механизмы формирования внеклеточных электрических

Физика
УДК 577.352.5: 537.31
П.М. БУЛАЙ, П.Г. МОЛЧАНОВ, С.Н. ЧЕРЕНКЕВИЧ
МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ЭЛЕКТРИЧЕСКИХ
СИГНАЛОВ ПРИ АДГЕЗИИ КЛЕТОК К ПОВЕРХНОСТИ*
A novel model with lumped parameters has been proposed to describe and interpret extracellular electrical signals. The approach
is based on continuity equation for nonstationary currents and uses representation of the nonuniform charge transfer through biological membranes. It has been determined that basic types of experimentally defined extracellular signals can be obtained by varying
passive parameters of the system, such as medium conductivity in the contact volume and cleft thickness.
Наряду с традиционными методами исследования электрической активности клеток, такими как
микроэлектродная техника и пэтч-кламп, интенсивно развиваются внеклеточные методы регистрации
и стимуляции, основанные на использовании планарных сенсоров [1]. Современные полупроводниковые технологии позволяют создавать многоэлектродные планарные сенсоры с высокой плотностью
элементов и встроенными схемами регистрации, стимуляции и коммутации. Применение подобных
устройств открывает новые возможности для исследования продолжительных динамических процессов в культурах клеток и органотипических срезах тканей и для разработки селективных клеточных
сенсоров [2, 3].
Интерпретация внешних электрических сигналов, регистрируемых экспериментально, требует
адекватного теоретического описания электрического контакта клеток с измерительными электродами.
Среди внеклеточных электрических сигналов, экспериментально регистрируемых у нервных клеток с помощью внешних планарных сенсоров, выделяют четыре основных типа: A, B, C, D, определяемых по форме сигналов [4, 5]. Впервые для объяснения формы внеклеточных электрических сигналов отдельных нейронов использовалась модель стационарных токов с сосредоточенными параметрами [6]. Эта модель основана на уравнении непрерывности для стационарных токов, которое в
интегральной форме выражается первым законом Кирхофа и представляет собой уравнение баланса
для токов смещения и проводимости. Каждый тип сигнала объяснялся на основании возможных изменений активных параметров модели (изменение плотности ионных каналов, емкости мембраны).
Экспериментальные данные интерпретируются с помощью различных модификаций этой модели.
Нами предложена новая модель с сосредоточенными параметрами для описания и объяснения
внеклеточных электрических сигналов нейронов. Новый подход основан на уравнении непрерывности для нестационарных токов и использует модель неоднородного переноса заряда через биологические мембраны [7].
С применением разработанной модели нами определены основные типы внеклеточных сигналов
путем изменения только пассивных параметров модели (проводимость среды и проводимость утечки
в области контакта клетки с электродом).
Методика исследования
Нами разработана модель для описания сигналов, одиночных клеток, находящихся на плоской поверхности планарного сенсора. При таком расположении клетки моделируемое пространство может
быть разделено на пять областей: клетка,
внешний раствор, щель между клеткой и
подложкой, измерительный электрод и референтный электрод (рис. 1). Размеры границ
приведены в таблице.
При стандартных условиях электрическая
проводимость в каждой из областей велика
по сравнению с проводимостью границ, а
проводимость и емкость границ однородны
по поверхности. В этом случае области можно рассматривать как эквипотенциальные, а
границы описывать эквивалентными элекРис. 1. Эквивалентная электрическая схема модели
трическими элементами с сосредоточенными
нестационарных токов с сосредоточенными параметрами.
параметрами.
(Обозначения приведены в таблице.)
*
Авторы статьи – сотрудники кафедры биофизики.
7
Вестник БГУ. Сер. 1. 2008. № 3
Переменные и параметры модели
Переменная или параметр
Внутриклеточный потенциал
Потенциал в зазоре
Потенциал измерительного электрода
Потенциал внешнего раствора
Потенциал референтного электрода
Диэлектрическая проницаемость среды
Дебаевская длина
Толщина щели
Проводимость среды в щели
Проводимость внешней среды
Проводимость внутриклеточной среды
Плотность трансмембранного тока верхней части мембраны
Плотность трансмембранного тока нижней части мембраны
Емкость верхней части клеточной мембраны
Емкость нижней части клеточной мембраны
Емкость измерительного электрода
Емкость референтного электрода
Емкость электрода в подложке
Емкость подложки
Проводимость измерительного электрода
Проводимость референтного электрода
Проводимость электрода в подложке
Проводимость подложки
Удельная емкость мембраны
Удельная емкость измерительного электрода
Удельная емкость референтного электрода
Удельная емкость электрода в подложке
Удельная емкость подложки
Удельная проводимость измерительного электрода
Удельная проводимость референтного электрода
Удельная проводимость электрода в подложке
Удельная проводимость подложки
Площадь верхней части мембраны
Площадь нижней части мембраны
Площадь измерительного электрода
Площадь подложки
Площадь электрода в подложке
Площадь референтного электрода
Коэффициент распределения натриевых каналов
Коэффициент распределения калиевых каналов
Коэффициент распределения хлорных каналов
Обозначение
Значение
φc
φj
φe
φs
φr
ε
λ
h
δj
δs
δc
Jms
Jmj
Cms
Cmj
Ce
Сr
Cu
Cd
Ge
Gr
Gu
Gd
cm
ce
cr
cu
cd
ge
gr
gu
gd
Sms
Smj
Se
Sd
Su
Sr
KNa
KK
KCl
–
–
–
–
0 мВ
81·ε0 Ф/м
1 нм
5÷105 нм
0,06÷1,80 См/м
1,8 См/м
0,6 См/м
j(δc,δs)·Sms
j(δc,δj)·Smj
cm·Sms
cm·Smj
ce·Se
cr·Sr
cu·Su
cd·Sd
ge·Se
gr·Sr
gu·Su
gd·Sd
50 мФ/м2
2 мФ/м2
2 мФ/м2
1 мФ/м2
3 мФ/м2
1 См/м2
1 См/м2
1 мСм/м2
1 мСм/м2
2000 мкм2
1000 мкм2
300 мкм2
700 мкм2
300 мкм2
1000 мм2
1·105
3·105
2·106
Для описания тока через мембрану нами использована модель неоднородного переноса заряда через
биологические мембраны [7]. Общую схему модели можно представить как последовательный перенос
заряда сначала в область с неоднородным распределением заряда вблизи ионного канала, а затем в область с однородным распределением заряда у поверхности мембраны. В результате такого переноса
вблизи канала образуется избыточный заряд, который формирует избыточный потенциал. Изменение
величины избыточного заряда описывается уравнением непрерывности для нестационарных токов:
δ
⎧
⎪ j (δ) = ε q,
⎨ ∂q
δ
⎪ = − q + j HH (V + ∆ϕ, t ),
ε
⎩ ∂t
(1)
где j(δ) – плотность трансмембранного тока, jHH(V+∆φ,t) – плотность трансканального тока (функция
Ходжкина – Хаксли) [8], δ – электрическая проводимость среды, ε – диэлектрическая проницаемость,
q – плотность избыточного заряда, t – время, V – трансмембранный потенциал, ∆φ – трансмембранный избыточный потенциал, V+∆φ – трансканальный потенциал. Плотность избыточного заряда и
потенциал вблизи каналов связаны следующим соотношением [7]:
(2)
q = Kc m ϕ,
8
Физика
где K – коэффициент распределения каналов, сm – удельная емкость мембраны, φ – избыточный потенциал. Коэффициент распределения каналов определяется размерами каналов и расстоянием между ними:
K=
rd2 4λ + rc 2rd − rc
,
rc2 rc
rd − rc
(3)
где rc – радиус канала, rd – полурасстояние между каналами, λ – дебаевская длина.
Величины избыточного заряда и избыточного потенциала находили отдельно для внутренней и
внешней поверхности мембраны, а также для каждого типа ионного тока (Na+, K+, Cl–).
Коэффициенты распределения каналов рассчитывали по формуле (3), исходя из удельной проводимости мембраны для различных ионов и проводимости одиночных каналов [9, 10].
Для описания тока через остальные однородные границы использовали закон Ома (см. таблицу).
Для расчета проводимости утечки в зазоре использовали формулу [11]:
G j = 4πδ j h,
(4)
где δj – проводимость среды в зазоре, h – толщина щели.
Электрическую активность клетки стимулировали дополнительным трансмембранным током величиной 0,3 нА.
Эквивалентной схеме модели соответствует начальная задача для системы дифференциальных
уравнений первого порядка. Задача решалась многошаговым методом численного дифференцирования Клопфинштейна переменного порядка с использованием интегрированных алгоритмов среды
моделирования MATLAB 7.0.
Результаты и их обсуждение
При относительно малых значениях емкости и проводимости измерительного электрода потенциал электрода и в щели между клеткой и подложкой изменялся одинаково, что позволяет использовать
общий для областей термин «внеклеточный сигнал».
В условиях, когда емкость измерительного электрода мала по сравнению с емкостью мембраны, форма внеклеточного сигнала определяется трансмембранным током, а амплитуда – проводимостью утечки.
Основной интерес для исследования представляла форма внеклеточного сигнала в зависимости от
параметров, определяющих различные типы и стадии контакта клетки с поверхностью. К числу таких
параметров относятся: проводимость среды в зазоре δj и толщина щели h. Оба параметра определяют
проводимость утечки по формуле (4). От проводимости среды зависит величина избыточного заряда
и избыточного потенциала вблизи поры канала в соответствии с формулами (1) и (2). Таким образом,
величина проводимости влияет на трансканальный
потенциал V + ∆ϕ , который определяется величиной тока, проходящего через канал.
Результаты моделирования представлены на рис. 2.
Уменьшение проводимости в щели ведет к увеличению избыточного заряда и избыточного потенциала вблизи поры канала. Для натриевых каналов
избыточный заряд и потенциал имеют отрицательное значение. Поскольку натриевые каналы открываются на первой стадии развития потенциала действия, то отрицательный избыточный потенциал
вблизи канала на внешней стороне мембраны приводит к более быстрой деполяризации канала (по
сравнению с трансмембранным потенциалом) и,
как следствие, к более ранней активации натриевого тока. Для калиевых каналов избыточный заряд и
потенциал имеют положительное значение. Калие- Рис. 2. Зависимость амплитуды (в милливольтах, период
вые каналы открываются на более поздней стадии
сигнала – 15 мс) и формы (A-, B-, C- и D-тип)
внеклеточных сигналов от толщины щели
развития потенциала действия, поэтому положии проводимости в ней среды
тельный избыточный потенциал вблизи канала на
внешней стороне мембраны приводит к реполяризации канала и уменьшению калиевого тока. Таким
образом, чем меньше проводимость среды в щели между клеткой и подложкой, тем быстрее развивается натриевый ток и медленнее – калиевый (рис. 3).
9
Вестник БГУ. Сер. 1. 2008. № 3
Определяющий форму сигнала суммарный ток
складывается из емкостного и ионных токов, поэтому чем быстрее развивается натриевый ток, тем
более выражен первый отрицательный пик в форме
внеклеточного сигнала (см. рис. 3).
При большом значении проводимости в щели
(равном проводимости внешней среды) избыточные потенциалы на каналах нижней и верхней частей клетки малы и равны между собой, что приводит к симметричности процессов переноса заряда.
В случае симметричности процессов ионный ток
повторяет по форме емкостный, но противополоРис. 3. Изменение трансмембранного и трансканальных
жен ему по направлению. Таким образом, суммарпотенциалов, трансмембранного тока и внеклеточного
потенциала для различных значений проводимости среды ный ток стремится к нулю и внеклеточный потенциал имеет малую амплитуду.
в щели (период сигнала – 15 мс); а – потенциал:
При малых значениях проводимости в щели (в 30
трансмембранный (1), трансканальный натриевый (2),
трансканальный калиевый (3); б – ток: емкостный (1),
раз меньше проводимости внешней среды) провонатриевый (2), калиевый (3); в – внеклеточный потенциал димость утечки значительно уменьшается. В результате амплитуда внеклеточного сигнала возрастает и
становится соизмеримой с амплитудой внутриклеточного потенциала, что приводит к значительному
уменьшению трансмембранного и трансканальных потенциалов. При падении трансмембранного потенциала ниже порога возбуждения ионные каналы не активируются и суммарный ток стремится к нулю, в результате внеклеточный потенциал повторяет форму внутриклеточного потенциала (см. рис. 3).
При увеличении проводимости среды в щели и увеличении толщины последней проводимость
утечки возрастает, в результате амплитуда внеклеточных сигналов уменьшается (см. рис. 2).
Среди полученных внеклеточных сигналов есть сигналы с формой, соответствующей основным
A-, B-, C-, D-типам внеклеточных сигналов, определяемых экспериментально и приведенных в литературе [4, 5]. Форма остальных сигналов представляет собой комбинацию этих основных типов сигналов.
Таким образом, установлено, что при использовании модели неоднородного переноса заряда через
биологические мембраны (уравнения непрерывности для нестационарных токов) и при изменении
только пассивных параметров системы, таких как проводимость среды в области контакта и толщины
щели, можно получить различные по форме внеклеточные сигналы.
Изменение пассивных параметров контакта может кардинально влиять на форму внешних сигналов наряду с такими факторами, как изменение ионоселективной проводимости мембраны [12] и
электрохимические процессы на измерительном электроде [13]. Кроме того, в случае использования
внутриклеточных электродов для стимуляции клетки форма внеклеточных сигналов может существенно зависеть от параметров электрода и режима стимуляции.
Следует также отметить, что поскольку проводимость среды в щели и проводимость утечки однозначно определяют электрические свойства контакта между клеткой и поверхностью, то они могут
быть использованы в качестве параметров, характеризующих степень адгезии клеток при изучении
адгезии к подложке различной природы.
1. F r o m h e r z P . , O f f e n h a u s s e r A . , V e t t e r T . , W e i s J . // Science. 1991. Vol. 252. P. 1290.
2. B e s l B . , F r o m h e r z P . // Eur. J. Neurosci. 2002. Vol. 15. P. 999.
3. Z e c k G . , F r o m h e r z P . // PNAS. 2001. Vol. 98. P. 10457.
4. J e n k n e r M . , F r o m h e r z P . // Phys. Rev. Lett. 1997. Vol. 79. P. 4705.
5. S c h a t z t h a u e r R . , F r o m h e r z P . // Eur. J. Neurosci. 1998. Vol. 10. P. 1956.
6. R e g e h r W . G . , P i n e J . , C o h a n C . S . et al. // J. Neurosci. Meth. 1989. Vol. 30. P. 91.
7. Б у л а й П . М . , М о л ч а н о в П . Г . , Ч е р е н к е в и ч С . Н . и др. // Вестн. БГУ. Сер. 1. 2008. № 1. С. 3.
8. H o d g k i n A . L . , H u x l e y A . F . // J. Physiol. 1952. Vol. 117. P. 500.
9. B e k k e r s J . M . , G r e e f f N . G . , K e y n e s R . D . // Ibid. 1986. Vol. 377. P. 463.
10. J e n t s c h T . J . , S t e i n V . , W e i n r e i c h F . , Z d e b i k A . A . // Physiol. Rev. 2002. Vol. 82. P. 503.
11. W e i s R . , F r o m h e r z P . // Phys. Rev. E. 1997. Vol. 55. P. 877.
12. F r o m h e r z P . Nanoelectronics and information technology. Berlin, 2003.
13. W r o b e l G . , S e i f e r t R . , I n g e b r a n d t S . et al. // Biophys. J. 2005. Vol. 89. P. 3628.
Поступила в редакцию 11.06.08.
Павел Михайлович Булай – научный сотрудник.
Павел Геннадьевич Молчанов – научный сотрудник.
Сергей Николаевич Черенкевич – член-корреспондент НАН Беларуси, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой.
10