Баланс Тh1/Th2-хелперов, уровень апоптоза при болезни Грейвса – Базедова

Баланс Тh1/Th2-хелперов,
уровень апоптоза
при болезни Грейвса – Базедова
и аутоиммунной офтальмопатии
В
последние годы в Республике Беларусь,
как и во многих странах, отмечается рост
случаев болезни Грейвса – Базедова (БГБ).
С данным заболеванием наиболее часто ассоциируется аутоиммунная офтальмопатия
(АИО), которая представляет собой органоспецифическое аутоиммунное заболевание, проявляющееся клинически примерно
в 50–60 % случаев БГБ [11]. Многие аспекты
патогенеза аутоиммунных заболеваний щитовидной железы остаются дискутабельными.
Неясны причины развития у ряда пациентов
АИО, в то время как у других больных с БГБ
отсутствуют проявления офтальмопатии.
В последнее время большое внимание уделяется изучению апоптоза с точки зрения
влияния его на различные патологические
процессы. Роль апоптоза значима в уравновешивании эффекта клеточной пролиферации, дифференцировки, а также элиминации функционально неполноценных иммунокомпетентных клеток. Одним из ведущих
механизмов развития аутоиммунных заболеваний щитовидной железы считают нарушение функции рецептора гибели клеток Fas
(СД95, APO-1) и его лиганда FasL. Известен
тот факт, что, несмотря на экспрессию Fas
и FasL, апоптоз тироцитов не характерен для
БГБ. Возможно, это обусловлено высоким
уровнем антител к рецептору тиротропного гормона при данной патологии и повышенной экспрессией ингибитора апоптоза
Bcl-2 [2]. В ряде работ показано, что при
БГБ повышен уровень растворимой формы
рецептора sFas, обладающей антиапоптоген-
Гончарова Н. В.,
Космачева С. М.,
Шпак И. Р.,
Данилова Л. И.,
Романовский А. А.
Научно-практический центр
гематологии и трансфузиологии,
БелМАПО,
Минск
ным действием за счет нарушения взаимодействия Fas/FasL. Увеличение sFas может блокировать процесс делеции В-лимфоцитов, что
способствует продукции антител к рецептору
тироторопного гормона [7]. В то же время
лимфоциты, инфильтрирующие щитовидную железу больных с БГБ, усиленно подвергаются процессам апоптоза. В научном
мире продолжается дискуссии относительно
характера нарушений апоптоза лимфоцитов
при БГБ. Существуют данные о снижении
экспрессии Fas-рецепторов на поверхности
периферических лимфоцитов, в то же время
при тяжелых формах БГБ отмечено повышение содержания экспрессирующих Fas CD4+
лимфоцитов [4, 8]. Нарушение механизмов
апоптоза приводит к изменению субпопуляционных взаимоотношений регуляторных
Т-лимфоцитов, что в свою очередь является
патогенетическим механизмом прогрессирования органоспецифической аутоиммунной
патологии [1]. В литературе активно обсуждается роль различных Т-хелперных субпопуляций в патогенезе БГБ и АИО. Выделяют
Th1-хелперы, продуцирующие INF-γ, TNF-α,
IL-2 и Th2-хелперы, вырабатывающие IL-4,
IL-10, IL-5, IL-13 [9]. Существующие в литературе данные о преимущественно клеточноопосредованном Th1 или гуморальном Th2
характере иммунных реакций при БГБ и АИО
противоречивы [10]. При БГБ регистрируют
как Th1 либо Th2, так и смешанные варианты
ответа, что определило наш интерес к уточнению данного вопроса.
136
КЛИНИКА
Научная публикация
„ ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Целью настоящей работы явилось исследование апоптоза и субпопуляционных изменений в клеточном звене иммунитета у больных с болезнью Грейвса – Базедова и в сочетании аутоиммунной офтальмопатией на фоне
тиростатической терапии.
„ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
На базе отделения эндокринологии 10-й
городской клинической больницы г. Минска
обследовано 28 больных БГБ. Исследование
проводилось в динамике: при поступлении
в клинику и через 6 недель после поведенного
лечения. Больные были разделены на 2 группы
в зависимости от наличия АИО: 10 пациентов
с болезнью БГБ и 14 больных БГБ в сочетании
с АИО. Средний возраст больных с АИО составил (39,05 ± 3,01) (3 мужчин, 11 женщин),
с БГБ – (41,7 ± 4,1) лет (4 мужчин, 6 женщин).
Все включенные в исследование больные исходно находились в состоянии тиротоксикоза. Пациентам проводилась тиростатическая
терапия препаратами метимазола (тирозол,
мерказолил) в дозе 15–30 мг/сут. При сочетании тиротоксикоза с активной АИО (9/14) дополнительно назначались глюкокортикоиды
(метилпреднизолон, преднизолон) в дозе 1 мг/
кг через день per os по альтернирующей схеме.
Контрольную группу составили 27 здоровых,
сопоставимых по полу и возрасту первичных
доноров.
Набор образцов крови для иммунологических исследований осуществлялся в стерильные «вакутайнеры» с гепарином, для
гормональных исследований – в пробирки без консерванта для сыворотки крови.
Определяли спонтанный и активированный
апоптоз в выделенных на градиенте плотности мононуклеарах периферической крови
(МПК), которые культивировали в течение
3 суток в присутствии митогена – фитогемаглютинина (ФГА). Апоптотические клетки детектировали на проточном цитофлуориметре «FACScan» (Becton Dickinson, San
Jose, США) с 15 мВт 488 нм аргон-ионным
лазером и 585/42 (FL2) дискриминационном фильтром. Данные анализировали после выделения логического гейта бластной
популяции в dot/plot распределении клеток
«Рецепт» № 4 (60), 2008
по их линейному переднему (FSC) и боковому (SSC) светорассеиванию. Минимум
10 000 клеток анализировалось на пробу.
Сбор и анализ данных проводили с помощью программы «LYSIS II software» (Becton
Dickinson, США).
Субпопуляции Т-хелперов определяли с помощью моноклональных антител
(anti-human IL-4 FITC конъюгированный
и anti-human INF-γ R-PE-конъюгированный,
Sigma) по содержанию внутриклеточных
цитокинов в цитоплазме лимфоцитов одновременно с фенотипированием этих клеток.
Определение внутриклеточных цитокинов
проводили в выделенных на градиенте плотности МПК, культивируемых в среде RPMI1640 (Sigma). МПК стимулировали поликлональными активаторами – ФМА и иономицином в присутствии ингибитора аппарата
«Гольджи» – монензина, для накопления внутриклеточных цитокинов. Количество Тh1(CD4+/INF-γ) и Тh2-(CD4+/IL-4)-клеток,
содержащих внутриклеточные цитокины,
оценивали с помощью проточной цитометрии при окрашивании соответственно антиγIFN или анти-IL-4 моноклональных антител
среди CD4+ лимфоцитов. Аналитическую
цитометрию проводили на проточном цитофлуориметре FACScan (Becton Dickinson, San
Jose, США).
Для определения уровней тиротропного
гормона (ТТГ) и свободного Т3 (св.Т3) использовали высокочувствительные наборы для
иммуноферментного анализа (Abbot, США),
свободный Т4 (св.Т4) определяли РИА (Roche,
Германия), антитела к тироидной пероксидазе (АТПО) также с использованием ИФА
(Abbot, США).
Cтатистическую обработку полученных
результатов осуществляли с помощью пакета
компьютерных программ «SPSS for Windows
13.0». Количественные данные представлены
в виде М ± σ. Для сравнения показателей
в группах и с контролем применялся непараметрический тест Манна – Уитни, при оценке
изменения показателей по сравнению с исходными данными – критерий Уилкоксона.
Различия оценивали как статистически
достоверные при значениях степени вероятности р < 0,05.
137
Баланс Тh1/Th2-хелперов, уровень апоптоза
при болезни Грейвса – Базедова и аутоиммунной офтальмопатии
Таблица 1
Показатели тироидного статуса наблюдаемых больных и группы контроля
БГБ, n = 10
БГБ+АИО, n = 14
через 6 недель
через 6 недель
до лечения
до лечения
лечения
лечения
5,6 ± 0,9**
10,3 ± 3,1♦
5,7 ± 1,2
22,67 ± 4,02♦♦
сТ3 пмоль/л
(9,81–36,01)
(4,1–11,3)
(5,8–34,1)
(3,8–14,5)
66,87 ± 11,5♦♦
26,3 ± 5,2*♦♦
39,3 ± 8,2♦♦
22,4 ± 4,6*♦
сТ4 пмоль/л
(36,5–100)
(18,4–34,6)
(13,4–99)
(17–36,2)
0,24 ± 0,1♦♦
0,52 ± 0,21♦♦
0,79 ± 0,3♦♦
0,23 ± 0,08♦♦
TТГ мМЕ/л
(0–0,618)
(0,016–0,71)
(0,005–0,88)
(0,01–2,2)
АТПО
325,49 ± 111,9♦♦ 568,2 ± 46,0♦♦ 950,56 ± 255,6♦♦ 624,1 ± 112,0♦♦
(9–680)
(11,2–635)
(4,3–2043)
(89–1080)
мМЕ/мл
Показатели
Контроль,
n = 27
4,6 ± 0,2
14,7 ± 0,34
2,2 ± 0,18
15,2 ± 4,8
П р и м е ч а н и е . * р < 0,05, ** р < 0,001 достоверность различий до и после лечения; ♦ р < 0,05, ♦♦ р < 0,001 достоверность
различий с группой контроля.
„ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Данные о состоянии функции ЩЖ и уровнях органоспецифических аутоантител у больных до и после проведенного курса лечения
представлены в таблице 1.
Пациенты обеих групп не различались
статистически значимо по уровню св. Т4, ТТГ,
АТПО, хотя при АИО наблюдались более
высокие титры антител к ТПО (p > 0,05), св.Т3
был достоверно выше в группе пациентов
с БГБ (р < 0,05). Значения тироидных гормонов, органоспецифических антител у наблюдаемых больных с высокой достоверностью
превышали контрольные значения (р < 0,001).
В динамике отмечено значимое снижение свободных фракций тироидных гормонов в обеих
анализируемых группах (р < 0,05, р < 0,001).
Дальнейшее исследование включало
оценку спонтанного и активированного
апоптоза МПК, субпопуляций Т-хелперов,
на проточном цитофлуориметре. В таблице 2
приведены показатели спонтанного и активированного апоптоза через 24 и 72 часа
культивирования МПК.
При исследовании 1-суточного апоптоза
выявлено повышение спонтанного апоптоза МПК у больных БГБ (p < 0,05) и низкие
значения активированного (p < 0,05) после
проведенного курса тиростатической терапии в сравнении с контрольной группой.
У больных с АИО наблюдались низкие значения спонтанного апоптоза как исходно,
так и после проведенного лечения (p < 0,01).
Не выявлено статистически значимых различий исследуемых показателей между анализи-
Таблица 2
Показатели апоптоза у больных с БГБ и АИО до и через 6 недель медикаментозной терапии
Исследуемые группы
БГБ,
n = 10
до лечения
после лечения
БГБ+АИО,
до лечения
n = 14
после лечения
Контроль n=27
1-суточный
активированспонтанный
ный
4,93 ± 5,67
2,25 ± 3,29♦
3,03 ± 5,79
0,95 ± 0,09♦
♦♦
0,41 ± 0,75
8,07 ± 11,6
1,44 ± 2,85♦♦
13,8 ± 15,87
1,78 ± 2,11
5,3 ± 3,95
3-суточный
активированспонтанный
ный
3,5 ± 2,34♦♦
6,61 ± 4,25♦♦
1,98 ± 2,11♦♦
7,04 ± 7,1♦♦
♦
3,2 ± 4,28
2,3 ± 2,7♦♦
8,05 ± 7,37
16,4 ± 14,5*^
4,8 ± 4,39
14,74 ± 9,33
П р и м е ч а н и е . В сравнении с контролем – ♦p < 0,05; ♦♦p < 0,01; при сравнении БГБ+АИО и БГБ ^ – < 0,05; * – p < 0,05
до и после лечения.
138
КЛИНИКА
Научная публикация
Таблица 3
Изменение в динамике Т-хелперных субпопуляций в периферической крови у больных
БГБ и АИО (в %)
Показатели
Тh1 (IFN-γ)
Th2 (IL-4)
Th1/
Th2
До лечения
После лечения
До лечения
После лечения
До лечения
После лечения
БГБ,
n = 10
8,54 ± 3,12
10,02 ± 3,1
1,45 ± 0,69♦♦
5,28 ± 1,5
6,56 ± 1,34♦
2,63 ± 0,76*
БГБ+АИО,
n = 14
9,66 ± 3,24
6,12 ± 2,6
4,86 ± 1,93 ^
1,16 ± 0,36♦
2,84 ± 0,6♦
6,71 ± 1,9*
Контроль,
n = 27
7,61 ± 2,48
2,7 ± 0,83
4,62 ± 1,49
П р и м е ч а н и е . В сравнении с контролем – ♦p < 0,05; ♦♦p < 0,05; при сравнении БГБ+АИО и БГБ ^ – p < 0,05; * – p < 0,05
до и после лечения.
руемыми группами, а также после проведенного лечения (p > 0,05).
Значительно более информативным является исследование 3-суточного апоптоза.
Показатели спонтанного апоптоза у больных с БГБ ((3,5 ± 2,34) %, p < 0,01) и с АИО
((3,2 ± 4,28) %, p < 0,05) достоверно снижены в сравнении с контрольной группой
((4,8 ± 4,39) %). Значения индуцированного
ФГА апоптоза МПК в сравнении с контролем
также были статистически значимо снижены
в обеих исследуемых группах (p < 0,01). После проведенной тиростатической терапии
у больных с БГБ показатели апоптоза остались низкими по сравнению с контрольной
группой (p < 0,05). В то время как у больных
с сочетанной аутоиммунной патологией выявлено усиление спонтанного и статистически
значимое повышение активированного апоптоза в сравнении с исходными показателями
(p < 0,05). После курса патогенетической терапии показатели активированного апоптоза не отличались от контрольных значений
у больных с АИО ((16,4 ± 14,5) %, у доноров
(14,74 ± 9,33) %, p > 0,05).
Таким образом, полученные результаты
свидетельствуют о снижении апоптоза МПК
у больных с БГБ и при ее сочетании с аутоиммунной офтальмопатией. Известно, что
наиболее значимой является оценка активированного апоптоза, которому подвергаются
лимфоциты при их стимуляции митогенами.
Согласно мнению ряда авторов ослабление
апоптоза способствует формированию аутоиммунных заболеваний вследствие наруше«Рецепт» № 4 (60), 2008
ния процесса выбраковки клонов лимфоцитов. Снижение апоптоза мононуклеарных
клеток способствует персистенции аутореактивных лимфоцитов, что ведет к прогрессированию аутоиммунного процесса.
Отсутствие нормализации показателей
апоптоза у пациентов с БГБ в нашем исследовании может быть связано с короткой продолжительностью тиростатической терапии.
Усиление активированного апоптоза в группе больных с аутоиммунной офтальмопатией вероятно отражает снижение активности процессов аутоагрессии в результате
проводимой иммуносупрессорной терапии
глкокортикостероидами. Известно, что
глюкокортикоиды обладают апоптогенным
действием, приводя к индукции клеточной
гибели.
Следующим этапом нашей работы было
исследование субпопуляций Т-хелперов.
Динамика Т-хелперов 1 и 2 типа в обеих группах в сравнении с контролем представлена
в таблице 3.
У больных с БГБ наблюдалось статистически значимое снижение CD4+/IL-4 клеток
((1,45 ± 0,69) %) в сравнении с контрольными
значениями ((2,7 ± 0,83) %, p < 0,01). После
проведенной тиростатической терапии в течение 6 недель увеличилось содержание CD4+/
INF-γ (p > 0,05), что привело к достоверному
снижению соотношения Th1/Th2 (p < 0,05).
На момент обследования у больных с АИО отмечено недостоверное увеличение CD4+/IL-4
клеток ((4,86 ± 1,93) %) в сравнении со значениями у доноров ((2,7 ± 0,83) %), в результате
139
Баланс Тh1/Th2-хелперов, уровень апоптоза
при болезни Грейвса – Базедова и аутоиммунной офтальмопатии
проведенного лечения баланс Th1/Th2 сдвигается в сторону Th1 за счет подавления Th2
((1,16 ± 0,36) %, p < 0,05 в сравнении с группой
контроля).
Полученные нами данные свидетельствуют о субпопуляционных сдвигах Т-клеток,
нарушении баланса Т-хелперов у больных
с БГБ и АИО. При БГБ до лечения баланс Th1/
Th2 смещен в сторону Th1 за счет снижения
Th2. Назначение тиростатических препаратов
приводит к увеличению Th2 и достоверному
снижению Th1/Th2. У больных с АИО в результате лечения наблюдается сдвиг баланса
Th1/Th2 в сторону Th1 за счет подавления
Th2. Изменения соотношения Т-хелперов,
представленные в нашей работе, отмечают
и другие исследователи [6]. Antonelli et al. обнаружили смещение баланса Т-хелперов от
Th1 к Th2 у гипертироидных больных с БГБ
в процессе лечения препаратами метимазола [3]. Согласно данным ряда исследований,
Th1 тип иммунных реакций преимущественно встречается на начальных стадиях БГБ
и АИО, в то время как гуморальный Th2 тип
характерен для более поздних стадий заболевания [5, 12].
„ ЗАКЛЮЧЕНИЕ
У больных с БГБ и при сочетании АИО
отмечается снижение как спонтанного, так
и индуцированного ФГА апоптоза. После проведенного курса тиростатической терапии
при БГБ показатели спонтанного и индуцированного апоптоза остаются достоверно низкими по сравнению с контрольной группой, что
свидетельствует о сохраняющемся дисбалансе
иммунной системы после кратковременного
курса терапии, направленной на нормализацию тироидного статуса. Медикаментозное
лечение приводит к статистически значимому
усилению индуцированного апоптоза у больных с АИО, что вероятно обусловлено действием глюкокортикостероидных препаратов.
При БГБ отмечается сдвиг хелперных субпопуляций в сторону Th1, у больных с аутоиммунной офтальмопатией – сдвиг в сторону Th2. После курса тиростатической
у больных БГБ происходит сдвиг баланса
Т-хелперов в сторону Th2 за счет увеличения
Th2. У больных с АИО сочетанная тиростатическая и глюкокортикостероидная приводит к сдвигу баланса в сторону Th1 за счет
подавления Th2.
„ ЛИТЕРАТУРА
1. Кандрор В. И. Аутоиммунные заболевания щитовидной железы и апоптоз / Проблемы эндокринологии. – 2002. – Т. 48, № 1. – С. 45–48.
2. Andrikoula M., Tsatsoulis A. The role of Fas-mediated apoptosis in thyroid disease / Eur.J.
Endocrinol. – 2001. – Vol. 144. – P. 561–568.
3. Antonelli A., Rotondi M., Fallahi P. et al. Increase of interferon-γ-inducible CXC chemokine
CXCL10 serum levels in patients with active Graves’ disease, and modulation by methimazole
therapy / Clin. Endocrinol. – 2006. – Vol. 64. – P. 189–195.
4. Fountoulakis S., Vartholomatos G., Kolaitis N. et al. Differential expression of Fas system apoptotic
molecules in peripheral lymphocytes from patients with Graves’ disease and Hashimoto’s thyroiditis
/ Eur. J. Endocrinol. – 2008. – Vol. 158, № 6. – P. 853–859.
5. Han R., Smith T.J. T helper type 1 and type 2 cytokines exert divergent influence on the induction of
prostaglandin E2 and hyaluronan synthesis by interleukin-1beta in orbital fibroblasts: implications
for the pathogenesis of thyroid-associated ophthalmopathy / Endocrinology. – 2006. – Vol. 147,
№ 1. – P. 13–19.
140
КЛИНИКА
Научная публикация
6. Inukai Y., Momobayashi A., Sugawara N. et al. Changes in expression of T-helper (Th) 1- and
Th2-associated chemokine receptors on peripheral blood lymphocytes and plasma concentrations
of their ligands, interferon-inducible protein-10 and thymus and activation-regulated chemokine,
after antithyroid drug administration in hyperthyroid patients with Graves’ disease / Eur. J.
Endocrinol. – 2007. – Vol. 156. – P. 623–630.
7. Lin J.D. The role of apoptosis in autoimmune thyroid disorders and thyroid cancer / BMJ. – 2001. –
Vol. 322. – P. 1525–1527.
8. Maruoka H., Watanabe M., Matsuzuka F. et al. Increased intensities of Fas expression on peripheral
T-cell subsets in severe autoimmune thyroid disease / Thyroid. – 2004. – Vol. 14, № 6. – P. 417–
423.
9. Prabhakar B. S. et al. Graves’ disease and Ophthalmopathy // Endocrine Rev. – 2003. – Vol. 24,
№ 6. – P. 802–835.
10. Weetman A. P. Cellular immune responses in autoimmune thyroid disease // Clin. Endocrinol.
(Oxf). – 2004. – Vol. 61, № 4. – P. 405–413.
11. Wiersinda W.M., Bartalena L. Epidemiology and prevention of Graves’ ophthalmopathy //
Thyroid. – 2002. – Vol. 12. – P. 855–860.
12. Xia N. et al. CD4+ T cells and the Th1/Th2 imbalance are implicated in the pathogenesis of Graves’
ophthalmopathy / Int. J. Mol. Med. – 2006. – Vol. 17, № 5. – P. 911–916.
«Рецепт» № 4 (60), 2008
141