Автореферат - Казанский государственный медицинский
реклама
На правах рукописи ШАТСКИХ ОКСАНА АЛЕКСЕЕВНА МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТИМУСА В УСЛОВИЯХ ПОСТУПЛЕНИЯ МЕЛАТОНИНА 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Казань – 2015 2 Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Чувашский государственный университет имени И. Н. Ульянова» Научный руководитель: Сергеева Валентина Ефремовна – доктор биологических наук, профессор кафедры медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет имени И. Н. Ульянова», заслуженный работник высшей школы Российской Федерации Официальные оппоненты: Виноградов Сергей Юрьевич – доктор медицинских наук, профессор кафедры гистологии, эмбриологии, цитологии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ивановская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации Шаймарданова Гульнара Фердинантовна – доктор биологических наук, научный сотрудник лаборатории молекулярных основ патогенеза федерального государственного бюджетного учреждения науки Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И. М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации Защита состоится 28 декабря 2015 года в __ часов на заседании диссертационного совета Д 208.034.01 при ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 49) С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 49 б) и на сайте: www.kgmu.kcn.ru Автореферат разослан «__» _________2015 года. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор Зубаирова Л.Д. 3 ВВЕДЕНИЕ Актуальность В последние годы в связи с увеличением количества различных видов патологий, связанных с недостаточно эффективной работой иммунной системы человека ввиду ухудшения экологии, стрессовых воздействий, алиментарных причин (Долгих О. В. и др., 2012; Chinen J., Shearer W. T., 2008; Amato G. D. et al., 2015), к центральным органам иммунной защиты приковано внимание исследователей (Hanson M. L. et al., 2010; Cui W. et al., 2015). В рамках этой проблемы несомненный интерес представляют вопросы, связанные с функционированием тимуса. Актуальность любых исследований этого органа обусловлена как высокой встречаемостью разных видов патологий, связанных с разнообразными нарушениями работы тимуса (Кулагина Н. Н., 2007), так и явной недостаточностью изученности клеточных основ различных нарушений в вилочковой железе. Одним из наименее исследованных аспектов функционирования тимуса является гуморальная регуляция деятельности различных клеток этого органа. Несмотря на кажущуюся хорошую изученность действия различных регуляторных факторов на вилочковую железу, эта проблема далека от разрешения. Тимус изучали при воздействии ряда гормонов: соматотропного (Спирин И. В., 2007), адренокортикотропного (Лузикова Е. М., 2008), глюкокортикостероидов (Засеева М. Д., 2015), хорионического гонадотропина (Ялалетдинова Л. Р. и др., 2014), вместе с тем влияние одного из важнейших гуморальных факторов организма – мелатонина – на различные клеточные типы тимуса практически не исследовано. На сегодняшний день мелатонин находит всё более широкое применение в клинике как адаптоген при смене часовых поясов, при инсомнии (Мендель В. Э, Мендель О. И., 2010; Innominato P. F. et al., 2015), в терапии патологии сердечнососудистой системы (Inoue Y., 2014) и желудочно-кишечного тракта (Беспятых А. Ю. и др., 2009), климактерического синдрома (Анисимов В. Н., Виноградова И. А., 2008), дегенеративных заболеваний нервной системы 4 (Sanchez-Barcelo E. J. et al., 2010), а также вводится в схемы противоопухолевого лечения при некоторых видах рака (Сорочан П. П. и др., 2012). Широкое клиническое применение мелатонина требует детального изучения всех его биологических функций, особенно эффектов на различные органы иммунной системы, тем более что в некоторых клетках тимуса, селезенки, костного мозга и лимфатических узлов обнаружены рецепторы к мелатонину (Cernysiov V. et al., 2012). В ряде работ показано модулирующее и синхронизирующее влияние мелатонина на деятельность Т-лимфоцитов in vivo и in vitro в культуре клеток и в тимусе (Литвиненко Г. И., 2011, 2015; Carrillo-Vico A. et al., 2013), однако влияние мелатонина на различные структурно-функциональные характеристики тимуса мало изучено. В создании микроокружения лимфоцитов тимуса важное место занимают NK-клетки, макрофаги и тучные клетки (Бибик Е. Ю., Берест А. Ю., 2011; Gupta S., 2005). Уже известно, что экзогенный мелатонин увеличивает количество NK-клеток и моноцитов, как в костном мозге, так и в селезенке (Currier N. L. et al., 2000), однако таких данных для тимуса в литературе нам не встретилось. В работе Ozkanlar S. с соавт. (2015) показано снижение количества положительных на эстеразу тучных клеток в тимусе крыс после введения мелатонина. Вместе с тем мы не обнаружили данные о том, как изменяются различные характеристики тучных клеток в тимусе при введении этого эпифизарного гормона. Недостаточная изученность различных типов клеток в тимусе во многом обусловлена подходов, низкой но информативностью методы классических иммуногистохимии позволяют морфологических корректно их идентифицировать. Так, для выявления кортикальных (дубль-позитивных) тимоцитов используется маркер CD1a (Ковальчук Л. В., 2005), макрофагов – CD68 (Taylor P. R. et al., 2005), натуральных киллеров – CD57 (Lopez-Verges S., 2010). Высокоспецифичным маркером Т-лимфоцитов является CD3 антиген. Мембранное расположение последнего характерно для зрелых Т-лимфоцитов, а цитоплазматическая локализация – для незрелых тимоцитов (Криволапов Ю. А., Леенман Е. Е., 2006). 5 Биогенные амины, такие как гистамин, серотонин и катехоламины, также играют важную роль в процессах функционирования любых клеток (Garcia M. G. et al., 2013; Arreola R. et al., 2015). Изменение содержания биогенных аминов в люминесцирующих клетках тимуса напрямую связано с модуляцией их функций в иммунных реакциях (Михайлова М. Н., 2004). Так, избыточное содержание гистамина и серотонина подавляет функции Т-лимфоцитов (Лузикова Е. М., Сергеева В. Е., 2008). Поэтому изучение изменений содержания биогенных аминов в структурах тимуса под действием мелатонина представляет несомненный интерес, ввиду того, что возможная роль влияния этого гормона на их содержание и секрецию клетками тимуса не исследована. Характер освещения напрямую связан с работой эпифиза и также оказывает влияние на состояние иммунной системы. Так, в ряде работ показано угнетающее действие постоянного освещения на иммунокомпетентные клетки (Бородин Ю. И. и др., 2012), ввиду подавления в организме синтеза мелатонина. Пребывание в постоянной темноте индуцирует эпифизарную гиперфункцию (Timofei O.V. et al., 2013). Однако возможное влияние световой депривации на структурнофункциональные характеристики тимуса практически не изучено. В связи с этим изучение влияния мелатонина на тимус при различных режимах освещения является важным и актуальным в практическом и теоретическом аспектах. Цель работы – изучение морфологической и иммуногистохимической характеристики тимуса лабораторных мышей при поступлении мелатонина с питьевой водой в течение 2 или 4 недель в зависимости от условий освещения. Задачи исследования: 1. Изучить морфометрические характеристики тимуса: площади коркового и мозгового веществ дольки при ежедневном поступлении мелатонина с питьевой водой в концентрации 4 мг/л в течение 2 или 4 недель в условиях естественного освещения или постоянного затемнения. 2. Исследовать количественное распределение CD1а-позитивных, CD3- позитивных клеток во всех зонах долек в тимусе мышей в моделируемых условиях эксперимента. 6 3. Определить особенности локализации и количественного распределения CD57-позитивных и CD68-позитивных клеток во всех зонах долек в тимусе животных, получавших мелатонин в различных световых условиях в течение 2 или 4 недель. 4. Сравнить количество тучных клеток, степень их метахромазии и дегрануляции в соединительнотканных корковых перегородках и паренхиме тимуса мышей при поступлении мелатонина в течение 2 или 4 недель в условиях естественного освещения или постоянного затемнения. 5. Исследовать содержание биогенных аминов (гистамина, серотонина и катехоламинов) в структурах тимусной дольки лабораторных мышей в моделируемых условиях эксперимента. Научная новизна Впервые выявлено, что мелатонин, поступающий ежедневно с питьевой водой в концентрации 4 мг/л в течение 2 или 4 недель в условиях естественного освещения или постоянного затемнения, оказывает иммуномодулирующее действие на тимус, сопровождающееся уменьшением площади коркового вещества и увеличением площади мозгового вещества долек, увеличением количества макрофагов и натуральных киллеров в корковом и мозговом веществе долек тимуса. При этом изменения количественных показателей натуральных киллеров более выражены в тимусе мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения, а макрофагов – в тимусе мышей, находившихся в условиях естественного освещения. Показано, что CD3-позитивные клетки чувствительны, а CD1а-позитивные клетки резистентны к ежедневному поступлению мелатонина в течение 2 или 4 недель в концентрации 4 мг/л независимо от условий освещения. Установлено, что количество тучных клеток в соединительнотканных корковых перегородках и паренхиме тимуса под влиянием мелатонина возрастает, что сопровождается увеличением доли тучных клеток без признаков дегрануляции, и эти изменения более выражены в тимусе мышей, находившихся в условиях постоянной темноты. 7 Выявлено, что при поступлении мелатонина независимо от длительности и условий освещения, происходит снижение содержания гистамина в биоаминсодержащих клетках дольки, и эти изменения носят более выраженный характер в тимусе мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения в течение месяца. Содержание серотонина и катехоламинов в люминесцирующих гранулярных клетках долек после 4 недель поступления мелатонина увеличивается в тимусе мышей, находившихся в условиях естественного освещения, и снижается – в тимусе мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения. Впервые показано, что в условиях поступления экзогенного мелатонина большую чувствительность к характеру освещения проявляют в тимусе макрофаги, NK-клетки и тучные клетки, но не Т-лимфоциты. Теоретическое и практическое значение Результаты проведенных исследований – один из примеров эндокринной регуляции нейроиммунных взаимодействий в тимусе. Они демонстрируют ответную реакцию иммунокомпетентных клеток при непосредственном участии нейромедиаторных биогенных аминов на экзогенный мелатонин, что позволяет расширить представления о роли гормона в деятельности иммунной системы. Выводы и научные положения диссертационной работы могут быть использованы в учебном процессе вузов медико-биологического профиля при изучении дисциплин «Гистология», «Иммунология», «Эндокринология». Полученные результаты относятся к области фундаментальных исследований и расширяют представления о закономерностях нейрогуморального обеспечения иммунного гомеостаза. Это может быть учтено при создании методов моделирования иммунного ответа с применением гормонов, в частности мелатонина. Реализация результатов исследования Научные положения, выводы и фотоматериалы диссертационного исследования используются в учебном процессе ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет имени И. Н. Ульянова», в работе бюджетного учреждения «Республиканская клиническая больница» МЗСР ЧР, автономного 8 учреждения Чувашской Республики «Институт усовершенствования врачей» МЗСР ЧР. Степень достоверности и апробация результатов Для обработки (гистологические полученного препараты, в ходе цифровые эксперимента данные) было материала использовано сертифицированное оборудование. Клеточные маркеры CD1a, CD3, CD57, CD68 широко используются в клинике. Достоверность полученных результатов в ходе исследования была обеспечена с помощью подбора адекватных иммуногистохимических и люминесцентно-гистохимических методов, последующей статистической обработки. Основные научные положения, выводы и результаты доложены и обсуждены на 8-й Всероссийской научной конференции «Бабухинские чтения в Орле» (Москва, 2011), Всероссийском молодежном научного семинаре «Наука и инновации – 2012» (Йошкар-Ола, 2012), II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Морфология в теории и практике», посвященной 90-летию со дня рождения Д. С. Гордон (Чебоксары, 2012), 86-й Всероссийской научной конференции памяти академика АН РТ, профессора И. Г. Салихова (Казань, 2012), XIX Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (Дубай, 2012), V Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения – 2013» (СанктПетербург, 2013), Научно-практической конференции, посвященной 40-летию кафедры патофизиологии «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Чебоксары, 2014), Всероссийской научнопрактической конференции с международным участием «Современные проблемы естественно-научных исследований» (Чебоксары, 2014), 89-й Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых (Казань, 2015), Международной научно-практической конференции «Теоретические и прикладные проблемы современной науки и образования» (Курск, 2015). Научные положения, выносимые на защиту: 1. Поступление мелатонина в организм лабораторных мышей в течение 2 или 4 недель в условиях естественного освещения или постоянного затемнения 9 приводит к снижению площади коркового вещества и увеличению площади мозгового вещества долек тимуса. Одновременно наблюдается уменьшение численности CD3-позитивных клеток и увеличение количества макрофагов, натуральных киллеров в корковом веществе долек тимуса; уменьшение количества CD3-позитивных клеток и увеличение количества макрофагов, натуральных киллеров в мозговом веществе долек тимуса, что сопровождается снижением содержания гистамина в люминесцирующих клетках долек и увеличением количества тучных клеток без признаков дегрануляции в тимусе. 2. В условиях поступления экзогенного мелатонина большая зависимость от световых условий в тимусе проявляется в содержании макрофагов, тучных клеток и натуральных киллеров, но не Т-лимфоцитов. Публикации Основные положения диссертации отражены в 12 опубликованных работах, 8 из них (3 статьи и 5 публикаций с тезисами докладов) – в центральных периодических журналах и изданиях, рекомендованных ВАК РФ для защиты кандидатских и докторских диссертаций. Структура и объем диссертации Диссертационный материал изложен на 172 страницах компьютерного исполнения и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственного исследования, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка использованной литературы, списка сокращений, списка иллюстративного материала. Работа включает 10 таблиц и 40 рисунков, из которых 20 – диаграммы и 20 – микрофотографии. Список литературы содержит 101 отечественный и 268 иностранных источников. Личное участие автора Автором лично осуществлялся выбор экспериментальных животных, разработка схемы эксперимента, условий и сроков воздействия, дозировки мелатонина, выведение животных из эксперимента, приготовление криостатных срезов, постановка люминесцентно-гистохимических реакций по методам Кросса, Эвена, Роста и Фалька–Хилларпа, цитоспектрофлуориметрия, выбор 10 иммуногистохимических маркеров, микроскопия препаратов, фотографирование, статистическая обработка данных. Написание глав диссертационного исследования, подготовка материалов к публикации проводились автором самостоятельно. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Научные опыты были проведены в 2008 – 2015 гг. в лаборатории кафедры медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии медицинского факультета ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет имени И. Н. Ульянова» согласно государственному плану по теме «Гистохимия биогенных аминов в морфофункциональном состоянии органов и тканей в норме и эксперименте (№ 0120.0851887 от 10.09.2008 г.)». Эксперименты проводились в осенне-зимний период года – с ноября по январь. Все исследования проводились при одобрении этического комитета медицинского факультета Чувашского государственного университета имени И. Н. Ульянова. Объектом исследования служил тимус 160 белых нелинейных мышейсамцов 2-месячного возраста массой 20-22 г. Животные были распределены на 8 групп: 1-я контрольная (n = 20) – мыши содержались в течение 2 недель эксперимента в обычных условиях вивария (естественное освещение; продолжительность светового дня 7 – 9 часов; освещенность на уровне клеток в утренние часы 50 – 150 лк, днем в пасмурный день – до 500 лк, в ясный день – до 1000 лк, вечером 100 – 200 лк; свободный доступ к питьевой воде и корму); 1-я опытная (n = 20) – мыши получали мелатонин (препарат «Мелаксен» (синтезированный мелатонин), Unipharm, Inc., США) в концентрации 4 мг/л с питьевой водой в течение 2 недель и находились в условиях естественного освещения; 2-я контрольная (n = 20) – мыши находились в условиях постоянного затемнения (клетки затемнялись черной тканью, непропускающей свет, освещенность в клетках в течение дня составляла 0 – 0,5 лк) в течение 2 недель эксперимента; 2-я опытная (n = 20) – мыши получали мелатонин в концентрации 4 мг/л с питьевой водой в течение 2 недель и находились в условиях постоянного 11 затемнения; 3-я контрольная (n = 20) – мыши содержались в естественных условиях освещения в течение 4 недель эксперимента; 3-я опытная (n = 20) – мыши получали мелатонин в концентрации 4 мг/л с питьевой водой в течение 4 недель и находились в условиях естественного освещения; 4-я контрольная (n = 20) – мыши находились в условиях постоянного затемнения в течение 4 недель; 4-я опытная (n = 20) – мыши получали мелатонин в концентрации 4 мг/л с питьевой водой в течение 4 недель и находились в условиях постоянного затемнения. Поскольку других источников жидкости опытные животные не имели, они потребляли воду с мелатонином, что фиксировалось. В среднем одна мышь потребляла 6 мл воды в сутки, что в пересчете составило 25 мкг мелатонина в день на одно животное. Тимус у животных забирался после декапитации на 14-е и 28-е сутки эксперимента во второй половине дня (1500–1700). Все действия, предусматривавшие контакт с лабораторными животными, осуществлялись с учетом требований «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ МЗ РФ от 19.06.2003 г. №267) и в соответствии с «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях». Методы исследования 1. Окраска гематоксилином и эозином для проведения общегистологической характеристики структур тимуса (Роймес Б., 1954). 2. состояния Окраска полихромным толуидиновым синим по Унна для оценки тканевых мукополисахаридов и гепарина в тучных клетках (Бочкарев В. А., 1988, Гордон Д. С., 1982). 3. Люминесцентно-гистохимический метод Фалька – Хилларпа в модификации Е. М. Крохиной для выявления серотонин- и катехоламинсодержащих структур тимуса (Крохина Е. М., 1969; Falk В., Hillarp N. A., 1962). 4. Люминесцентно-гистохимический метод Кросса, Эвена, Роста для выявления гистаминсодержащих структур тимуса (Cross S. A., Ewen S. W., Rost F. W., 1971). 12 5. Цитоспектрофлуориметрия для идентификации и количественного измерения содержания гистамина, серотонина и катехоламинов в клетках тимуса. 6. Иммуногистохимический метод (Kumar G. L., Rudbeck L., 2011) с использованием поликлональных и моноклональных антител к следующим антигенам: CD1a (Santa Cruz, США), CD3 (Santa Cruz, США), CD57 (Dako, Дания), CD68 (Dako, Дания). Парафиновые срезы толщиной 5 мкм наносились на предметные стекла, обработаные L-polysine. В последующем срезы органа подвергались сушке при комнатной температуре в течение 24 часов. Окраска препаратов происходила по стандартным протоколам ручными и аппаратными способами с помощью иммуногистохимических автостейнеров AUTOSTAINER-360 (THERMO, Великобритания) и Leica BOND-MAX (Германия). 7. Метод морфометрии. Производился подсчет клеток в 50 полях зрения микроскопа Микмед-5 (ОАО Ломо, Россия) при увеличении 400 и 1000 с помощью программы «Image G». Измерение площади коркового и мозгового вещества долек тимуса производилось с применением демо-версии программы «Sigma Scan Pro 5.0». 8. Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета программ Microsoft Оffice® Excel 2007 и SPSS Statistics 17.0 (2008) (Плеханов А. В., 2010). СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Морфологическая характеристика тимуса При окраске гематоксилином и эозином гистологических срезов тимуса мышей контрольных и опытных групп визуализируются дольки с темным корковым веществом и более светлым мозговым веществом. Поступление мелатонина в течение 2 недель приводит к снижению соотношения Sк.в/Sм.в по отношению к данному показателю у контрольных животных в 1,3 раза (p < 0,001) независимо от условий освещения. На 4-й неделе поступления гормона в различных световых условиях структурные изменения имеют более выраженный характер, что проявляется уменьшением площади коркового вещества (в 1,5 раза в условиях естественного освещения, в 1,4 раза в 13 условиях постоянного затемнения, p < 0,001) и увеличением площади мозгового вещества дольки (в 2,0 раза в условиях естественного освещения, в 2,25 раза в условиях постоянного затемнения, p < 0,001), снижением соотношения Sк.в./Sм.в. (с 4,74±0,14 до 1,77±0,07 в условиях естественного освещения, с 5,11±0,12 до 1,83±0,10, p < 0,001, в условиях постоянного затемнения). Иммуногистохимическое исследование структур тимуса CD1а-позитивные клетки (кортикальные тимоциты) располагаются в корковом веществе долек тимуса непосредственно под капсулой органа, и их количество составляет у контрольных мышей, находившихся в условиях естественного освещения 47,46±2,74 и 46,68±2,54 клеток в поле зрения, под влиянием мелатонина – 46,80±1,60 и 51,60±2,09 клеток в поле зрения (2 и 4 недели эксперимента соответственно). В условиях постоянного затемнения в тимусе контрольных мышей количество CD1а-позитивных клеток составляет 41,50±1,97 и 40,16±2,49 в поле зрения, под влиянием мелатонина – 43,20±2,36 и 44,30±2,47 клеток в поле зрения (2 и 4 недели эксперимента соответственно). Поступление мелатонина в течение 2 или 4 недель в различных условиях освещения приводит к снижению количества CD3-позитивных лимфоцитов в корковом и мозговом веществе долек тимуса мышей (Таблица 1). При этом наиболее выраженное снижение количества CD3-позитивных клеток в тимусе отмечается на 4-й неделе поступления гормона независимо от условий освещения (Рисунки 1, 2). Количество CD57-позитивных клеток (натуральных киллеров) после поступления мелатонина в течение 2 или 4 недель значительно увеличивается во всех зонах долек тимуса. Так, у мышей, содержавшихся в условиях естественного освещения, при поступлении с питьевой водой мелатонина установлено увеличение количества CD57-позитивных клеток в корковом веществе долек тимуса в 4,7 и 3,5 раза (p < 0,001) для сроков две и четыре недели соответственно, а в мозговом – в 5,0 раз (p < 0,001) для обоих сроков. Эти изменения носят более выраженный характер в условиях постоянного затемнения и заключаются в увеличении количества CD57-позитивных клеток в корковом веществе долек 14 тимуса в 6,0 и 6,4 раза (p < 0,001), а в мозговом – в 8 и в 7,5 раза (p < 0,001) для сроков две и четыре недели соответственно. Таблица 1 – Количество CD3-позитивных клеток в морфофункциональных зонах долек тимуса экспериментальных мышей (M±m) Параметр КВ долек МВ долек Граница КВ и МВ Параметр Группы экспериментальных мышей Срок эксперимента – 2 недели Естественное освещение Постоянное затемнение контроль опыт контроль опыт 548,06±11,79 415,02±9,24** 516,12±8,20 426,96±13,07** 414,18±10,20 357,30±6,49** 390,12±8,16 334,40±8,26** 166,20±2,78 128,16±3,10** 149,02±4,29 132,76±4,17* Срок эксперимента – 4 недели Естественное освещение Постоянное затемнение контроль опыт контроль опыт 536,88±10,77 305,52±11,77** 521,14±12,75 320,84±8,97** 421,36±9,81 254,82±9,63** 403,30±12,38 237,20±6,49** КВ долек МВ долек Граница 158,72±2,13 110,72±2,78** КВ и МВ * – p < 0,05, ** – p < 0,001 а 152,32±2,86 107,76±2,52** б Рисунок 1 – CD3-позитивные клетки в тимусе мышей, находившихся в условиях естественного освещения в течение 4 недель: а – контроль; б – поступление мелатонина Иммуногистохимическая реакция к CD3. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 100. Ок. 10 15 а б Рисунок 2 – CD3-позитивные клетки в тимусе мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения в течение 4 недель: а – контроль; б – поступление мелатонина Иммуногистохимическая реакция к CD3. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 100. Ок. 10 Количество макрофагов (CD68-позитивных клеток) в тимусе лабораторных мышей, находившихся в условиях естественного освещения, под действием мелатонина увеличивается в корковом веществе долек в 5,7 и 5,4 раза (p < 0,001), а в мозговом – в 3,5 и 3,9 раза (p < 0,001) на 2-й и 4-й неделе соответственно. В условиях постоянного затемнения эти изменения менее значительны, и заключаются в увеличении количества макрофагов в корковом веществе долек тимуса в 4,5 и 4,2 раза (p < 0,001), а в мозговом – в 2,0 раза и в 2,1 раза (p < 0,001) на 2 и 4 неделе поступления гормона соответственно. Тучные клетки тимуса В тимусе контрольных мышей, содержавшихся в условиях постоянного затемнения в течение 2 или 4 недель, отмечается усиление дегрануляции тучных клеток, а также увеличение общего количества тучных клеток на 4-й неделе эксперимента в 1,6 раза в соединительнотканных корковых перегородках (p < 0,001), в 1,5 раза в паренхиме тимуса (p < 0,05). Поступление мелатонина в условиях естественного освещения вызывает статистически значимое изменение количества тучных клеток в тимусе только на 4-й неделе эксперимента, что проявляется в увеличении их количества в 1,3 раза в корковых перегородках и 1,4 раза в паренхиме органа (p < 0,05). Поступление гормона в условиях 16 постоянного затемнения приводит к увеличению количества тучных клеток независимо от сроков эксперимента, как в корковых перегородках, так и паренхиме органа, что превышает данный показатель контрольных мышей в 1,4 и 1,3 раза (p < 0,05) соответственно на 2-й неделе эксперимента, и в 1,5 (p < 0,001) и в 1,3 раза (p < 0,05) соответственно на 4-й неделе эксперимента. Доля Т0 форм (без признаков дегрануляции) тучных клеток в тимусе мышей, находившихся условиях естественного освещения в течение 2 или 4 недель, под влиянием мелатонина имеет тенденцию к увеличению за счет снижения доли Т3 форм (полностью дегранулированных) тучных клеток. Поступление мелатонина в течение 2 или 4 недель в условиях постоянного затемнения приводит к более выраженному увеличению доли Т0 форм тучных клеток как в корковых перегородках (с 4% до 34% и с 1% до 33% соответственно для сроков 2 и 4 недели p < 0,001), так и в паренхиме тимуса (с 7% до 39% и с 5% до 36% соответственно, p < 0,001) по сравнению с контрольной группой за счет снижения доли Т3 форм тучных клеток. Биоаминсодержащие структуры тимуса Постоянное затемнение (в течение 2 или 4 недель) вызывает увеличение содержания гистамина во всех структурах тимуса контрольных мышей. Поступление мелатонина в течение 2 или 4 недель независимо от условий освещения приводит к снижению интенсивности люминесценции гистамина в люминесцирующих гранулярных клетках коркового вещества, люминесцирующих гранулярных клетках на границе коркового и мозгового вещества, лимфоцитах коркового и мозгового вещества долек тимуса (Рисунки 3, 4). Более выраженное снижение содержания гистамина отмечается в люминесцирующих клетках долек тимуса мышей, получавших мелатонин в условиях постоянного затемнения в течение 4 недель. 17 18 18 16 16 14 12 10 14 ** ** * ** 8 12 контроль мелатонин 10 ** 8 6 6 4 4 2 2 0 ** * контроль мелатонин 0 2 недели естественное освещ ение 2 недели постоянное затемнение 4 недели естественное освещ ение 4 недели постоянное затемнение 2 недели естественное освещ ение 2 недели постоянное затемнение а 4 недели естественное освещ ение 4 недели постоянное затемнение б Рисунок 3 – Интенсивность люминесценции гистамина в люминесцирующих гранулярных клетках коркового вещества (а) и люминесцирующих гранулярных клетках на границе коркового и мозгового вещества (б) долек тимуса экспериментальных мышей, усл. ед. * – p < 0,05, ** – p < 0,001 14 12 12 10 10 8 8 6 4 ** контроль ** ** ** мелатонин ** 6 4 контроль * ** ** мелатонин 2 2 0 0 2 недели естественное освещ ение 2 недели постоянное затемнение 4 недели естественное освещ ение 4 недели постоянное затемнение 2 недели естественное освещ ение а 2 недели постоянное затемнение 4 недели естественное освещ ение 4 недели постоянное затемнение б Рисунок 4 – Интенсивность люминесценции гистамина в лимфоцитах коркового вещества (а) и лимфоцитах мозгового вещества (б) долек тимуса экспериментальных мышей, усл. ед. * – p < 0,05, ** – p < 0,001 Интенсивность свечения серотонина и катехоламинов на 4-й неделе поступления мелатонина в гранулярных люминесцирующих клетках коркового вещества и гранулярных люминесцирующих клетках на границе коркового и мозгового вещества долек увеличивается в тимусе мышей, находившихся в условиях естественного освещения, и снижается в тимусе мышей, находившихся в условиях постоянного затемнения (Рисунки 5, 6). Значения серотонинового индекса в клетках тимусной дольки мышей, получавших мелатонин в различных световых условиях в течение 2 или 4 недель, не имеет резких колебаний. Так, у мышей, находившихся в условиях естественного освещения в течение 2 и 4 недель, серотониновый индекс в биоаминсодержащих клетках тимуса варьирует от 0,85 до 1,11, а в условиях постоянного затемнения – от 0,95 до 1,04. 18 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ** ** ** контроль мелатонин 2 недели естественное освещ ение 2 недели постоянное затемнение 4 недели естественное освещ ение 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 4 недели постоянное затемнение * ** * контроль мелатонин 2 недели естественное освещ ение 2 недели постоянное затемнение а 4 недели естественное освещ ение 4 недели постоянное затемнение б Рисунок 5 – Интенсивность люминесценции серотонина в люминесцирующих гранулярных клетках коркового вещества (а) и люминесцирующих гранулярных клетках на границе коркового и мозгового вещества (б) долек тимуса экспериментальных мышей, усл. ед. * – p < 0,05, ** – p < 0,001 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ** ** ** контроль мелатонин 2 недели естественное освещ ение 2 недели постоянное затемнение 4 недели естественное освещ ение 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 4 недели постоянное затемнение ** * ** контроль мелатонин 2 недели естественное освещ ение 2 недели постоянное затемнение 4 недели естественное освещ ение 4 недели постоянное затемнение Рисунок 6 – Интенсивность люминесценции катехоламинов в люминесцирующих гранулярных клетках коркового вещества (а) и люминесцирующих гранулярных клетках на границе коркового и мозгового вещества (б) долек тимуса экспериментальных мышей, усл. ед. * – p < 0,05, ** – p < 0,001 Характер корреляционных связей по содержанию серотонина и катехоламинов в клетках тимуса при поступлении мелатонина в различных световых условиях в течение 2 или 4 недель отражает тесную сопряженность уровней свечения данных биоаминов между собой. Это проявляется в существовании умеренных и сильных прямых корреляционных связей в паре серотонин – катехоламины в структурах тимуса мышей, получавших мелатонин в течение 2 или 4 недель независимо от условий освещения. Таким образом, результаты нашего исследования демонстрируют наличие теснейших взаимосвязей между нервной, эндокринной и иммунной системами. Поступление мелатонина в течение 2 или 4 недель в различных условиях освещения приводит к структурно-функциональным изменениям в тимусе, которые сопровождаются уменьшением количества CD3-позитивных тимоцитов и 19 увеличением численности макрофагов, натуральных киллеров и тучных клеток. Причем эти изменения происходят при одновременном перераспределении биогенных аминов в клетках тимуса. Известно, что различные клетки иммунной системы могут иметь разные нейроэндокринные синхронизаторы (Литвиненко Г. И., 2010). В условиях поступления экзогенного мелатонина при нахождении в постоянном затемнении или естественном освещении мышей в нашей работе фиксируются различия в реакции макрофагов, тучных клеток, натуральных киллеров и Т-лимфоцитов. Так, макрофаги, натуральные киллеры и тучные клетки проявляют большую зависимость от смены светового режима, чем тимоциты. Качественные и количественные характеристики тучных клеток, принимающих непосредственное участие в создании микроокружения тимоцитов, изменение содержания биогенных аминов в клетках, имеющих большое значение в процессах пролиферации и дифференцировки Т-лимфоцитов, по результатам нашего исследования, также зависят от условий освещения. 20 ВЫВОДЫ 1. Поступление мелатонина с питьевой водой в концентрации 4 мг/литр в течение 4 недель в условиях естественного освещения или постоянного затемнения вызывает снижение площади коркового вещества и увеличение площади мозгового вещества долек тимуса мышей. 2. Количество CD3-позитивных клеток в тимусе мышей, получавших мелатонин: а) снижается в корковом веществе долек в 1,3 раза и в 1,8 раза (p < 0,001) для сроков 2 и 4 недели соответственно в условиях естественного освещения; б) снижается в корковом веществе долек в 1,2 и 1,6 раза (p < 0,001) для сроков 2 и 4 недели соответственно в условиях постоянного затемнения; в) в мозговом веществе долек тимуса, независимо от условий освещения, количество CD3-позитивных клеток уменьшается в 1,2 и в 1,7 раза (p < 0,001) для сроков две и четыре недели соответственно. Количество CD1а-позитивных клеток не претерпевает значимых изменений. 3. Поступление мелатонина в течение 2 или 4 недель в различных условиях освещения приводит к увеличению количества CD57- и CD68позитивных клеток во всех зонах долек тимуса с достижением максимальных показателей на 4-й неделе. Изменение содержания CD57-позитивных клеток более выражено при поступлении гормона в условиях постоянного затемнения, а CD68-позитивных клеток – в условиях естественного освещения. 4. Постоянное затемнение приводит к увеличению количества тучных клеток и усилению их дегрануляции в тимусе, что наиболее выражено на 4-й неделе эксперимента. Поступление мелатонина на сроках 2 или 4 недели увеличивает долю недегранулирующих форм тучных клеток при увеличении их общего количества, что более выражено в тимусе мышей при постоянном затемнении. 5. Содержание гистамина во всех клетках тимуса: а) при постоянном затемнении увеличивается; б) под влиянием мелатонина снижается, что более значительно в тимусе мышей в условиях постоянного затемнения. 21 6. Содержание катехоламинов и серотонина в гранулярных люминесцирующих клетках дольки на 4-й неделе поступления гормона: а) увеличивается в тимусе мышей при естественном освещении; б) снижается в тимусе мышей при постоянном затемнении. 7. Характер освещения при поступлении мелатонина более значим в тимусе для макрофагов, натуральных киллеров, тучных клеток, чем для Т-лимфоцитов. РЕКОМЕНДАЦИИ 1. При проведении практических занятий по биологии, гистологии, иммунологии, эндокринологии в образовательных учреждениях медицинского профиля необходимо выделять роль взаимосвязей между нервной, эндокринной и иммунной системами в адаптационных процессах организма к действию факторов внешней и внутренней среды. 2. Полученные данные об особенностях иммуномодулирующего действия мелатонина в зависимости от световых условий необходимо учитывать в клинических подходах к терапии этим эпифизарным гормоном. 3. Учитывать морфологических полученные изменениях в результаты тимусе, настоящей сопровождающихся работы о изменением количества Т-лимфоцитов, макрофагов, натуральных киллеров, тучных клеток и уровней люминесценции биоаминов после поступления мелатонина в различных световых условиях при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедрах гистологии медицинских и биологических факультетов ВУЗов. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Шатских, О. А. Морфофункциональная реакция натуральных киллеров и макрофагов селезенки на введение мелатонина животным, содержащимся при различных световых режимах / О. А. Шатских, Е. М. Лузикова // Морфология. – 2012. – Т. 141, № 1. – С. 43 – 46. 22 2. Шатских, О. А. Исследование CD57+ клеток тимуса при введении мелатонина / О. А. Шатских, В. Е. Сергеева, Е. М. Лузикова // Материалы седьмой международной научной школы «Наука и инновации – 2012» ISS «SI–2012». – Йошкар-Ола: МарГУ, 2012. – С. 177 – 181. 3. Шатских, О. А. Морфофункциональная реакция CD57+ клеток тимуса на фоне введения мелатонина животным, содержащимся в различных световых условиях / О. А. Шатских, Е. М. Лузикова // Сборник тезисов по материалам 86-й Всероссийской студенческой научной конференции памяти чл.-корр. АН РТ, проф. И. Г. Салихова и 15-й Всероссийской медико-исторической конференции, посвященной 200-летию клинического медицинского образования в Казани. – Казань: Изд-во Казанского государственного медицинского университета, 2012. – С. 242. 4. Шатских, О. А. Морфо-функциональная реакция макрофагов селезенки на введение мелатонина и тироксина / Е. М. Лузикова, В. Е. Сергеева, О. А. Шатских, Г. Ф. Хуснетдинова // Электронный научнообразовательный вестник «Здоровье и образование в XXI веке». – 2012. – Т. 14, № 8. – С. 208 – 209. 5. Шатских, О. А. Исследование корреляционных отношений между биоаминами в структурах тимуса при введении мелатонина / О. А. Шатских, В. Е. Сергеева // Международный научно-исследовательский журнал. – 2013. – № 6 (13), Ч. 3. – С. 65 – 66. 6. Шатских, О. А. Реакция аминосодержащих структур тимуса на введение мелатонина при разных режимах освещения / О. А. Шатских // Вестник Чувашского университета. – 2013. – № 3. – С. 568 – 572. 7. Шатских, О. А. Состояние тучных клеток на фоне введения мелатонина / О. А. Шатских, Е. М. Лузикова, В. Е. Сергеева // Журнал научных статей «Здоровье и образование в XXI веке». – 2013. – Т. 15, № 1–4. – С. 213 – 214. 8. Шатских, О. А. К вопросу о характеристике тучноклеточной популяции при перераспределении гистамина в лимфоидных органах 23 лабораторных животных // В. С. Гордова, О. А. Шатских, Т. Л. Смирнова и др. / Аллергология и иммунология. – 2013. – Т. 14, № 3. – С. 191. 9. Шатских, О. А. Влияние мелатонина на CD68+ клетки тимуса / О. А. Шатских, В. Е. Сергеева // Современные проблемы естественно-научных исследований: сборник научных статей. – Чебоксары: Изд-во Чуваш. гос. пед. унта, 2014. – С. 61 – 63. 10. Шатских, О. А. Адаптационная реакция макрофагов лимфоидных органов лабораторных животных на введение иммуномодуляторов / В. С. Гордова, О. А. Шатских, Е. М. Лузикова и др. // Аллергология и иммунология. – 2015. – Т. 16, № 3. – С. 312 – 313. 11. Шатских, О. А. Тучные клетки тимуса при введении мелатонина / О. А. Шатских, В. Е. Сергеева // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2015. – № 8. – С. 973. 12. Шатских, О. А. Реакция CD1а- и CD3-позитивных клеток тимуса при введении мелатонина в различных световых условиях [Электронный ресурс] / О. А. Шатских, Е. М. Лузикова, В. Е. Сергеева // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 5. – Режим доступа: http://www.science-education.ru/128-21615. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ КВ – корковое вещество дольки тимуса; ЛК – люкс; МВ – мозговое вещество дольки тимуса; CD (cluster of differentiation) – кластер дифференцировки; NK – натуральные киллеры; Sк.в – площадь коркового вещества дольки; Sм.в – площадь мозгового вещества дольки.
