIANIGRA INDUCED BY OVEREXPRESSION OF THE RECOMBINANT ALPHASYNUCLEINGENE O. A. Vezheeva, T. N. Sergeeva, V. G. Sergeev Udmurt State University, Izhevsk, Russia © Коллектив авторов, 2013 г. Исследовали влияние гиперэкспрессии альфа-синуклеина в дофаминергических нейронах на интенсивность нейродегенерации и провоспалительной активации микроглиальных клеток черной субстанции мозга в рамках гипотезы о сопряженности процессов нейровоспаления и нейродегенерации. О вкладе нейровоспаления в процессы нейродегенерации судили по результатам эксперимента с ежедневным однократным введением кортикостерона в течение 8 недель крысам, которым предварительно в область черной субстанции мозга инъецировали вектор, сконструированный на основе аденоассоциированного вируса, несущий ген альфа-синуклеина человека. Обнаружено, что введение вектора драматически редуцирует количество дофаминергических нейронов (–86,5±16,8%), в то же время дополнительные инъекции кортикостерона значительно повышали количество выживающих дофаминергических нейронов (+35,7±12,4%). Иммуногистохимическое исследование продемонстрировало как повышение экспрессии глиальными клетками иммунопозитивных провоспалительных маркеров (МНС II, IL-1), так и выраженность глиоза. Полученные данные свидетельствуют о нейродегенеративном эффекте повышения уровня эндогенного альфа-синуклеина в черной субстанции мозга и его провоспалительном действии на микроглию, активация которой, в свою очередь, усиливает интенсивность нейродегенерации. Ключевые слова: альфа-синуклеин, синуклеопатии, болезнь Паркинсона, микроглия, нейродегенерация, нейровоспаление. We investigated the effect of overexpression of alpha-synuclein in the dopaminergic neurons on neurodegeneration and proinflammatory activation of microglial cells in the substantia nigra to test hypotheses about the relationship of neuroinflammation and neurodegeneration. The degree of neuroinflammation influence on neurodegeneration judged by the administration of corticosterone to rats with rAAV human alpha-synuclein. It has been found that the introduction of the vector dramatically reduces the number of dopaminergic neurons (-86,5±16,8%), while corticosterone injection significantly increased the number of surviving dopaminergic neurons in rats with rAAV human alpha-synuclein (+35,7±12,4%). Immunohistochemical study showed a increase in the expression of MHC II and IL-1 and the severity of gliosis. The findings suggest that there is neurodegenerative effect of elevated levels of endogenous alphasynuclein, and its pro-inflammatory effect on microglia activation which, in turn, increases the intensity of neurodegeneration. Key words: alpha-synuclein, synucleinopathies, Parkinson's disease, microglia, neurodegeneration, neuroinflammation. Введение. Болезнь Паркинсона (БП) — хроническое, прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, характеризующееся мышечной ригидностью, тремором, брадикинезией, нарушением походки, неустойчивостью позы, вегетативной дисфункцией, депрессией, снижением интеллекта и памяти вплоть до развития деменции [1]. Независимо от формы заболе- вания (наследуемой или спорадической) двигательные нарушения у больных с БП вызываются дегенерацией дофаминергических (ДА) нейронов компактной части черной субстанции (ЧС) мозга, проецирующихся в стриатум (полосатое тело) [2]. В сохранившихся нейронах мозга страдающих БП обнаруживаются цитоплазматические включения, 72 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 называемые тельцами Леви, основной компонент которых представлен фибриллярной (полимеризованной) формой белка альфа-синуклеина (А-син) [3]. Следует отметить, что тельца Леви обнаруживаются в телах нервных клеток и при других нейродегенеративных заболеваниях, таких как деменция с образованием телец Леви, болезнь диффузных телец Леви, множественная системная атрофия [4] на основании чего БП и перечисленные заболевания объединяют в одну нозологическую группу, получившую название синуклеопатии [5–7]. Рядом ранних работ продемонстрирована вовлеченность А-син в целый спектр клеточных процессов, регулирующих гомеостаз ДА, включая регуляцию активности транспортеров ДА [8], активность тирозингидроксилазы [9] и формирование синаптических пузырьков [10]. Альфа-синуклеин вовлечен в транспорт везикул от эндоплазматической сети к комплексу Гольджи [11], трафик тубулина [12], взаимодействие с белками митохондрий [13] и контроль ядерной транскрипции [14, 15]. Предполагается, что нарушение любого из этих процессов может лежать в основе клеточной дисфункции и клеточной смерти. Несмотря на выявление целого ряда молекулярных механизмов нейротоксичности гиперпродуцируемого А-син, полная оценка вклада этого белка в патофизиологию БП не может быть полной без учета значимости в нейродегенеративных процессах нейровоспаления, ключевую роль в котором играют микроглиальные клетки, активируемые при высвобождении в межклеточную среду нейронального А-син. Первые сообщения о том, что в мозге больных Паркинсона детектируется активированная микроглия, были сделаны 25 лет назад [2]. С тех пор множество исследований, проведенных как на людях, так и в моделях паркинсонизма на животных, продемонстрировали феномен вовлеченности воспалительных процессов в развитие и прогрессирование гибели дофаминергических нейронов [16]. Выяснено, что активированная микроглия секретирует провоспалительные факторы, такие как монооксид азота и интерферон-γ, а также цитокины: фактор некроза опухолей-α иинтерлейкин-1β [17–21], которые могут активировать каспазы в дофаминергических нейронах и индуцировать механизмы апоптоза [2, 19, 22, 23]. Кроме того, активация микроглии вызывает образование свободнорадикальных соединений в нейронах и окислительный стресс [24]. Вместе взятые эти данные свидетельствуют о том, что персистирующая активация микроглиальных клеток активно вовлекается в прогрессирование БП. Возможная связь между патологией А-син и активацией микроглии была ранее продемонстрирова- но в экспериментах in vitro [25–27]. В частности, Zhang и соавт. сообщили о том, что ингибирование активности микроглии снижает смерть дофаминергических нейронов, индуцированную введением агрегированной формы А-син в смешанную клеточную культуру [28]. В нашем исследовании мы использовали ранее описанную модель БП, основанную на индукции прогрессирующей дегенерации дофаминергических нейронов, вызываемой гиперэкспрессией человеческого нативного А-син, индуцированной инъекцией в область черной субстанции рекомбинантного аденоасооциированного вируса (рААВ) [29–31]. Мы исследовали изменение фенотипа микроглиальных клеток и их количества в условиях повышенного производства в нейронах А-син и, предполагая, что нейровоспаление усугубляет течение нейродегенеративного процесса, оценивали это влияние в дополнительном эксперименте с ингибированием активации микроглиальных клеток кортикостероном. Материалы и методы исследования. В эксперименте использовали 30 самцов крыс линии Вистар, массой 150–200 г, которые содержались в стандартных условиях. Животным контрольной группы (10 крыс) с помощью стереотаксической установки вводили в черную субстанцию левой стороны мозга 2 мкл суспензии с рекомбинантным вирусом, содержащим ген зеленого флюоресцирующего белка по координатам: 5,2 мм каудальней брегмы, 2,0 мм латеральнее осевого шва, на глубину 7,2 мм относительно твердой оболочки мозга. Животным двух экспериментальных групп (20 крыс) аналогичным образом вводили вирусный вектор, несущий ген альфа-синуклеина человека. Концентрации генных копий вирусов переносящего ген зеленого флюоресцирующего белка и альфа-синуклеина во вводимом растворе составляли 7,9×1011 и 8,2×1011 генных копий/мл соответственно. Часть животных (10 крыс) после введения рекомбинантного вируса с геном альфа-синуклеина получала ежедневные интраперитонеальные инъекции ацетата кортикостерона-21 (Sigma, USA; 2 мг/100 г массы тела), разведенного в 1 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида, в течение 8 недель. Спустя 8 недель эксперимента ткани животных фиксировали транскардиальной перфузией 4% параформальдегида и отбирали мозг для иммуногистохимического исследования. Мозг выдерживали в 10% растворе сахарозы, готовили криостатные срезы толщиной 14 мкм. Для иммуногистохимического окрашивания использовали антитела против тирозингидроксилазы (мышиные IgG, 1:2000; Chemicon, Temecula, CA), интерлейкина-1β (IL-1β) (кроличьи МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 IgG, 1 : 5000; Chemicon), А-син человека (мышиные IgG, 1 : 2000; Sigma). Срезы отмывались в ЗФР трижды после каждого этапа инкубации. Все инкубационные растворы содержали 0,25% Triton X-100. Для визуализации первых антител использовали вторые антитела, конъюгированные либо с пероксидазой хрена, либо с люминесцентным красителем. В первом случае срезы инкубировали в течение часа при комнатной температуре в растворах биотилированных антимышиных антител осла (в разведении 1 : 200) (BA2001; VectorLaboratories, Burlingame, CA), и в течение 20 минут в растворе, содержашем авидин-биотин-пероксидазный комплекс (ABC Elite; VectorLaboratories, Burlingame, CA). Для двойной и флюоресцентной иммуногистохимической окраски в качестве вторых антител использовали антитела, конъюгированные с FITC, Alexa 488, Cy-3 (1 : 1000; Chemicon). Подсчет количества нервных и глиальных клеток в области черной субстанции проводили на коронарных срезах на стороне введения вектора и противоположной стороне мозга, которая рассматривалась как контроль. Обсчитывался каждый пятый срез, средние значения представлялись в процентном выражении относительно контрольных, которые принимались за 100%. Об интенсивности экспрессии иммунореактивного продукта (на основании чего делался вывод об уровне экспрессии изучаемых белков) судили по интенсивности флюоресцентного свечения исследуемого участка мозга стандартной площади (1 мм2), измеряемой при помощи компьютерной программы ImageProPlus 6.0. Статистический анализ данных проводили с использованием программы Statistica 6.0. Различия в количестве клеток и интенсивности экспрессии иммунореактивного сигнала между группами животных анализировали посредством использования метода двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Результаты исследования. Эксперимент с введением в область черной субстанции рекомбинантного гена, кодирующего зеленый флюоресцентный белок при помощи того же вируса, который использовался для переноса генов А-син человека, подтвердил точность инъецирования векторов в заданную область и эффективность инфицирования дофаминергических нейронов (рис. 1). Подсчет нейронов черной субстанции мозга, иммунореактивных к тирозин-гидроксилазе, у животных через 8 недель после введения в эту область рекомбинантного вируса, переносящего ген А-син, показал значительное снижение их количества по 73 сравнению с контралатеральной стороной мозга, служившей контролем (–56,7±12,4%) (рис. 2). Введение кортикостерона животным после локального введения рекомбинантного вектора с геном А-син достоверно повышало количество выживших нейронов (+36,4% относительно группы с гиперпродукцией А-син). Наблюдаемый нейропротективный эффект гормонального ингибирования микроглиальной активации позволяет сделать вывод а б в Рис. 1. Экспрессия перенесенного при помощи стереотаксического введения в область черной субстанции мозга рААВ гена зеленого флюоресцирующего белка в дофаминергических нейронах. Экспрессия зеленого флюоресцирующего белка (а) в вентральной части среднего мозга, где расположены дофаминергические нейроны (б), локализована преимущественно в нейронах компактной части черной субстанции (в; выделены стрелками). Длина линии 450 мкм. о существенном вкладе нейровоспаления в интенсивность дофаминергической нейродегенерации. Важно отметить, что индукция экспрессии зеленого флюоресцирующего белка в ДА нейронах компактной части черной субстанции не вызывала ни снижения количества нейронов, ни увеличения количества микроглиальных клеток в области введения вектора по сравнению с противоположной стороной мозга, служившей контролем. Отсутствие провоспалительной реакции микроглии в данном случае свидетельствует, что аденоассоциированный вирус, использованный в конструкции вектора, сам по себе не вызывает нейровоспаления, которое, таким образом, может быть следствием индуцированной гиперпродукции А-син в нейронах и/или гибели нейронов. Локальная инъекция рекомбинантного вируса, переносящего ген альфа-синуклеина в нейроны черной субстанции мозга, вызывала в выживающих нейронах повышение экспрессии иммунореактивно- 74 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 го А-син и агрегирование его в крупные цитоплазматические включения (рис. 3). а б Микроглиальные клетки с подобного рода изменениями обнаруживались не только в черной субстан- в Рис. 2. Снижение интенсивности нейродегенерации дофаминергических нейронов при интраперитонеальном введении дексаметазона крысам после введения в черную субстанцию мозга рААВ альфа-синуклеина: а — контроль; б — введение рААВ альфа-синуклеина вызывает резкое снижение количества нейронов в компактной части черной субстанции; введение дексаметазона животным после введения рААВ альфа-синуклеина (в) повышает количество выживающих нейронов. Кроме того, редкие агрегаты А-син обнаруживались и в клеточных ядрах. В группе с дополнительным интраперитонеальным введением кортикостерона, помимо увеличения количества выживающих нейронов, визуально отмечалось увеличение агрегатов А-син в цитоплазме и ядрах. Данное наблюдение а б ции, но и прилегающих к ней областях мозга. Кроме того, микроглиальные клетки в области введения рекомбинантного вектора экспрессировали высокие уровни иммунореактивного IL-1β (+153,9±27,4%). Введение кортикостерона животным после индукции у них экспрессии гена А-син в ДА нейронах чер- в Рис. 3. Экспрессия иммунореактивного альфа-синуклеина в дофаминергических нейронах: а — контроль; б — незначительное агрегирование альфа-синуклина в цитоплазме и ядрах нейронов через 8 недель после введения в черную субстанцию рекомбинантного вектора с геном альфа-синуклеина человека; в — увеличение количества агрегатов альфа-синуклеина в переживающих нейронах черной субстанции у животных с индуцированной гиперэкспрессией альфа-синуклеина. согласуется с гипотезой о возможной нейропротективной роли агрегированного А-син, связывающего избыток токсичных олигомеров этого белка. Через 8 недель после инъекции в мозг вектора, переносящего ген А-син, отмечалось значительное повышение количества микроглиальных клеток, экспрессирующих молекулы MHCII, по сравнению с контралатеральной стороной (+246,4±27,8%). Мы идентифицировали две основные клеточные формы активированных микроглиоцитов. Если покоящаяся микроглия имела вид относительно небольших клеток с тонкими, ветвящимися отростками, то ее активация вызывает усиление экспрессии молекул МНС II, увеличение клеточной площади, укорочение отростков вплоть до их исчезновения и приобретение неправильной формы (рис. 4). ной субстанции приводило к снижению микроглиоза (+108,2±24,6%) и синтеза в микроглии IL-1β (+45,4±12,4%), а также визуальному уменьшению содержания клеток с «фагоцитарным цитофенотипом». Обсуждение результатов. Полученные нами данные, наряду с сообщениями о том, что гиперэкспрессия А-син человека в среднем мозге крыс и обезьян ведет к развитию прогрессирующей дофаминергической нейропатологии и дегенерации волокон в стриатуме [30, 31], позволяют сделать вывод, что повышенное производство в ДА нейронах А-син инициирует развитие молекулярных и клеточных событий, ведущих к нейрональной гибели. О важной роли микроглии в этих процессах свидетельствуют результаты опыта с введением кортикостерона — гормона, в значительной степени ингиби- 75 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 рующего интенсивность иммунных процессов как на периферии, так и в ЦНС, непосредственно воздействуя на микроглиальные клетки. Введение этого глюкокортикоида не только снижало количество активированных глиальных клеток, но и повышало количество выживающих нейронов. В нашем исследовании реактивное повышение количества микроглиальных клеток сопровождалось а и индукции в них синтеза провоспалительного цитокина IL-1β при повышенном производстве в нейронах А-син, что согласуется с прежними наблюдениями сходных изменений у мышей с индуцированной паркинсонподобной патологией мозга [33–37]. Свойство внеклеточного А-син активировать микроглию ранее было описано в экспериментах in vitro [25, 27, 38], в которых обнаружен феномен захвата в б Рис. 4. Экспрессия иммунореактивного МНС II на глиальных клетках: а — контроль; б — повышение плотности экспрессируемой метки на глиальных клетках, укорочение и утолщение отростков; в — утрата отростков и приобретение микроглией неправильной формы. изменением их клеточного фенотипа. Введение рекомбинантного вектора приводило к активации микроглии преимущественно макрофагального типа. Введение кортикостерона вызывало уменьшение количества глиальных клеток, имеющих вид фагоцитирующих макрофагов. Микроглия представляет собой линию резидентных макрофагов ЦНС, которые мигрируют в область повреждения нейронов или проникновения чужеродных антигенов из соседних областей [32]. Известно, что микроглия высокочувствительна даже к незначительным патологическим изменениям, реагируя на них изменением своей морфологии и экспрессии поверхностных рецепторов. В нашем эксперименте мы также наблюдали значительное повышение количества микроглиальных клеток, экспрессии молекул МНС II и процессинга А-син микроглиальными клетками [39] и в экспериментальных моделях на животных [34, 40]. Полученные нами данные, наряду с результатами других исследователей, свидетельствуют о нейродегенеративном эффекте повышения уровня эндогенного А-син и его провоспалительном действии на микроглию, активация которой, в свою очередь, усиливает интенсивность нейродегенерации. Формируемый таким образом порочный патофизиологический круг может обеспечивать хроническое персистирование нейровоспалительного и нейродегенеративного процессов. Выявленный патофизиологический механизм позволяет рассматривать возможность фармакологического ингибирования активации микроглиальных клеток в качестве терапевтической стратегии, направленной на лечение синуклеопатий. Литература 1. Lang A., Lozano A. Parkinson's disease: First of two parts // N. Engl. J. Med.— 1998.— Vol. 339.— Р. 1044–1053. 2. McGeer P. L., Itagaki S., Boyes B. E. et al. Reactive microglia are positive for HLA-DR in the substantianigra of Parkinson’s and Alzheimer’s disease brains // Neurology.— 1988.— Vol. 38.— Р. 1285–1291. 3. Forno L. S., Sternberger L. A., Sternberger N. H. Reaction of Lewy bodies with antibodies to phosphorylated and non-phosphorylated neurofilaments // Neurosci Lett.— 1986.— Vol. 64 (3).— Р. 253–258. 4. Bayer T. A., Hartmann T., Havas L. et al. Alpha-synuclein accumulate sin Lewy bodies in Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies butnotin Alzheimer's disease beta-amyloid plaquecores // Neurosci Lett.— 1999.— Vol. 266 (3).— Р. 213–216. 5. Duda J. E., Lee V. M., Trojanowski J. Q. Neuropathology of synuclein aggregates // J. Neurosci Res.— 2000.— Vol. 61 (2).— Р. 121–127. 6. Goedert M. Alpha-synuclein and neurodegenerative diseases // Nat. Rev. Neurosci.— 2001.— Vol. 2 (7).— Р. 492–501. 7. Norris E. H., Giasson B. I., Lee V. M. Alpha-synuclein: normal function and role in neurodegenerative diseases // Curr. Top Dev. Biol.— 2004.— Vol. 60.— Р. 17–54. 8. Wersingerand C., Sidhu A. Attenuation of dopamine transporter activity by alpha-synuclein // Neurosci Lett.— 2003.— Vol. 340.— Р. 189–192. 9. Peng X., Tehranian R., Dietrich P. et al. Alpha-synuclein activation of protein phosphatase 2A reduces tyrosine hydroxylase phosphorylation in dopaminergic cells // J. Cell. Sci.— 2005.— Vol. 118.— Р. 3523–3530. 76 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 10. Lotharius J. et al. Effect of mutant alpha-synuclein on dopamine homeostasis in a new human mesencephalic cell line // J. Biol. Chem.— 2002.— Vol. 277.— Р. 38884–38894. 11. Cooper A. A. et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models // Science.— 2006.— Vol. 313.— Р. 324–328. 12. Lee H. J., Khoshaghideh F., Lee S. et al. Impairment of microtubule-dependent trafficking by overexpression of alpha-synuclein // Eur. J. Neurosci.— 2006.— Vol. 24.— Р. 3153–3162. 13. Martin L. J. et al. Parkinson’s disease alpha-synuclein transgenic mice develop neuronal mitochondrial degeneration and cell death // J. Neurosci.— 2006.— Vol. 26.— Р. 41–50. 14. Kontopoulos E., Parvin J. D., Feany M. B. Alpha-synuclein acts in the nucleus to inhibit histone acetylation and promote neurotoxicity // Hum Mol Genet.— 2006.— Vol. 15.— Р. 3012–3023. 15. Iwata A., MiuraI S., Sawada M. et al. Alpha-synuclein forms a complex with transcription factor Elk-1 // J. Neurochem.— 2001.— Vol. 77.— Р. 239–252. 16. Tansey M. G., Goldberg M. S. Neuroinflammation in Parkinson's disease: its role in neuronal death and implications or therapeutic intervention // NeurobiolDis.— 2010.— Vol. 37 (3).— Р. 510–518. 17. Mogi M., Harada M., Kondo T. et al. Interleukin-1 beta, interleukin-6, epidermal growth factor and transforming growth factor alpha are elevated in the brain from parkinsonian patients // Neurosci Lett.— 1994.— Vol. 180.— Р. 147–150. 18. Boka G., Anglade P., Wallach D. et al. Immunocytochemical analysis of tumor necrosis factor and its receptors in Parkinson’s disease // Neurosci Lett.— 1994.— Vol. 172.— Р. 151–154. 19. Mogi M., Togari A., Kondo T. et al. Caspase activities and tumor necrosis factor receptor R1 (p55) level are elevated in the substantianigra from parkinsonian brain // J. Neural Transm.— 2000.— Vol. 107.— Р. 335–341. 20. Hunot S., Dugas N., Faucheux B. et al. FcepsilonRII/CD23 is expressed in Parkinson’s disease and induces, in vitroproduction of nitric oxide and tumor necrosis factor-alpha in glial cells // J. Neurosci.— 1999.— Vol. 19.— Р. 3440–3447. 21. Brodacki B., Staszewski J., Toczylowska B. et al. Serum interleukin (IL-2, IL-10, IL-6, IL-4), TNF alpha, and INF gamma concentrations are elevated in patients with atypical and idiopathic parkinsonism // Neurosci Lett.— 2008.— Vol. 441.— Р. 158–162. 22. Hartmann A., Troadec J. D., Hunot S. et al. Caspase-8 is an effector in apoptotic death of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease, but pathway inhibition results in neuronal necrosis // J. Neurosci.— 2001.— Vol. 21.— Р. 2247–2255. 23. Ferrer I., Blanco R., Carmona M. et al. Active, phosphorylation-dependent mitogen-activated protein kinase (MAPK/ERK), stress-activated protein kinase/c-Jun N-terminal kinase (SAPK/JNK), and p38 kinase expression in Parkinson’s disease and Dementia with Lewy bodies // J. Neural. Transm.— 2001.— Vol. 108.— Р. 1383–1396. 24. Teismann P., Schulz J. B. Cellular pathology of Parkinson’s disease: astrocytes, microglia and inflammation // Cell Tissue Res.— 2004.— Vol. 318.— Р. 149–161. 25. Klegeris A., Pelech S., Giasson B. I. et al. Alphasynuclein activates stress signaling protein kinases in THP-1 cells and microglia // Neurobiol Aging.— 2008.— Vol. 29.— Р. 739–752. 26. Austin S. A., Floden A. M, Murphy E. J., Combs C. K. Alpha-synuclein expression modulates microglial activation phenotype // J. Neurosci.— 2006.— Vol. 26.— Р. 10558–10563. 27. Thomas M. P., Chartrand K., Reynolds A. et al. Ion channel blockade attenuates aggregated alpha synuclein induction of microglial reactive oxygen species: relevance for the pathogenesis of Parkinson’s disease // J. Neurochem.— 2007.— Vol. 100.— Р. 503–519. 27. Zhang W., Wang T., Pei Z. et al. Aggregated alphasynuclein activates microglia: a process leading to disease progression in Parkinson’s disease // Faseb J.— 2005.— Vol. 19.— Р. 533–542. 29. Kirik D., Annett L. E., Burger C. et al. Nigrostriatal alpha-synucleinopathy induced by viral vector-mediated overexpression of human alpha-synuclein: a new primate model of Parkinson’s disease // Proc. Natl. Acad. Sci USA.— 2003.— Vol. 100.— Р. 2884–2889. 30. Kirik D., Rosenblad C., Burger C. et al. Parkinson-like neurodegeneration induced by targeted overexpression of alphasynuclein in the nigrostriatal system // J. Neurosci.— 2002.— Vol. 22.— Р. 2780–2791. 31. Eslamboli A., Romero-Ramos M., Burger C. et al. Long-term consequences of human alpha-synuclein overexpression in the primate ventral midbrain // Brain.— 2007.— Vol. 130.— Р. 799–815. 32. Kreutzberg G. W. Microglia: a sensor for pathological events in the CNS // Trends Neurosci.— 1996.— Vol. 19.— Р. 312–318. 33. Su X., Maguire-Zeiss K. A., Giuliano R. et al. Synuclein activates microglia ina model of Parkinson’s disease // Neurobiol Aging.— 2008.— Vol. 29.— Р. 1690–1701. 34. Su X., Federoff H. J., Maguire-Zeiss K. A. Mutant alpha-Synuclein Overexpression Mediates Early Proinflammatory Activity // Neurotox Res.— 2009.— Vol. 16.— Р. 238–254. 35. Gomez-Isla T., Irizarry M. C., Mariash A. et al. Motor dysfunction and gliosis with preserved dopaminergic markers in human alphasynuclein A30P transgenic mice // Neurobiol. Aging.— 2003.— Vol. 24.— Р. 245–258. МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 77 36. Kahle P. J., Giasson B. I., Ozmen L. et al. Misfolded proteinase K-resistant hyperphosphorylated alpha-synuclein in aged transgenic mice with locomotor deterioration and in human alpha-synucleinopathies // J. Clin. Invest.— 2002.— Vol. 110.— Р. 1429–1439. 37. Putten van der H., Wiederhold K. H., Probst A. et al. Neuropathology in mice expressing human alpha-synuclein // J. Neurosci.— 2000.— Vol. 20.— Р. 6021–6029. 38. Jin J., Shie F. S., Liu J. et al. Prostaglandin E2 receptor subtype 2 (EP2) regulates microglial activation and associated neurotoxicity induced by aggregated alpha-synuclein // J Neuroinflammation.— 2007.— Vol. 4.— Р. 2. 39. Lee H. J., Suk J. E., Bae E. J. et al. Clearance and deposition of extracellular alpha-synuclein aggregates in microglia // Biochem. Biophys Res Commun.— 2008.— Vol. 372.— Р. 423–428. 40. Kim S., Cho S. H., Kim K. Y. et al. Alpha-synuclein induces migration of BV-2 microglial cells by up-regulation of CD44 and MT1-MMP // J. Neurochem.— 2009.— Vol. 109.— Р. 1483–1496. Поступила в редакцию: 15.07.2013 г. Контакт: Вежеева Ольга Александровна. promo-olga@yandex.ru Внимание читателя! Вышел в свет сборник научных работ в приложении к журналу «ВИЧинфекция и иммуносупрессии». № 1/2013 г. Фармакоэкономика ВИЧинфекции / Под ред. Н. А. Белякова и Н. В. Сизовой.— СПб.: Балтийский медицинский образователь ный центр.— 2013.— 138 с. Подробная информация: http://hivspb.ru; email: infeklcijaaids@gmail.com; телефон: (812) 4078337 78 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 УДК 577.1 ВОЗМОЖНЫЙ МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕХАНИЗМ АНАЛЬГЕТИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА ПЕПТИДНЫХ ФРАГМЕНТОВ ДЕФЕНСИНОВ В. Б. Плахова, И. В. Рогачевский, Т. Н. Шелых, С. А. Подзорова, Б. В. Крылов Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН, Санкт-Петербург, Россия A PUTATIVE MOLECULAR MECHANISM OF ANALGESIC EFFECT OF DEFENSIN PEPTIDE FRAGMENTS V. B. Plakhova, I. V. Rogachevskiy, T. N. Shelykh, S. A. Podzorova, B. V. Krylov I. P. Pavlov Institute for Physiology RAS, St.-Petersburg, Russia © Коллектив авторов, 2013 г. Методом локальной фиксации напряжения изучено действие гексапептидных фрагментов дефенсина NP-1 на Nav1.8-каналы мембраны ноцицептивного нейрона. Полученные данные указывают на то, что лиганд-рецепторное взаимодействие исследованных пептидов с каналами происходит за счет формирования солевых связей между положительно заряженными функциональными группами в составе молекул пептидов (Arg или Lys) и отрицательно заряженными остатками в составе аминокислотной последовательности канала (видимо, Glu или Asp). Значительная величина заряда исследуемых молекул способствует тому, что на начальном этапе связывания они притягиваются к отрицательно заряженной поверхности клеточной мембраны за счет электростатических сил и удерживаются около нее, после чего происходит образование лиганд-рецепторного комплекса с медленным натриевым каналом. Действующие концентрации гексапептидов относительно низки t (≈100 нмоль/л), но они на несколько порядков превышают полученную нами ранее величину КД для молекулы NP-1 (2 пмоль/л). Уникальный пространственный и структурный дизайн молекулы дефенсина позволяет ей с высочайшей эффективностью выступать в качестве как эндогенного антибиотика, так и анальгетика. Ключевые слова: дефенсины, метод локальной фиксации потенциала, Nav1.8-каналы, гексапептиды, анальгетики. Effects of defensin NP-1 hexapeptide fragments on Nav1.8 channels of nocicepitive neuron membrane were investigated by patchclamp method. The data obtained indicate that the ligand-receptor interaction of the peptides with the channel occurs due to formation of salt bonds between positively charged functional groups of the peptide molecules (Arg or Lys) and negatively charged residues of the channel aminoacid chain (Glu or Asp). The significant positive charge of the peptides under investigation conduces their electrostatic attraction to the negatively charged membrane surface at the initial stage of binding and further retention at the surface, after which the ligand-receptor complex with Nav1.8 channel is formed. The acting hexapeptide concentrations are relatively low (≈100 nM), but they exceed the value of defensin NP-1 KD (2 pM) by several orders of magnitude. The unique spatial and structural design of the defensin molecule makes it possible to very effectively serve both as an endogenous antibiotic and an analgesic agent. Key words: defensins, patch-clamp method, Nav1.8 channels, hexapeptides, analgesics. Введение. Эндогенные антибиотики дефенсины продуцируются нейтрофильными гранулоцитами и клетками покровного эпителия слизистой оболочки кишечника. Замечательным свойством этих молекул является их способность в очень низких концентрациях снижать возбудимость мембраны ноцицептивного нейрона [1–5]. Ранее нами с помощью метода локальной фиксации потенциала было исследовано действие дефенсинов NP-1 и NP-4 на мембрану сенсорных нейронов [1–5]. Оно приводило к снижению эффективного заряда активационной воротной системы Nav1.8-каналов ноцицептивных нейронов. Этот процесс зависел от концентрации исследованных агентов. Применение уравнения Хилла позволило установить, что величина КД для дефенсина NP-4 (80 нмоль/л) почти на 5 порядков больше, чем величина КД (2 пмоль/л) для дефенсина NP-1. Это означает, что физиологическая активность дефенсина NP-1 чрезвычайно высока. Следовательно, можно предположить наличие сильного анальгетического эффекта у данного агента. Проведенные ранее квантовохимические расчеты позволили предположить, что для двух исследованных молекул дефенсинов анальгетический эффект может быть обусловлен образованием межмолекулярной связи между карбоксильной группой амино- МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 кислоты 14Glu и активным центром молекулы-мишени [1–5]. В случае дефенсина NP-4 на образование связи с каналом влияет также внутримолекулярное взаимодействие указанной карбоксильной группы с активными атомами соседних аминокислот, в результате сродство эндогенного антибиотика NP-4 к мембранной мишени уменьшается почти на 5 порядков по сравнению с дефенсином NP-1. Можно предположить, что молекула NP-1 обладает уникальной структурой, которая определяется ее первичной аминокислотной последовательностью и пространственным строением. Эта структура жестко стабилизирована тремя дисульфидными мостиками. Чрезвычайно низкая даже по сравнению с другими дефенсинами величина КД для указанной молекулы обусловлена, видимо, этой уникальной структурой. Ответу на вопрос о том, могут ли более простые пептидные молекулы, являющиеся отрезками нативной формы аминокислотной последовательности дефенсина NP-1, проявлять свои анальгетические свойства, посвящена настоящая работа. Материалы и методы исследования. Эксперименты выполнены на культивируемых изолированных нейронах спинальных ганглиев новорожденных крысят линии Вистар. Для выделения нейронов был применен модифицированный метод краткосрочного культивирования [6], обеспечивающий высокий выход жизнеспособных клеток. Методика выделения небольших темных ноцицептивных нейронов, характеризующихся высокой плотностью Nav1.8-каналов, подробно описана ранее [7]. В работе использовались следующие стандартные растворы (концентрации представлены в ммоль/л). Внеклеточный раствор: NaCl — 65, CaCl2 — 2, MgCl2 — 2, Choline Cl — 70, HEPES-Na — 10, тетродотоксин (TTX) — 0,0001, pH = 7,4. Внутриклеточный раствор: CsF — 100, NaCl — 10, CsCl — 40, MgCl2 — 2, HEPESNa — 10, pH = 7,2. Исключение из вне- и внутриклеточного растворов ионов калия позволило избавиться от всех компонентов калиевого тока, а ионы фтора во внутриклеточном растворе обеспечивали блокирование кальциевых токов [6, 8]. Наличие во внеклеточном растворе ионов ТТХ в низкой концентрации обеспечивало блокирование быстрых ТТХ-чувствительных каналов, что делало возможным регистрировать характеристики только одной популяции натриевых каналов — медленных ТТХ-нечувствительных (Nav1.8) каналов. В работе использованы реактивы фирмы «Sigma». Гексапептиды Pro-Arg-Glu-Arg-Arg-Ala-NH2 (PRERRA), Pro-Arg-Ala-Arg-Arg-Ala-NH2 (PRARRA) и ProLys-Glu-Lys-Lys-Ala-NH2 (PKEKKA) применялись в концентрациях 125 нмоль/л, 100 нмоль/л 79 и 100 нмоль/л соответственно. Все опыты проведены при комнатной температуре 22–24° С. Трансмембранные ионные токи регистрировали с помощью метода локальной фиксации потенциала на целой клетке [9] в условиях плотного контакта (метод «patch-clamp» в конфигурации «регистрация активности целой клетки»). Эксперименты проводили с использованием аппаратно-программного комплекса на основе усилителя «L/M EPC-7», ПЭВМ и разработанной нами системы автоматизации. Система автоматизации предназначена для выполнения ряда функций, главной из которых является определение величины эффективного заряда активационной воротной системы медленных натриевых каналов в ритме эксперимента. Регистрация семейств натриевых токов и их дальнейшая обработка осуществлялись общепринятым методом [7, 10, 11]. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием критерия Стьюдента. Уровень статистической значимости различий экспериментальных и контрольных данных соответствовал р<0,05. Результаты исследования. Изменение потенциалочувствительности Nav1.8-каналов исследовали с помощью измерения величины эффективного заряда (Zeff) их активационного воротного устройства до и после воздействия гексапептидов. Измерение этой величины основано на методе, предложенном Алмерсом [12]. В основе метода лежит гипотеза о том, что при смещении мембранного потенциала в сторону гиперполяризации отношение числа открытых каналов к числу закрытых может стремиться к единственной экспоненте, представляющей собой распределение Больцмана. Для построения этой экспоненты необходимо осуществить предельный переход при стремлении трансмембранного потенциала к минус бесконечности. Практически же надо осуществить регистрацию натриевых токов во всем возможном диапазоне ступенек напряжения (E), причем основную информацию о величине эффективного заряда в соответствии с методом Алмерса должны нести те токи, которые активируются при наиболее отрицательных потенциалах. Пример применения указанного метода при исследовании мембраны ноцицептивного нейрона в конкретном эксперименте приведен далее. Исходные записи семейства медленных натриевых токов в контрольных условиях и после приложения гексапептида PKEKKA (100 нмоль/л) представлены на рис. 1. Регистрировали амплитудные (пиковые) значения токов (Imax), которые позволяют получить функцию Imax(E). Приложение гексапептида PKEKKA (100 нмоль/л) с наружной стороны мембраны изме- 80 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 няет форму нормированной пиковой вольт-амперной характеристики медленных натриевых токов по сравнению с контрольными данными (рис. 2). а Рис. 2. Нормированные значения пиковых вольт-амперных характеристик медленных натриевых каналов до и после воздействия гексапептида PKEKKA в концентрации 100 нмоль/л. Следствием изменения крутизны левой ветви вольт-амперной характеристики является возникновение S-образного начального участка зависимости хордовой проводимости от потенциала GNa(E): GNa(E) = Imax(E)/(E — ENa), где ENa — величина потенциала реверсии натриевого тока, Ipic(E) — амплитудное значение тока при де- б Рис. 1. Семейства медленных натриевых токов до (а) и после (б) приложения гексапептида PKEKKA в концентрации 100 нмоль/л. Тестирующий потенциал изменялся от –50 до 50 мВ с шагом 10 мВ. Поддерживаемый потенциал, длительность которого составляла 300 мс, был равен –110 мВ. Токи утечки и емкостные токи вычтены программным способом. Пиковые значения токов были нормированы, т. е. max строились по формуле: Ipic / ⏐Ipic ⏐, где Ipic — пиmax ковое значение тока, Ipic — максимальное значение. Зависимости построены по данным контрольного эксперимента и после действия вещества. Стрелка указывает на изменение начального нелинейного участка, определяющего предельное пороговое изменение потенциалочувствительности медленных натриевых каналов. Эффект, позволяющий обнаружить количественную связь между потенциалочувствительностью активационной воротной системы медленных натриевых каналов и воздействием исследуемого агента, проявляется в изменении крутизны левой ветви вольт-амперной характеристики. Важно отметить, что при этом не изменяется потенциал реверсии: правая ветвь вольт-амперной характеристики пересекает ось абсцисс в той же точке (с учетом погрешности эксперимента) как до, так и после приложения гексапептида PKEKKA (рис. 3). Рис. 3. Потенциалозависимость хордовой проводимости медленных натриевых каналов. Функция GNa(E) была нормирована, т. е. строилась GNa(E)norm = GNa(E)/ GNamax(E), где GNamax(E) — ее максимальное значение. Показаны данные контрольного эксперимента и результаты, полученные после приложения гексапептида PKEKKA в концентрации 100 нмоль/л. поляризующем потенциале Е. Функция GNa(E) имеет начальный S-образный участок, крутизна которого отражает наиболее важные особенности потенциалочувствительности активационного процесса. Стационарным параметром, определяющим возможный механизм лиганд-рецепторного связывания действующих агентов с мембраной сенсорного нейрона, служит эффективный заряд (Zeff) активационной воротной системы [7, 13]. Именно он был выбран на- МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 ми как количественный показатель, отражающий эффект воздействия исследуемых пептидов. Для оценки наблюдаемого эффекта в рамках мембранной ионной теории Ходжкина–Хаксли [16] можно предположить, что число открытых каналов (No) пропорционально величине хордовой проводимости GNa(E), а число закрытых каналов (Nс) определяется функцией ⎨GNamax – GNa(E)⎬. Тогда [12]: lim(No/Nc)=lim[GNa(E)/ ⎨GNamax – E→ –∞ E→ –∞ – GNa(E)⎬]→Cexp[ZeffeE/kT], E→ –∞ где С — константа, Zeff — эффективный заряд, выраженный в единицах заряда электрона е, k — постоянная Больцмана, T — абсолютная температура. При Е→ –∞ предел исследуемой функции стремится к одноэкспоненциальной зависимости, представляющей собой распределение Больцмана. В логарифмическом масштабе эта функция может быть наглядно представлена с удовлетворительной точностью с помощью регрессионной прямой, проходящей через начальные экспериментальные точки. На рис. 4 представлен этот способ построения Zeff. Тангенсы углов наклона регрессионных прямых построены здесь по первым точкам и определяют предельную логарифмическую чувствительность к потенциалу Nav1.8-каналов. Значения Zeff указаны рядом с регрессионными прямыми, что позволяет оценить изменение Zeff при добавлении исследуемого агента. Приложение гексапептида PKEKKA снижало значение с Zeff = 6,6 (в контрольном эксперименте) до значения Zeff =5,0. Рис. 4. Влияние гексапептида PKEKKA в концентрации 100 нмоль/л на потенциалочувствительность активационной воротной системы медленных натриевых каналов. Экспоненциальная функция, представленная в логарифмическом масштабе (ось ординат), позволяет определить величину Zeff по тангенсу угла наклона асимптот, проведенных к начальным участкам этих функций в контрольном опыте и после приложения гексапептида. 81 На рис. 5 суммированы полученные нами результаты. В контрольных опытах величина эффективного заряда составляла Zeff = 6,6±0,4 (n=12). После приложения 125 нмоль/л PRERRA величина Zeff составила 4,4±0,3 (n=8), после приложения 100 нмоль/л PRARRA величина Zeff снизилась до 5,0±0,5 (n=33), после приложения 100 нмоль/л PKEKKA Zeff был равен 4,9±0,4 (n=17). Обсуждение результатов. Изученные нами ранее молекулы дефенсинов кролика NP-1, NP-4 и NP-5 [1–5] состоят из 33 аминокислотных остатков и обладают сложной структурой, что сильно затрудняет возможность их прямого синтеза и, как следствие, ограничивает их потенциальную применимость в качестве лекарственных средств. В этой связи были предприняты попытки выделить фраг- Рис. 5. Снижение эффективного заряда активационной воротной системы медленных натриевых каналов после воздействия пептидов. Контрольное значение Zeff = 6,6±0,4 (n=12). После приложения 125 нмоль/л PRERRA величина Zeff составила 4,4±0,3 (n=8), после приложения 100 нмоль/л PRARRA величина Zeff составила 5,0±0,5 (n=33), после приложения 100 нмоль/л PKEKKA Zeff составила 4,9±0,4 (n=17). * Отличия от контрольного значения статистически достоверны. менты молекул дефенсинов, которые были бы относительно легко синтезируемы, но в то же время сохраняли бы необходимый спектр физиологически важных свойств, в первую очередь в отношении их анальгетического действия. Рассматриваемые в настоящей работе гексапептиды были выбраны следующим образом. Гексапептид PRERRA (Pro-Arg-Glu-Arg-Arg-Ala-NH2) является отрезком аминокислотной последовательности молекулы дефенсина NP-1 (c 12-го по 17-й остатки). Он включает глутаминовую кислоту (Glu), которая, согласно высказанному нами ранее предположению, может быть ответственна за лиганд-рецепторное связывание дефенсина с молекулярной мишенью, ведущему к снижению величины эффективного заряда ак- 82 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 тивационной воротной системы Nav1.8-каналов, управляющих кодированием болевого сигнала [14, 15]. Гексапептид PRARRA (Pro-Arg-Ala-Arg-Arg-Ala) был получен из PRERRA точечной заменой Glu на Ala, а PKEKKA — заменой трех Arg на Lys. Все три указанные молекулы в соответствии с результатами наших экспериментов (см. рис. 5) способны модулировать функционирование Nav1.8каналов в концентрациях, составляющих приблизительно 100 нмоль/л. Следовательно, поскольку замена Glu на Ala (переход от PRERRA к PRARRA) не приводит к потере активности пептида, можно сделать вывод, что наличие в молекуле Glu не является необходимым условием, определяющим способность пептида к связыванию с каналом, что расходится с нашими более ранними представлениями. С другой стороны, сохранение наблюдаемого эффекта при переходе от PRERRA к PKEKKA свидетельствует о том, что в формировании лиганд-рецепторного комплекса участвует положительно заряженная функциональная группа. Только Arg и Lys в ряду 20 естественных аминокислот несут положительный заряд в боковой цепи при физиологически адекватных условиях, и наличие у PKEKKA достоверно определенной способности снижать Zeff говорит о взаимозаменяемости этих двух аминокислот в процессе связывания гексапептидов с молекулярной мишенью, являющейся частью аминокислотной последовательности канала. На основании этого можно предположить, что лиганд-рецепторное взаимодействие указанных пепти- дов происходит за счет формирования солевых связей, включающих положительно заряженные функциональные группы в составе молекул пептидов (Arg или Lys) и отрицательно заряженные аминокислотные остатки в составе мишени (например, Glu или Asp). Значительная величина положительного заряда исследуемых гексапептидов свидетельствует в пользу того, что на начальном этапе связывания рассматриваемые молекулы за счет электростатических сил притягиваются к отрицательно заряженной поверхности клеточной мембраны и удерживаются около нее, после чего происходит образование лиганд-рецепторного комплекса с медленным натриевым каналом. Анализируя возможные анальгетические свойства исследуемых молекул, необходимо еще раз отметить, что хотя действующие концентрации гексапептидов весьма низки и находятся в диапазоне 100 нмоль/л, они на несколько порядков превышают полученную нами величину КД для молекулы дефенсина NP-1 (2 пмоль/л). Возможно, это является следствием эволюционного процесса, результатом которого стал уникальный созданный природой пространственный и структурный дизайн указанной молекулы, способной выступать в качестве как эндогенного антибиотика, так и анальгетика. Она отличается высокой структурной жесткостью за счет присутствия трех дисульфидных мостиков, устойчива к действию гидролизующих ферментов, относительно компактна, а также обладает амфипатическими свойствами. Литература 1. Ноздрачев А. Д., Крылов Б. В., Сабанов В. С. и др. Эндогенные антибиотики дефенсины как возможные регуляторы функционирования натриевых каналов нейронов спинномозговых ганглиев // Доклады Академии наук.— 1997.— Т. 355, № 5.— С. 705–707. 2. Плахова В. Б., Рогачевский И. В., Щеголев Б. Ф. и др. Дефенсин NP-4 уменьшает потенциалочувствительность медленных натриевых каналов сенсорных нейронов // Сенсорные системы.— 2005.— Т. 19, № 2.— С. 110–116. 3. Плахова В. Б., Щеголев Б. Ф., Рогачевский И. В. и др. Возможный молекулярный механизм взаимодействия дефенсина с мембраной сенсорного нейрона // Росс. физиол. журн.— 2000.— Т. 86, № 11.— С. 1471–1480. 4. Рогачевский И. В., Плахова В. Б., Щеголев Б. Ф. и др. Рецептор дефенсина: возможный механизм снижения возбудимости мембраны сенсорного нейрона // Доклады Академии наук.— 2000.— Т. 375, № 6.— С. 843–846. 5. Щеголев Б. Ф., Рогачевский И. В., МакКи М. Л. и др. Квантовохимическое исследование равновесной геометрии и электронного строения молекул эндогенных пептидов NP-4 и NP-5 // Журнал общей химии.— 2005.— Т. 75, № 3.— С. 509–515. 6. Elliott A. A., Elliott J. R. Characterization of TTX-sensitive and TTX-resistant sodium currents in small cells from adult rat dorsal root ganglia // J. Physiol. (Lond.).— 1993.— Vol. 463, № 1.— P. 39–56. 7. Yachnev I. L., Plakhova V. B., Podzorova S. A. et al. Mechanism of pain relief by low-power infrared irradiation: ATP is an IR-target molecule in nociceptive neurons // Med. Chemistry.— 2012.— Vol. 8, № 1.— P. 14–21. 8. Kostyuk P. G., Krishtal O. A., Pidoplichko V. I. Effect of internal fluoride and phosphate on membrane currents during intracellular dialysis of nerve cells // Nature.— 1975.— Vol. 257, № 5528.— P. 691–693. 9. Hamill O. P., Marty A., Neher E. et al. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches // Pflu.. gers Arch.— 1981.— Vol. 391, № 1.— P. 85–100. 10. Hodgkin A. L., Huxley A. F. Currents carried by sodium and potassium ions through the membrane of the giant axon of Loligo // J. Physiol.— 1952.— Vol. 116, № 4.— P. 449–472. 83 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 11. Hodgkin A. L., Huxley A. F. The dual effect of membrane potential on sodium conductance in the giant axon of Loligo // J. Physiol.— 1952.— Vol. 116, № 4.— P. 497–506. 12. Алмерс В. Воротные токи и движение зарядов в возбудимых мембранах // Мембраны: ионные каналы.— M.: Мир, 1981.— С. 129–236. 13. Крылов Б. В., Дербенев А. В., Подзорова С. А. и др. Морфин уменьшает чувствительность к потенциалу медленных натриевых каналов // Росс. физиол. журн.— 1999.— Т. 85, № 2.— С. 225–236. 14. Карымова Е. А., Катина И. Е., Плахова В. Б. и др. Возможный механизм кодирования ноцицептивных сигналов: роль медленных натриевых каналов // Сенсорные системы.— 2008.— Т. 22, № 3.— С. 257–270. 15. Jarvis M. F., Honore P., Shieh C. C. et al. A-803467, a potent and selective Nav1.8 sodium channel blocker, attenuates neuropathic and inflammatory pain in the rat // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.— 2007.— Vol. 104, № 20.— P. 8520–8525. 16. Hodgkin A. L., Huxley A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve // J. Physiol.— 1952.— Vol. 117, № 4.— P. 500–544. Поступила в редакцию:15.07.2013 г. Контакт: Крылов Борис Владимирович. krylov@infran.ru Внимание читателя! В приложении к журналу «ВИЧинфекция и иммуносупрессии» вышел сборник научных работ «ВИЧ и психическое здоровье», № 2/2013 г. / Под ред. Н. А. Белякова и В. В. Рассохи% на.— СПб.: Балтийский медицинский образовательный центр.— 2013.— 142 с. http://hiv%spb.ru; Подробная информация: e%mail: infeklcijaaids@gmail.com; телефон: (812) 407%83%37 84 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 УДК 616-053.31+616-053.36:612.017.1+619.9 ПРОГНОЗ СОХРАНЕНИЯ НЕВРОЛОГИЧЕСКОЙ СИМПТОМАТИКИ К КОНЦУ ПЕРВОГО ГОДА ЖИЗНИ У НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ С ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ Л. В. Кравченко, А. А. Афонин Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии МЗ РФ, Россия PROGNOSIS OF NEUROLOGICAL SYMPTOMATOLOGY PRESERVATION BY THE END OF THE FIRST YEAR OF LIFE IN NEWBORN BABIES, WHO HAD CYTOMEGALOVIRUS INFECTION L. V. Kravchenko, A. A. Afonin Rostov Scientific-Research Institute of Obstetrics and Pediatrics, Russia © Л. В. Кравченко, А. А. Афонин, 2013 г. Проведено динамическое клиническое и иммунологическое исследование Т-лимфоцитов CD3+CD28+ и В-лимфоцитов CD20+CD40+ в сыворотке крови у новорожденных детей с цитомегаловирусной инфекцией. Установлена патогенетическая роль противоинфекционной защиты. Нарушения противоинфекционной защиты обусловлены снижением CD3+CD28+ и увеличением CD20+CD40+. Прогностическим критерием для сохранения неврологической симптоматики к концу первого года жизни является определение в периферической крови функциональной активности Т-лимфоцитов CD3+, лимфоцитов, экспрессирующих CD28 в общей популяции, Т-лимфоцитов без маркера костимуляции CD28 (CD3+CD28–), а также Тлимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности маркеры активации CD69, CD71 и готовности к апоптозу CD95. Ключевые слова: новорожденные дети, цитомегаловирусная инфекция, лимфоциты, неврологическая симптоматика. Follow-up clinical and immunological studies were undertaken to examine the CD28+ T-lymphocyte, CD40+ B-lymphocyte response in the sera of neonatal infants with cytomegalovirus infection. The pathogenetic role of anti-infective protection was established. The significant decrease in the levels of CD20+CD40+ and lowering CD3+CD20+ was found to be a prognostically poor determinant serios cytomegalovirus virus infection. It was revealed that for the preservation of neurological symptoms by the end of the first year of life it is statistically significant to determine in peripheral blood functional activity of CD3, CD4, CD40T-lymphocytes, lymphocytes expressing CD28, CD3–CD28+ in the total population, T-lymphocytes without CD28 (CD3+CD28–) costimulation marker and also T-lymphocytes expressing CD71+, CD95+ markers of late activation on their surface. Key words: neonatal infants, herpes virus infection, lymphocyte, neurological symptomatology. Введение. Актуальность изучения цитомегаловирусной инфекции (ЦМВИ) обусловлена широкой циркуляцией цитомегаловирусов в популяции и высокой частотой передачи их от матери к плоду [1, 2]. Цитомегаловирусная инфекция рассматривается как одна из ведущих причин мертворождаемости, самопроизвольных выкидышей, преждевременных родов, заболеваемости новорожденных и младенческой смертности [3, 4]. Значимое место в защите новорожденных от цитомегаловирусной инфекции занимает иммунная система. Известно, что течение ЦМВИ сопряжено с иммунодепрессией, в частности со снижением функциональной активности Т-лимфоцитов [5]. Выраженность иммунного ответа может определять клиническое течение и исход заболевания при ЦМВИ, поэтому изучение механизмов иммунодепрессии при данном заболева- нии является чрезвычайно важным. Исследованиями последних лет идентифицированы пути передачи клеточных и межклеточных сигналов, осуществляемых с участием молекул костимуляции, усиливающих пролиферативную активность Т-лимфоцитов и повышающих способность к синтезу цитокинов. Однако в доступной литературе имеются единичные работы по изучению молекул костимуляции (CD28 и CD40) у детей первых месяцев жизни [6–8]. Причастность апоптоза к формированию иммунодепрессии при ЦМВИ недостаточно изучена. Усиление экспрессия CD95 на лимфоцитах периферической крови может обусловливать дальнейшее развитие программированной клеточной гибели [9]. Целью данной работы явилось изучение костимулирующих молекул (CD28, CD40), маркеров активации (CD69, CD71) и маркера готовности к апоп- МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 тозу (CD95) на лимфоцитах периферической крови у новорожденных с клиническими проявлениями цитомегаловирусной инфекции и определение прогностических критериев исхода церебральной патологии к концу первого года жизни у детей, перенесших цитомегаловирусную инфекцию (ЦМВИ) в периоде новорожденности. Материалы и методы исследования. Изучены иммунологические показатели у 106 новорожденных с цитомегаловирусной инфекцией, находившихся на стационарном лечении в отделении патологии новорожденных ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. В зависимости от тяжести заболевания дети были разделены на группы: 1-я — цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ), типичная генерализованная форма (тяжелая) — 54 человек; 2-я — ЦМВИ, типичная генерализованная форма с неполной клинической симптоматикой (среднетяжелая) — 52 человек. Контрольную группу составили 15 условно здоровых детей обоего пола в возрасте до одного месяца, не инфицированных герпесвирусами. Всем детям на первом месяце жизни проводили комплексное клинико-лабораторное обследование, включавшее использование молекулярно-биологического (ПЦР) метода определения вируса цитомегалии. В качестве материала для исследования пациентов служили периферическая кровь и моча. Использовали набор реагентов производства «АмплиСенс» (ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ) и оборудования, включающего многоканальный амплификатор ДНК «Терцик» (производство ДНК-Технология, г. Москва) с компьютером и программным обеспечением «Sigmagel» (Швеция). Определение специфических антител классов IgG и IgM в сыворотке крови к цитомегаловирусу (CMV) проводилось непрямым твердофазным иммуноферментным методом с использованием стандартных наборов реактивов фирмы «Вектор-Бест», г. Новосибирск. Диагностика цитомегаловирусной инфекции основывалась на комплексной оценке клинической картины заболевания и результатах лабораторных исследований. Диагноз цитомегаловирусной инфекции ставился при выявлении ДНК цитомегаловируса, в крови и в моче и нарастании титров специфических антител класса IgG в сыворотке крови к цитомегаловирусу в динамике в последующие сроки наблюдения либо при наличии специфических антител IgM в сыворотке крови у ребенка. Содержание лимфоцитов, экспрессирующих 85 CD28, CD40, СD3+, СD4+, СD8+, СD69+, СД71+, СD95+, СD3+СD28+, СD3+ СD28–, СD3–СD28+, СD20+СD40+ периферической крови определяли на проточном лазерном цитофлуориметре «Beckman COULTER» Epics XL II (США) с помощью моноклональных антител к кластерам дифференцировки СD3+, СD20+, СD4+, СD8+, СD69+, СD71+СD28+, СD40+, СD95+ фирмы IMMUNOTECH (Франция). Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ «STATISTICA-6». В связи с тем, что распределение данных не подчинялось нормальному закону, для оценки статистической значимости различий между сравниваемыми группами использовался непараметрический критерий Вилкоксона. Для представления результатов использованы медиана и интерквартильный размах. Различия сравниваемых величин признавались статистически достоверными при уровне значимости р<0,05. Пересечение интерквартильных интервалов не говорит об отсутствии достоверных различий сравниваемых групп [10]. Анализ многомерных нелинейных зависимостей проведен с помощью пакета «PolyAnalist 3.5. Pro». Применены также методы логистической регрессии и «деревья решений» с использованием пакета ППП Deductor 5. Результаты исследования. Проведена сравнительная оценка содержания абсолютного и относительного количества лимфоцитов с маркерами костимуляции СD3+CD28+, CD20+CD40+ в периферической крови на первом месяце жизни у детей с различными формами герпесвирусной инфекции. У детей с тяжелой формой ЦМВИ отмечалось достоверное (p<0,04) снижение относительного количества клеток с маркерами костимуляции CD3+CD28+ (табл. 1) на фоне достоверного снижения CD28 в общей популяции в сравнении с детьми контрольной группы. Наряду с этим достоверно возрастало (p<0,01) количество CD3+CD28– (табл. 2). При среднетяжелой форме ЦМВИ также отмечалось снижение относительного и абсолютного количества лимфоцитов с маркерами костимуляции CD3+CD28– при снижении количества лимфоцитов, экспрессирующих CD28, при этом не отмечалось возрастания числа T-лимфоцитов без маркеров костимуляции CD28 (CD3+CD28–). В наших исследованиях с целью более глубокого понимания нарушений в гуморальном звене иммунитета было проведено определение молекул CD40 (табл. 3). Полученные данные сравнивались с данными контрольной группы. При этом в группе детей с ЦМВИ, 86 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 генерализованной формой необходимо отметить достоверное увеличение количества активированных лимфоцитов с маркерами костимуляции CD20+CD40+. явило уточняющие критерии прогноза сохранения церебральной патологии у обследованного контингента детей. Òàáëèöà 1 Äèíàìèêà ïîêàçàòåëåé êëåòî÷íîãî èììóíèòåòà ó äåòåé ñ ãåðïåñâèðóñíîé èíôåêöèåé (CD28 è CD3+ CD28+) (ñðîê íàáëþäåíèÿ 1 ìåñ) CD3+CD28+ CD28 Ãðóïïà ÖÌÂÈ, òÿæåëàÿ Ìåäèàíà ôîðìà (1-ÿ) (n=54) * ð1–2 ÖÌÂÈ, ñðåäíåòÿæå- Ìåäèàíà ëàÿ ôîðìà (2-ÿ) * (n=52) Êîíòðîëüíàÿ ãðóïïà Ìåäèàíà (n=15) % 109/ë % 109/ë 1,70 (0,64–3,45)** 0,0002 0,35 1,70 (0,40–3,59) 0,0002 3,70 (2,25–6,60) 0,09 (0,03–0,18) 0,001 0,37 0,06 (0,01–0,19) 0,0004 0,15 (0,09–0,24) 50,55 (46,80–60,20) 0,04 0,01 52,35 (47,18–59,95) 0,002 68,10 (42,05–85,50) 2,79 (1,70–3,75) 0,46 0,001 1,87 (1,67–3,30) 0,0008 2,93 (1,38–3,17) Çäåñü è â òàáë. 2, 3: * äîñòîâåðíîñòü îòëè÷èé îò ïîêàçàòåëåé êîíòðîëüíîé ãðóïïû â âîçðàñòå 1 ìåñ; í/ä — íåäîñòîâåðíî; ** â ñêîáêàõ äàíû çíà÷åíèÿ 1–3-ãî êâàðòèëÿ; ð — äîñòîâåðíîñòü ðàçëè÷èé ìåæäó ãðóïïàìè. Òàáëèöà 2 Äèíàìèêà ïîêàçàòåëåé êëåòî÷íîãî èììóíèòåòà ó äåòåé ñ ãåðïåñâèðóñíîé èíôåêöèåé CD3–CD28+ è CD3+CD28– (ñðîê íàáëþäåíèÿ 1 ìåñ) CD3–CD28+ Ãðóïïà ÖÌÂÈ, òÿæåëàÿ ôîðìà (1-ÿ) n=54 Ìåäèàíà * ð1–2 ÖÌÂÈ, ñðåäíåòÿæå- Ìåäèàíà ëàÿ ôîðìà (2-ÿ) * (n=52) Êîíòðîëüíàÿ ãðóïïà Ìåäèàíà (n=15) CD3+CD28– % 109/ë % 109/ë 2,01 (0,34–5,40)** 0,28 0,0001 1,00 (0,49–5,13) 0,0002 4,20 (2,40–8,70) 0,13 (0,02–0,35) 0,16 0,0001 0,08 (0,02–0,37) 0,0009 0,22 (0,09–0,66) 6,70 (2,87–22,45) 0,01 0,0002 5,35 (3,38–10,3) 0,1 3,10 (1,50–7,80) 0,49 (0,15–1,41) 0,0001 0,0001 0,27 (0,12–0,42) 0,19 0,012 (0,04–0,22) В результате динамического наблюдения за обследуемыми детьми в течение первого года жизни выявлено, что к концу первого года жизни у части детей с ЦМВИ имела место задержка психомоторного развития (44,8%), которая сочеталась в ряде случаев с глухотой (5,9%), эпилепсией (11,9%), спастическим тетрапарезом (32,2%) и слепотой (13,4%). Нами обследованы в возрасте трех месяцев 122 ребенка, перенесших ЦМВИ в периоде новорожденности, из них 35 человек с сохраняющейся неврологической симптоматикой к концу первого года жизни и 87 — с отсутствием неврологической симптоматики к концу первого года жизни. Применение методов логистической регрессии и «деревья решений» с использованием пакета ППП Deductor 5 вы- При использовании в качестве исходных параметров для прогнозирования сохранения неврологической симптоматики при ЦМВИ к концу первого года жизни значения лимфоцитов с рецепторами CD3+, СD4+, CD8+, CD20+, CD28, CD40, CD3+CD28+, CD3+CD28–, CD3–CD28+, CD20+CD40 в результате процедуры отсеивания было обнаружено, что статистически значимым для сохранения неврологической симптоматики при ЦМВИ к концу первого года жизни является определение в периферической крови функциональной активности Т-лимфоцитов CD3, CD4, лимфоцитов, экспрессирующих CD 28, CD3–CD28+ в общей популяции, Т-лимфоцитов без маркера костимуляции CD28 (CD3+CD28–) и молекул CD40 (табл. 4). 87 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 Для лучшей интерпретации и представления полученных данных нами применялись методы логистической регрессии и ROC-анализа. Коэффициенты логистической регрессии, используемые для расчета точки разделения с использованием вышеуказанных параметров, представлены в табл. 5. Прогностическая ценность положительного результата — 32,3. Для визуальной оценки полученной формулы построена ROC-кривая (рис. 1). Показатель AUC, отражающий площадь под кривой, равный 0,873, свидетельствует об очень хорошем качестве модели. Òàáëèöà 3 Äèíàìèêà ïîêàçàòåëåé ãóìîðàëüíîãî çâåíà èììóííîé ñèñòåìû ó äåòåé ñ ãåðïåñâèðóñíîé èíôåêöèåé (CD40+, CD 20+CD40+) (ñðîê íàáëþäåíèÿ 1 ìåñ) CD40+ Ãðóïïà ÖÌÂÈ, òÿæåëàÿ Ìåäèàíà ôîðìà (1-ÿ) (n=54) * ð1–2 ÖÌÂÈ, ñðåäíåòÿæå- Ìåäèàíà ëàÿ ôîðìà (2-ÿ) * (n=52) Êîíòðîëüíàÿ ãðóïïà Ìåäèàíà (n=15) % 109/ë % 109/ë 0,90 (0,26–1,56)** 0,006 0,09 0,40 (0,13–0,84) 0,0003 1,27 (0,30–5,80) 0,05 (0,02–0,11) 0,005 0,25 0,03 (0,01–0,07) 0,0006 0,06 (0,01–0,22) 18,20 (10,60–27,95)** 0,0001 0,001 18,30 (11,85–23,60) 0,0003 5,90 (3,15–11,45) 0,85 (0,52–1,24) 0,0001 0,0007 0,66 (0,32–1,36) 0,0001 0,22 (0,11–0,38) Òàáëèöà 4 Óðîâåíü çíà÷èìîñòè ñîäåðæàíèÿ â ñûâîðîòêå êðîâè ïîïóëÿöèé Ò- è Â-ëèìôîöèòîâ äëÿ ïðîãíîçà ñîõðàíåíèÿ íåâðîëîãè÷åñêîé ñèìïòîìàòèêè ó íîâîðîæäåííûõ, ïåðåíåñøèõ ÖÌÂÈ ¹ ï/ï 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 CD20+CD40+ Ïîêàçàòåëü Çíà÷èìîñòü, % CD3–CD28+ CD4 CD3+CD28– CD40 CD3 CD28 CD20+CD40+ CD8 CD3+CD28+ CD20 44,053 24,104 14,015 6,991 6,536 4,300 0 0 0 0 С использованием коэффициентов логистической регрессии рассчитана формула прогноза сохранения неврологической симптоматики. ((CD3–CD28+ × 0,074) + CD4+ × (–0,182) + + (CD3+CD28– × 0,035) + CD40 × (–0,2862) + + CD3 × 0,1062)+ (CD28 × 0,1952)) – 0,4588 Если результат расчета по формуле >0,39 у ребенка будут церебральные нарушения к концу первого года жизни. При значении <0,32 у ребенка к концу года церебральные нарушения выявляться не будут. Чувствительность — 71,43%, специфичность — 88,89%. Òàáëèöà 5 Êîýôôèöèåíòû ëîãèñòè÷åñêîé ðåãðåññèè äëÿ ïîïóëÿöèé Ò- è Â-ëèìôîöèòîâ, èñïîëüçóåìûå äëÿ ïðîãíîçà ñîõðàíåíèÿ íåâðîëîãè÷åñêîé ñèìïòîìàòèêè ó íîâîðîæäåííûõ, ïåðåíåñøèõ ÖÌÂÈ Ïîêàçàòåëü <Êîíñòàíòà> CD3 CD4 CD8 CD20 CD3+CD28+ CD3–CD28+ CD3+CD28– CD20+CD40+ CD28 CD40 Êîýôôèöèåíò –0,45877 0,1062 –0,18201 0,016714 –0,08715 –0,015979 0,074216 0,034959 0,090792 0,19524 –0,2862 При использовании для прогноза сохранения церебральной патологии к концу года у детей, перенесших цитомегаловирусную инфекцию в периоде новорожденности, в качестве исходных параметров уровней Т-лимфоцитов с рецепторами CD69, CD71, CD95 в результате процедуры отсеивания была обнаружена статистическая значимость всех трех показателей. Уровень значимости содержания в сыворотке крови маркеров активации лимфоцитов отражен в табл. 6. 88 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 Для лучшей интерпретации и представления полученных данных нами применялись методы логистической регрессии и ROC-анализа. Коэффициенты логистической регрессии, используемые для расчета точки разделения с использованием вышеуказанных параметров представлены в табл. 7. неврологической симптоматики. (CD69 × (–9,0761) + CD71 × 4,1389 + CD95 × × 2,8098) — 8,4271. Если результат расчета по формуле >0,32 у ребенка будут церебральные нарушения к концу первого года жизни. При значении <0,32 у ребенка к концу года церебральные нарушения выявляться не будут. Чувствительность — 97,37%, специфичность — 97,37%. Прогностическая ценность положительного результата 645. Для визуальной оценки полученной формулы построена ROC-кривая (рис. 2). Рис. 1. ROC-кривая для показателей CD3–CD28+, CD3+CD28–, CD3, CD4, CD28, CD40 при прогнозировании сохранения неврологической симптоматики к концу первого года жизни у новорожденных, перенесших ЦМВИ. Cut off — точка разделения; AUC — площадь под кривой. Òàáëèöà 6 Óðîâåíü çíà÷èìîñòè ñîäåðæàíèÿ ìàðêåðîâ àêòèâàöèè ëèìôîöèòîâ äëÿ ïðîãíîçà ñîõðàíåíèÿ íåâðîëîãè÷åñêîé ñèìïòîìàòèêè ó íîâîðîæäåííûõ, ïåðåíåñøèõ ÖÌÂÈ ¹ 1 2 3 Ïîêàçàòåëü Çíà÷èìîñòü, % CD95 CD71 CD69 80,691 14,260 5,049 Òàáëèöà 7 Êîýôôèöèåíòû ëîãèñòè÷åñêîé ðåãðåññèè ìàðêåðîâ àêòèâàöèè ëèìôîöèòîâ, èñïîëüçóåìûå ïðè ïðîãíîçå ñîõðàíåíèÿ íåâðîëîãè÷åñêîé ñèìïòîìàòèêè ó íîâîðîæäåííûõ, ïåðåíåñøèõ ÖÌÂÈ Ïîêàçàòåëü Êîíñòàíòà CD69 CD71 CD95 Êîýôôèöèåíò –8,4371 –9,0761 4,1389 2,8098 С использованием коэффициентов логистической регрессии рассчитана формула прогноза сохранения Рис. 2. OC-кривая для показателей CD69,CD71, CD95 при прогнозировании сохранения неврологической симптоматики к концу первого года жизни у новорожденных, перенесших ЦМВИ. Cut off — точка разделения; AUC — площадь под кривой. Показатель AUC, отражающий площадь под кривой, равный 0,996, свидетельствует об очень хорошем качестве модели. Обсуждение результатов. Проведенными исследованиями установлено, что при ЦМВИ у новорожденных детей выявлялось иммунодефицитное состояние, характеризующееся нарушениями кооперации Ти В-лимфоцитов и преобладанием процессов негативной активации (апоптоз). Изучение экспрессии молекул костимуляции привело к пониманию механизмов, лежащих в основе развития ЦМВИ, и позволило по-новому взглянуть на их патогенез. Сигналы, поступающие в T-клетку, недостаточны для индукции экспрессии генов активации и пролиферации. Эти процессы усиливаются благодаря сигналам, запускаемым через молекулу CD28. Отсутствие одного из компонентов комплекса костимуляции приводит к дефектам иммунной защиты. При ЦМВИ, тяжелой форме более высокий, чем в других группах больных, уровень абсолютного и относительного количества МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 клеток без маркеров костимуляции СD3+CD28– и более выраженное снижение числа клеток с маркерами CD3+CD28+, через которые проводятся в клетку костимулирующие сигналы, необходимые для активации Т-хелперов, вызвало угнетение клеточного звена иммунитета на внедрение патогена. Это являлось одной из причин более тяжелого течения заболевания у пациентов этой группы. Как и при взаимодействии антигенпредставляющей клетки с Т-хелперами, при T-B-кооперации имеется двусторонняя направленность сигналов, однако преобладающее направление их в этом случае происходит от T- к Bклетке, и при этом активируется B-лимфоцит. Высокая значимость определения повышенного содержания В-клеток, экспрессирующих на своей поверхности рецепторы CD40 (CD20+CD40+), отражает важность прямого контакта между Ти В-клетками, которые осуществляются через эту молекулу. Сигнал, возникающий в результате участия клеток CD20+CD40+, является основным костимулирующим сигналом при включении ответа В-лимфоцитов, что в конечном итоге обеспечивает пролиферацию B-лимфоцитов. Изменения в иммунном статусе пациентов со среднетяжелой формой ЦМВИ носили однонаправленный характер, но по некоторым параметрам были менее выраженными, чем при тяжелой форме ЦМВИ. Статистическая значимость Т-лимфоцитов без маркера костимуляции CD28 свидетельствует 89 о специфичности CD3+CD28– Т-лимфоцитов для ЦМВИ. Т-лимфоциты CD3+CD28– появляются как следствие ЦМВИ, коррелируют обратно пропорционально с CD3+CD28+ Т-лимфоцитами, что указывает на важность отсутствия молекулы костимуляции CD28 для прогноза неблагоприятного течения ЦМВИ в виде сохранения неврологических нарушений к концу первого года жизни. Заключение. Развитие цитомегаловирусной инфекции у детей обусловлено нарушением противовирусного иммунитета с иммунологическими сдвигами в Т-клеточном (снижение CD3+CD28+) и в В-клеточном (увеличение CD20+CD40+) звеньях иммунной системы. Тяжелая форма ЦМВИ характеризуется достоверно более выраженным снижением экспрессии CD3+CD28+ и увеличением + + CD20 CD40 . Дети, перенесшие ЦМВИ в периоде новорожденности, в 44,8% случаев имеют сохранение неврологической симптоматики к концу первого года жизни. Статистически значимым для сохранения неврологической симптоматики к концу первого года жизни является определение в периферической крови функциональной активности Т-лимфоцитов CD3, CD4, CD40, лимфоцитов, экспрессирующих CD 28, CD3–CD28+ в общей популяции, Т-лимфоцитов без маркера костимуляции CD28 (CD3+CD28–), а также Т-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности маркеры активации CD69, CD71 и готовности к апоптозу CD95. Литература 1. Орджоникидзе Н. В., Агаронян Н. Г. Современные аспекты внутриутробной инфекции // Журнал Российского общества акушеров-гинекологов.— 2005.— № 1.— С. 8–12. 2. Перинатальные инфекции / под ред. А. Я. Сенчук, З. М. Дубоссарской.— М.: Медицинское информационное агентство, 2005. 3. Неонатология: национальное руководство / под ред. Н. Н. Володина.— М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007.— 848 с. 4. Бочарова И. И., Аксенов А. Н., Башкин Н. Ф. и др. Итоги и перспективы научных исследований по проблеме внутриутробной инфекции новорожденных // Российский вестник акушера-гинеколога.— 2007.— № 5.— С. 60–63. 5. Whitley R. Neonatal herpes simplex virus infection // Curr. Opin. Infect. Dis.— 2004.— Vol. 17, № 3.— P. 243–246. 6. Хаитов Р. М., Манько В. М. Физиологические особенности активации и торможения функций клеток иммунной системы. Рецепторные структуры и внутриклеточные сигнальные пути макрофагов и естественных клеток-киллеров // Российский физиологический журнал им. И. М. Сеченова.— 2006.— Т. 92, № 6.— С. 662–667. 7. Gaytant M. A., Rours G. I., Steegers E. A. et al. Congenital cytomegalovirus infection after recurrent infection: case reports and review of the literature // Eur. J. Pеdiatr.— 2003.— Vol. 162, № 34.— P. 248–253. 8. Рабсон А., Ройт А., Далвз П. Основы медицинской иммунологии.— М.: Бином, 2006. 9. Барышников А. Ю. Иммунологические проблемы апоптоза.— М.: Эдиториал УРСС, 2002. 10. Реброва О. Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA.— М.: МедиаСфера, 2002. Поступила в редакцию:15.07.2013 г. Контакт: Кравченко Лариса Вахтанговна. larakra@list.ru 90 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 УДК 616.895.8:616.379-008 ШИЗОФРЕНИЯ — ФАКТОР, УВЕЛИЧИВАЮЩИЙ РИСК РАЗВИТИЯ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО СИНДРОМА. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА ПОДБОРА ПАР 1,2Н. Г. Незнанов, 2И. А. Мартынихин, 3Д. А. Танянский, 4О. П. Ротарь, 4В. Н. Солнцев, 1Н. А. Соколян, 4А. О. Конради, 3А. Д. Денисенко 1Санкт-Петербургский научно-исследовательский психоневрологический институт им. В. М. Бехтерева, Россия 2Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова, Россия 3Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН, Санкт-Петербург, Россия 4Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии им. В. А. Алмазова, Санкт-Петербург, Россия SCHIZOPHRENIA IS A FACTOR INCREASING THE RISKS OF METABOLIC SYNDROME DEVELOPMENT. FINDINGS OF THE RESEARCH INVOLVING PAIR SELECTION METHOD 1,2N. G.Neznanov, 2I. A. Martynikhin, 3D. A. Tanyansky, 4O. P. Rotar’, 4V. N. Solntsev, 1N. A. Sokolyan, 4A. O. Konradi, 3A. D. Denisyenko 1St.-Petersburg Bekhterev Psychoneurological Research Institute, Russia 2St.-Petersburg State Medical University named after I. P. Pavlov, Russia 3Institute of The Experimental Medicine of North-West Branch of Russian Academy of Medical Sciences, St.-Petersburg, Russia 4Almazov Federal Blood, Heart, And Endocrinology Centre, St.-Petersburg, Russia © Коллектив авторов, 2013 г. Больные шизофренией имеют высокие показатели смертности от сердечно-сосудистых и эндокринных заболеваний, поэтому изучение метаболического синдрома (МС) как значимого фактора риска этих заболеваний важно для разработки методов предупреждения преждевременной смертности у данной категории больных. Цель исследования: оценить распространенность МС и его компонентов у пациентов с шизофренией в сравнении с психически здоровыми лицами. Из когорты 1561 банковского служащего были отобраны 138 работников, соответствующих 138 больным шизофренией по полу, возрасту и индексу массы тела. В обеих группах определяли показатели антропометрии, уровень артериального давления, липидограмму, содержание в крови глюкозы, инсулина, кортизола, пролактина, лептина и адипонектина. По сравнению с группой контроля больные шизофренией характеризовались более высокой частотой МС (по критериям NCEP ATP III она составила соответственно 12,3% и 35,5%) и таких его проявлений, как абдоминальное ожирение, гипертриглицеридемия, снижение уровня холестерина липопротеинов высокой плотности (ХС ЛПВП). Концентрации глюкозы, общего холестерина и ХС ЛПВП были снижены у больных шизофренией, в то время как содержание инсулина и триглицеридов у пациентов было повышено. Больные шизофренией имеют значимо более высокий риск метаболических нарушений, что способствует развитию у них сердечно-сосудистых заболеваний и снижению продолжительности жизни. Наряду с этим МС у больных шизофренией имеет ряд значимых особенностей, которые, вероятно, обусловлены действием специфичных для этих больных факторов риска. Ключевые слова: метаболический синдром, ожирение, шизофрения. The aim was to evaluate the prevalence of metabolic syndrome and its components in patients with schizophrenia and to compare the frequency of these metabolic disorders with mental healthy subjects. Methods. 138 schizophrenic patients and 138 bank employees controls, matched by sex, age and body mass index, we enrolled to this study. In both groups plasma concentrations of lipids, glucose, insulin, cortisol, prolactin, leptin and adiponectin were determined. Results. In comparison with controls patients with schizophrenia had significantly higher frequency of metabolic syndrome and such its components as abdominal obesity, hypertriglyceridemia and low level of high density lipoprotein cholesterol. Schizophrenic patients had lower concentrations of glucose, total and high density lipoprotein cholesterol, while insulin and triglycerides content was higher in this group. Conclusions. Patients with schizophrenia have high risk of metabolic syndrome, which can predispose them to development of cardiovascular disorders and decline of life longevity. Metabolic syndrome in patients with schizophrenia has some special features, which can be a result of influence of specific risk factors on these subjects. Key words: metabolic syndrome, obesity, schizophrenia. МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 Введение. Область психиатрии, занимающаяся лечением больных психозами, и в частности шизофренией, долгое время была изолирована от других медицинских специальностей. Главной целью врачей-психиатров был контроль над продуктивными симптомами болезни (бред, галлюцинации, агрессивное поведение). Однако когда в этом направлении были достигнуты значимые успехи, стало очевидно, что соматическое здоровье больных шизофренией страдает не меньше, чем психическое. Смертность среди страдающих шизофренией в 1,5 раза выше, чем в общей популяции (по данным метаанализа [1]), а продолжительность жизни меньше на 20% [2]. При этом помимо значительной частоты суицидов выявляются высокие показатели смертности от сердечно-сосудистых и эндокринных заболеваний [1], и доля этих заболеваний среди больных шизофренией растет [3]. Поэтому изучение метаболического синдрома (МС) как важного фактора риска сердечно-сосудистых заболеваний и сахарного диабета 2-го типа может дать ценные сведения для разработки методов предупреждения преждевременной смертности у больных шизофренией. В ряде исследований, проведенных в последние годы за рубежом, выявлено значимое увеличение частоты МС, сахарного диабета и нарушения толерантности к глюкозе у больных шизофренией при сопоставлении с психически здоровыми лицами. Так, в публикации McEvoy [4] приводятся данные обследования 687 больных шизофренией в США. Метаболический синдром был выявлен у 40% лиц. При сопоставлении полученных данных с результатами эпидемиологического исследования в США (NHANES III [5]) показатели распространенности МС у больных шизофренией были в 2 раза выше, чем среди прочего населения. В дальнейшем схожие результаты были получены в Канаде и странах Западной Европы [6–8]. В нашей стране еще бытует мнение, что проблема широкой распространенности МС (который прежде имел второе название «синдром изобилия») актуальна лишь для Европы и Америки, где высок уровень жизни и часто встречается ожирение. Для российских же больных шизофренией, чье бедственное экономическое положение ни для кого не секрет, эта проблема не всегда признается актуальной. В то же время результаты первых оценок распространенности МС среди больных шизофренией в России [9, 10] и предварительные данные нашей работы [11] свидетельствуют о высокой частоте обменных нарушений у этой категории больных и в нашей стране. К сожалению, отсутствие достоверных данных о распространенности МС среди населения России пока не позволяет 91 доказать непосредственный вклад шизофрении и ассоциированных с ней нарушений в увеличение риска развития этой патологии у наших больных. Цель настоящей работы — сравнение распространенности МС среди больных шизофренией, обследованных в одной из городских психиатрических больниц Санкт-Петербурга, и среди психически здоровых людей. В качестве группы сравнения были выбраны работники петербургских отделений Сбербанка России, обследованные сотрудниками Федерального центра сердца, крови и эндокринологии им. В. А. Алмазова. Работники банковской сферы, как и больные шизофренией, относятся к группе с высоким кардиометаболическим риском, так как характер их труда связан с высоким психоэмоциональным напряжением в сочетании с низкой физической активностью. Для того чтобы нивелировать возможные различия между сравниваемыми группами по половозрастным и антропометрическим параметрам, мы использовали метод парного сравнения, при котором в пару к каждому больному шизофренией подбирался работник банка того же пола, возраста и с теми же индексом массы тела. Материалы и методы исследования. В выборку больных шизофренией были включены пациенты с диагнозом параноидной шизофрении по критериям МКБ-10, проживающие в Санкт-Петербурге и госпитализированные на момент обследования в городскую психиатрическую больницу № 6. С целью формирования выборки, наиболее точно соответствующей общей популяции больных шизофрении, других критериев отбора не использовали, больные отбирались сплошным методом. У всех обследованных натощак, после двенадцатичасового воздержания от приема пищи, проводили забор образцов венозной крови, измеряли артериальное давление (АД), рост, массу тела, окружность талии, концентрацию глюкозы, общего холестерина (ХС), ХС липопротеидов высокой плотности (ХС ЛПВП), триглицеридов (ТГ). Обследование работников Сбербанка проводили непосредственно на рабочих местах при помощи специально созданных скрининговых бригад. У всех обследованных служащих измеряли те же антропометрические и лабораторные показатели, что и у больных шизофренией. Дополнительно, с помощью иммуноферментного анализа определяли содержание в крови пролактина, кортизола, инсулина, лептина, адипонектина, а также вычисляли индекс инсулинорезистентности НОМА (HOMA = глюкоза (ммоль/л) × инсулин (мкЕД/мл) / 22,5), коэффициент атерогенности (КА = (общий ХС — ХС ЛПВП)/ХС ЛПВП) и индекс массы тела (ИМТ = масса тела (кг) / 92 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 рост2 (м2)). Метаболический синдром диагностировали по критериям NCEP ATP III и IDF (табл. 1). Для проведения парного сравнения к каждому обследованному больному шизофренией подбирали в пару одного из работников Сбербанка, соответствующего этому больному по полу, возрасту и ИМТ. При наличии нескольких человек, точно совпадающих по всем параметрам, случайным образом в пару отбирался только один из них. При отсутствии точного совпадения допускалось отклонение по ИМТ был равен 23,6 кг/м2 (SD 3,66) среди мужчин и 24,9 кг/м2 (SD 5,03) среди женщин. При этом 33,1% обследованных имели избыточную массу тела (ИМТ ≥25, но <30 кг/м2), а 8,5% — ожирение различных степеней (ИМТ ≥30 кг/м2). Средняя длительность шизофрении составила 12,7 года (SD 11,1). Распространенность МС по критериям NCEP ATP III cоставила 36,2% (среди мужчин — 27,2%, среди женщин — 45,1%), по критериям IDF — 38% (среди мужчин — 22,2%, среди женщин — 53,6%). Òàáëèöà 1 Êðèòåðèè ìåòàáîëè÷åñêîãî ñèíäðîìà (IDF è NCEP ATP III) Êðèòåðèè IDF, 2005 [12] Êðèòåðèè NCEP ATP III, 2001 [13] Äëÿ ïîñòàíîâêè äèàãíîçà ÌÑ íåîáõîäèìî: • Öåíòðàëüíîå (àáäîìèíàëüíîå) îæèðåíèå (äëÿ åâðîïåîèäíîé ðàñû äèàãíîñòèðóåòñÿ ïðè îêðóæíîñòè òàëèè ó ìóæ÷èí ³94 ñì, ó æåíùèí ³80 ñì). • Ïëþñ ëþáûå äâà ïóíêòà èç íèæåïåðå÷èñëåííûõ: • Ïîâûøåíèå óðîâíÿ Òà âûøå 1,7 ììîëü/ë èëè ñïåöèôè÷íàÿ òåðàïèÿ ýòîãî íàðóøåíèÿ. • Íèçêàÿ êîíöåíòðàöèÿ ÕÑ ËÏÂÏ (ìóæ÷èíû <1,03 ììîëü/ë, æåíùèíû <1,29 ììîëü/ë) èëè ñïåöèôè÷íàÿ òåðàïèÿ ýòîãî íàðóøåíèÿ. • Ïîâûøåíèå ÀÄ: ñèñòîëè÷åñêîå Àij130 ìì ðò. ñò., èëè äèàñòîëè÷åñêîå Àij85 ìì ðò. ñò., èëè ëå÷åíèå ïðåæäå äèàãíîñòèðîâàííîé ãèïåðòåíçèè. • Ïîâûøåíèå óðîâíÿ ãëþêîçû ïëàçìû êðîâè íàòîùàê ³5,6 ììîëü/ë èëè ïðåæäå äèàãíîñòèðîâàííûé ñàõàðíûé äèàáåò Äëÿ ïîñòàíîâêè äèàãíîçà ÌÑ íåîáõîäèìî íàëè÷èå ëþáûõ òðè ïóíêòà èç íèæåïåðå÷èñëåííûõ: • Îêðóæíîñòü òàëèè ó ìóæ÷èí >102 ñì, ó æåíùèí >88 ñì. • Ïîâûøåíèå óðîâíÿ Òà âûøå 1,7 ììîëü/ë èëè ñïåöèôè÷íàÿ òåðàïèÿ ýòîãî íàðóøåíèÿ. • Íèçêàÿ êîíöåíòðàöèÿ ÕÑ ËÏÂÏ (ìóæ÷èíû <1,03 ììîëü/ë, æåíùèíû <1,29 ììîëü/ë) èëè ñïåöèôè÷íàÿ òåðàïèÿ ýòîãî íàðóøåíèÿ. • Ïîâûøåíèå ÀÄ: ñèñòîëè÷åñêîå ÀÄ ³130 ìì ðò. ñò. èëè äèàñòîëè÷åñêîå ÀÄ ³85 ìì ðò. ñò. èëè ëå÷åíèå ïðåæäå äèàãíîñòèðîâàííîé ãèïåðòåíçèè. • Ïîâûøåíèå óðîâíÿ ãëþêîçû íàòîùàê ³6,1 ììîëü/ë èëè ïðåæäå äèàãíîñòèðîâàííûé ñàõàðíûé äèàáåò на ±0,5 кг/м2 или по возрасту на ±1 год. При отсутствии пары в этих рамках больного исключали из анализа. Для статистического анализа использовали: для абсолютных значений (например, концентрации) t-критерий для связанных выборок (статистический пакет SPSS 17.0), для относительных значений (например, %) тест McNemar для зависимых выборок и точный критерий Фишера для независимых выборок (онлайн калькулятор фирмы GraphPad Software Inc., http://www.graphpad.com). Результаты исследования. В соответствии с критериями включения в обследование был отобран 181 больной шизофренией. Отказались от обследования 12 больных, 5 человек были исключены в связи с недостаточно обоснованным диагнозом шизофрении, данные еще одной больной были исключены в связи с наличием у нее декомпенсированного сахарного диабета 1-го типа. Всего в статистическую обработку были включены данные 163 больных. Количество мужчин и женщин было сопоставимым (81 мужчина и 82 женщины). Средний возраст мужчин составил 39 лет, средний возраст женщин — 45,1 лет. Средний ИМТ Среди работников Сбербанка обследован 1561 человек (более 80% работников подразделений, в которых проходило обследование). Число обследованных женщин значительно превосходило число мужчин (1223 и 338 соответственно). Средний возраст мужчин — 39,6 года, средний возраст женщин — 38,2 года. Средний ИМТ — 26,6 кг/м2 (SD 4,00) среди мужчин и 24,8 кг/м2 (SD 5,00) среди женщин. При этом 29,5% обследованных имели избыточную массу тела, а 15,6% — ожирение. Распространенность МС по критериям NCEP ATP III cоставила 17,6% (среди мужчин — 35,2%, среди женщин — 12,7%), по критериям IDF — 19,4% (среди мужчин — 39,4%, среди женщин — 13,9%). При подборе контрольной группы из числа работников Сбербанка удовлетворяющие условиям сравнения пары были найдены для 138 больных шизофренией (66 мужчин — средний возраст 37,8 года, ИМТ 23,8 кг/м2 и 72 женщины — средний возраст 43,6 года, ИМТ 24,9 кг/м2). При проведении парного сравнения выявлено, что среди больных шизофренией чаще, чем в группе кон- 93 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 троля, диагностировали МС (табл. 2) и такие его проявления, как абдоминальное ожирение, гипертриглицеридемия, снижение уровня ХС ЛПВП. В то же время у пациентов с шизофренией наблюдалось некоторое снижение частоты гипергликемии, а частота артериальной гипертензии в группах не различалась (табл. 3). Кроме того, у больных шизофренией по сравнению с группой контроля в среднем было больше выявленных компонентов МС (табл. 2). При сопоставлении средних значений кардиометаболических факторов риска (табл. 4) также выяви- наблюдалось достоверное повышение уровня лептина по сравнению с той же группой обследуемых без шизофрении (p=0,035). Следует также отметить повышение концентрации в крови пролактина и кортизола у пациентов с шизофренией (табл. 4). При проведении анализа с распределением по полу выяснилось, что у женщин в группе шизофрении по сравнению с контролем отмечалось статистически значимое повышение частоты МС как по критериям NCEP ATP III, так и по критериям IDF (табл. 5). Среди мужчин различия в распространенности МС Òàáëèöà 2 ×àñòîòà è ñðåäíåå êîëè÷åñòâî êðèòåðèåâ ìåòàáîëè÷åñêîãî ñèíäðîìà ïî NCEP ATP III (2001) è IDF (2005) ó áîëüíûõ â ãðóïïå øèçîôðåíèè è êîíòðîëÿ Êðèòåðèè Áîëüíûå øèçîôðåíèåé (n=138) Êîëè÷åñòâî êðèòåðèåâ ïî ATPIII (ñðåäíåå) Ìåòàáîëè÷åñêèé ñèíäðîì ïî ATPIII, % Êîëè÷åñòâî êðèòåðèåâ ïî IDF (ñðåäíåå) Ìåòàáîëè÷åñêèé ñèíäðîì ïî IDF, % * Ðàçëè÷èÿ 1,9 35,5 2,2 36,2 Êîíòðîëü (n=138) 1,1* 12,3* 1,5* 18,8* äîñòîâåðíû ïðè p<0,0001. Òàáëèöà 3 ×àñòîòà êîìïîíåíòîâ ìåòàáîëè÷åñêîãî ñèíäðîìà ïî êðèòåðèÿì NCEP ATP III (2001) è IDF (2005) ó áîëüíûõ â ãðóïïå øèçîôðåíèè è êîíòðîëÿ Êðèòåðèè Áîëüíûå øèçîôðåíèåé (n=138) Àáäîìèíàëüíîå îæèðåíèå ïî ATP III, % Àáäîìèíàëüíîå îæèðåíèå ïî IDF, % Ãèïåðòðèãëèöåðèäåìèÿ, % Ñíèæåíèå óðîâíÿ ÕÑ ËÏÂÏ, % Ãèïåðãëèêåìèÿ ïî ATP III, % Ãèïåðãëèêåìèÿ ïî IDF, % Àðòåðèàëüíàÿ ãèïåðòåíçèÿ, % * Ðàçëè÷èÿ 31,2 53,6 32,6 72,5 8,7 20,3 34,8 Êîíòðîëü (n=138) 18,8** 39,8** 14,5** 22,5** 18,1* 35,5* 35,5 äîñòîâåðíû ïðè p<0,05; ** ïðè p<0,001. лись разнонаправленные изменения. Так, больные шизофренией по сравнению с контрольной группой характеризовались более высоким значением окружности талии и более низким уровнем АД. На фоне более низкой концентрации в крови глюкозы и холестерина, у пациентов с шизофренией выявлялось повышение содержания в крови инсулина, ТГ и снижение уровня ХС ЛПВП. Несмотря на данные диссоциации, в группе шизофрении отчетливо был выше индекс НОМА и коэффициент атерогенности, что свидетельствует в пользу неблагоприятной суммарной тенденции метаболических изменений у этих больных. На этом фоне плазменные концентрации адипонектина и лептина между группами не отличались. Вместе с тем у пациентов с шизофренией и МС между больными шизофренией и здоровыми лицами были статистически значимыми только по критериям NCEP ATPIII. При этом женщины среди больных шизофренией имели значимо большую частоту МС по сравнению с мужчинами (p=0,0006 для критериев NCEP ATP III и р=0,0002 для критериев IDF), а среди психически здоровых разницы в распространенности МС в зависимости от пола не было (p=0,6122 для критериев NCEP ATP III и р=1,000 для критериев IDF). В обеих группах обследуемых отмечалось закономерное увеличение частоты МС с возрастом (рисунок). При этом статистически значимые различия (p<0,01) между группой больных и контролем наблюдались лишь в возрасте 40–50 лет и старше 94 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 50 лет. В возрастных подгруппах менее 30 лет и 30–40 лет распространенность МС среди больных шизофренией была выше, но не достигала уровня статистической значимости. Результаты и их обсуждение. В настоящей работе при сопоставлении больных шизофренией и повышенной атерогенностью липидного спектра крови. Вполне вероятно, что в патогенезе инсулинорезистентности и атерогенной дислипидемии при шизофрении особая роль отводится гормональным изменениям, в частности повышению уровня в крови пролактина и кортизола, а также лептинорезистент- Òàáëèöà 4 Êàðäèîìåòàáîëè÷åñêèå ôàêòîðû ðèñêà ó áîëüíûõ â ãðóïïå øèçîôðåíèè è êîíòðîëÿ Áîëüíûå øèçîôðåíèåé (n=138) Ïàðàìåòðû Îêðóæíîñòü òàëèè, ñì Ñèñòîëè÷åñêîå ÀÄ, ìì ðò. ñò. Äèàñòîëè÷åñêîå ÀÄ, ìì ðò. ñò. Ãëþêîçà ïëàçìû, ììîëü/ë Èíñóëèí, ìêÅÄ/ìë Èíäåêñ ÍÎÌÀ Îáùèé ÕÑ, ììîëü/ë ÕÑ ËÏÂÏ, ììîëü/ë Òðèãëèöåðèäû, ììîëü/ë Êîýôôèöèåíò àòåðîãåííîñòè Àäèïîíåêòèí, ìêã/ìë Ëåïòèí, íã/ìë Ïðîëàêòèí, ìêÌÅ/ìë Êîðòèçîë, íìîëü/ë ñðåäíåå SD 89,4 120,8 76,6 5,02 13,6 3,2 4,8 1,0 1,6 3,8 10,7 22,7 601,9 819,4 10,6 14,8 9,2 0,9 7,9 3,7 1,2 0,2 0,8 1,3 5,7 30,1 625,5 239,3 Êîíòðîëü (n=138) ñðåäíåå 84,1 123,2 79,7 5,3 9,3 2,2 5,3 1,5 1,2 2,9 10,8 15,8 280,2 487,6 SD 10,9*** 17,6* 12,0*** 1,0* 7,9*** 2,1** 1,2*** 0,5*** 1,0*** 1,6*** 6,6 19,5 141,5** 161,8*** * ð£0,05; ** ð£0,01; *** ð£0,001. Òàáëèöà 5 ×àñòîòà ìåòàáîëè÷åñêîãî ñèíäðîìà ïî êðèòåðèÿì NCEP ATP III (2001) è IDF (2005) ó ìóæ÷èí è æåíùèí Êðèòåðèé Ìóæ÷èíû, n=66 Ìåòàáîëè÷åñêèé ñèíäðîì ïî ATPIII, % Ìåòàáîëè÷åñêèé ñèíäðîì ïî IDF, % Æåíùèíû, n=72 Ìåòàáîëè÷åñêèé ñèíäðîì ïî ATPIII, % Ìåòàáîëè÷åñêèé ñèíäðîì ïî IDF, % * Äîñòîâåðíîñòü Áîëüíûå øèçîôðåíèåé Êîíòðîëü 27,3 19,7 10,6* 18,2 43,1 51,4 13,9** 19,4** ðàçëè÷èé ïðè p<0,05; ** ïðè p<0,001. и психически здоровых людей, идентичных по полу, возрасту и ИМТ, выявлено, что больные шизофренией имеют более высокую распространенность МС и большинства его компонентов. При этом отмечались две важные особенности. 1. Более высокая распространенность МС у больных шизофренией сочеталась со сниженным уровнем АД, глюкозы и общего ХС. Однако ввиду большего содержания инсулина, ТГ и более низкого уровня ХС ЛПВП данные пациенты в целом отличались сниженной инсулиночувствительностью ности, о которой свидетельствует более выраженное повышение уровня лептина при МС у пациентов с шизофренией по сравнению с психически здоровыми лицами. 2. Внутри группы больных шизофренией женщины характеризовались более высокой частотой МС, чем мужчины, тогда как половые различия его распространенности среди психически здоровых лиц не выявлялись. Данные особенности могут свидетельствовать об особых патогенетических механизмах, участвующих МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 в развитии МС у больных шизофренией. В целом увеличение риска развития метаболических расстройств у этой категории больных можно связать с сочетанным влиянием нескольких групп факторов. Влияние психопатологии шизофрении. Больные шизофренией испытывают значимый стресс как от ре- Рисунок. Частота метаболического синдрома по критериям NCEP ATP III (2001) у больных шизофренией и в группе контроля в разных возрастных группах. альных стрессоров (неблагоприятные жизненные события, факт наличия заболевания, трудности социальной адаптации и пр.), так и от «псевдострессоров» (переживания, обусловленные бредом и галлюцинациями). У страдающих шизофренией часто выявляется депрессия, связь которой с сердечно-сосудистыми заболеваниями в настоящее время широко обсуждается. Эти факторы могут приводить к изменениям в деятельности гипоталамо-гипофизорно-надпочечниковой оси и длительной гиперкортизолемии, которая, в свою очередь, способствует развитию абдоминального ожирения, инсулинорезистентности и повышению АД. Кроме того, основой шизофрении являются эмоционально-волевые расстройства (апатия, пассивность, безынициативность и пр.), которые косвенным образом способствуют формированию нездорового образа жизни: гипокинезии, нездоровому питанию, малой заботы о своем здоровье, высокой частоте курения и употребления алкоголя. Так, среди больных шизофренией курили 73%, имели регулярные физические нагрузки 22%, в то время как среди психически здоровых курили 32%, а физические нагрузки имели 47% обследованных. Снижение социального статуса больных шизофренией может приводить к значимым различиям в питании. В обследуемых выборках сред- 95 ний доход среди тех, кто согласился ответить на этот вопрос, в группе больных шизофренией был в 5 раз ниже, чем в группе банковских работников. При этом среди обследованных больных шизофренией 60% пациентов указало, что из-за недостатка денег хотя бы иногда ограничивают себя в употреблении мясных продуктов и сладостей, 54% — во фруктах, а 20% даже в простой еде (хлеб, крупы). Указанный аспект может объяснять более низкие показатели уровня глюкозы и общего ХС в группе больных шизофренией. Влияние антипсихотической терапии. Больные шизофренией нуждаются в длительном, часто пожизненном приеме антипсихотиков (нейролептиков). Эти препараты пока еще недостаточно ясным образом способны значимо влиять на обменные процессы в организме больного. В проспективных исследованиях показано, что антипсихотики, особенно атипичного ряда, воздействуют практически на все компоненты МС: способствуют увеличению массы тела, повышению в крови уровня глюкозы, ХС и ТГ [14, 15]. С другой стороны, некоторые антипсихотики оказывают гипотензивное действие, вследствие чего могли остаться невыявленными повышенные уровни АД у некоторой части обследованных пациентов. Возможная связь патогенетических механизмов обменных нарушений и шизофрении. Эта связь обсуждается только гипотетически, поскольку патогенез шизофрении известен пока еще далеко не полностью. Но предполагать ее существование позволяют данные о широкой распространенности нарушений обмена веществ у «первичных», недавно болеющих больных шизофренией [16, 17], высокая наследственная отягощенность по нарушениям обмена веществ и сахарному диабету у больных шизофренией [18], данные о значимом и устойчивом снижении уровня аполипопротеина А1 у больных шизофренией [19, 20], что косвенно подтверждает выявленный в настоящем исследовании низкий уровень ХС ЛПВП в группе шизофрении. Заключение. Таким образом, больные шизофренией имеют значимо более высокий риск метаболических нарушений, что способствует развитию у них сердечно-сосудистых заболеваний и снижению продолжительности жизни. Наряду с этим МС у больных шизофренией имеет ряд значимых особенностей, которые, вероятно, обусловлены действием специфичных для этих больных факторов риска. Литература 1. Brown S. Excess mortality of schizophrenia: a meta-analysis // Brit. J. of Psychiatry.—1997.— Vol. 171.— Р. 502–508. 2. Newman S. C., Bland R. C. Mortality in a cohort of patients with schizophrenia: a record linkage study // Can. J. Psychiatry.— 1991.— Vol. 36 (4).— Р. 239–245. 96 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 3. Osby U., Correia N., Brandt L., Ekbom A., Sparen P. Mortality and causes of death in schizophrenia in Stockholm county.— Sweden, 2000.— Vol. 45(1–2).— Р. 21–28. 4. McEvoy J., Meyer J., Goff D. et al. Prevalence of the metabolic syndrome in patients with schizophrenia: baseline results from the Clinical Antipsychotic Trials of Intervention Effectiveness (CATIE) schizophrenia trial and comparison with national estimates from NHANES III. Schizophrenia Research.— 2005.— Vol. 80 (1).— Р. 19–32. 5. Ford E. S., Giles W. H., Dietz W. H. Prevalence of the metabolic syndrome among US adults: findings from the third National Health and Nutrition Examination Survey // JAMA.— 2002.— Vol. 287.— Р. 356–359. 6. Heiskanen T., Niskanen L., Lyytikainen R. et al. Metabolic syndrome in patients with schizophrenia // J. of Clinical Psychiatry.— 2003.— Vol. 64.— Р. 575–579. 7. Cohn T., Prud’homme D., Streiner D. et al. Characterizing Coronary Heart Disease Risk in Chronic Schizophrenia: High Prevalence of the Metabolic Syndrome // Can. J. Psychiatry.— 2004;49.— Р. 753–760. 8. De Hert M., van Winkel R., Van Eyck D. et al. Prevalence of diabetes, metabolic syndrome and metabolic abnormalities in schizophrenia over the course of the illness: a cross-sectional study // Clin. Pract. Epidemol. Ment. Health.— 2006.— Vol. 27.— Р. 14. 9. Капилетти С. Г., Мосолов С. Н., Шафаренко А. А. Частота метаболических расстройств у больных шизофренией, получающих антипсихотическую терапию. Материалы Общероссийской конференции Реализация подпрограммы «Психические расстройства» Федеральной целевой программы «Предупреждение и борьба с социально-значимыми заболеваниями (2007–2011)» Москва 28–30 октября 2008.— М., 2008.— С. 414–416. 10. Горобец Л. Н. Нейроэндокринные дисфункции и нейролептическая терапия.— М.: Медпрактика-М, 2007.— 312 с. 11. Незнанов Н. Г., Мартынихин И. А., Соколян Н. А. Распространенность метаболического синдрома среди госпитализированных больных параноидной формой шизофрении в Санкт-Петербурге // Тезисы научно-практической конференции «Актуальные проблемы оказания психиатрической помощи в Северо-Западном регионе Российской Федерации».— СПб., 2008.— С. 147–148. 12. The IDF consensus worldwide definition of the metabolic syndrome. International Diabetes Federation, 2006, www.idf.org/metabolic_syndrome, website of the International Diabetes Federation. 13. Executive summary of the Third Report of The National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on detection, evaluation, and treatment of high blood cholesterol in adults (Adult Treatment Panel III) // JAMA.— 2001.— Vol. 285.— Р. 2486–2497. 14. American Diabetes Association, American Psychiatric Association, American Association of Clinical Endocrinologists, North American Association for the Study of Obesity. Consensus development conference on antipsychotic drugs and obesity and diabetes // J. Clin. Psychiatry.— 2004.— Vol. 65.— Р. 267–272. 15. Newcomer J. W., Nasrallah H. A., Loebel A. D. The atypical antipsychotic therapy and metabolic issues national survey: practice patterns and knowledge of psychiatrists // J. Clin. Psychopharmacol.— 2004.— Vol. 24 (5 suppl. 1).— Р. S1–S6. 16. Ryan M. С. M., Collins P., Thakore J. H. Impaired fasting glucose tolerance in first-episode, drug naive patients with schizophrenia // Amer. J. of Psychiatry.— 2003.— Vol. 160.— Р. 284–289. 17. Thakore J. H., Vlahoos J., Martin A. Increased visceral fat distribution in drug-naive and drug-free patients with schizophrenia // Int. J. of Obesity Related Metabolic Disorders.— 2002.— Vol. 26.— Р. 137–141. 18. Bushe C., Holt R. Prevalence of diabetes and impaired glucose tolerance in patients with schizophrenia // Brit. J. of Psychiatry.— 2004.— Vol. 18, № 4 (suppl. 47).— Р. 67–71. 19. La Y. J., Wan C. L., Zhu H. et al. Decreased levels of apolipoprotein A-I in plasma of schizophrenic patients // J. Neural. Transm.— 2007.— Vol. 114 (5).— Р. 657–663. 20. Huang J., Wang L., Prabakaran S. et al. Independent protein-profiling studies show a decrease in apolipoprotein A1 levels in schizophrenia CSF, brain and peripheral tissues. // Molecular Psychiatry advance online publication 16 October 2007.— doi: 10.1038/sj.mp.4002108 Поступила в редакцию: 23.04.2013 г. Контакт: Незнанов Николай Григорьевич. spbinstb@bekhterev.ru Подписка на 2014 год открыта Наш подписной индекс — 5 7 9 9 9 97 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 УДК 615.036.8 РОЛЬ ОПИАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ В МЕХАНИЗМЕ НЕЙРОМОДУЛИРУЮЩЕГО ВЛИЯНИЯ ЭНДОГЕННОГО АНТИБИОТИКА ДЕФЕНСИНА В ВЕСТИБУЛЯРНОМ ЭПИТЕЛИИ ЛЯГУШКИ И. В. Рыжова, Т. В. Тобиас, Ю. Н. Андрианов, А. Д. Ноздрачев Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН, Санкт-Петербург, Россия THE ROLE OF OPIATE RECEPTORS IN THE MECHANISM OF NEUROMODULATION OF ENDOGENIC ANTIBIOTIC DEFENSINE IN THE FROG VESTIBULAR EPITHELIUM I. V. Ryzhova, T. V. Tobias, G. N, Andrianov, A. D. Nozdrachev Pavlov Institute of Physiology, Russian Academy of Sciences, St.-Petersburg, Russia © Коллектив авторов, 2013 г. Антибактериальные пептиды дефенсины обладают полифункциональной активностью. В наших предыдущих исследованиях впервые показано модулирующее действие дефенсинов кролика и человека (HNP-1) на глутаматэргическую синаптическую передачу в вестибулярном эпителии лягушки. Целью настоящего исследования явилось изучение возможного участия опиатных рецепторов в модулирующем действии дефенсина HNP-1. В электрофизиологических экспериментах специфический агонист μ-опиатных рецепторов (ОР) DAGO (0,1–100 мкмоль) и специфический агонист κ-ОР U-50448 (1 нмоль — 10 мкмоль) понижали уровень фоновой активности афферентных нервных волокон. Специфический антагонист κ-ОР norBinaltorphimine (nor-Bin) в концентрациях 0,01–10 мкмоль повышал частоту фоновой импульсации, а специфический антагонист μ-ОР СТАP (0,01–1 мкмоль) оказывал двухфазное позитивно-негативное действие. Аппликация специфических агониста δ-ОР DSLET (0,1 нмоль — 10 мкмоль) и антагониста δ-ОР налтриндола (1 нмоль — 10 мкмоль) была неэффективна. СТАP (100 нмоль) и nor-Bin (10 мкмоль) нивелировали депрессивный эффект дефенсина (1 нмоль), что предполагает конкурентное взаимодействие лигандов μ- и κ-ОР и дефенсина. Данные свидетельствуют о влиянии иммунной системы на сенсорные функции периферического звена вестибулярной сенсорной системы и о том, что модулирующее действие дефенсина в глутаматэргическом синапсе вестибулярного эпителия осуществляется посредством μ- и κ-ОР. Ключевые слова: дефенсин, нейромодуляция, вестибулярный аппарат, волосковые клетки, глутамат, опиатные рецепторы. Antibacterial peptides defensins display multifunctional activity. Our previous study revealed a modulating effect of rabbit and human (HNP-1) defensins on afferent synaptic transmission in the vestibular epithelium of the frog. The current study investigated the possible involvement of the opiate receptors in defensin modulation of glutamatergic synaptic transmission. Hair cell synaptic transmission was examined using the methods of electrophysiological recording of multiunit nerve fibers activity and externally applied drugs. Specific agonist μ-opioid receptor (OR) DAGO (0,1–100 μM) and specific agonist κ-OR U-50448 (1 nM — 10 μM) decreased the level of background discharge in the afferent fibers. The resting activity was increased during application of specific antagonist κ-OR nor-Binaltorphimine (nor-Bin) in concentration 0,01–10 μM. Specific antagonist μ-OR CTAP (0,01–1 μM) provided two-phase positive-negative action. Application of specific agonist δ-OR DSLET (0,1–10 μМ) and antagonist δ-OR naltrindole (1 nm-10 μM) did not modify the resting activity. CTAP (100 nm) and nor-Bin (10 μМ) antagonized the depressive effect of HNP-1 (1 nm), supporting the evidence for competitive interaction of HNP-1 and μ- and κ-opioid receptor ligands. The results obtained suggest that the immune system can modulate afferent synaptic transmission of the vestibular epithelium of the frog. Cross talk between glutamatergic and immune system by means of μ-and κ-opiate receptor subtypes is discussed. Key words: defensins; neuromodulation; hair cells; opiate receptors, vestibular, glutamate. Введение. Дефенсины — низкомолекулярные эндогенные пептиды, относятся к классу природных антибиотиков, обладающих широким спектром антибактериальной активности. Дефенсины выделены из тканей бактерий, грибов, насекомых, членистоногих, амфибий, млекопитающих и растений. Характерной чертой природных антибиотиков позвоночных животных является то, что они не обладают 98 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 антигенной специфичностью, но быстро транспортируются лейкоцитами в место воспаления и высвобождаются из нейтрофилов путем экзоцитоза. Механизму антимикробного действия дефенсинов посвящена обширная литература. Считается, что дефенсины вследствие электростатического притяжения контактируют с отрицательно заряженной липидной мембраной патогена, перфорируют ее и формируют проницаемый для ионов канал [1]. Дефенсины обладают полифункциональными свойствами: они, являясь ключевыми компонентами врожденного и приобретенного иммунитета, участвуют в запуске процесса воспаления и проявляют иммунорегуляторное действие [2, 3]. Отмечено участие дефенсинов в процессах аналгезии [4] и их взаимодействие с рецепторами адренокортикотропина [5]. Дефенсины активируют процесс секреции гистамина из тучных клеток [6], инициируют деление эпителиальных клеток дыхательных путей и выделение из них цитокинов, угнетают синтез глюкокортикоидов [7, 8], регулируют сокращение гладкой мускулатуры сосудов [9], понижают эффективный заряд активационной воротной системы [10], стимулируют заживление ран [11], регенерацию нервных волокон [12] и другие процессы. Изучение влияния дефенсина HNP-1 человека на функциональную активность вестибулярного эпителия представляло для нас особый интерес в связи со специфичностью морфологической и функциональной организации волосковых клеток и их высокой ототоксичностью к целому ряду веществ [13, 14]. Периферический отдел вестибулярной системы состоит из утрикулюса, саккулюса и трех полукружных каналов. Сенсорным элементом вестибулярного эпителия является волосковая клетка, синаптически контактирующая с афферентным нервным волокном. На волосковых клетках оканчиваются эфферентные волокна, по которым поступают сигналы из центральной нервной системы. В настоящее время накоплены многочисленные данные о том, что наиболее вероятным нейропередатчиком в афферентном синапсе вестибулярного аппарата является глутамат, а его действие осуществляется посредством сопряженной работы ионотропных и метаботропных глутаматных рецепторов [15–17]. Принято считать, что функционирование синапса определяется совместной работой нейромедиатора и нейромодуляторов [15, 18, 19]. В наших предыдущих электрофизиологических экспериментах in vitro в условиях внешней перфузии вестибулярного аппарата лягушки при помощи метода регистрации импульсной активности нерва, контактирующего с ampula posterior, впервые было доказано влияние дефенсина кролика и человека (HNP-1) на синаптичес- кую передачу между волосковой клеткой и афферентным нервным волокном. HNP-1 в зависимости от концентрации (10-13–10-9 М) угнетал частоту фоновой активности афферентных волокон и понижал амплитуду ответов, вызванных аппликацией L-глутамата и его агонистов: АМPА (1 мкмоль), NMDA (10 мкмоль), каината (1 мкмоль) и trans-АСPD (10 мкмоль), но не ацетилхолина. Антагонист ацетилхолина атропин не изменял ингибирующего действия дефенсина. Эти данные позволили сделать вывод, что в вестибулярном эпителии HNP-1 модулировал синаптическую передачу афферентного глутаматэргического синапса и не оказывал влияния на эфферентный холинергический синапс. Постсинаптическое действие дефенсина в глутаматэргическом синапсе подтверждалось в опытах с блокадой выделения медиатора пресинаптической мембраной в гипермагниевом/гипокальциевом растворе. В данных экспериментальных условиях дефенсин ингибировал восстановленный уровень активности афферентного волокна, вызванный аппликацией глутамата (1 ммоль), что свидетельствовало о постсинаптическом действии дефенсина. Для изучения механизма этого действия была использована выдвинутая нами гипотеза о возможном участии опиоидной системы в ингибирующем действии исследуемого природного антибиотика. Нашими предыдущими исследованиями было установлено, что опиоидная система оказывает модулирующее действие на процесс глутаматэргической синаптической передачи в вестибулярном эпителии [18, 20]. Действительно, антагонист опиатных рецепторов налоксон уменьшал депрессивный эффект дефенсина и возвращал импульсацию к первоначальному уровню, что свидетельствовало об участии опиатных рецепторов в ингибирующем действии HNP-1. Учитывая, что опиатные рецепторы являются гетерогенной популяцией рецепторов и представлены μ- δ- и κ-подтипами, задачей настоящего исследования было выяснение, какие именно подтипы опиатных рецепторов взаимодействуют с дефенсином. Материалы и методы исследования. Эксперименты выполняли на лягушках Rana temporaria массой около 20 г. В работе использовано 61 животное, в каждой серии экспериментов проведено от 4 до 16 опытов. Препаровку иссеченной хрящевой капсулы с лабиринтом проводили в перфузионной камере под контролем бинокулярного микроскопа при непрерывной перфузии раствором перилимфы комнатной температуры следующего состава (в ммоль): NaCl — 105; KCl — 2,5; NaHCO3 — 3,4; NaH2PO3•H2O — 0,5; Na2HPO4•7H2O — 2,5; CaCl2 — 1,8; глюкоза — 4,0. Вещества растворяли МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 в указанном растворе в необходимых концентрациях при рН 7,4. Аппликацию исследуемых растворов осуществляли методом внешней перфузии. При этом полная замена раствора в камере происходила примерно за 40 секунд. Подачу исследуемых растворов осуществляли не ранее чем через 30 мин после окончания препаровки и после полной стабилизации уровня импульсной активности. Для анализа использовались только препараты со стабильным уровнем фоновой активности. В опытах применяли следующие вещества: L-глутамат, специфические агонист μ-опиатных рецепторов DAGO ([D-Ala2, N-Ме-Phe4, Gly5-оl]- Enkephalin) и μ-антагонист СТAP (DPhe-Cys-Tyr-D-Тyr-Аrg-Тhr-Pen-Тhr-NH2), специфические агонист δ-опиатных рецепторов DSLET ([D-Ser2, Leu5, Thr6]-Enkephalin) и δ-антагонист налтриндол, специфические агонист κ-опиатных рецепторов U-50488 и антагонист κ-опиатных рецепторов nor-Binaltorphimine (nor-Bin). Регистрацию суммарной импульсной активности афферентных волокон, контактирующих с рецепторным эпителием заднего полукружного канала (ampulla posterior), осуществляли при помощи засасывающего стеклянного электрода с диаметром кончика 100–300 мкмоль. Величина диаметра кончика 99 диапазоне, ее первоначальное значение в каждом опыте выбиралось произвольно, т. е. оно служило точкой отсчета, относительно которой оценивали эффекты исследуемых веществ (% к фону). После окончания эксперимента на основании полученного цифрового материала с помощью пакета программ MS-Excel производилось построение графиков изменения частоты импульсной активности во времени при действии исследуемых веществ. Каждая точка на графике является усредненным значением частоты афферентной импульсной активности, регистрируемой за 10 с. Оценку достоверности результатов экспериментов проводили при помощи парного t-теста. Результаты и их обсуждение. Афферентные нервные волокна, иннервирующие вестибулярные органы, характеризуются фоновой активностью, которая отражает процесс спонтанного выделения глутамата пресинаптической мембраной [15]. Поэтому регистрация изменений уровня импульсной активности при аппликации различных химических агентов позволяет оценивать их влияние на синаптическую передачу в аминокислотном синапсе. Изучение влияния агониста μ-опиатных рецепторов проводили в диапазоне концентраций 0,05–100 мкмоль. В большинстве экспериментов пороговая концентрация DAGO составляла около 0,01 мкмоль. Рис. 1. Влияние специфического агониста μ-опиатных рецепторов DAGO на уровень фоновой активности в афферентном синапсе заднего полукружного канала лягушки: a — тормозные эффекты, наблюдаемые в одном типичном эксперименте, при действии следующих концентраций DAGO: 1–0,1 мкмоль; 2–5 мкмоль; 3–10 мкмоль. На данном рисунке, а также на рис. 2a, 3a, 4a и 5: по оси абсцисс — время, с; по оси ординат — частота импульсной активности, имп/с; б — кривая доза–ответ DAGO в афферентном синапсе вестибулярного аппарата лягушки. Эффекты DAGO представлены в виде относительного подавления фоновой импульсации (%) к фону. Каждая точка представлена средним значением и стандартной ошибкой (n=8–10). По оси абсцисс — концентрация, мкмоль; по оси ординат — относительное подавление фоновой импульсации, %. Уровень фоновой импульсной активности принят за 100%. электрода подбиралась в соответствии с диаметром вестибулярного нерва. Использовался усилитель биопотенциалов, изготовленный в лабораторных условиях. Импульсную активность контролировали на экране катодного осциллоскопа, параллельно преобразовывали в прямоугольные импульсы длительностью 2 мс и в течение всего эксперимента регистрировали на компьютере при помощи оригинальной программы. Поскольку частота импульсной активности вестибулярного нерва варьировала в широком Аппликация DAGO сопровождалась зависимым от концентрации уменьшением частоты фоновой активности и увеличением длительности ответа. Статистический анализ показал, что кривая доза-ответ была линейной в диапазоне концентраций 0,1–10 мкмоль. В наших экспериментах максимальный ингибирующий эффект достигался при концентрации 10 мкмоль и составлял 42,2% (рис. 1). В некоторых экспериментах тормозной фазе ответа предшествовала небольшая позитивная фаза. 100 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 Перфузия препарата специфическим антагонистом μ-опиатных рецепторов СТАP (0,01–1000 нмоль) приводила к двухфазному позитивно-негативному изменению частоты фоновой активности. Первая фаза ответа была возбуждающей, небольшой по амплитуде, а в некоторых опытах отсутствовала. Вторая тормозная фаза ответа сменялась фазой «отдачи» при окончании аппликации СТАP и началом перфузии нормальным раствором. Для того чтобы отразить изменение амплитуды обеих фаз ответа, за величину реакции принимали разность максимального и минимального значения частоты импульсной активности в процентах относительно фонового уровня. Из анализа результатов следует, что увеличение амплитуды ответа зависело от концентрации СТАP. Обращает на себя внимание более быстрый рост амплитуды второй негативной фазы (рис. 2). Специфический антагонист κ-опиатных рецепторов nor-Bin в зависимости от концентрации увеличивал уровень фоновой активности, который возвращался к исходному уровню в нормальном растворе (рис. 4). Статистический анализ данных показал, что потенцирующее влияние nor-Bin в диапазоне концентраций 0,01–10 мкмоль зависело от концентрации антагониста и достигало 60±6,4% (р<0,05, n=16) от первоначального уровня (рис. 4). Таким образом, наши опыты показали, что в вестибулярном эпителии лягушки модулирующее влияние опиоидной системы на глутаматэргическую синаптическую передачу осуществляется посредством μ- и κопиатных рецепторов. Для того чтобы выявить, какие подтипы опиатных рецепторов могут взаимодействовать с дефенсином исследовали влияние антагонистов μ- и κопиатных рецепторов на ингибирующее действие Рис. 2. Влияние специфического антагониста μ-опиатных рецепторов СТАP на синаптическую передачу в рецепторных органах полукружных каналов лягушки: а — эффекты СТАP, наблюдаемые в одном типичном эксперименте, при действии следующих концентраций препарата: 1 — 10-10 М; 2 — 10-9 М; 3 — 10-8 М; 4 — 10-7 M; 5 — 10-6 M; б — кривая доза–ответ СТАP в афферентном синапсе вестибулярного аппарата лягушки. Эффекты СТАP представлены в виде разности максимального и минимального значений частоты импульсной активности при действии СТАР относительно фонового уровня. Каждая точка представлена средним значением и стандартной ошибкой (n=4–5). По оси абсцисс — концентрация, нмоль; по оси ординат — величина реакции относительно уровня фоновой импульсации, %. Уровень фоновой импульсации принят за 100%. Аппликация специфических агониста δ-опиатных рецепторов DSLET (0,1 нмоль — 10 мкмоль) и антагониста δ-опиатных рецепторов налтриндола (1 нмоль — 10 мкмоль) не оказывала статистически достоверных изменений уровня фоновой активности, в связи с чем данные на приводим. Специфический агонист κ-опиатных рецепторов U-50488 уменьшал уровень фоновой активности. В широком диапазоне концентраций (0,001–1 мкмоль) депрессивный эффект U-50488 выходил на плато и составлял 20–25%, а при концентрации агониста 10 мкмоль достигал 37,4±16,6% (р<0,05 n=5–6). Наблюдаемые изменения были обратимы в нормальном растворе. Типичное влияние различных концентраций U-50488 на фоновую активность афферентных волокон в одном типичном эксперименте и суммарные данные по влиянию U50488 представлены на рис. 3. HNP-1. В наших экспериментах аппликация дефенсина вызывала уменьшение частоты фоновой активности афферентных волокон. Последующее добавление к раствору дефенсина растворов антагонистов μ- и κ-опиатных рецепторов СTAP (1 нмоль) или nor-Bin (1 нмоль) восстанавливало первоначальный уровень активности. Во всех опытах по окончании аппликации nor-Bin наблюдалось увеличение частоты фоновой активности выше исходного, что, вероятно, связано с усиленным выделением медиатора (рис. 5). Полученные данные свидетельствуют о конкурентном взаимодействии дефенсина и опиатных антагонистов и об участии опиатной системы в ингибирующем эффекте дефенсина. Принято считать, что в нормальных условиях гомеостазис внутреннего уха поддерживается за счет иммунной системы, составной частью которой являются антимикробные пептиды, такие как дефенси- МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 ны. Они, представляя собой медиаторы воспаления и иммунного ответа, концентрируются главным образом в месте воспаления в микромолярных концентрациях и перфорируют мембрану антигена [4]. Как указывалось ранее, дефенсины обладают полифунк- 101 действовать на возбудимые мембраны и синаптическую передачу. Эта гипотеза косвенно подтверждается данными о присутствии в тканях мозга кролика пептида кортикостатина, принадлежащего семейству дефенсинов [21]. Рис. 3. Влияние специфического агониста κ-опиатных рецепторов U-50488 на уровень фоновой активности в полукружных каналах лягушки: а — эффекты U-50488, наблюдаемые в одном типичном эксперименте, при действии следующих концентраций препарата: 1 — 10-8 моль; 2 — 10-7 моль; 3 — 10-6 моль; б — кривая доза–ответ U-50488. Модулирующее влияние U-50488 представлено относительно фонового уровня активности, принятого за 100%. Каждая точка представлена средним значением и стандартной ошибкой (n=5–6). По оси абсцисс — концентрация, нмоль; по оси ординат — величина реакции относительно уровня фоновой импульсации, %. Рис. 4. Влияние специфического антагониста κ-опиатных рецепторов nor-Bin на уровень фоновой активности афферентного синапса заднего полукружного канала лягушки: а — потенцирующий эффект различных концентраций nor-Bin, наблюдаемый в одном типичном эксперименте: 1 — 10-7 моль; 2 — 10-6 моль; 3 — 10-5 моль; б — кривая доза–ответ nor-Bin в афферентном синапсе вестибулярного аппарата лягушки. Эффекты nor-Bin представлены относительно уровня фоновой импульсации, принятого за 100%. Каждая точка представлена средним значением и стандартной ошибкой (n=16). По оси абсцисс — концентрация, нмоль; по оси ординат — величина реакции относительно уровня фоновой импульсации, %. Рис. 5. Конкурентное взаимодействие дефенсина HNP-1 cо специфическими антагонистами μ-опиатных рецепторов CTAP и κ-опиатных рецепторов nor-Bin. Записи двух экспериментов. По оси абсцисс — время, секунды: по оси ординат — частота фоновой активности, имп./с. циональной активностью, которая может, вероятно, запускаться за счет механизмов, отличных от антимикробного. Вполне логично предположить, что вне зоны активного воспаления дефенсины могут находиться в тканях в более низких концентрациях и воз- Данные литературы о воздействии дефенсинов на возбудимые мембраны, к сожалению, пока крайне ограничены. На культивируемых изолированных нейронах спинальных ганглиев при помощи метода патч-клампа показано, что дефенсин NP-1 изменяет 102 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 эффективный заряд активационной воротной системы тетродотоксиннечувствительных натриевых каналов со стехиометрией 1 : 1, а антагонист опиатных рецепторов налтрексон не оказывает влияния на наблюдаемый эффект [10]. На основании этих данных авторы предполагают, что NP-1 связывается со специализированным мембранным рецептором дефенсина. Важно отметить, что различные дефенсины обладают различной способностью к модуляции натриевых ионных токов, что предполагает вовлечение различных механизмов в регуляцию возбудимости мембран [22]. Данные о существовании мембранного рецептора, специфически связывающего дефенсин, получены при изучении механизмов модулирующего влияния α-дефенсина на сокращение гладкой мускулатуры аорты крысы [9]. В этих экспериментах дефенсин при концентрациях ниже патологических специфически взаимодействует с липопротеином низкой плотности, связанным с рецептором протеина/α2макроглобулина, что приводит к взаимодействию с протеинкиназой С (PKC), уменьшению содержания внутриклеточного Са2+ и ингибированию сокращения гладкой мускулатуры Данные литературы о локализации и функции дефенсинов во внутреннем ухе крайне ограничены. Мун и соавт. [23] выявили β-дефенсин в эпителиальных клетках внутреннего уха и показали, что его экспрессия запускается интерлейкином-1α. В нашем предыдущем исследовании [24] проводилось сравнительное изучение влияния аминогликозидного антибиотика гентамицина и дефенсинов кролика и человека на синаптическую передачу в глутаматэргическом синапсе вестибулярного аппарата лягушки. Показано, что дефенсины кролика и человека в равной степени ингибируют уровень фоновой активности афферентных волокон. Последнее свидетельствует об отсутствии видоспецифичности исследуемых внутренних антибиотиков в процессе модуляции синаптической передачи. Депрессивный эффект дефенсинов был насыщаем при наномолярных концентрациях, а характер кривой подавления импульсной активности был сходен с таковой лей-энкефалина, но резко отличен от гентамицина [18, 25]. Далее нами было показано, что дефенсин ингибирует ответы на глутамат, АМРА, NMDA, каинат и trans-ACPD, что свидетельствует о том, что депрессивный эффект дефенсина распространяется на все подтипы глутаматных рецепторов. Участие опиоидной системы в тормозном действии дефенсина подтверждалось в двух сериях экспериментов. В первой из них налоксон уменьшал ингибирующее действие дефенсина. Во второй — депрессивный эффект дефенсина нивелировался действием налоксона [25]. Принято считать, что опиатные рецепторы проявляют достаточно высокую степень консервативности в филогенезе. В частности, высокое сходство всех трех подтипов опиатных рецепторов у млекопитающих и у лягушек доказано при помощи метода радиолигандного связывания специфических агонистов опиатных рецепторов с гомогенатом мозга лягушки [26]. Это позволило нам использовать специфические агонисты и антагонисты опиатных рецепторов, применяемые у млекопитающих, для идентификации опиатных рецепторов в вестибулярном эпителии лягушки. Наши опыты показали, что глутаматэргическая синаптическая передача может модулироваться только μ- и κ-опиатными рецепторами. Действительно, только агонисты и антагонисты μ- и κ-, но не δ-опиатных рецепторов статистически достоверно изменяют уровень фоновой активности афферентных волокон. Тот факт, что СТАP понижал восстановленный глутаматом уровень активности после блокады синаптической передачи в гипермагниевом/гипокальциевом растворе, позволил сделать вывод о постсинаптической локализации μопиатных рецепторов, что не исключает возможность их расположения и на волосковой клетке [27]. Результаты наших экспериментов и данные литературы позволяют сделать вывод о модуляции глутаматэргической синаптической передачи κ- и μ-опиатными рецепторами на пре- и постсинаптическом уровне соответственно. Результаты наших экспериментов соответствуют данным Вега и Сото [19], полученным на вестибулярном эпителии аксолотля, где также были идентифицированы только μ- и κ-опиатные рецепторы. Авторы также приходят к выводу о постсинаптической локализации μ-опиатных рецепторов на основании того, что агонист μ-опиатных рецепторов DAGO не оказывал влияния на ток, регистрируемый от волосковых клеток, но модулировал ответ АМРА после блока пресинаптической мембраны. Напротив, пресинаптическая локализация κ-опиатных рецепторов доказана при помощи регистрации токов Са2+ от изолированных волосковых клеток. Из всех тестируемых агонистов и антагонистов опиатных рецепторов только U-50488 уменьшал выходящий ток Са2+. Ни в наших экспериментах, ни в экспериментах на аксолотле не удалось выявить влияния специфических лигандов опиатных рецепторов на холинергические рецепторы, что исключает влияние эфферентной системы на исследуемый процесс. Локализации различных подтипов опиатных рецепторов в структурах внутреннего уха выявлены и у млекопитающих [28, 29]. Три классических подтипа опиатных рецепторов идентифицированы МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 в улитке крысы при помощи иммуноцитохимических и молекулярно-генетических методов [29]. Нервные волокна, содержащие μ-, κ- и δ-подтипы рецепторов, обнаружены в биполярных клетках и нервных волокнах внутри спирального ганглия, а нервные волокна, содержащие μ-, и κ-подтипы рецепторов, наблюдались в лимбических структурах. Только δи κ-иммунореактивность обнаружена во внутренних и наружных волосковых клетках, биполярных клетках спирального ганглия и интедентальных клетках лимбических структур. Постсинаптическая локализация μ-опиатных рецепторов подтверждена и в опытах на вестибулярном эпителии крыс [28]. При помощи молекулярно-генетических и иммуноцитохимических методов показано, что иммунореактивность к μ-опиатным рецепторам была выявлена в телах ганглиозных клеток, в каликсе, в диморфных и бутонообразных окончаниях, контактирующих с волосковыми клетками. μ-Иммунореактивность отсутствовала в вестибулярных эфферентных волокнах, идентифицированных с помощью холин/ацетилхолинтрансферазной иммунореактивности. Приведенные данные цитируемых авторов свидетельствуют об особенностях модуляции сигнала во внутреннем ухе у амфибий и млекопитающих. Участие опиоидной системы в модуляции глутаматэргической синаптической передачи описано для нейронов спинного мозга, где показано, что изменение взаимодействия глутамата с мембраной в присутствии мет-энкефалина осуществляется без изменения афинности, но за счет уменьшения числа мест связывания глутамата с мембраной [30]. Аналогичный механизм активации μ-опиатных рецепторов на постсинаптической мембране можно предположить и для дефенсина, так как показано его конкурентное взаимодействие с налоксоном и СTAP. Поскольку HNP-1 вытесняется антагонистом κ-опиатных рецепторов nor-Bin, можно предположить, что исследуемый антибиотик оказывает модулирующее влияние на выделение медиатора из пресинаптической мембраны волосковой клетки посредством взаимодействия с κ-опиатными рецепторами. Показано, что агонист κ-опиатных рецепторов вызывает уменьшение тока ионов Са2+ [19], а L-тип кальциевых каналов 103 связан с выделением медиатора в волосковых клетках [31–33]. Для подтверждения гипотезы о влиянии дефенсина на токи ионов Са2+ в волосковых клетках требуются дальнейшие исследования. Сейчас уже накоплены многочисленные данные о взаимном влиянии опиоидной и иммунной систем. Опиоиды могут активировать экспрессию цитокинов и модулировать активность иммунной системы [34–37]. Наши данные и литературные источники позволяют сделать вывод о том, что опиатные рецепторы могут не только взаимодействовать с эндогенными лигандами опиатных рецепторов, но и активироваться цитокинами и эндогенными антибиотиками. Взаимодействие опиатных рецепторов и воспалительного цитокина интерферона-α показано для центральной нервной системы. При помощи радиолигандного метода доказано связывание интерферона-α с опиатными рецепторами [38, 39]. Локально вызываемое воспаление в спинном мозге приводит к усиленной экспрессии μ-опиатных рецепторов на мембранах нейронов [40], а ноцицептивный эффект медиатора воспаления интерферона-α блокируется налоксоном. Интегративная деятельность ИА на центральную нервную систему описана в обзоре Е. В. Лосевой и соавт. [41], где, в частности, выявлено модулирующее влияние интерферона-α на функции возбудимых мембран посредством опиатных рецепторов в различных отделах мозга. Особое внимание уделяется данным литературы о том, что ИА может оказывать различные модулирующие влияния на нейроны: возбуждающее, которое связывают с активацией δ- и κ-опиатных рецепторов и которое может быть блокировано налоксоном, тормозное, связанное с участием μ-опиатных рецепторов и нивелируемое налоксоном, а также активирующее, которое не менялось в присутствии налоксона [41, 42]. Наши данные позволяют сделать вывод, что иммунная система может осуществлять контроль афферентного потока в вестибулярных органах посредством дефенсина HNP-1. Модуляция глутаматэргической синаптической передачи осуществляется на пре- и постсинаптическом уровне с участием κ- и μ-опиатных рецепторов при помощи механизма, отличного от антимикробного. Литература 1. Lerher R. I., Lichtenstein A. K., Ganz T. Defensins: antimicrobial and cytotoxic peptides of mammalian cells // Ann. Rev. Immunol.— 1993.— Vol. 11.— P. 105–128. 2. Raj P. A., Dentino A. R. Current status of defensins and their role in innate and adaptive immunity // FEMS Microbiology Let.— 2002.— Vol. 206.— P. 9–18. 3. Risso A. Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity // J. Leukoc. Biol.— 2000.— Vol. 68.— P. 785–792. 104 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 4. Young D., Biragyn A., Kwak L. W. et al. Mammalian defensin in immunity: more than just microbial // Trands Immunol.— 2002.— Vol. 23, № 6.— P. 291–296. 5. Bateman A., MacLeod R. J., Lembessis P. et al. The isolation and characterization of a novel corticostatin/defensin-like peptide from kidney // J. Biol. Chem. 1996.— Vol. 271.— P. 10654–10659. 6. Befus A. D., Mowal C., Gilchrist M. et al. Neutrophil defensins induce histamin secretion from mast cells: mecanism of action // J. Immunol. 1999. Vol 163. P 947–953. 7. Oppenheim J. J., Biragyn A., Kwak L. W. et al. Roles of antimicrobial peptides such as defensins in innate and adaptive immunity // Ann. Rheum. Dis.— 2003.— Vol. 62.— P. ii17–ii21. 8. Wetering van S., Mannesse-Lazeroms S. P. G., Stekenburg van M. A. J. A. et al. Neutrophil defensins stimulate the release of cytokines by airway epithelial cells: modulation by dexamethasone // Inflame. Res.— 2002.— Vol. 51.— P. 8–15. 9. Nassar T., Akkawi S., Bar-Shavit R. et al. Human defensin regulates smooth muscle cell contraction: a role for low-density lipoprotein receptorrelated protein/ 2-macroglobulin receptor // Blood.— 2002.— Vol. 100, № 12.— P. 4026–4032. 10. Plakchova V. B., Shchegolev B. F., Rogachevskii I. V. et al. A possible molecular mechanism for the interaction of defensin with the sensory neuron membrane // Neurosci. and Behav. Physiol.— 2002.— Vol. 32, № 4.— P. 409–415. 11. Gudmundson G. H., Agerberth B. Neutrophil antibacterial peptides, multifunctional effecter molecules in the mammalian immune system // J. Immunol. Methods.— 1999.— Vol. 232.— P. 45–54. 12. Nozdrachev A. D., Kolosova L. I., Moiseeva A. B., Ryabchikova O. V. The role of defensin NP-1 in restoring the functions of injured nerve trunk // Neurosc. and Behav. Physiol.— 2006.— Vol. 36, № 3.— P. 313–315. 13. Hawkins J. E. Drug Ototoxicity // Handbook of Sensory Physiology / еds.: W. D. Keidel, W. D. Neff.— Berlin: Springer, 1976.— P. 707–748. 14. Llorens J., Dememes D. Hair cell degeneration resulting from 3,3’-imminodipropionitrile toxicity in the rat vestibular epithelia // Hear. Res.— 1994.— Vol. 76.— P. 78–86. 15. Guth P. S., Perin P., Norris C. H. et al. The vestibular hair cells: post-transductional signal processing // Progr. Neurobiol.— 1998a.— Vol. 54.— P. 193–247. 16. Guth P. S., Holt J. C., Perin P. et al. The metabotropic glutamate receptors of the vestibular organs // Hear. Res.— 1998b.— Vol. 125.— P. 154–162. 17. Andrianov G. N., Puyal J., Raymond J. et al. Immunocytochemical and pharmacological characterization of metabotropic glutamate receptors of the vestibular end organs in the frog // Hear. Res.— 2005.— Vol. 204.— P. 200–209. 18. Andrianov G. N., Ryzhova I. V. Opioid peptides as possible neuromodulators of the afferent synaptic transmission in the frog semicircular canal // Neurosci.— 1999.— Vol. 93.— P. 801–806. 19. Vega R., Soto E. Opioid receptors mediate a postsynaptic facilitation and a presynaptic inhibition at the afferent synapse of axolotl vestibular hair cells // Neurosci.— 2003.— Vol. 118.— P. 75–85. 20. Andrianov G. N., Ryzhova I. V. Lack of evidence of an interaction between leu-enkephalin and muscarinic-like responses in the frog semicircular canal // Neurosignals.— 2003.— Vol. 12.— P. 310–314. 21. Tominada T., Fukata J., Hayashi Y. et al. Distribution and characterization of immunoreactive corticostatin in the hypothalamic-pituitary-adrenal axis // Endocrinilogy.— 1992.— Vol. 130, № 3.— P. 1593–1598. 22. Плахова В. Б., Рогачевский И. В., Щеголев Б. Ф. и др. Дефенсин NP-4 уменьшает потенциалочувствительность медленных натриевых каналов сенсорных нейронов // Сенс. сист.— 2005.— Т. 19, № 2.— С. 122–129. 23. Moon S.-K., Lee H.-Y., Li J.-D. et al. Activation of a Src-dependent Raf-MERK1/2ERK signaling pathway is required for IL-1A-induced upregulation of β-defensin 2 in human middle ear epithelial cells // Biochimica et Biophysica Acta (BBA).— 2002.— Vol. 1590.— P. 41–51. 24. Андрианов Ю. Н., Ноздрачев А. Д., Рыжова И. В. Сравнительный анализ влияний аминогликозидного антибиотика дефенсина NP-1 и аминогликозидного антибиотика гентамицина на синаптическую передачу в рецепторах вестибулярного аппарата лягушки // Известия РАН. Серия биологическая.— 2007.— № 6.— С. 705–710. 25. Andrianov G. N., Nozdrachev A. D., Ryzhova I. V. The role of defensins in the excitability of the peripheral vestibular system in the frog: Evidence for the presence of communication between the immune and nervous systems // Hear. Res.— 2007.— Vol. 230.— P. 1–8. 26. Newnan L. C., Steven S., Sands S. et al. Characterization of μ-κ- and δ-opioid binding in amphibian whole brain tissue homogenates // J. Pharmacol. and Exp. Therap.— 2002.— Vol. 301, № 1б.— P. 364–370. 27. Андрианов Ю. Н., Рыжова И. В., Тобиас Т. В. Участие мю-опиатных рецепторов в нейромодулирующей функции опиоидных пептидов в периферических структурах вестибулярной системы лягушки // Сенс. сист.— 2010.— Т. 24, № 3.— С. 233–241. 28. Popper P., Cristobal R., Wackym P. A. Expression and distribution of mu opioid receptors in the inner ear of the rat // Neurosci.— 2004.— Vol. 129.— P. 225–233. 29. Jongkamonwiwat N., Phansuwan-Pujito P., Sarapoke P. et al. The presence of opioid receptors in rat inner ear // Hear Res.— 2003.— Vol. 181.— P. 85–93. МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 105 30. Kuznetsov V. I., Godukhin O. V. Mechanism of methionin-enkephalin modulation of glutamatergic transmission in the rat striatum // Neurosci. Lett.— 1985.— Vol. 57, № 2.— P. 143–146. 31. Martinez-Dunst C., Michaels R. L., Fuchs P. A. Release sites and calcium channels in hair cells of the chik’s cochlea // J. Neurosci.— 1997.— Vol. 17.— P. 9133–9144. 32. Martini M., Rossi M. L., Rubbini G. et al. Calcium currents in hair cells isolated from semicircular canals of the frog // Biophysical J.— 2000.— Vol. 78, March.— P. 1240–1254. 33. Perin P., Soto E., Vega R. et al. Calcium channels function roles in the frog semicircular canal // NeuroReport.— 2000.— № 11.— P. 417–420. 34. Im H.-J., Kang S.-W., Loh H. H. Opioid receptor gene: cytokine response element and the effect of cytokines // Brain Res.— 1999.— № 829.— P. 174–179. 35. McCarthy L., Wetzel M., Sliker J. K. et al. Opioids, opioid receptors and the immune response // Drug Alcohol Depend.— 2001.— Vol. 62.— P. 111–123. 36. Salzet M., Tasiemski A. Involvement of pro-enkephalin-derived peptides in immunity // Dev. Comp. Immunol.— 2001.— Vol. 25.— P. 177–185. 37. Rogers T. J., Peterson P. K. Opioid G protein-coupled receptors: signals at the crossroads of inflammation // Trend. Immunol.— 2003.— Vol. 24.— P. 116–121. 38. Aguet M. High affinity binding of 125I-labeled mouse interferon to specific cell surface receptors // Nature.— 1980.— Vol. 284.— P. 459–461. 39. Алябьева Т. Н., Балашов А. М., Панченко Л. Ф. Различное влияние α-интерферона на μ- и δ опиатные рецепторы головного мозга крыс // Нейрохимия.— 1988.— Т. 7, № 1.— С. 3–15. 40. Ninkovic M, Hunt S. P., Gleave J. R. W Localization of opiate and histamine H1 receptors in the primary sensory ganglia and spinal cord // Brain Res.— 1982.— Vol. 241.— P. 197–206. 41. Лосева Е. В., Логинова Н. А., Акмаев И. Г. Роль интерферона-альфа в регуляции функций нервной системы // Успехи физиол. наук.— 2008.— Т. 39, № 2.— С. 32–46. 42. Dafny N., Jang P. B. Interferon and central nervous system // Eur. J. Pharmacol.— 2005.— Vol. 523, № 1–3.— С. 1–15. Поступила в редакцию: 15.07.2013 г. Контакт: Рыжова Ирина Викторовна. ireneryzhova@mail.ru Подписка на 2014 год открыта Наш подписной индекс — 5 7 9 9 9 106 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 УДК 615.27:616.37-002 АГРЕГАЦИЯ ТРОМБОЦИТОВ И ДЕЙСТВИЕ АНТИОКСИДАНТОВ ПРИ ОСТРОМ ПАНКРЕАТИТЕ 1Б. Б. Бромберг, 1академик РАМН Н. А. Майстренко, 2А. Н. Тулупов, 3В. Ф. Киричук, 1Д. С. Криволапов, 1А. М. Гулько 1Военно-медицинская академия им. С. М. Кирова МО РФ, Санкт-Петербург, Россия 2Санкт-Петербургский Научно-исследовательский институт скорой помощи им. И. И. Джанелидзе, Россия 3Саратовский государственный медицинский университет им. В. И. Разумовского Минздрава России PLATELET AGGREGATION, AND EFFECT OF ANTIOXIDANTS IN ACUTE PANCREATITIS 1B. B. Bromberg, 1full member of the RAMS N. A. Maistrenko, 2A. N. Tulupov, 3V. F. Kiruchuk, 1D. S. Krivolapov, 1A. M. Gul`ko 1Kirov Military Medical Academy, St.-Petersburg, Russia 21I. I. Dzhanelidze Emergency Medical Care Institute, Saint-Petersburg, Russia 3Saratov State Medical University n. a. V. I. Razumovsky, Russia © Коллектив авторов, 2013 г. В работе изучалось влияние антиоксидантов на агрегацию тромбоцитов у больных острым панкреатитом. Основу работы составил анализ результатов обследования и лечения 174 человек. Все пациенты были разделены на три группы. Группу сравнения составили 30 практически здоровых лиц. Для изучения агрегации тромбоцитов использовали тубидиметрический метод с применением двухканального лазерного анализатора агрегации тромбоцитов «Biola 230 LA» и различные индукторы, такие как АДФ, обеспечивающий энергозависимую агрегацию тромбоцитов друг с другом, коллаген, вызывающий взаимодействие тромбоцитов между собой и с поврежденным участком сосудистой стенки, ристоцетин, активно стимулирующий адгезию тромбоцитов, а также лектины: конканавалин А (Соn А), лектин зародышей пшеницы (WGA) и фитогемагглютинин Р — РНА-Р. Проведенное исследование показало, что реамберин и цитофлавин являются препаратами, которые через реализацию антигипоксического и антиоксидантного эффекта способствуют коррекции внутрисосудистых нарушений микроциркуляции, восстанавливают агрегацию тромбоцитов и обеспечивают ее коррекцию при остром панкреатите. Ключевые слова: острый панкреатит, микроциркуляция, тромбопластиновая коагулопатия, агрегация тромбоцитов, звенья патогенеза, антиоксиданты. The present study examined the influence of antioxidants on the vascular agregation of trombocytes in acute pancreatitis patients. The analysis of the examination and treatment of 174 patients provided the basis of this work. All the patients were divided into three groups. The control group was constituted by 30 healthy individuals. Along with the routine methods of studying platelet aggregation, a new turbidimetric technique implementing a two-channel laser analyzer «Biola230 LA», was used to investigate thrombocyte functional properties, also different inductors, such as ADA, ensure the energy-dependent vascular agregation of trombocytes, collagen, caused trombocytic interaction between each others and with damaged site of vascular paries, ristocetin, taking an active part in activation of trombocytic adhesion, lecitins: Соn А, WGA и РНА-Р too. Conducted researches showed, reamberin and cytoflavin are medications, which work towards correction intravascular malfunction of microcirculation, restore vascular agregation of trombocytes and implement correction of it in acute pancreatitis patients, powered on realization of antihypoxic and antioxidantive effects. Key words: acute pancreatitis, microcirculation, thromboplastin coagulopathy, aggregation of thrombocytes, pathogenesis pathway, antioxidants. Введение. Острый панкреатит (ОП) является одной из нерешенных проблем современной медицины и занимает второе, а в некоторых регионах — первое место в структуре ургентных хирургических заболеваний [1]. По темпам роста ОП опережает другие неотложные заболевания органов брюшной полости. Помимо увеличения числа больных, имеется тенденция к возрастанию доли деструктивных форм [2], частота которых составляет 10–30%, а летальность при них достигает 60–80% [2, 3]. Стабильно высокий уровень летальности обусловлен сложным, многоуровневым патогенезом заболе- МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 вания, при этом некоторые механизмы реализации патологических реакций остаются неясными до настоящего времени. Изменения микроциркуляции в поджелудочной железе (ПЖ) и окружающих ее тканях являются важным аспектом патоэндосаногенеза этого заболевания. Ангиоспазм, венозный застой, микротромбозы, интерстициальный отек и гипоксия вызывают первичное повреждение панкреоцитов и приводят к развитию ишемического ОП. Гемодинамические нарушения появляются на ранних стадиях и сопровождают все периоды заболевания [4–6, 24]. В зависимости от формы ОП характеризуется нарушениями различной степени выраженности со стороны практически всех органов и систем, ведущими при прогрессировании заболевания к полиорганной недостаточности. Нарушения микроциркуляции являются основой развития локального воспаления и спутником системной воспалительной реакции. Важную роль в формировании комплекса сосудистых реакций играют эндотелиальная дисфункция, синдром ишемии-реперфузии, а также нарушения тромбоцитарного звена системы гемостаза, которые при данной патологии до настоящего времени изучены недостаточно полно, хотя оценка изменений активности тромбоцитов при ОП различной тяжести представляет интерес [6, 7]. Ишемия ПЖ вызывает высвобождение и активацию свободных радикалов кислорода, брадикинина и провоспалительных медиаторов, а также дисбаланс между NO и эндотелином. Эти медиаторы могут играть роль активаторов гиперкоагуляционного каскада, ведущего к тромбозу микрососудов с исходом в ишемическую гипоксию панкреатоцитов с последующим воздействием реперфузии, что завершается развитием очагового некроза. Активация процессов перекисного окисления липидов является механизмом, определяющим структурно-функциональное состояние мембран клеток. Первичное повреждение ацинарных клеток приводит к чрезмерному усилению в них процессов свободнорадикального окисления, вызывающего антиоксидантную недостаточность и неконтролируемое перекисное окисление липидов, повышению активности лизосомальных ферментов, вследствие чего происходит дальнейшее усугубление патологических процессов в ПЖ [8–10]. Местными причинами нарушения внутриорганной микроциркуляции ПЖ могут быть иммунопатологические факторы и активация аутомикрофлоры кишечника, что сопровождается увеличением вязкости крови и способствует агрегации форменных элементов, образованию микротромбов мелких сосудов, усугубляет эффект иммунопатологических реакций 107 вследствие развития гипоксии. На тромбах могут фиксироваться иммунные комплексы и антитела против ПЖ [11]. Принимая во внимание, что у больных ОП уже на ранних стадиях наблюдаются нарушения антиоксидантной активности, вплоть до развития оксидативного стресса [12], патогенетически может быть обоснованным введение лекарственных препаратов, обладающих способностью тем или иным способом снижать выраженность свободнорадикальных реакций. Данное направление лечения ОП получило достаточное экспериментальное обоснование в исследованиях на животных [13]. Однако в протоколах лечения данной патологии в Российской Федерации при обозначении перспективных направлений антиоксидантная терапия не упоминается [3, 14, 23]. Определенные сложности в этом направлении терапии создает и тот факт, что, несмотря на более чем тридцатилетнюю историю изучения роли активных форм кислорода и процессов перекисного окисления в развитии различных патологических состояний, остается крайне немногочисленным перечень антиоксидантных препаратов, вышедших за рамки экспериментальных и доклинических испытаний и использующихся в клинической практике [3, 15]. В работах ряда авторов ранее показана потенциально важная роль скорости активации тромбоцитов в патогенезе ОП. Имеются данные о связи данного параметра с развитием осложнений у больных тяжелым ОП [16, 17]. Известно, что тромбоциты участвуют не только в гемостазиологических звеньях патогенеза ОП, но и непосредственно в воспалительном процессе, в частности индукции нейтрофильной инфильтрации ПЖ [18]. Каскад патофизиологических изменений в крови также сопровождается формированием синдрома гиперкоагуляции, особенно проявляющемся при тяжелом ОП [11, 12]. Коагулопатия, включающая процессы гиперагрегации, гиперкоагуляции и др., является, вероятно, защитным механизмом (наиболее простым и надежным из всех возможных), ограничивающим генерализацию фатально опасных агентов за счет локального тромбоза сосудов. Коррекция нарушений микроциркуляции крови, наряду с противовоспалительной терапией, является ключевым аспектом современного подхода к лечению ОП, направленным на снижение летальности при данной патологии [24]. Известно, что у больных ОП отмечается истощение собственных механизмов антиоксидантной защиты в организме [3]. Значимая роль в патогенезе ОП процессов пероксидации является патогенетическим обоснованием важности антиоксидантной терапии в лечении данного заболевания [3, 6, 12, 19]. 108 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 Можно полагать, что своевременное применение антиоксидантов на ранних стадиях ОП позволит в значительной степени снизить активность процессов перекисного окисления липидов, накопление его продуктов, восстановить недостаточность антиоксидантной системы, затормаживая прогрессирование заболевания [15, 16]. Например, показаны перспективы применения таких веществ, обладающих в том числе и антиоксидантной активностью, как ликопин, таурин, лавсон и другие, для лечения ОП [15]. Однако в ряде рандомизированных исследований применение антиоксидантов при ОП не оказало значимого влияния на смертность, что делает спорной обоснованность использования данных препаратов в лечении ОП относительно других, позитивно зарекомендовавших себя средств [20]. Цель исследования: изучить влияние антиоксидантов на агрегацию тромбоцитов у больных ОП in vitro и обосновать возможность использования при комплексном лечении. Материалы и методы исследования. Основу работы составил анализ результатов обследования и лечения 174 человек. Все пациенты были разделены на три группы. В 1-ю группу включены 74 пациента с тяжелым ОП, во 2-ю — 70 больных нетяжелым (легким) панкреатитом. Группу сравнения составили 30 здоровых лиц. Распределение больных ОП по полу и возрасту проводилось в соответствии с классификацией ВОЗ 1963 года (табл. 1). Так как тромбоцитарное звено гемостаза относится к числу систем «быстрого реагирования» на воздействия экзо- и эндогенных факторов, в том числе патогенных, тромбоциты являются удобным объектом изучения альтерации клеток организма при ОП. Для исследования функциональных свойств тромбоцитов использовался традиционный турбидиметрический метод с применением двухканального лазерного анализатора агрегации тромбоцитов «Biola 230 LA», основанный на оценке среднего размера агрегатов в реальном времени [4, 11]. Области применения лазерных анализаторов «Biola» различны. Наряду с широким перечнем они используются для диагностики состояния тромбоцитарного звена гемостаза, врожденных и приобретенных нарушений гемостаза, оценки эффективности терапии, скрининга новых лекарственных препаратов, оценки жизнеспособности тромбоцитарной массы при переливании крови, а также в токсикологии [4]. Для изучения агрегации тромбоцитов использовались различные индукторы, такие как АДФ (5 мкл — 0,1 мг/мл), обеспечивающий энергозависимую агрегацию тромбоцитов друг с другом, коллаген (5 мкл — 2 мг/мл), вызывающий их взаимодействие между собой и с поврежденным участком сосудистой стенки, и ристоцетин (5 мкл — 15 мг/мл), активно стимулирующий адгезию тромбоцитов, а также лектины (10 мкл — 32 мкг/мл) [22]. Для наиболее точной и полной идентификации углеводных компонентов тромбоцитарных гликопроÒàáëèöà 1 Ðàñïðåäåëåíèå áîëüíûõ ïî âîçðàñòó è ïîëó (n =144) Âîçðàñò, ãîäû 18–29 30–44 45–59 60–74 75–90 Èòîãî Ìóæ÷èíû àáñ. ÷èñëî 8 28 16 10 6 68 Æåíùèíû % 5,5 19,4 11,1 14,7 6,9 47,2 àáñ. ÷èñëî 10 24 24 10 8 76 Проведенное исследование было рандомизированным двойным слепым плацебоконтролируемым, клиническим, проспективным. Подтверждение диагноза ОП и тяжести течения осуществлено на основе анализа клинических, лабораторных, функциональных, лучевых и инструментальных данных, проведенных на различных этапах лечения, согласно протоколам диагностики и лечения острых хирургических заболеваний органов брюшной полости [21]. Âñåãî áîëüíûõ % 6,9 16,6 16,6 6,9 5,5 76 àáñ. ÷èñëî 32 168 281 252 55 144 % 4,06 21,32 35,66 31,98 6,98 100 теиновых рецепторов были выбраны лектины, которые представляют собой новый тип гистохимических реагентов. Их основным свойством является специфическое связывание с углеводными детерминантами тканевых и клеточных гликоконъюгатов без изменения химической структуры последних. Учитывалась их различная углеводная специфичность. Так, РНА-Р взаимодействует почти со всеми углеводными компонентами гликопротеиновых рецепторов, хотя преимущественно он связывается 109 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 с участками b-D-галактозы. WGA специфически реагирует с N-ацетил-D-глюкозамином, N-ацетилнейраминовой (сиаловой) кислотой. Con А — с манозасодержащими участками [4]. Для характеристики динамической и кинетической функции тромбоцитов были выбраны наиболее информативные показатели, характеризующие сосудисто-тромбоцитарное звено гемостаза: максимальная степень, максимальная скорость, время достижения максимальной степени, время достижения максимальной скорости агрегации тромбоцитов. В зависимости от сроков заболевания изучалась динамика агрегационной функции тромбоцитов с учетом использования вышеназванных антиоксидантов. Для коррекции нарушенной агрегации тромбоцитов использовались синтетические препараты отечественной фирмы «Полисан» реамберин и цитофлавин [3]. Анализ полученных результатов клинических исследований проводился методами математической статистики с помощью пакета прикладных программ Statistica for Windows 7.0. чный критерий Фишера. Корреляционный анализ проводили с использованием коэффициента линейной корреляции Пирсона и ранговой корреляции Спирмена. Для определения прогностической значимости признаков и исследования вида зависимости между признаками использовался регрессионный анализ. Различия считали значимыми при уровне значимости соответствующего критерия р<0,05. В тех случаях, когда проверка вида распределения анализируемых данных, проводимая с использованием критерия Шапиро–Уилка, показывала, что исследуемые показатели характеризовались нормальным распределением, для статистической обработки данных использовали параметрические статистические критерии. Для данных, закон распределения которых не соответствовал нормальному, использовались непараметрические методы. Результаты исследований. По данным эпидемиологического анализа исследуемой совокупности ОП чаще встречался у мужчин трудоспособного возраста, причем по мере старения пациентов наблюдалась тенÒàáëèöà 2 Ðàñïðåäåëåíèå îáñëåäóåìûõ â çàâèñèìîñòè îò ïîëà Ãðóïïû Íåòÿæåëûé îñòðûé ïàíêðåàòèò (n=70) Òÿæåëûé îñòðûé ïàíêðåàòèò (n=74) Ïðàêòè÷åñêè çäîðîâûå ëèöà (n=30) Èòîãî Ïîë ìóæ÷èíû æåíùèíû 32 (18,3%) 44 (25,2%) 15 (8,6%) 91 (52,2%) 38 (21,8%) 30 (17,2%) 15 (8,6%) 83 (47,7%) Рисунок. Нарушения агрегационной функции тромбоцитов у больных острым нетяжелым (а) и тяжелым (б) панкреатитом. Для анализа клинического материала создана электронная база данных (программа Microsoft Access 2000 9.0.3821 SR-1), представляющая собой табличный формализованный вариант сведений из историй болезней и протоколов вскрытий 144 пациентов. Для определения значимости различий между исследуемыми признаками, в том числе относительными единицами, использовали критерий хи-квадрат (χ2). При числе наблюдений менее 5 применяли то- денция к утяжелению процесса в ПЖ как у мужчин, так и у женщин. У женщин ОП чаще развивался в возрасте старше 60 лет, как правило, нетяжелый (табл. 2). При нетяжелом ОП в первые двое суток отмечается умеренная гиперагрегация, а концу второй недели заболевания все показатели нормализуются (рисунок). При инкубации богатой тромбоцитами плазмы с раствором для инфузий 1,5% реамберина, полученной у больных острым нетяжелым панкреатитом 110 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 в первые пять суток заболевания, наблюдали статистически значимое увеличение на 58% максимальной степени агрегации тромбоцитов по сравнению с показателем плазмы, богатой тромбоцитами больных, инкубируемой с изотоническим раствором натрия хлорида. При добавлении раствора цитофлавина в плазму больных констатировали также повышение на 27,7% указанного динамического показателя агрегации по сравнению с контрольным значением плазмы больных (табл. 3). цитофлавина — на 35% по сравнению со значениями агрегации тромбоцитов, инкубируемыми с NaCI 0,9% у больных в эти же сроки. Таким образом, у больных нетяжелым ОП максимальная степень агрегации тромбоцитов и время ее достижения частично нормализуются под действием обоих антиоксидантов. На максимальную скорость агрегации реамберин оказывает значимое влияние, а на время достижения максимальной скорости агрегации используемые антиоксиданты практически не влияют. Òàáëèöà 3 Èçìåíåíèå ïîêàçàòåëåé àãðåãàöèè òðîìáîöèòîâ, èíäóöèðîâàííîé ÀÄÔ, ó áîëüíûõ îñòðûì íåòÿæåëûì ïàíêðåàòèòîì ïðè èíêóáàöèè ñ àíòèîêñèäàíòàìè â óñëîâèÿõ in vitro (õ±s, n=20) Ïîêàçàòåëè àãðåãàöèè Ìàêñèìàëüíàÿ ñòåïåíü àãðåãàöèè, % Âðåìÿ äîñòèæåíèÿ ìàêñèìàëüíîé ñòåïåíè àãðåãàöèè, ñ Ìàêñèìàëüíàÿ ñêîðîñòü àãðåãàöèè, %/ìèí Âðåìÿ äîñòèæåíèÿ ìàêñèìàëüíîé ñêîðîñòè àãðåãàöèè, ñ a Ïðîáà Ïëàçìà+ðàñòâîð NaCI 0,9% Ïëàçìà ñ ðåàìáåðèíîì Ïëàçìà ñ öèòîôëàâèíîì Ïëàçìà+ðàñòâîð NaCI 0,9% Ïëàçìà ñ ðåàìáåðèíîì Ïëàçìà ñ öèòîôëàâèíîì Ïëàçìà+ðàñòâîð NaCI 0,9% Ïëàçìà ñ ðåàìáåðèíîì Ïëàçìà ñ öèòîôëàâèíîì Ïëàçìà+ðàñòâîð NaCI 0,9% Ïëàçìà ñ ðåàìáåðèíîì Ïëàçìà ñ öèòîôëàâèíîì 1–5-å ñóòêè çàáîëåâàíèÿ 36,8±3,4 58,0±2,9a;b 47,0±2,4 84,2±2,1 61,8±3,09a 67,8±3,3a;b 25,2±1,6 36,0±1,6a 26,7±1,3a;b 28,6±0,84 36,7±1,1a 38,8±1,14b ð<0,05 ïî ñðàâíåíèþ ñ êîíòðîëåì (ïëàçìà+ðàñòâîð NaCI 0,9%); b p<0,05 ïî ñðàâíåíèþ ñ ïðåäûäóùèì çíà÷åíèåì â ñòðîêå. Проследим динамику изменения кинетического показателя — времени достижения максимальной степени агрегации тромбоцитов под влиянием указанных антиоксидантов. Так, при инкубации плазмы, богатой тромбоцитами, у больных нетяжелым ОП в первые 5 суток заболевания с раствором реамберина отмечали его снижение на 26,6%, а цитофлавина — на 19,5% по сравнению с контролем. Динамический показатель — максимальная скорость агрегации тромбоцитов — изменялся следующим образом. В первые 5 суток заболевания регистрировали статистически достоверное (р<0,05) возрастание скорости на 42,8% под действием реамберина, а под влиянием цитофлавина в эти же сроки не происходило изменений по сравнению с контрольным значением инкубированной плазмы больных с 0,9% раствором натрия хлорида. Время достижения максимальной скорости агрегации под влиянием антиоксидантов изменяется следующим образом: под действием реамберина в первые 5 суток заболевания отмечается увеличение кинетического показателя на 28%, а под влиянием Несколько другие результаты нами получены у больных тяжелым ОП. Анализ динамики агрегационной активности тромбоцитов у больных тяжелым ОП (см. рисунок) показал, что в начале ферментативной фазы заболевания отмечаются выраженные процессы гиперагрегации. К концу второй недели заболевания показатели частично нормализуются, а в фазу секвестрации не наблюдается восстановления функциональной активности, отмечаются процессы гипоагрегации. При тяжелом ОП под влиянием антиоксидантов реамберина и цитофлавина наблюдали следующие изменения максимальной степени агрегации (табл. 4). В ферментативной фазе, в первые 5 суток тяжелого ОП отмечали увеличение на 47% этого показателя агрегации при инкубации плазмы больных, богатой тромбоцитами, с раствором реамберина и на 18,2% — раствора цитофлавина по сравнению с контролем — плазмой больных, инкубируемой с 0,9% раствором натрия хлорида. Время достижения максимальной степени агрегации тромбоцитов в ферментативной фазе при инкубации плазмы, обогащенной тромбоцитами, с рас- 111 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 твором реамберина укорачивалось на 10%, а при инкубации с цитофлавином существенных изменений по сравнению с плазмой больных тяжелым острым панкреатитом в эти же сроки заболевания не происходило. Максимальная скорость агрегации при инкубации плазмы, обогащенной тромбоцитами с раствором реамберина, в первые 5 суток заболевания увеличивалась на 21,5%, при инкубации с цитофлавином не изменя- При эндотоксикозе, сопровождающем ОП, развиваются выраженные изменения в системе гемостаза, в частности нарушения функциональной активности тромбоцитов. По нашим данным, выраженность эндотоксикоза ассоциирована со степенью нарушения агрегационной функции тромбоцитов (сравнение данных на рисунке для 1–2-х суток ОП — р<0,05). Очевидно, что применение антиоксидантов при эндо- Òàáëèöà 4 Ïîêàçàòåëè àãðåãàöèè òðîìáîöèòîâ, èíäóöèðîâàííîé ÀÄÔ, ó áîëüíûõ îñòðûì òÿæåëûì ïàíêðåàòèòîì ïðè èíêóáàöèè ñ àíòèîêñèäàíòàìè â óñëîâèÿõ in vitro (õ±s, n=24) Ïîêàçàòåëü àãðåãàöèè Ìàêñèìàëüíàÿ ñòåïåíü àãðåãàöèè, % Âðåìÿ äîñòèæåíèÿ ìàêñèìàëüíîé ñòåïåíè àãðåãàöèè, ñ Ìàêñèìàëüíàÿ ñêîðîñòü àãðåãàöèè, %/ìèí Âðåìÿ äîñòèæåíèÿ ìàêñèìàëüíîé ñêîðîñòè àãðåãàöèè, ñ a Ïðîáà 1–5-å ñóòêè çàáîëåâàíèÿ Ïëàçìà+ðàñòâîð NaCI 0,9% Ïëàçìà ñ ðåàìáåðèíîì Ïëàçìà ñ öèòîôëàâèíîì Ïëàçìà+ðàñòâîð NaCI 0,9% Ïëàçìà ñ ðåàìáåðèíîì Ïëàçìà ñ öèòîôëàâèíîì Ïëàçìà+ðàñòâîð NaCI 0,9% Ïëàçìà ñ ðåàìáåðèíîì Ïëàçìà ñ öèòîôëàâèíîì Ïëàçìà+ðàñòâîð NaCI 0,9% Ïëàçìà ñ ðåàìáåðèíîì Ïëàçìà ñ öèòîôëàâèíîì 30,2±1,1 44,5±1,7à 35,7±1,0b 338,0±6,9 302,8±16,1b 331,2±7,6b 27,9±1,1 33,9±1,4a 27,2±0,9b 136,8±1,14 100,8±0,84à 122,4±1,02b ð<0,05 ïî ñðàâíåíèþ ñ êîíòðîëåì (ïëàçìà+ðàñòâîð NaCI 0,9%); b p<0,05 ïî ñðàâíåíèþ ñ ïðåäûäóùèì çíà÷åíèåì â ñòðîêå. лась по сравнению с контрольными значениями. Время достижения максимальной скорости агрегации при инкубации с реамберином увеличивалось на 26,3%, а под действием цитофлавина — на 10,5% по сравнению с лицами контрольной группы, плазма которых инкубировалась с 0,9% раствором натрия хлорида. Обсуждение результатов. Полученные результаты свидетельствуют о различной степени восстановления показателей агрегатограммы под влиянием изучаемых антиоксидантов (реамберин и цитофлавин) у больных с разной степенью тяжести ОП. Из табл. 3 и 4 видно, что изучаемые антиоксиданты в целом нормализуют показатели агрегации. Повышенные динамические показатели агрегации тромбоцитов снижаются у больных тяжелым ОП, а кинетические характеристики агрегации удлиняются, т. е. замедляются процессы гиперагрегации под действием данных препаратов. При сниженных динамических показателях наблюдалось их увеличение, а при повышенных кинетических показателях агрегации тромбоцитов происходило укорочение. Следовательно, в большинстве случаев указанные препараты восстанавливают агрегацию тромбоцитов и обеспечивают ее коррекцию при ОП. генной интоксикации панкреатогенного генеза способствует коррекции нарушений микроциркуляции, что может являться обоснованием более детального исследования перспектив их клинического применения у больных ОП [3, 4]. Полученные нами результаты дополняют имеющиеся данные о положительном влиянии реамберина на патологические процессы при ОП, в частности профилактике респираторного дистресс-синдрома и панкреонекроза [22]. Применительно к цитофлавину имеются данные о положительном влиянии на клеточный метаболизм при ОП, причем более выраженном относительно ряда других веществ с антиоксидантной активностью [3]. Расстройства функциональной активности тромбоцитов при ОП диктуют необходимость включения в состав комплексного лечения больных с указанной патологией антиоксидантов, нормализующих кислотный состав их гликопротеиновых рецепторов, восстанавливающих их нарушенную конформацию и связанное с этим восстановление нарушенных функций тромбоцитов. Анализ данных исследований позволил получить более детальное представление о нарушенных 112 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 звеньях патогенеза сосудисто-тромбоцитарного гемостаза. Заключение. В начале развития ОП функциональная активность тромбоцитов сопровождается преимущественно процессами гиперагрегации и повышением адгезии к поврежденной сосудистой стенке, которые наиболее выражены при тяжелых деструктивных формах заболевания, при развитии эндотоксикоза и сепсиса. С третьей недели развития тяжелого ОП отмечается снижение активности тромбоцитов. Применение препаратов реамберина и цитофлавина при ОП способствует коррекции нарушений микроциркуляции крови, в частности, положительно влияя на агрегационную функцию тромбоцитов. Реамберин и цитофлавин являются адаптогенами, нормализующими нарушенные показатели агрегации тромбоцитов как при нетяжелом, так и при тяжелом ОП, в большинстве случаев восстанавливая агрегацию тромбоцитов или же обеспечивая ее коррекцию, что делает целесообразным их использование в комплексном лечении больных с ОП. Литература 1. Багненко С. Ф., Рухляда Н. В., Гольцов В. Р. Диагностика тяжести острого панкреатита в ферментативной фазе заболевания // Клинико-лабораторный консилиум.— 2005.— № 7.— С. 18–19. 2. Савельев В. С., Филимонов М. И., Гельфанд Б. Р. и др. Деструктивный панкреатит: алгоритм диагностики и лечения // Consilium medicum.— 2001.— Т. 3, № 6.— С. 40–49. 3. Шанин Ю. Н., Шанин В. Ю., Зиновьев Е. В. Антиоксидантная терапия в клинической практике (теоретическое обоснование и стратегия проведения).— СПб.: Элби-СПб, 2003.— 128 с. 4. Бромберг, Б. Б. Изменения агрегационных свойств тромбоцитов при остром панкреатите и их коррекция: автореф. дис. канд. мед. наук / Б.Б. Бромберг.— СПб, 2011.— 220 с. 5. Гринев М. В., Бромберг Б. Б., Киричук В. Ф. Патогенетические механизмы сепсиса (на модели некротизирующего фасциита) // Инфекции в хирургии.— 2011.— Т. 9, № 1.— С. 20–22. 6. Кузник Б. И. Нетрадиционные представления о механизмах развития тромбогеморрагического синдрома и диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови // Тромбоз, гемостаз и реология.— 2010.— Т. 41, № 1.— С. 22–43. 7. Uhlmann D., Lauer H., Serr F., Witzigmann H. Pathophysiological role of platelets and platelet system in acute pancreatitis // Microvasc Res.— 2008.— Vol. 76 (2).— Р. 114. 8. Бромберг Б. Б., Тулупов А. Н., Киричук В. Ф. и др. Изменение функций тромбоцитов у больных острым панкреатитом // Всероссийская научно-практическая конференция, посвященная 90-летию профессора М. А. Лущицкого «Актуальные вопросы военно-морской и клинической хирургии».— СПб., 2009.— С. 24–25. 9. Bulger E. M., Maier R. V. Antioxidants in critical illness // Arch. Surg.— 2001.— Vol. 136.— P. 1201–1207. 10. Dulce M., Cruz-Santamaria, Taxonera C., Giner M. Update on pathogenesis and clinical management of acute pancreatitis // World J. of Gastrointestinal Pathophysiology.— 2012.— Vol. 3, № 3.— Р. 60–70. 11. Akbal E., Demirci S., Kocak E. et al. Alterations of platelet function and coagulation parameters during acute pancreatitis // Blood Coagul Fibrinolysis.— 2013.— Vol. 24 (3).— Р. 243–246. 12. Werner J., Hartwig W., Hackert T. et al. Multidrug strategies are effective in the treatment of severe experimental pancreatitis // Surgery.— 2012.— Vol. 151 (3).— Р. 372–381. 13. Ramudo L., Manso M. A., Vicente S., De Dios I. Pro- and anti-inflammatory response of acinar cells during acute pancreatitis. Effect of N-acetyl cysteine // Cytokine.— 2005.— Vol. 32.— Р. 125–131. 14. Biradar S., Veeresh B. Protective effect of lawsone on L-Arginine induced acute pancreatitis in rats // Indian J. Exp. Biol.— 2013.— Vol. 51 (3).— Р. 256–261. 15. Ozkan E., Akyu..z C., Dulundu E. et al. Protective effects of lycopene on cerulein-induced experimental acute pancreatitis in rats // J. Surg. Res.— 2012.— Vol. 176 (1).— Р. 232–238. 16. Ma Q., Zhang M., Wang Z. et al. The beneficial effect of resveratrol on severe acute pancreatitis // Ann. N. Y. Acad. Sci.— 2011.— Vol. 1215.— Р. 96–102. 17. Osada J., Wereszczynska-Siemiatkowska U., Dabrowski A., Dabrowska M. I. Platelet activation in acute pancreatitis // Pancreas.— 2012.— Vol. 41 (8).— Р. 1319–1324. 18. Abdulla A., Awla D., Hartman H. et al. Role of platelets in experimental acute pancreatitis // Br. J. Surg.— 2011.— Vol. 98 (1).— Р. 93–103. 19. Uhl W., Muller C., Buchler M. W. Definition of predictors of a complicated course in acute pancreatitis // Langenbecks Arch. Chir. Suppl. Kongressbd.— 1998.— Vol. 115.— Р. 427–433. 20. Easler J. J., Mounzer R., Papachristou G. I. Pharmacological therapy for acute pancreatitis: where are we now? where are we going? // Minerva Gastroenterol Dietol.— 2012.— Vol. 58 (4).— Р. 365–376. 113 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 21. Протоколы диагностики и лечения острых хирургических заболеваний органов брюшной полости / Ассоциация хирургов Санкт-Петербурга. Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт скорой помощи им. И. И. Джанелидзе.— СПб., 2007.— 58 с. 22. Власов А. П., Григорьева Т. И., Потянова И. В. и др. Влияние реамберина на эффект фотогемотерапии при эндогенной интоксикации, обусловленной острым панкреатитом, в эксперименте // Экспериментальная и клиническая фармакология.— 2012.— № 75 (7).— С. 27–31. 23. Milewski J., Rydzewska G., Degowska M. et al. N-acetylcysteine does not prevent post-endoscopic retrograde cholangiopancreatography hyperamylasemia and acute pancreatitis // World J. Gastroenterol.— 2006.— Vol. 12.— Р. 3751–3755. 24. Zhu R., Wei S., Wu C. et al. Utility of clot formation and lysis assay to monitor global coagulation state of patients with severe acute pancreatitis // Dig Dis Sci.— 2012.— Vol. 57 (5).— Р. 1399–1403. Поступила в редакцию: 25.06.2013 г. Контакт: Бромберг Борис Борисович. trebleb82@mail.ru Внимание читателям журнала! Академия медицинских наук в содружестве с вузами и научноис следовательскими институтами СанктПетербурга, СанДиего, Атлан ты и Вашингтона проводят Международный конгресс «Нейронауки и ВИЧинфекция». Конференция будет проведена 21–22 октября 2013 г. в СанктПе тербурге на базе Института экспериментальной медицины СЗО РАМН и СПб Центра СПИД. Подробную информацию можно получить на сайте: hivspb.ru Сопредседатели конгресса: академик РАМН Г. А. Софронов академик РАМН Н. А. Беляков Контактный тел: 8 (812) 4078337; 8 (812) 2510853 114 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 УДК 616.327-002 ЗАВИСИМОСТЬ СВОЙСТВ STREPTOCOCCUS PYOGENES ОТ УРОВНЯ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНА RGG 1,2А. В. Дмитриев, 3M. S. Chaussee 1Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН, Санкт-Петербург, 2Санкт-Петербургский государственный университет, Россия 3Университет Южной Дакоты, г. Вермиллион, США Россия DEPENDENCE OF STREPTOCOCCUS PYOGENES PROPERTIES FROM THE RGG GENE TRANSCRIPTIONAL LEVEL 1Institute 1,2A. V. Dmitriev, 3M. S. Chaussee of Experimental Medicine of the North-West Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, St.-Petersburg, Russia 2St.-Petersburg State University, Russia 3University of South Dakota, Vermillion, USA © Коллектив авторов, 2013 г. Streptococcus pyogenes является патогенным для человека микроорганизмом. Белок-регулятор транскрипции Rgg контролирует фенотипические свойства S. pyogenes, в частности вирулентность. В настоящем исследовании ген rgg был восстановлен в мутантных штаммах SF370 rgg- и NZ131 rgg- под контролем как природного, так и гетерологичного плазмидного промотора. Уровень транскрипции гена rgg под действием гетерологичного промотора оказался в 2 раза выше, чем под действием природного промотора. Восстановление гена rgg на хромосоме под природным промотором восстановило фенотипические свойства мутантных штаммов до свойств «родительских» штаммов. В то же время восстановление гена rgg под гетерологичным плазмидным промотором не восстановило ни одно из фенотипических свойств. Таким образом, результаты исследования доказывают комплексный механизм регуляции, опосредованный белком-регулятором транскрипции Rgg. Учитывая значимость белка Rgg для контроля вирулентных свойств S. pyogenes, перспективными представляются дальнейшие исследования опосредованной Rgg регуляции транскрипции генов. Ключевые слова: Streptococcus pyogenes, регуляция транскрипции, белок Rgg. Streptococcus pyogenes is well-known human pathogen. The transcriptional regulatory protein Rgg controls the variety of S. pyogenes phenotypes, in particular, virulent phenotype. In this study the rgg gene was restored in SF370 rgg- и NZ131 rgg- mutant strains under native and plasmid heterologous promoters. Transcriptional level of rgg gene under the control of heterologous promoter was 2-fold higher than that under the control of native promoter. Restoration of rgg in the chromosome under the control of the native promoter restored wild-type phenotypes. In contrast, episomal complementation of rgg under plasmid heterologous promoter did not restore any of phenotypic properties. Together, the results indicate that the mechanism of Rgg-mediated regulation is complex. Given the importance of Rgg in controlling virulence properties in S. pyogenes, further characterization of the mechanism of Rgg-mediated gene transcription is necessary. Key words: Streptococcus pyogenes, transcriptional regulation, Rgg protein. Введение. Streptococcus pyogenes — грамположительный микроорганизм, приводящий к многочисленным патологическим процессам, от фарингита до некротизирующего фасцита, и тяжелым постстрептококковым осложнениям [1]. Патогенез заболеваний, вызываемых S. pyogenes, во многом связан с наличием у него секретируемых и локализованных на поверхности микроорганизма факторов патогенности, синтез которых контролируется на стадиях транскрипции, трансляции и посттрансляционно [2]. На уровне транскрипции экс- прессия генов патогенности находится под контролем разветвленной регуляторной сети, включающей в себя двухкомпонентные регуляторные системы и ДНК-связывающие белки-регуляторы транскрипции. Одним из таких белков-регуляторов является белок Rgg, влияющий на транскрипцию большого числа генов S. pyogenes, что отражается на фенотипических свойствах микроорганизма. В штамме NZ131 инактивация гена rgg привела к изменениям в уровнях транскрипции более 700 генов, и эти изменения отразились на свойствах S. pyogenes, в частности мутант- МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 ный штамм стал неспособен синтезировать эритрогенный токсин SpeB [3]; у мутантного штамма изменилась экспрессия таких факторов патогенности, как стрептолизин О, стрептолизин S, стрептокиназа, белок Maс, НАД-гликогидролаза, М-белок, митогенный фактор MF-1 и др. [4–6]; инактивация гена rgg оказала влияние на адаптацию S. pyogenes к условиям стресса и повлияла на способность S. pyogenes использовать аминокислоты и углеводы для размножения и роста [6, 7]; инактивация гена rgg повлияла на частоту индукции профага NZ131.1 [6]; штамм, мутантный по гену rgg, стал более вирулентным по сравнению с исходным штаммом NZ131 [8, 9]. Сравнительный анализ транскриптомов четырех штаммов S. pyogenes MGAS5005, CS101, SF370, NZ131 и их rgg мутантов показал, что инактивация гена rgg привела к изменению уровней транскрипции 3, 13, 45 и 706 генов соответственно, что может свидетельствовать о штаммовой специфичности активности регулятора Rgg [10]. Некоторые аминокислоты в белке Rgg, например серин в положении № 103, аргинин в положении № 11, триптофан в положении №142, а также аминокислоты на С-терминальном конце белка, принципиально важны для проявления им функциональных свойств [11–13]. Кроме того, не исключено, что на функциональную активность белка Rgg могут влиять не только отдельные аминокислоты, но и изменения в уровне транскрипции кодирующего его гена rgg, которые теоретически могут происходить под действием факторов окружающей среды. Таким образом, целью настоящей работы явилось моделирование изменений в уровне транскрипции гена rgg и изучение этого влияния на фенотипические свойства S. pyogenes. Материалы и методы исследования. В работе использовали штаммы S. pyogenes SF370 (серотип М1, выделен в США от пациента с раневой инфекцией) и NZ131 (серотип М49, выделен в Новой Зеландии от пациента с острым постстрептококковым гломерулонефритом), а также созданные на их основе мутантные штаммы по гену rgg, SF370 rgg- и NZ131 rgg- соответственно, охарактеризованные ранее [10], и штамм Enterococcus faecalis UV202. Штаммы S. pyogenes и E. faecalis выращивали в течение ночи при 37° C в присутствии 5% CO2 в среде ToddHewitt (Becton Dickinson, США), содержащей 0,2% дрожжевого экстракта (Difco, США). При необходимости добавляли эритромицин или канамицин до конечной концентрации 2,5 мкг/мл и 500 мкг/мл соответственно. Штамм Escherichia coli DH10B выращивали на качалке в течение ночи при 37° C в среде LB (Amresco, США), содержащей при необходимо- 115 сти ампициллин или канамицин в концентрации 75 мкг/мл или 50 мкг/мл соответственно. Большинство рутинных генно-инженерных процедур (выделение геномной ДНК, рестрикция, электрофорез ДНК и др.) осуществляли в соответствии с руководством [14]. Плазмидные ДНК выделяли с использованием Axy PrepTM Plasmid Midiprep Kit (Axygen, США). Полимеразную цепную реакцию проводили с использованием праймеров, представленных в соответствующих разделах. Температуры отжига праймеров подбирали в зависимости от их последовательностей. Секвенирование ДНК проводили на секвенаторе Beckman Coulter CEQTM 8000 (США), как описано ранее [15]. РНК выделяли с использованием RNeasy Mini Kit (Qiagen, США), как описано ранее [5]. Концентрацию и качество РНК определяли на микрочипах RNA 6000 Nano LabChip с использованием анализатора Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, США) согласно инструкции производителя. ПЦР с обратной транскриптазой в режиме реального времени (количественная ОТ-ПЦР) проводили с использованием праймеров на гены rgg, speB, purN, sagA и TaqMan проб, описанных ранее [6, 10], и системы ABI Prism 7000 (PE Applied Biosystems, США) согласно инструкции производителя. Электротрансформацию штаммов проводили, используя электропоратор Gene Pulser Xcell™ (BioRad, США) согласно инструкции производителя. Экспрессию эритрогенного токсина SpeB и НАДгликогидролазы определяли, как описано в работе А. С. Рождественской и соавт. [8]. Сравнительный анализ последовательностей ДНК проводили с использованием баз данных GenBank и программы BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Результаты и их обсуждение. Конструирование рекомбинантной плазмиды p1. Ген rgg штамма NZ131 клонировали в векторе pMSP3535Va размером 8,3 т. п. н., который способен к независимой репликации как в стрептококках, так и E. coli, и содержит ген устойчивости к канамицину. Для клонирования была выбрана следующая стратегия. На первом этапе сконструированы праймеры KpnFwd (5’-GGGGTA CCCCATATGGAAATTGGTGAA-3’) и XbaRev (5’-GCTCTAGAGCCTCAGGACAGTTTATGT3’), содержащие рестрикционные сайты KpnI и XbaI (подчеркнуты). Эти праймеры использовали для амплификации полноразмерного гена rgg. ПЦР продукт гидролизовали рестриктазами KpnI и XbaI, очищали и лигировали с вектором pMSP3535Va, предварительно гидролизованным KpnI и XbaI. Лигазную смесь использовали для трансформации штамма E. faecalis strain UV202. Устойчивые к действию 116 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 канамицина клоны отбирали и анализировали. В дальнейшем один из устойчивых клонов выращивали в 100 мл питательной среды Todd–Hewitt и из полученной биомассы выделяли искомую рекомбинантную плазмиду размером 9,2 т. п. н., названную p1, которая содержала полноразмерный ген rgg (рис. 1). Особенностью такой генетической конструкции явилась возможность независимой экспрессии гена rgg под контролем гетерологичного плазмидного промотора. струкции явилась невозможность независимой экспрессии гена rgg под контролем гетерологичного плазмидного промотора, а возможность экспрессии гена rgg лишь в том случае, если эта плазмида будет интегрирована в хромосомную ДНК стрептококка. Восстановление гена rgg в мутантных штам мах. Восстановление гена rgg в мутантных штаммах SF370 rgg- и NZ131 rgg- осуществляли двумя способами. В первом случае мутантные штаммы транс- aaaaaa aaaaaa aaaaaa aaaaaa aaaaaa Рис. 1. Восстановление полноразмерного гена rgg под контролем природного промотора (Prgg) и гетерологичного плазмидного промотора (Р) в штаммах S. pyogenes. Символами Гр+ и ColE1 обозначены ориджины репликации плазмид в грамположительных стрептококках и грамотрицательной E. coli соответственно. Конструирование рекомбинантной плазмиды p4.2. Для того чтобы создать вектор, содержащий ген rgg, но неспособный к независимой репликации в стрептококках, штамм E. coli DH10B трансформировали плазмидой p1. Ранее опубликованы данные, что в системе E. coli плазмиды на основе вектора pMSP3535Va могут потерять ориджин репликации для стрептококков [16]. В результате анализа трансформантов обнаружены два типа колоний E. coli, которые различались по диаметру. Колонии обоих типов были выращены в среде LB, а их плазмидные ДНК выделены. Анализ нуклеотидных последовательностей плазмидных ДНК показал различия в их размерах: одна из плазмид была идентична плазмиде p1 (9,2 т. п. н.), а во второй (размером 6,5 т. п. н.) оказался утраченным ориджин репликации для стрептококков. Именно эта плазмида, названная p4.2, была использована для дальнейших исследований (см. рис. 1). Особенностью такой генетической кон- формировали плазмидой p1 методом электропорации. В полученных штаммах, названных NZ131 rgg-/prgg и SF370 rgg-/prgg, как ожидалось, экспрессия гена rgg должна была осуществляться под контролем плазмидного промотора (см. рис. 1). Во втором случае мутантные штаммы трансформировали плазмидой p4.2 методом электропорации. Как описано выше, плазмида p4.2 неспособна к самостоятельной репликации в стрептококках, поэтому отбор селективных рекомбинантов проводили методами ПЦР и секвенирования, направленными на выявление клонов, в которых плазмида p4.2 была интегрирована в хромосомную ДНК стрептококка, а ген rgg восстановлен вместе с природным промотором. В результате трансформации и последующей интеграции плазмиды p4.2 в хромосомные ДНК мутантных штаммов были получены клоны, названные NZ131 rgg-/chrgg и SF370 rgg-/chrgg, в которых, как ожидалось, экспрессия гена rgg должна была МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 осуществляться под контролем природного промотора (см. рис. 1). Клонирование гена rgg под контроль природного промотора восстанавливает экспрессию эритро генного токсина SpeB. Анализ штаммов NZ131, SF370, их rgg изогенных мутантов, а также всех штаммов с восстановленным геном rgg показал, что экспрессия эритрогенного токсина SpeB восстановилась в штаммах NZ131 rgg-/chrgg и SF370 rgg/chrgg, но не восстановилась в штаммах NZ131 rgg/prgg и SF370 rgg-/prgg (рис. 2). 117 гочисленным изменениям в метаболизме штаммов [3–7, 9, 10]. Для того чтобы доказать, что все изменения действительно связаны с инактивацией гена rgg, а не с вторичной мутацией, которая могла произойти в каком-нибудь из фрагментов генома, проанализировано, действительно ли клонирование гена rgg под контроль природного промотора восстанавливает свойства штаммов. В результате исследований обнаружено, что клонирование гена rgg в мутантных штаммах SF370 rggи NZ131 rgg- под контроль природного промотора Рис. 2. Зона экспрессии эритрогенного токсина SpeB вокруг колоний штаммов S. pyogenes, выраженная в миллиметрах. Для того чтобы выяснить, связаны ли различия в уровнях экспрессии SpeB с возможными различиями в уровнях экспрессии генов rgg и speB в различных штаммах, у всех штаммов на постэкспоненциальной фазе роста была выделена мРНК, а уровни транскрипции генов rgg и speB оценены методом количественной ОТ-ПЦР. В результате исследования обнаружено, что уровни транскрипции генов rgg и speB в штаммах NZ131 rgg-/chrgg и SF370 rgg/chrgg сходны с таковыми в штаммах NZ131 и SF370, в то время как в штаммах NZ131 rgg-/prgg и SF370 rgg-/prgg они в 2 раза выше, чем в штаммах NZ131 и SF370 (рис. 3). восстановило свойства штаммов до таковых, характерных для SF370 и NZ131. В частности, гемолитическая активность, которая была существенно выше в штамме NZ131 rgg- [6], восстановлена в штамме NZ131 rgg-/chrgg до уровня NZ131. НАД-гликогидролазная активность, которая была в 16 раз выше в штамме NZ131 rgg- [6], восстановлена в штамме NZ131 rgg-/chrgg до уровня NZ131. Нарушенный метаболизм аминокислот в штамме NZ131 rgg- [5] восстановлен в штамме NZ131 rgg-/chrgg до уровня NZ131. Кроме того, восстановление гена rgg под природный промотор восстановило уровень спонтанной индукции бактериофага NZ131.1 (рис. 4). Рис. 3. Относительные уровни транскрипции генов rgg и speB в штаммах S. pyogenes. Учитывая, что белок Rgg непосредственно взаимодействует с регуляторной областью гена speB и является активатором SpeB [17], полученные результаты указывают на репрессорный эффект повышенного уровня транскрипции rgg на уровень синтеза SpeB. Клонирование гена rgg под контроль природного промотора восстанавливает исходный фенотип штаммов NZ131 и SF370. Как опубликовано ранее, кроме нарушения синтеза SpeB, инактивация гена rgg в штаммах SF370 и NZ131 привела к мно- ПЦР проведена с использованием праймеров cpsFQ и mutX [6], направленных на детекцию attB сайта в геноме S. pyogenes. Интенсивность амплификата размером 496 п. н. прямо пропорциональна уровню спонтанной индукции бактериофага NZ131.1. Восстановление гена rgg в штамме SF370 rgg- под контроль природного промотора восстановило кривую роста штамма до таковой, характерной для SF370 (рис. 5). Кроме того, уровни транскрипции генов purN и sagA были также восстановлены до уровней таковых в исходном штамме SF370. Все эти 118 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 данные свидетельствуют, что изменения свойств в обоих rgg мутантных штаммах (SF370 rggи NZ131 rgg-) действительно связаны с инактивацией гена rgg, а не с вторичной мутацией. Рис. 4. Восстановление уровня спонтанной индукции бактериофага NZ131.1: трек 1 — штамм NZ131; трек 2 — штамм NZ131 rgg; трек 3 — штамм NZ131 rgg-/chrgg; трек 4 — штамм NZ131 rgg/prgg; трек 5 — маркер молекулярной массы. Следует отметить, что восстановление гена rgg под контроль гетерологичного плазмидного промотора в сконструированных штаммах NZ131 rgg/prgg и SF370 rgg-/prgg не восстановило вышеупомянутые фенотипические свойства (рис. 2, 4, 5). Несмотря на эффективную транскрипцию гена rgg (даже превышающую таковую в исходных штаммах), свойства штаммов остались такими же, как и у мутантных штаммов, что свидетельствует о значимости уровня транскрипции гена rgg для функциональной активности белка Rgg. Рис. 5. Кривые роста штаммов S. pyogenes. Белок-регулятор Rgg функционирует в составе динамического транскрипционного регулятор ного комплекса. Учитывая результаты, полученные в настоящем исследовании и работах других авторов, можно сделать несколько предположений о природе функционирования белка Rgg. По-видимому, все же взаимодействие белка Rgg с промоторными областями генов не является простым химическим взаимодействием ДНК с белком [17–19], в противном случае это не объясняет штаммовую специфичность действия Rgg [10]. Влияние опреде- ленных аминокислот на C-терминальном конце белка Rgg на активацию экспрессии SpeB [12], но совершенно не вовлеченных в процесс непосредственного взаимодействия «ДНК-белок», указывает на взаимодействие белка Rgg c другими белками или ко-факторами. Одним из таких белков является белок LacD.1 (тагатоза-1,6-бифосфатальдолаза), который способен связываться с Rgg во время ранней логарифмической фазы роста, препятствуя активации транскрипции гена эритрогенного токсина SpeB [20]. Однако и это никак не объясняет, почему Rgg все же регулирует другие гены на этой же фазе роста [6, 10]. Таким образом, наиболее логичным представляется функционирование белка Rgg в составе динамического транскрипционного комплекса, включающего в себя Rgg и ряд штаммо-специфических белков. Косвенным доказательством такого взаимодействия являются еще неопубликованные данные о взаимодействии Rgg с рядом стрептококковых белков [21]. Из результатов данной работы очевидно, что не только аминокислотная последовательность Rgg и наличие неизвестных на сегодня кофакторов, но и уровень транскрипции гена rgg критически важны для регуляторных свойств белка Rgg. Как указано в данной работе, даже двукратное увеличение уровня транскрипции гена rgg приводит к уменьшению до нуля уровня транскрипции гена speB (рис. 3). Не исключено, что при достижении в бактериальной клетке определенного уровня синтеза Rgg эти молекулы начинают формировать неактивные гомодимеры или гетеродимеры с другими Rgg паралогами. Другим возможным объяснением инактивации свойств Rgg при высоком уровне его синтеза может быть изменение растворимости белка и, как следствие, его активности. Кроме того, возможно, что процесс синтеза белка Rgg на рибосомах непосредственно зависит от характеристик мРНК транскриптов, в частности, синтезированы ли они на матрице хромосомной ДНК или на матрице плазмидной ДНК. Заключение. Таким образом, функциональные свойства белка-регулятора Rgg во многом зависят от уровня экспрессии гена rgg, и даже двукратное его увеличение приводит к полной потере функциональных свойств Rgg. Кроме того, белок-регулятор Rgg функционирует в составе динамического транскрипционного регуляторного комплекса, характеризующегося штаммовой специфичностью, что открывает широкие перспективы для дальнейших исследований. *** Исследование поддержано грантом Российского фонда фундаментальных исследований 13-04-01864а. МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 119 Литература 1. Cunningham M. W. Pathogenesis of group A streptococcal infections // Clin. Microbiol. Rev.— 2000.— Vol.13, № 3.— P. 470–511. 2. Kreikemeyer B., McIver R. S., Podbielski A. Virulence factor regulation and regulatory networks in Streptococcus pyogenes and their impact on pathogen-host interactions // Trends Microbiol.— 2003.— Vol. 11, № 5.— P. 224–232. 3. Chaussee M. S., Ajdic D., Ferretti J. J. The rgg gene of Streptococcus pyogenes NZ131 positively influences extracellular SPE B production // Infect. Immun.— 1999.— Vol. 67, № 4.— P. 1715–1722. 4. Chaussee M. S., Watson, R. O., Smoot J. C. et al. Identification of Rgg-regulated exoproteins of Streptococcus pyogenes // Infect. Immun.— 2001.— Vol. 69, № 2.— P. 822–831. 5. Chaussee M. S., Somerville G. A., Reitzer L. et al. Rgg coordinates virulence factor synthesis and metabolism in Streptococcus pyogenes // J. Bacteriol.— 2003.— Vol. 185, № 20.— P. 6016–6024. 6. Dmitriev A. V., McDowell E. J., Kappeler K. V. et al. The Rgg regulator of Streptococcus pyogenes influences the utilization of nonglucose carbohydrates, prophage induction, and expression of the NAD-glycohydrolase virulence operon // J. Bacteriol.— 2006.— Vol. 188, № 20.— P. 7230–7241. 7. Chaussee, M. A., Callegari E. A., Chaussee M. S. Rgg regulates growth phase-dependent expression of proteins associated with secondary metabolism and stress in Streptococcus pyogenes // J. Bacteriol.— 2004.— Vol. 186, № 21.— P. 7091–7099. 8. Рождественская А. С., Дмитриев А. В., Грабовская К. Б. и др. Инактивация гена регулятора транскрипции Rgg изменяет экспрессию секретируемых факторов патогенности и вирулентность Streptococcus pyogenes // Мед. акад. журн.— 2008.— Т. 8, № 2.— С. 21–27. 9. Pulliainen A. T., Hytonen J., Haataja S. et al. Deficiency of the Rgg regulator promotes H2O2 resistance, AhpCF-mediated H2O2 decomposition, and virulence in Streptococcus pyogenes // J. Bacteriol.— 2008.— Vol. 190, № 9.— P. 3225–3235. 10. Dmitriev A. V., McDowell E. J., Chaussee M. S. Inter- and intraserotypic variation in the Streptococcus pyogenes Rgg regulon // FEMS Microbiol. Lett.— 2008.— Vol. 284, № 1.— P. 43–51. 11. Loughman, J. A., Caparon M. G. Contribution of invariant residues to the function of Rgg family transcription regulators // J. Bacteriol.— 2007.— Vol. 189, № 2.— P. 650–655. 12. Hollands A., Aziz R. K., Kansal R. et al. A naturally occurring mutation in ropB suppresses SpeB expression and reduces M1T1 group A streptococcal systemic virulence // PLoS One.— 2008.— Vol.3, № 12.— P. e4102. 13. Kappeler K. V., Anbalagan S., Dmitriev A. V. et al. A naturally occurring Rgg variant in serotype M3 Streptococcus pyogenes does not activate speB expression due to altered specificity of DNA binding // Infect. Immun.— 2009.— Vol.77, № 12.— P. 5411–5417. 14. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование.— М.: Мир, 1984.— 479 с. 15. Ильясов Ю. Ю., Дмитриев А. В. Геномный полиморфизм Streptococcus dysgalactiae subspecies equisimilis // Мед. акад. журн.— 2012.— Т. 12, № 2.— С. 90–96. 16. Bryan E. M., Bae T., Kleerebezem M. et al. Improved vectors for nisin–controlled expression in gram–positive bacteria // Plasmid.— 2000.— Vol. 44, № 2.— P. 183–190. 17. Neely M. N., Lyon W. R., Runft D. L. et al. Role of RopB in growth phase expression of the SpeB cysteine protease of Streptococcus pyogenes // J. Bacteriol.— 2003.— Vol. 185, № 17.— P. 5166–5174. 18. Anbalagan S., McShan W. M., Dunman P. M. et al. Identification of Rgg binding sites in the Streptococcus pyogenes chromosome // J. Bacteriol.— 2011.— Vol. 193, № 18.— P. 4933–4942. 19. Anbalagan S., Dmitriev A., McShan W. M. et al. Growth phase–dependent modulation of Rgg binding specificity in Streptococcus pyogenes // J. Bacteriol.— 2012.— Vol. 194, № 15.— P. 3961–3971. 20. Loughman J. A., Caparon M. G. A novel adaptation of aldolase regulates virulence in Streptococcus pyogenes // EMBO J.— 2006.— Vol. 25, № 22.— P. 5414–5422. 21. Kapeller K. V. Personal communication. Поступила в редакцию: 22.07.2013 г. Контакт: Дмитриев Александр Валентинович. admitriev10@yandex.ru Подписка на 2014 год открыта Наш подписной индекс — 5 7 9 9 9 120 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 Светлой памяти нашего друга ЮРИЙ ДМИТРИЕВИЧ ИГНАТОВ 28 июня 2013 года ушел из жизни заведующий кафедрой фармакологии, директор института фармакологии, академик РАМН, заслуженный деятель науки РФ, вице-президент Российского научного общества фармакологов, доктор медицинских наук, профессор Юрий Дмитриевич Игнатов. Он был питомцем 1-го ЛМИ им. акад. И. П. Павлова (сегодня — Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова) и после окончания лечебного факультета в 1963 году бессменно работал в этом вузе. С 1963 по 1966 год учился в аспирантуре на кафедре фармакологии. В 1967 году защитил кандидатскую диссертацию, а в 1977 году — докторскую. В период с 1966 по 1970 год работал ассистентом кафедры фармакологии, с 1970 по 1977 год — доцентом. В 1977–1978 годах работал в должности профессора. С 1978 года и до самого последнего дня он заведовал кафедрой фармакологии, а с 1996 года одновременно был и директором института фармакологии им. А. В. Вальдмана. В 2010 году Юрию Дмитриевичу было присуждено звание Почетного доктора СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова. Ю. Д. Игнатов являлся одним из ведущих фармакологов России. Он приобрел широкую известность в нашей стране и за рубежом благодаря выдающимся фундаментальным и прикладным исследованиям по проблеме боли и обезболивания. Им получены приоритетные данные о дифференцированном участии различных опиатных рецепторов в регуляции эмоционально-аффективных компонентов острой боли различного генеза, выявлены особенности опиоидергической регуляции системной и регионарной гемодинамики, проводящей системы сердца, тромбоцитарно-сосудистого гемостаза. Научно обоснована оригинальная концепция рецепторной разобщенности опиоидергической регуляции боли и ее сердечно-сосудистых (вегетативных) проявлений, предопределившая поиск новых опиатов и опиоидов с направленным рецепторным действием с целью расширения спектра аналгетиков за счет более эффективных и безопасных средств. Юрий Дмитриевич выдвинул гипотезу о существовании альтернативных (неопиатных) нейромедиаторных систем регуляции боли и выявил принципы функционирования адренергических болеутоляющих механизмов. Получены доказательства, что лекарственные средства с центральным адренопозитивным эффектом обладают отчетливой болеутоляющей активностью, лишены наркогенного потенциала и других негативных эффектов морфиноподобных аналгетиков. С позиций сформулированного им положения об адренергической болеутоляющей системе обосновано применение нового класса неопиатных аналгетиков в анестезиологии и при болевых синдромах в различных областях практической медицины. МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 Выявлены перспективные классы производных имидазолина и гуанидина, которые служат основой для получения новых отечественных центральных аналгетиков неопиатного действия. Это большой вклад в совершенствование средств и методов обезболивания в кардиологии, неврологии, стоматологии, акушерской практике. Под его руководством активно проводились экспериментальные исследования по изучению изменений трансмембранных ионных токов изолированных нейронов при действии фармакологических средств. Показаны механизмы мембранного действия сердечных гликозидов; нового анксиолитика афобазола; антигипоксических средств алмида, бемитила и мексидола. Основные особенности мембранотропного действия: дозозависимые активации и блокирование потенциально управляемых ионных каналов, влияние на кинетику их открывания-закрывания, влияние на потенциал поверхностного заряда мембраны и неспецифические токи утечки мембраны, свидетельствующие о стабильности мембраны. Ю. Д. Игнатов уделял внимание изучению нейрофизиологических механизмов краниальной нейрососудистой боли. Им показано нисходящее тормозное влияние центрального серого вещества среднего мозга на вызванную электрической стимуляцией сосудов твердой мозговой оболочки, активность нейронов тригеминоваскулярной системы. Установлено, что сенситизация рецепторов твердой мозговой оболочки приводит к обратимому увеличению фоновой и вызванной активности нейронов тройничного комплекса. Результаты экспериментальных исследований стали основанием для клинической апробации антиконвульсантов (вальпроата, топиромата, карбамазепина) при лечении хронической мигрени. Юрий Дмитриевич всегда активно участвовал в научно-общественной работе. Он являлся членом редколлегии и редакционных советов четырех научных журналов, заместителем председателя Правления Российского и Санкт-Петербургского научных обществ фармакологов, членом международной и Российской ассоциаций по изучению боли. Им организованы одна из первых в России лаборатория фармакоэпидемиологии и Информационный центр по клинической фармакологии. 121 Академик РАМН Ю. Д. Игнатов успешно развивал отечественную фармакологию. Им опубликовано 425 научных работ, в том числе 12 монографий, 7 сборников научных трудов, 13 справочников для врачей, 15 учебных пособий. Имеет 6 авторских свидетельств. На базе кафедры (Института) фармакологии проведено 8 Всероссийских с международным участием конференций по нейрофармакологии боли, клинической фармакологии болеутоляющих средств и фундаментально-прикладным аспектам наркоманий. Он подготовил 15 докторов и 44 кандидата наук, являлся председателем диссертационного Совета СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова, членом диссертационного Совета ИЭМ РАМН. Более 30 лет (1977–2008 гг.) Юрий Дмитриевич был проректором по учебной работе и первым проректором Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И. П. Павлова. Он внес огромный вклад в становление и развитие высокого уровня медицинского образования в Университете, совершенствование структуры факультетов, учебной части, в подготовку и расстановку научно-педагогических кадров. Как руководитель учебной работы медицинского вуза, он пользовался авторитетом среди руководителей медицинских вузов Российской Федерации. Заслуги Юрия Дмитриевича перед медицинской наукой и образованием получили достойное признание. В 1991 году он избран членом-корреспондентом РАМН, а в 2000 году — действительным членом РАМН. В 1994 году удостоен диплома «Академик Международной академии наук высшей школы». В 1991 году ему присвоено звание «Заслуженный деятель науки РСФСР». Юрий Дмитриевич имеет правительственные награды: медаль «За трудовое отличие», ордена «Знак Почета» и «За заслуги перед Отечеством» II степени и др. В мае 2013 года он получил премию правительства Санкт-Петербурга за выдающиеся достижения в области высшего и среднего профессионального образования. Не стало нашего друга, выдающегося ученого, талантливого педагога, мыслителя. От нас ушел удивительно чуткий, добрый и талантливый человек, коллега, учитель и товарищ. Светлая ему память и соболезнования всем родным и близким. Северо-Западное отделение РАМН Санкт-Петербургский государственный медицинский университет Редколлегия Медицинского академического журнала 122 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 ПРАВИЛА ОФОРМЛЕНИЯ СТАТЕЙ 1. Статьи для публикации должны быть написаны на русском языке, иметь реферат (резюме), ключевые слова (3–4) на русском и английском языках. 2. Статьи представляются в редакцию на электронных и бумажных носителях. Если у автора есть затруднения с пересылкой статьи по почте, предоставление материала возможно в электронном виде. Все страницы должны быть пронумерованы от первой до последней страницы, без пропусков и литерных добавлений (например, 2а и т. п.). 3. Объем статьи не должен превышать: 3.1. Передовая статья, обзор, лекция — 25 страниц; 3.2. Оригинальная статья — 15 страниц; 3.3. Рекомендации для врачей — 5 страниц; 3.4. Рецензии, информация, хроника — 3 страницы. 4. Статья должна иметь следующие разделы. 4.1. Титульный лист — указываются название статьи, инициалы и фамилии авторов, полное название учреждения, город на русском и английском языках. Титульный лист должен быть подписан всеми авторами. 4.2. Резюме — до 1500 знаков, отражает цель, основные методы исследований, важнейшие результаты. 4.3. Основной текст должен включать в себя следующие разделы, расположенные в установленном порядке: 4.3.1. Введение; 4.3.2. Материалы и методы исследования — обязательно указываются сведения о статистической обработке экспериментального или клинического материала; 4.3.3. Результаты и их обсуждение; 4.3.4. Выводы; 4.3.5. Литература. 5. Каждая таблица должна иметь номер и название. Рисунки, графики, схемы должны быть черно-белыми с различимой штриховкой, выполнены в электронном (отдельными файлами с сохранением возможности редактирования) и бумажном вариантах отдельно от текста, а также иметь подрисуночные подписи без сокращений и дублироваться в тексте. При включении в публикацию растровой графики (сканированных, цифровых снимков, снимков с экрана мониторов и т. п.) предпочтение отдается рисункам c размером меньшей стороны не менее 5 см (640 пикселей), в форматах pdf, tiff, jpeg (максимальное качество). 6. Библиографический список. 6.1. Библиографические описания источников располагают в порядке упоминания их в тексте статьи и нумеруют арабскими цифрами. 6.2. В лекции можно давать список рекомендуемой литературы, и тогда в тексте ссылаться на источники не обязательно. 6.3. Библиографический список оформляют в соответствии с действующим ГОСТом. 6.4. Ссылки на цитируемые работы в тексте дают в виде порядковых номеров, заключенных в квадратные скобки. Не следует включать в список литературы диссертации. 6.5. Примеры: 1. Ткаченко Б. И. Физиология человека.— СПб.: Наука, 2000.— 400 с. 2. Шабанов П. Д. Механизмы лекарственной зависимости // Мед. акад. вестн.— 2001.— Т. I, № 1.— С. 27–35. 3. Лебедев А. А. Поведенческие эффекты алаптида у крыс-изолянтов // Эмоциональное поведение / Под ред. Е. С. Петрова.— СПб.: Питер, 2000.— С. 56–78. 7. Данные об авторах статьи должны включать следующие сведения: фамилия, имя, отчество, место работы с указанием города и страны, адрес для переписки и номер телефона для связи, е-mail. 8. Все термины, употребляемые в статье, должны строго соответствовать действующим номенклатурам (анатомической, гистологической и др.), названия лекарственных средств — Государственной Фармакопее, единицы физических величин — системе единиц СИ. 9. Статьи, поступившие в редакцию, обязательно рецензируются. Если у рецензента возникают вопросы, статья возвращается на доработку. Датой поступления статьи считается дата получения редакцией окончательного варианта статьи. Редакция оставляет за собой право внесения редакторских изменений в текст, не искажающих смысла статьи. 11. Авторское право на конкретную статью принадлежит авторам статьи, что отмечается знаком ©. За издательством остается право на оформление, издание, распространение и доведение до всеобщего сведения публикаций, а также включение журнала в различные базы данных и информационные системы. При перепечатке статьи или ее части ссылка па журнал обязательна. 12. Редакция высылает авторам 1 копию журнала, в котором опубликована статья. 13. Редакция не выплачивает гонорара за статьи и не взимает плату за опубликование рукописей. 14 Журнал публикует рекламу по профилю журнала в виде отдельных рекламных модулей, статей, содержащих коммерческую информацию по профилю журнала с указанием «Публикуется на правах рекламы». Размещение рекламы в журнале платное. Объем помещения рекламной информации в журнале ограничен. 15. Материалы следует направлять ответственному секретарю Александру Валентиновичу Дмитриеву. Адрес: Санкт-Петербург, 197022, Каменноостровский пр., д. 71, СЗО РАМН, электронная почта: medicalacfdemicjournal@gmail.com, admitriev10@yandex.ru. Мы рады всем Вашим статьям, представленным в наш журнал! Мнение редакции может не совпадать с точкой зрения авторов опубликованных материалов. Редакция не несет ответственности за последствия, связанные с неправильным использованием информации МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 123 Уважаемые читатели «Медицинского академического журнала»! Сообщаем, что открыта подписка на первое полугодие 2014 года. Наш подписной индекс — 5 7 9 9 9 Периодичность — 4 номера в год. Стоимость одного номера для индивидуальных подписчиков и организаций — 300 руб. Подписка на первое полугодие 2014 года — 600 руб. Для подписки можно воспользоваться бланком. Медицинский академический журнал Свидетельство о регистрации: ПИ № 2-4952 от 17.01.2001 г. Редактор: Т. В. Руксина Верстка: К. К. Ершов Подписано в печать 10.09.13 г. Формат 60×90 1/8. Бумага офсетная. Печать офсетная. Печ. л. 18. Тираж 1000 экз. Отпечатано в типографии: ООО «РИП СПБ», Санкт-Петербург, пер. Дмитровский, д. 7, лит. А, пом. 6-Н. C M Y K 2013 C M Y K P 3 b ТОМ 13 2013 № 3
