Экспериментальная проверка нарушений сплайсинга при

УДК 577.21
Игудин Е.Л.1
1
Московский физико-технический институт
Экспериментальная проверка нарушений сплайсинга при наследственных
эндокринных патологиях
Исследования мутаций в генах с большим количеством интронов показывают,
что мутации сплайсинга могут составлять до половины всех мутантных аллелей [1].
Вариации ДНК, влияющие на сплайсинг, могут вызывать нарушения связанные с
одним геном, а также влиять на риск развития сложных многофакторных заболеваний и
их фенотипическое проявление [2].
Цель настоящей работы – экспериментальная проверка влияния замен
нуклеотидов
в
области
экзон-инторнных
стыков
на
сплайсинг.
Объектами
исследования были новые замены нуклеотидов (мутации), обнаруженные у больных с
соответствующими эндокринными нарушениями: замена IVS6-2C>A в донорном сайте
сплайсинга гена CYP11B2, замена IVS2-7C>G в акцепторном сайте сплайсинга в гене
CYP21A2, и замена IVS7-1G>C в акцепторном сайте сплайсинга гена GCK. Мутации в
гене СYP11B2 (стероид-11-бета гидроксилаза или альдостеронсинтаза) приводят к
изолированному дефициту минералокортикоидов, в гене CYP21A2 (стероид-21гидроксилаза) - к нарушению синтеза стероидных гормонов и врожденной дисфункции
коры надпочечников, а мутации в гене GCK (глюкокиназа)– к одной из форм диабета –
MODY.
В ходе работы были поставлены и решены следующие экспериментальные задачи:
1. Конструирование минигенов CYP11B2, CYP21A2, GCK
2. Встраивание минигенов в вектор pRK5, содержащий промотор и энхансер
цитомегаловируса и участок полиаденилирования вируса SV40.
3.
Трансфекция полученными конструкциями клеток человека (HEK293).
Выделение РНК, синтез кДНК, ПЦР-амплификация фрагмента кДНК с
праймерами, специфичными к вектору.
4. Анализ продуктов ПЦР (электрофорез в агарозном геле, секвенирование)
Анализ продуктов ПЦР показал, что замена IVS6-2C>A в донорном сайте сплайсинга
гена CYP11B2 не приводит к нарушению сплайсинга интрона 6 и может быть
классифицирована как нефункциональный полиморфизм. Замена IVS2-7C>G в
акцепторном сайте сплайсинга гена CYP21A2 нарушает акцепторный сайт сплайсинга
интрона 2 и приводит с сохранению интрона в мРНК. Замена IVS7-1G>C в
акцепторном сайте сплайсинга гена GCK нарушает нормальный акцепторный сайт
сплайсинга интрона 7 и приводит к активации нескольких криптических сайтов
сплайсинга в интроне 7. В результате образуются альтернативные продукты
сплайсинга, содержащие части интрона 7.
Литература
1. Ast G. 2004. How did alternative splicing evolve? Nat. Rev. Genet., v. 5, 773-782.
2. Nissim-Rafinia M, Kerem B. Splicing regulation as a potential genetic modifier. Trends
Genet 2002;18:123–127.