Эндокринная функция дофаминергических нейронов целостного

На правах рукописи
CАЙФЕТЯРОВА ЮЛИЯ ЮРЬЕВНА
ЭНДОКРИННАЯ ФУНКЦИЯ ДОФАМИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ
ЦЕЛОСТНОГО МОЗГА В ОНТОГЕНЕЗЕ КРЫС
Специальность 03.03.01 – физиология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва - 2012
Работа выполнена в лаборатории гормональных регуляций Федерального
государственного бюджетного учреждения науки Института биологии
развития им. Н.К. Кольцова РАН.
Научный руководитель:
академик Угрюмов Михаил Вениаминович
Официальные оппоненты:
Манухин Борис Николаевич - доктор биологических наук, профессор,
Институт биологии развития РАН, руководитель группы межклеточных
взаимодействий
Раевский Владимир Вячеславович - доктор биологических наук,
профессор, Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии
РАН, руководитель лаборатории нейроонтогенеза
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт
физиологии им. И.П. Павлова РАН
Защита диссертации состоится «25 » апреля 2012 г. в 15 часов
на заседании Диссертационного совета Д 002.238.01 Института биологии
развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу:
119334, Москва, ул. Вавилова, д.26.
С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на
сайте Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.
Сайт: http://idbras.comcor.ru/; e-mail: idbras@bk.ru
Автореферат разослан «___» марта 2012 г.
Ученый секретарь
Диссертационного совета,
кандидат биологических наук
ele0806@yandex.ru
Е.Б. Абрамова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Одной из наиболее актуальных задач современной
физиологии является изучение механизмов нейроэндокринной регуляции,
обеспечивающих поддержание постоянства внутренней среды и регуляцию
важнейших функций взрослого и развивающегося организма. Исследования
формирования нейроэндокринной регуляции развития и функционирования
организма
в
онтогенезе
имеют
большое
значение
не
только
для
фундаментальной медико-биологической науки, но и для клинической
медицины, поскольку малейшие нарушения метаболизма физиологически
активных веществ (ФАВ) нейроэндокринной системы на ранних стадиях
развития могут приводить к развитию тяжелых врожденных заболеваний.
Нейроэндокринная система в онтогенезе регулирует развитие целостного
организма
(Угрюмов,
1999).
ФАВ,
вырабатывающиеся
компонентами
нейроэндокринной системы, выступают в роли индукторов развития, оказывая
необратимое морфогенетическое влияние на развивающиеся клетки- и органымишени (Lauder, 1993; Ugrumov, 1997; Mirochnik et al., 2005).
Мозг является центральным и ключевым звеном нейроэндокринной
системы. Долгое время считалось, что мозг включается в нейроэндокринную
регуляцию только после окончательной дифференцировки нейронов и
формирования нейротрансмиссии (Dlouha et al., 1982). Полученные в последнее
время нами и другими исследователями данные, согласно которым нейроны
мозга сразу же после их образования и задолго до формирования
межнейрональных связей и гемато-энцефалического барьера (ГЭБ) начинают
синтезировать и выделять ФАВ (Ugrumov et al., 1989; Borisova et al., 1991;
Ugrumov et al., 1994), позволяют пересмотреть традиционные представления о
роли мозга в нейроэндокринной регуляции развития целостного организма. В
связи с этим нами была выдвинута гипотеза, согласно которой, мозг в
онтогенезе до формирования межнейрональных синаптических связей и ГЭБ,
3
может рассматриваться как эндокринный орган, участвующий в регуляции
развития
и
функционирования
периферических
органов
и
целостного
организма.
Ранее при изучении развития моноамин- и пептидергических систем
мозга нами были получены косвенные доказательства в пользу выдвинутой
гипотезы. Так было показано, что ДА содержится в общей системе циркуляции
плодов и новорожденных крыс в концентрации, достаточной для оказания
эндокринного влияния на секрецию пролактина гипофизом взрослых крыс
(Ben-Jonathan et al., 1980). После закрытия ГЭБ концентрация ДА в
периферической крови резко падает (Лаврентьева и др., 2006), что исключает
дальнейшее участие ДА мозгового происхождения в эндокринной регуляции.
Однако, прямых доказательств того, что ДА, синтезируясь в нейронах мозга,
поступает в общую систему циркуляции в онтогенезе до формирования ГЭБ,
получено не было.
Кроме того, до сих пор отсутствуют попытки оценить влияние ДА
мозгового происхождения на периферические органы-мишени в период
отсутствия ГЭБ, тогда как это является одним из важнейших критериев
эндокринной функции мозга. Учитывая, что рецепторы к ДА обнаруживаются в
разных органах в онтогенезе задолго до формирования ГЭБ (Felder et al., 1989),
можно ожидать, что ДА мозгового происхождения, содержащийся в
периферической крови, способен оказывать влияние на развитие и/или
функциональную
активность
этих
органов,
что
требует
дальнейшей
экспериментальной проверки.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей диссертационной работы –
получить прямые доказательства эндокринной функции
нейронов целостного мозга в онтогенезе до формирования ГЭБ.
4
ДА-ергических
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Разработать
ингибирования
экспериментальную
синтеза
ДА
модель
нейронами
мозга
фармакологического
в
онтогенезе
до
формирования ГЭБ.
2. Оценить вклад мозга в формирование физиологически активной
концентрации ДА в плазме крови после ингибирования его синтеза в
нейронах мозга до формирования ГЭБ.
3. Получить доказательства того, что ДА мозгового происхождения,
содержащийся в периферической крови до формирования ГЭБ, оказывает
прямое эндокринное влияние на выделение пролактина из лактотрофов
гипофиза в моделях in vivo и in vitro.
Научная новизна работы. Впервые разработана модель фармакологического
ингибирования синтеза ДА избирательно в мозгу у крыс в раннем
постнатальном периоде. Экспериментально подобрана доза ингибитора,
существенно снижающая синтез ДА в мозгу и не влияющая на его синтез в
периферических ДА-синтезирующих источниках.
Впервые получено прямое доказательство того, что до формирования
ГЭБ ДА поступает из мозга в общую систему циркуляции, обеспечивая
поддержание его физиологически активной концентрации в крови.
Впервые на моделях in vivo и in vitro показано, что ДА мозгового
происхождения, содержащийся в периферической крови у неонатальных крыс
до формирования ГЭБ, оказывает специфическое влияние на функциональную
активность лактотрофов, ингибируя выделение пролактина из передней доли
гипофиза.
Научная и практическая значимость работы. Получены убедительные
доказательства в пользу гипотезы о том, что мозг до формирования ГЭБ
5
функционирует как эндокринный орган, выделяя ФАВ в общую систему
циркуляции, которые в дальнейшем участвуют в регуляции функциональной
активности органов-мишеней, что принципиально меняют существующую
концепцию формирования нейроэндокринной регуляции развития целостного
организма.
Новый вариант концепции формирования нейроэндокринной регуляции в
онтогенезе и ее роли в развитии целостного организма, а также основанные на
этой концепции новые представления о патогенезе врожденных заболеваний,
могут быть широко представлены в курсах и учебниках по физиологии и
фундаментальной медицине для студентов университетов и медицинских
институтов.
Работа вносит вклад не только в экспериментальную физиологию, но и в
клиническую медицину, в частности перинатологию. Изучение молекулярноклеточных механизмов эндокринной регуляции развития периферических
мишеней со стороны ФАВ мозгового происхождения позволит по-новому
представить
себе
механизмы
развития
врожденных
заболеваний
репродуктивной и выделительной функций, нарушения функционирования
сердечно-сосудистой системы и ряда других. Это, в свою очередь, приведет к
изменению стратегии ранней диагностики и лечения врожденных заболеваний,
существенно повысив их эффективность.
Вклад автора. Все эксперименты, описанные в диссертационной работе, были
спланированы и выполнены автором. Анализ всех полученных данных был
также проведен автором.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены и
обсуждены:
- на конференциях: Конференция молодых ученых Института биологии
развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва, 2008, 2009, 2010 гг.; Конференция,
6
посвященная 90-летию со дня рождения академика Т.М.Турпаева, Москва,
2008; Конференция молодых ученых Института нормальной физиологии им.
П.К. Анохина РАМН, Москва, 2009; Международная междисциплинарная
конференция «Современные проблемы системной регуляции физиологических
функций», Сафага, 2010; Международная конференция «Биологические основы
индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», Клязьма, 2010;
Международный симпозиум «Molecular Neurobiology Today and Tomorrow»,
Берлин, 2010; Научно-практическая конференция с международным участием
"Нейрохимические подходы к исследованию функционирования мозга",
Ростов, 2011.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них
статей в журналах, соответствующих перечню ВАК – 1, статей в иностранных
рецензируемых журналах – 1, тезисов и материалов конференций – 7.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора
литературы, описания материалов и методов исследования, результатов,
обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 238 источников.
Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 22
рисунка, 4 таблицы.
7
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Животные.
Исследование проведено на самцах крыс линии Вистар на третий день
постнатального развития (П3). День рождения крысят считали 1-ым
постнатальным днем (П1).
Эксперименты.
Разработка модели ингибирования синтеза дофамина в мозгу у крыс на П3.
Подкожное введение ингибитора синтеза дофамина.
Животным подкожно вводили α-метил-пара-тирозин (αMПТ) (Sigma,
США) – ингибитор тирозингидроксилазы. В первой серии экспериментов
животным однократно
вводили 200, 100, 80 или 50 мкг
0.9 % NaCl, а в контроле – только 10 мкл
0.9 % NaCl.
αMПT в 10 мкл
Сбор материала
производили через 20 часов после инъекций. Во второй серии экспериментов
опытным животным вводили 50 мкг αMПT в 10 мкл 0.9 % NaCl. В контроле
животным вводили 10 мкл 0.9 % NaCl. Сбор материала производили через
4 часа после введения ингибитора.
Стереотаксическое введение ингибитора синтеза дофамина в боковые
желудочки мозга.
Животным под эфирным наркозом в боковой желудочек мозга однократно
вводили 50 мкг αMПT в 2 мкл 0.9 % NaCl по координатам: 1.2 мм латерально
от брегмы, 2.0-2.5 мм вглубь мозга, через стеклянную микроканюлю (d = 50
8
мкм), соединенную с гамильтоновским шприцем
(Ugrumov and Mitskevich,
1980); в контроле крысам однократно вводили 2 мкл 0.9 % NaCl.
Полное или частичное выключение дофаминового ингибиторного контроля
секреции пролактина у крыс на П3 (in vivo).
Крысам на П3 в боковой желудочек мозга вводили 50 мкг αМПТ,
контрольным животным вводили 0.9 % NaCl. У одних животных через 4 часа
собирали кровь из сердца и выделяли переднюю долю гипофиза. Другим
животным
через 4
часа
после внутрижелудочкового
введения
αМПТ
внутрибрюшинно вводили 0,75 мг/кг галоперидола – ингибитора рецепторов к
ДА, а через 1,5 часа собирали кровь и выделяли переднюю долю гипофиза. Сбор
материала у крыс проводили под пентобарбиталовым наркозом (40 мг/кг).
Инкубация гипофизов крыс на П3 и взрослых животных в Кребс–Рингер буфере
(in vitro).
Влияние разных концентраций экзогенного дофамина на секрецию пролактина.
Крыс на П3 декапитировали, выделяли переднюю долю гипофиза, делили
ее пополам и переносили в камеры, содержащие 300 мкл холодного
Кребс-Рингер буфера (КРБ) следующего состава (мМ): NaCl – 120, KCl – 4.8,
CaCl2 – 2.0, MgSO4 – 1.2, NaHCO3 – 25, D-глюкоза – 10.1, HEPES – 20,
аскорбиновая кислота – 0.13 (Sigma, США). В каждую камеру помещали по
3 половинки гипофизов. После 45-минутной стабилизации в КРБ при
температуре 37°С среду заменяли на 300 мкл свежей и проводили две 10минутные инкубации для оценки спонтанного выделения пролактина. Затем
одни половинки гипофизов переносили на 5 минут в КРБ, содержащий ДА в
концентрации 1,5 нг/мл или 0,4 нг/мл, в то время как другие половинки тех же
9
самых гипофизов продолжали инкубировать в КРБ без ДА. Полученные
образцы инкубационной среды хранили при –70°С до определения пролактина.
Контроль специфичности действия дофамина на секрецию пролактина через
Д2-рецепторы.
Процедуры инкубации, сбора и хранения материала проводились
аналогично описанным выше. Разница заключалась в том, что одни половинки
гипофизов
после
предварительной
45-минутной
стабилизации
и
двух
10-минутных инкубаций в КРБ на 5 минут переносили в КРБ, содержащий
1.5 нг/мл ДА, в то время как другие половинки этих же гипофизов переносили
также на 5 минут в КРБ, содержащий 1.5 нг/мл ДА и 10-10 М галоперидола.
Инкубация гипофизов крыс на П3 в плазме крови, содержащей эндогенный
дофамин.
У крыс под пентобарбиталовым наркозом (40 мг/кг) собирали кровь из
сердца и выделяли переднюю долю гипофиза. В собранную кровь добавляли
0,13 мM аскорбиновой кислоты (для сохранности эндогенного ДА), и затем ее
центрифугировали при 7000 об/мин. Полученную у животных плазму
пулировали и до проведения инкубации хранили 1 час при температуре +4°С.
Гипофизы,
после предварительной
45-минутной
стабилизации,
сначала
инкубировали 20 минут при 37°С в КРБ, а затем одни половинки гипофизов в
течение 30 минут инкубировали в плазме при 37°С, содержащей 10 -10 М
галоперидола, в то время как другие половинки тех же гипофизов
инкубировали в такой же плазме, но без галоперидола. После этого образцы
инкубационной плазмы и сами гипофизы замораживали и хранили при -70°С до
определения в них пролактина. Кроме того, по окончании эксперимента
образцы
инкубационной
плазмы
отбирали
10
для
контроля
сохранности
эндогенного
ДА
с
помощью
метода
высокоэффективной
жидкостной
хроматографии (ВЭЖХ) и хранили при температуре -70°С.
Взятие и обработка материала.
После подкожных инъекций αMПT у крыс под пентобарбиталовым
наркозом (40 мг/кг) выделяли мозг (одно полушарие за исключением 2/3
мозжечка), орган Цукеркандля, надпочечники и собирали кровь из сердца;
после внутрижелудочковых инъекций αMПT помимо вышеперечисленных
образцов собирали почки. На пробу приходился материал от одного животного.
Для определения ДА методом ВЭЖХ кровь переносили в пробирку,
содержащую 30 мкл 5% раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА)
(Sigma, США) и 10 мкл 10% раствора метабисульфита натрия (Sigma, США).
Затем отделяли плазму центрифугированием при 1500 об/мин в течение
10 минут и добавляли в нее 3,4-дигидроксибензиламин гидробромид (ДГБА) –
внутренний
стандарт
(Sigma,
США)
в
0,1н
HClO4.
Далее
плазму
центрифугировали при 14000 об/мин 20 минут, переносили в эппендорф и
хранили при -70о С до определения ДА. Перед определением ДА осаждали на
оксиде алюминия, элюировали 0,2 н
HClO4 и полученные образцы
центрифугировали при 4000 об/мин. Выделенное полушарие мозга и
периферические органы
гомогенизировали в 10 объемах 0,1 н HClO4,
содержащей ДГБА при помощи ультразвукового гомогенизатора (Labsonic M,
Sartorius, Франция), центрифугировали при 14 000 об/мин в течение 20 минут и
в полученном супернатанте определяли ДА.
Для определения пролактина в плазме крови у животных под
пентобарбиталовым наркозом (40 мг/кг) брали кровь из сердца, после чего ее
центрифугировали при температуре +4°С на скорости 7000 об/мин в течение
20 минут. В полученном супернатанте определяли содержание гормона.
11
Для
определения
пролактина
в
ткани
гипофизов
проводили
предварительную экстракцию гормона. Для этого гипофизы гомогенизировали
при
помощи
ультразвукового
гомогенизатора
в
0.05
M
карбонат-бикарбонатном буфере (рН 10,0), после чего в течение часа
проводили экстракцию пролактина. Затем образцы центрифугировали 30 минут
при температуре +4 °С и скорости 5000 об/мин и отбирали полученный
супернатант. После нейтрализации супернатанта с помощью 0,01н HCl,
проводили измерение пролактина.
Высокоэффективная
жидкостная
хроматография
с
электрохимической
детекцией.
Измерение ДА в осажденной плазме крови, в супернатантах ткани мозга
и периферических органов проводили при помощи обратно–фазной ВЭЖХ с
электрохимической детекцией (Amperometric detector LC-4B, Bioanalytical
Systems, США) при потенциале 655 мВ. Пробы вводили в инжектор (Rheodyne
7125, США) с петлей объемом 20 мкл. Разделение производили на 10сантиметровой колонке с внутренним диаметром 4 мм и наполнителем С-18, 3,3
мкм (Dr.Maisch GmbH, Германия). Подвижной фазой служил 0.1 М цитратнофосфатный буфер, содержащий 0.3 мМ октансульфоната натрия (Sigma, США),
0.1 мМ ЭДТА (Sigma, США) и 8 % ацетонитрила (Sigma, США) (pH 3.2).
Скорость потока 1 мл/мин обеспечивалась насосом (Gilson 307, Франция). Пик
ДА идентифицировали, ориентируясь на время его выхода в стандарте,
содержание
рассчитывали
методом
внутреннего
стандарта,
используя
отношение площадей пиков в стандартной смеси и в образце, с помощью
программы «Мультихром» (Россия).
12
Иммуноферментный анализ.
Измерение пролактина в ткани передней доли гипофиза, образцах плазмы
и инкубационной среды проводили с помощью метода иммуноферментного
анализа, c использованием коммерческих наборов (SPIbio-Rat Prolactin EIA Kit,
Bertin Pharma, Франция).
Статистическая обработка результатов.
Статистический анализ полученных результатов проводили с помощью Fтеста для определения однородности выборки и t-теста Стьюдента для
определения достоверности различий.
13
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
I. Мозг до формирования гемато-энцефалического барьера в онтогенезе –
важнейший источник дофамина в крови у крыс
В данной работе на примере ДА изучали возможность поступления ФАВ
из мозга в общую систему циркуляции в перинатальном периоде развития до
формирования ГЭБ. Для проведения экспериментов были использованы
животные на П3, у которых ГЭБ для ДА не сформирован. Для получения
прямых доказательств поступления ДА из мозга в кровь нами была разработана
принципиально новая модель фармакологического ингибирования синтеза ДА в
мозгу. В качестве ингибитора синтеза ДА был выбран αМПТ – конкурентный
ингибитор ключевого фермента синтеза ДА – тирозингидроксилазы. На первом
этапе данной работы проводился подбор максимальной дозы ингибитора, в
которой при системном введении и поступлении в кровь он не влиял бы на
синтез ДА в периферических органах и в мозгу. Подкожное введение αMПT в
дозах 200 и 100 мкг через 20 часов приводило к достоверному изменению
концентрации ДА в мозгу, плазме и органе Цукеркандля (Рис.1 А, Б, Г).
Введение ингибитора в дозе 80 мкг вызывало достоверное снижение
концентрации ДА в плазме (Рис.1 Б). Только введение αMПT в дозе 50 мкг не
оказывало влияния на концентрацию ДА в изучаемых органах и плазме крови
(Рис.1 А, Б, В, Г). Учитывая, что через 20 часов мы можем наблюдать в
организме компенсаторные процессы после воздействия αМПТ, мы проверили
результат введения дозы 50 мкг через 4 часа. Оказалось, что результаты,
полученные при введении этой дозы не различались – через 20 часов и через 4
часа концентрация ДА в периферических органах, мозгу и плазме не
изменялась, что дало возможность использовать нам данную дозу и данное
время в последующих экспериментах по стереотаксическому введению
ингибитора. Хотя при подкожном введении доза 50 мкг и не оказывала влияния
14
на концентрацию ДА в мозгу, мы предположили, что при непосредственном
введении ее в мозг она оказала бы локальное ингибирующее действие на ДАпродуцирующие нейроны.
αМПТ
0.9% NaCl
35
0
30
0
25
0
20
0
15
0
10
0
5
0
0
Б
3
*
200
Дофамин, нг/мл
Дофамин,нг/г ткани
А
*
80
100
*
*
200
100
1
0
50
*
2
αМПТ, мкг
600
Дофамин, нг/г ткани
Дофамин, нг/г ткани
Г
750
450
0
300
150
0
50
αМПТ, мкг
В
600
80
200
80
100
αМПТ, мкг
450
*
300
150
0
50
*
200
80
100
αМПТ, мкг
50
Рис. 1. Концентрация дофамина в мозгу (А), плазме крови (Б), надпочечниках (В) и органе
Цукеркандля (Г) через 20 часов после подкожного введения 200, 100, 80 и 50 мкг αМПТ; в
контроле вводили 0.9% NaCl.
* Достоверные различия между контролем и опытом (p < 0.05).
Стереотаксическое введение 50 мкг αМПТ в боковые желудочки мозга через 4
часа привело к значительному снижению концентрации ДА в мозгу и плазме
15
(Рис. 2), в то время как в периферических органах не происходило изменения
концентрации ДА (Табл. 1).
300
αМПТ
2.5
ДА, нг/г ткани
2
200
1.5
*
1
100
*
0
ДА, нг/мл плазмы
0.9% NaCl;
0.5
0
Рис. 2. Концентрация дофамина (ДА) в мозгу (слева) и плазме крови (справа) через 4 часа
после внутрижелудочкового введения 50 мкг αМПТ; в контроле вводили 0.9% NaCl.
* Достоверные различия между контролем и опытом (p < 0.05).
Табл.1. Концентрация дофамина (ДА) в надпочечниках, органе Цукеркандля и
почках через 4 часа после внутрижелудочкового введения 50 мкг αМПТ; в
контроле вводили 0.9% NaCl.
Орган
Вводимое
вещество
ДА, нг/г
Орган Цукеркандля
Надпочечники
0.9% NaCl
418.2±47.3
αMПT
0.9% NaCl
354.4±37.2
αMПT
623.2±64.5 657.3±59.2
Почки
0.9% NaCl
αMПT
22.2±3.4
18.3±2.4
Таким образом, на разработанной нами модели получено прямое
доказательство поступления ДА из мозга в кровь в раннем постнатальном
периоде развития у крыс до становления ГЭБ, при этом развивающийся мозг
вносит существенный вклад в формирование физиологически активной
концентрации ДА в общей системе циркуляции.
16
II. Регуляция секреции пролактина дофаминергическими нейронами
развивающегося мозга
Для оценки влияния ДА, поступающего из мозга в общую систему
циркуляции, на периферические органы, в качестве мишени мы использовали
лактотрофы гипофиза. Для того, чтобы оценить влияние ДА, поступающего из
мозга в общую систему циркуляции, на секрецию пролактина передней долей
гипофиза в экспериментах in vivo проводили частичное (на разработанной ранее
модели введения αМПТ в мозг) или полное (с помощью введения
галоперидола) выключение дофаминового ингибиторного контроля секреции
пролактина. Как после частичного, так и полного выключения дофаминового
контроля происходило увеличение выделения пролактина гипофизом в кровь, в
то время как в самом гипофизе концентрация пролактина снижалась только при
полном выключении дофаминового контроля (Рис. 3).
Концентрация ПРЛ, нг/мл
*
12
16
*
*
8
8
4
0
Плазма
Гипофиз
Концентрация ПРЛ, нг/мг
16
24
0.9% NaCl
αМПТ
αМПТ+галоперидол
0
Рис. 3. Концентрация пролактина (ПРЛ) в плазме (слева) и в гипофизе (справа) после полного
(внутрижелудочковое введение αМПТ и системное введение галоперидола) или частичного
(внутрижелудочковое введение αМПТ) ингибирования дофаминового контроля секреции ПРЛ
у крыс на третий постнатальный день; в контроле в боковые желудочки мозга вводили 0.9%
NaCl.
* Достоверные различия между контролем и опытом (p < 0.05).
17
Полученные в эксперименте in vivo данные свидетельствуют об
ингибиторном влиянии ДА мозгового происхождения на выделение пролактина
лактотрофами передней доли гипофиза у неонатальных крыс. Однако следует
иметь в виду, что ДА мозгового происхождения до формирования ГЭБ может
оказывать влияние на секрецию пролактина как через портальную систему
циркуляции, так и через общий кровоток.
Для подтверждения нашей гипотезы о развивающемся мозге как об
эндокринном органе принципиально важно было определить, обладает ли ДА
именно в той концентрации, в которой он содержится в периферической крови
у неонатальных крыс, ингибирующим влиянием на секрецию пролактина. Для
ответа на данный вопрос были проведены эксперименты in vitro.
Нами показано, что концентрация ДА в плазме крови трехдневных
животных составляет 1.9 нг/мл, причем она снижается до 0.4 нг/мл после
частичного ингибирования синтеза ДА в мозгу с помощью αМПТ. Поэтому для
получения доказательства того, что ДА именно мозгового происхождения,
содержащийся в периферической крови, может оказывать влияние на секрецию
пролактина гипофиза, в экспериментах in vitro гипофизы трехдневных
животных инкубировали в КРБ с разными концентрациями экзогенного ДА:
1.5 нг/мл - концентрация, которая создается в плазме в результате поступления
ДА из мозга в кровь, и 0.4 нг/мл – концентрация, которая создается за счет
выделения ДА из периферических ДА-синтезирующих органов и частично из
мозга. Через 5 минут после начала инкубации передней доли гипофизов с ДА в
концентрации 1.5 нг/мл происходит достоверное снижение выделения
пролактина в инкубационную среду, в то время как инкубация с ДА в
концентрации 0.4 нг/мл не влияет на выделение пролактина (Рис.4А).
Концентрация пролактина в ткани гипофизов не изменялась, поскольку при
инкубации в КРБ выделяется небольшой процент от общего содержания этого
гормона в ткани.
18
Для оценки специфичности действия ДА на секрецию пролактина,
т.е. через рецепторы к ДА, использовали дополнительный контроль с
введением в среду, наряду с ДА, ингибитора его рецепторов – галоперидола.
Как и ожидалось, введение галоперидола снимало ингибирующее влияние ДА
ПРЛ, нг/мг гипофиза/300 мкл среды
А
КРБ
Плазма
0.9
*
0.6
Б
3
2
* *
0.3
*
0
1
0
ПРЛ, нг/мг гипофиза/300 мкл плазмы
на секрецию пролактина лактотрофами (Рис. 4А).
А
КРБ
0,4 нг/мл ДА
1,5 нг/мл ДА
ДА + галоперидол
Б
плазма без
галоперидола
плазма с
галоперидолом
Рис. 4. Концентрация пролактина (ПРЛ) в среде после инкубации передней доли гипофиза
крыс на третий постнатальный день:
(А) в Кребс–Рингер буфере (КРБ), содержащем экзогенный дофамин (ДА) в концентрации
1.5 или 0.4 нг/мл, либо 1.5 нг/мл ДА в присутствии 10-10 М галоперидола; в контроле
половинки соответствующих гипофизов инкубировали в КРБ без ДА. * Достоверные различия
между контролем и опытом (p < 0.05);
(Б) в плазме после инкубации гипофизов животных на П3 в присутствии 10-10М галоперидола
или без него. * Достоверные различия между концентрацией ПРЛ в плазме с галоперидолом
или без (p < 0.05).
Поскольку действие экзогенного ДА в искусственной среде (КРБ) может
отличаться от действия эндогенного ДА в крови, т.к. в крови могут находиться
другие химические сигналы, модифицирующие эффекты ДА, то следующий
этап нашей работы был посвящен проверке действия эндогенного ДА,
содержащегося в периферической крови крыс до становления ГЭБ, на
выделение пролактина из гипофиза. Как и ожидалось, концентрация
пролактина в плазме, содержащей эндогенный ДА и экзогенный галопериодол
19
в концентрации 10-10 М, была значительно выше, чем в плазме, содержащей
только эндогенный ДА (Рис. 4Б). При этом концентрация пролактина в ткани
гипофизов не изменялась. Использование специального контроля показало, что
концентрация эндогенного ДА в плазме не изменялась в течение всего периода
инкубации гипофизов, сохраняясь примерно на уровне 2 нг/мл. Полученные
результаты свидетельствуют о том, что эндогенный ДА, содержащийся в
плазме периферической крови у неонатальных крыс до становления ГЭБ,
способен ингибировать выделение пролактина из передней доли гипофиза.
Таким образом, в данной работе представлены доказательства того, что
ДА, поступающий из мозга в общую систему циркуляции до формирования
ГЭБ, регулирует функциональную активность лактотрофов передней доли
гипофиза, и в частности, выделение пролактина.
20
ВЫВОДЫ
1.
Впервые разработана экспериментальная модель ингибирования
синтеза дофамина в мозгу у крыс в перинатальном периоде до формирования
гемато-энцефалического барьера. Подобрана минимальная доза ингибитора,
максимально снижающая уровень дофамина в мозгу и не влияющая на его
синтез в периферических органах.
2.
На
развивающегося
разработанной
мозга
в
модели
показан
формирование
существенный
физиологически
вклад
активной
концентрации дофамина в общей системе циркуляции до формирования
гемато-энцефалического
барьера,
о
чем
свидетельствует
значительное
снижение концентрации дофамина в плазме крови после ингибирования его
синтеза в мозгу.
3.
На примере гипофиза как периферического органа-мишени для
дофамина в экспериментах in vivo и in vitro получены доказательства того, что
до формирования гемато-энцефалического барьера дофамин, поступающий из
мозга в общую систему циркуляции, оказывает прямое эндокринное влияние на
выделение пролактина из лактотрофов гипофиза.
4.
Полученные данные подтверждают гипотезу о том, что мозг в
онтогенезе до формирования гемато-энцефалического барьера играет роль
эндокринного
органа,
секретируя
в
общую
систему
циркуляции
физиологически активные вещества, и оказывает прямое эндокринное влияние
на развитие и функционирование периферических органов-мишеней.
21
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Сайфетярова Ю. Ю., Дегтярева Е.А., Сапронова А.Я., Угрюмов М. В.
Эндокринная функция дофаминергических нейронов мозга у крыс в
перинатальном периоде // Нейрохимия. 2011. Т. 28(3). С.192-199.
2. Ugrumov M.V., Saifetyarova J.Y., Lavrentieva A.V., Sapronova A.Y.
Developing brain as an endocrine organ: secretion of dopamine // Mol. Cell.
Endocrinol. 2012. V. 348(1). P.78-86.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография
ГЭБ – гемато-энцефалический барьер
ДА – дофамин
ДГБА – 3,4-дигидроксибензиламин гидробромид
П – постнатальный день
ФАВ – физиологически активные вещества
ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота
22