Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пензенский государственный
реклама
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пензенский государственный университет» На правах рукописи КРУЧИНИНА Анастасия Дмитриевна ВЛИЯНИЕ СЕЛЕКТИВНЫХ ИНГИБИТОРОВ ОБРАТНОГО ЗАХВАТА МОНОАМИНОВ НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ ОБМЕНА РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ В ОТДЕЛАХ МОЗГА, НАДПОЧЕЧНИКАХ И СЫВОРОТКЕ КРОВИ КРЫС Специальность 03.01.04 – биохимия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор М.Т. Генгин Москва – 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ……………………………………………………………………... 5-8 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ …………………………………….............. 9-45 1.1. Моноаминовые нейромедиаторные системы и механизмы их функционирования ................................................................................... 9-14 1.1.1. Серотонинергическая система ……………………………………. 9-11 1.1.2. Дофаминергическая система ……………………………………… 11-13 1.1.3. Норадренергическая система ……………………………………... 13-14 1.2. Процессинг регуляторных пептидов и их биологическая роль ……… 14-16 1.3. Функциональное взаимодействие моноаминовых и пептидергической нейромедиаторных систем в норме и при патологиях 16-20 1.4. Нейрохимические основы депрессии ………………………………….. 21-30 1.5. Общая характеристика и физико-химические свойства ферментов нелизосомальной локализации ……………………………………………. 30-45 1.5.1. Карбоксипептидаза Е (КФ 3.4.17.10) …………………………….. 34-37 1.5.2. Фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая карбоксипептидаза 38-39 1.5.3. Пептидил-дипептидаза А (КФ 3.4.15.1) …………………………. 40-42 1.5.4. Лизинкарбоксипептидаза (КФ 3.4.17.3) ……………………….… 43-45 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ………………… 46-50 2.1. Материалы исследования …………………….......................................... 46 2.2. Методы исследования ……………………………………………..…........ 47-50 2.2.1. Метод введения лекарственных препаратов ……………………... 47 2.2.2. Метод определения активности карбоксипептидазы Е …..……. 47-48 2.2.3. Метод определения активности фенилметилсульфонилфторидингибируемой карбоксипептидазы…………………………………. 48 2.2.4. Метод определения активности пептидил-дипептидазы А …….. 49 2.2.5. Метод определения активности лизинкарбоксипептидазы …….. 49 2.2.6. Методы определения активности ферментов обмена регуляторных пептидов in vitro …………………………………………......... 50 3 2.2.7. Статистическая обработка результатов исследования …………. 50 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ………………………….......... 51-90 3.1. Влияние введения 0,2 % Твин-80 на активность ферментов обмена регуляторных пептидов …………………...………………………………... 51-59 3.2. Влияние однократного введения селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов на активность ферментов обмена регуляторных пептидов в отделах мозга и надпочечниках крыс ……………….………. 60-72 3.2.1. Активность карбоксипептидазы Е и пептидил-дипептидазы А при введении флуоксетина …………………………………………….... 60-63 3.2.2. Активность карбоксипептидазы Е и пептидил-дипептидазы А при введении ребоксетина ………………………………………………. 64-67 3.2.3. Активность карбоксипептидазы Е и пептидил-дипептидазы А при введении бупропиона ………………………………………………. 67-71 3.2.4. Активность карбоксипептидазы фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой при введении флуоксетина, ребоксетина, бупропиона ………………………………………………………………. 71-72 3.3. Влияние системного введения селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов на активность ферментов обмена регуляторных пептидов в отделах мозга и надпочечниках крыс …………………….….. 72-83 3.3.1. Активность карбоксипептидазы Е и пептидил-дипептидазы А при введении флуоксетина ……………………………………………… 72-75 3.3.2. Активность карбоксипептидазы Е и пептидил-дипептидазы А при введении ребоксетина ………………………………………………. 76-79 3.3.3. Активность карбоксипептидазы Е и пептидил-дипептидазы А при введении бупропиона ………………………………………………. 79-82 3.3.4. Активность карбоксипептидазы фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой при введении флуоксетина, ребоксетина, бупропиона ………………………………………………………………… 82-83 3.4. Влияние селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов на активность ферментов обмена регуляторных пептидов в сыворотке 4 крови крыс …………………………………………………………………... 84-89 3.4.1. Активность лизинкарбоксипептидазы и пептидил- дипептидазы А при однократном введении флуоксетина, ребоксетина, бупропиона ………………………………………………………………… 84-86 3.4.2. Активность лизинкарбоксипептидазы и пептидил- дипептидазы А при системном введении флуоксетина, ребоксетина, бупропиона ………………………………………………………………… 86-89 3.5. Активность ферментов обмена регуляторных пептидов при действии селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов in vitro …....... 89-90 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ …………... 91-109 ВЫВОДЫ ………………………………………………………………….......... 110 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ …………………………………………………….. 111-112 ЛИТЕРАТУРА ………………………………………………………………….. 113-147 5 ВВЕДЕНИЕ В последние годы практическая медицина пополнилась большим количеством высокоэффективных лекарственных препаратов. Однако, во многом нерешёнными остаются проблемы лечения различных психических заболеваний, включая депрессию. Депрессия является распространённым расстройством, приводящим к нетрудоспособности взрослого населения [27, 69]. Средний возраст начала заболевания варьируется от 20 до 30 лет [137], причём женщины более подвержены данной патологии [180]. Несмотря на огромное внимание специалистов к проблеме, постоянный поиск методов диагностики, создание новых лекарственных препаратов, не было достигнуто реальных успехов в данном направлении. Имеющиеся на сегодня данные не дают полного представления об основных причинах возникновения и молекулярных механизмах развития депрессивного состояния, что также затрудняет поиск эффективных методов лечения. Моноаминовые нейромедиаторные системы играют ведущую роль в контроле психических и моторных функций, формировании эмоционального состояния, в процессах обучения и памяти. Их функциональные нарушения лежат в основе большинства психических расстройств [5, 154, 200, 214, 234]. Отсутствие достаточной информации о механизмах взаимодействия моноаминовых систем с другими регуляторными системами не позволяет осуществлять успешную коррекцию нарушений при различных заболеваниях [5, 9, 105]. Согласно моноаминовой теории депрессии, дефицит основных моноаминов (серотонина, норадреналина, дофамина) в синаптической щели играет ключевую роль в патогенезе данного заболевания [36, 119, 154, 166]. В связи с этим в медицинской практике для лечения патологии широкое применение находят препараты, повышающие уровень моноаминов и их метаболитов в мозге, такие как селективные ингибиторы обратного захвата моноаминов и ингибиторы моноаминоксидазы антидепрессантами [9, 59, 166, нормализует 172, 195]. Таким нарушенные образом, лечение взаимоотношения 6 нейротрансмиттеров, которые считаются ответственными за клинические проявления заболевания [119]. В настоящее время предполагается, что в основе патогенеза депрессии лежат изменения в различных системах организма [36, 69, 70]. Обсуждается участие пептидергической системы в механизмах действия селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов [59]. Установлено, что при их введении значительно изменяется уровень целого ряда регуляторных пептидов, играющих важную роль в этиологии и патогенезе депрессии [233]. По-видимому, большинство физиологических функционирования эффектов, моноаминовых систем, возникающих опосредуются при изменении именно через пептидергическую систему [5, 105]. Вместе с тем, молекулярные механизмы действия селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов на уровень биологически активных пептидов остаются не изученными. Известно, что реакции ограниченного протеолиза лежат в основе образования активных форм регуляторных пептидов из пропептидов и их деградации [19, 47, 282]. К ферментам, катализирующим реакции ограниченного протеолиза относятся экзопептидазы, отщепляющие остатки аргинина и лизина с С-конца [155, 245, лизинкарбоксипептидаза, карбоксипептидаза 281], в частности карбоксипептидаза Е, фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая и пептидил-дипептидаза А, отщепляющая С-концевой дипептид [18, 72, 73]. Поскольку уровень многих регуляторных пептидов изменяется при депрессии и антидепрессантной терапии [161, 167, 183], логично предположить участие в патологическом процессе ферментов, участвующих в синетезе и деградации регуляторных пептидов. Целью работы было выяснение роли ферментов обмена регуляторных пептидов КПЕ (КФ 3.4.17.10), ПДПА (КФ 3.4.15.1), ФМСФ-КП, ЛКП (КФ 3.4.17.3) в механизмах взаимодействия моноаминовых и пептидергической систем при введении селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов. При выполнении работы были поставлены следующие задачи: 7 1. Исследовать влияние карбоксипептидазы карбоксипептидазы, 0,2% Е, Твин-80 в 0,9% NaCl на активность фенилметилсульфонилфторидингибируемой- пептидил-дипептидазы А, лизинкарбоксипептидазы в отделах мозга, надпочечниках и сыворотке крови крыс. 2. Изучить влияние флуоксетина (10 мг/кг), ребоксетина (10 мг/кг), бупропиона (20 мг/кг) на активность ферментов обмена регуляторных пептидов в различных отделах мозга, надпочечниках и сыворотке крови. 3. Сравнить динамику изменений активности ферментов обмена регуляторных пептидов в различных отделах мозга, надпочечниках и сыворотке крови в зависимости от времени после введения различных селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов. 4. Изучить влияние флуоксетина, ребоксетина и бупропиона на активность исследуемых ферментов in vitro. Положения, выносимые на защиту: 1. Ферменты обмена регуляторных пептидов – карбоксипептидаза фенилметилсульфонилфторидингибируемая-карбоксипептидаза, Е, пептидил- дипептидаза А, лизинкарбоксипептидаза участвуют в механизмах регуляции взаимодействия моноаминовых и пептидергической нейромедиаторных систем 2. Активность ферментов карбоксипептидазы Е, фенилметилсульфонилфторидингибируемой-карбоксипептидазы, пептидил- дипептидазы А, лизинкарбоксипептидазы разнонаправлено изменяется на фоне интраперитонеального введения селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов 3. Ферменты процессинга регуляторных пептидов принимают участие в реализации антидепрессантного действия флуоксетина, ребоксетина и бупропиона 4. Активность ферментов обмена регуляторных пептидов служит показателем состояния пептидергической системы и изменяется при психических расстройствах, что диктует необходимость разработки фармакологических препаратов для лечения депрессии, влияющих на активность ферментов 8 Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые изучено влияние селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов флуоксетина, ребоксетина, бупропиона на активность карбоксипептидазы Е (КФ 3.4.17.10), пептидил-дипептидазы А (КФ 3.4.15.1), лизинкарбоксипептидазы (КФ 3.4.17.3) и фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы в нервной ткани и сыворотке крови крыс. Выявлена зависимость изменения активности изучаемых ферментов от типа селективного ингибитора обратного захвата моноаминов, отдела нервной системы и времени после введения. Полученные данные представляют интерес для понимания механизмов функционирования моноаминовых систем, их взаимодействия с пептидергической системой и роли ферментов обмена регуляторных пептидов в реализации антидепрессантного эффекта селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов. Полученные результаты могут быть использованы при разработке новых эффективных терапевтических препаратов для коррекции ряда психических заболеваний, таких как депрессия, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, наркомания и алкоголизм, при которых нарушения происходят одновременно в комплексе нескольких регуляторных систем [5, 9]. Апробация работы. Материалы диссертации доложены на всероссийских и международных научно-практических конференциях. По теме диссертации опубликовано более 14 работ, в том числе 4 статьи в журналах, реферируемых ВАК РФ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из 6 разделов: введение, обзор литературы по теме диссертации, материалы и методы исследований, результаты исследования, обсуждение результатов исследования, выводы. Работа изложена на 147 страницах, иллюстрирована 32 рисунками, 3 таблицами. Список литературы содержит 284 наименований на русском и иностранных языках. 9 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Моноаминовые нейромедиаторные системы и механизмы их функционирования К моноаминовым нейромедиаторным системам относят серотонинергическую, норадренергическую, дофаминергическую системы, в нейронах которых в качестве нейротрансмиттеров секретируются серотонин, норадреналин и дофамин [5, 10, 105]. Данные нейрохимические системы участвуют в механизмах регуляции ряда физиологических процессов в организме, в формировании эмоционального статуса и вовлечены в патогенез многих психических заболеваний, в том числе депрессии [9, 42, 46, 154]. Фармакологическое воздействие, компенсирующее дефицит или избыток данных нейромедиаторов в синаптической щели способствует снижению симптоматики нейродегенеративных патологий и аффективных расстройств [105]. 1.1.1. Серотонинергическая система Серотонинергическая система мозга представлена нейронами ядер шва мозгового ствола и широкой сетью аксонов, проецирующихся на области коры больших полушарий, базальные ганглии, образования лимбической системы, спинной мозг [2, 5, 105]. Данная нейромедиаторная система вовлечена в механизмы терморегуляции, сна и бодрствования, пищевого поведения, иммунного ответа, двигательной активности, восприятия боли, кардиоваскулярного регулирования, формирования эмоционального статуса, регуляции гипофизарной секреции [9]. Ключевым ферментом биосинтеза серотонина (5-гидрокситриптамина) в организме является триптофангидроксилаза, преобразующая L-триптофан в 5гидрокситриптофан [140], который декарбоксилируется с образованием серотонина при участии декарбоксилазы ароматических L-аминокислот [5, 10, 105]. 10 В организме млекопитающих в телах серотонинергических нейронов обнаружены две изоформы триптофангидроксилазы: триптофангидроксилаза 1 – фермент, регулирующий синтез медиатора в тучных клетках и кишечнике, и триптофангидроксилаза 2 – фермент, катализирующий образование серотонина в мозге [144]. Синтезированный в пресинаптических окончаниях серотонин депонируется в синаптических пузырьках. При помощи протон-зависимой АТФазы ионы H+ закачиваются в везикулы, при выходе протонов по градиенту концентрации молекулы серотонина поступают внутрь. Передача нервного импульса сопровождается деполяризацией мембраны и высвобождением нейромедиатора в синаптическую щель [32]. Молекулярным механизмом прекращения нейромедиаторной передачи является обратный захват серотонина особым белком-транспортером, переносящим медиатор из синаптической щели в цитоплазму нейрона или глиальной клетки, и его разрушение с помощью МАО до 5- гидроксииндолальдегида, который при участии ацетальдегиддегидрогеназы превращается в 5-гидроксииндолуксусную кислоту [10, 104]. Также прекращение секреции медиатора осуществляется по механизму обратной связи через воздействие на пресинаптические 5-НТ1А и 5-НТ1В-ауторецепторы [51]. Основой функционального разнообразия физиологических эффектов медиатора являются рецепторы, обладающие различным сродством к серотонину и локализованные на пресинаптических и постсинаптических мембранах в различных отделах мозга: коре больших полушарий, лимбической системе, базальных ганглиях, чёрной субстанции, области вентральной покрышки [63]. Выделяют 7 типов серотониновых рецепторов: 5-НТ1, 5-НТ2, 5-НТ3, 5-НТ4, 5-НТ5, 5-НТ6, 5-НТ7. В ЦНС преимущественно обнаружены метаботропные 5-НТ1 и 5-НТ2-рецепторы. Тип 5-НТ1-рецепторов состоит из 5 подтипов: 5-НТ1А, 5-НТ1В, 5-НТ1D, 5-НТ1E, 5-НТ1F, представляющих собой простые белки, содержащие 365422 аминокислотных остатка, и сопряженные с аденилатциклазой посредством G- 11 белков. Тип 5-НТ2-рецепторов состоит из трёх подтипов: 5-НТ2А, 5-НТ2В, 5-НТ2С, представляющих собой простые белки, сопряженные с фосфолипазой С [209]. Са2+-зависимое фосфорилирование триптофангидроксилазы приводит к усилению синтеза интенсивности 5-гидрокситриптофана секреции серотонина из из триптофана. пресинаптических Регуляция нейрональных терминалей осуществляется по принципу обратной связи через пресинаптические 5-НТ1А и 5-НТ1В-рецепторы [51]. 5-НТ2А-рецепторы, регулирующие уровень серотонина в мозге, в больших количествах содержатся в структурах, отвечающих за эмоциональные и когнитивные процессы – в гиппокампе, хвостатом ядре, базальных ганглиях и передней коре мозга [163]. Помимо этого, серотонин оказывает модулирующее влияние на уровень других нейротрансмиттеров [40]. Рецепторная основа этого воздействия включает 5-НТ1В, 5-НТ1D, 5-НТ2А, 5-НТ2С–рецепторы [100]. Через пресинаптические 5-НТ1D-рецепторы по принципу отрицательной обратной связи регулируются уровни высвобождения дофамина, ацетилхолина и глутамата [63]. Действуя через 5-НТ2С-рецепторы, серотонин ингибирует дофаминергическую систему, а через 5-НТ2А-рецепторы стимулирует её. За счёт подавления секреции ГАМК через 5-НТ1В-рецепторы серотонин может усиливать активность дофаминергических нейронов [100]. Активация 5-НТ2А-рецепторов на ГАМКергических нейронах вызывает подавление активности норадренергических нейронов голубого пятна [262], в то время как антагонист 5-НТ2А-рецепторов асенапин увеличивает секрецию норадреналина и дофамина в префронтальной коре и гиппокампе крыс [171]. 1.1.2. Дофаминергическая система Дофаминергические нейроны локализованы в среднем мозге, обонятельной луковице, гипоталамусе и перивентрикулярной области продолговатого мозга. Нейроны чёрной субстанции дают проекции в стриатум, образуя нигростриарный путь. Образования лимбической системы и лобные отделы коры иннервируются через мезолимбические пути от покрышки среднего мозга. Система 12 дофаминергических клеток вокруг четвертого желудочка простирается внутри ствола мозга до гипоталамуса [5, 10, 105]. Дофаминергическая система участвует в контроле двигательной активности, формировании эмоционального статуса, модулировании нейроэндокринных сигналов за счет регуляции секреции гормонов передней доли гипофиза и гипоталамуса [66, 85, 222]. Предшественником аминокислота дофамина гидроксилируется до является тирозин. Первоначально 3,4-диоксифенилаланина при участии тирозингидроксилазы. Далее под действием декарбоксилазы ароматических Lаминоксилот из 3,4-диоксифенилаланина образуется дофамин. Регуляция синтеза осуществляется по принципу отрицательной обратной связи путем ингибирования тирозингидроксилазы медиатором. Из синаптической щели дофамин посредством специфического транспортера переносится внутрь нейронов, где расщепляется с помощью моноаминооксидазы, альдегиддегидрогеназы и катехол-О- метилтрансферазы до гомованилиновой кислоты [10, 100]. Выделяют пять типов метаботропных дофаминовых рецепторов D1, D2, D3, D4, D5, различающихся между собой по чувствительности к дофамину и нейролептику спиперону. Все рецепторы гомологичны, представляют собой αспирали, состоящие из 7 трансмембранных доменов, сопряжены с ГТФсвязывающими белками. D 2, D3-рецепторы имеют преимущественно пресинаптическую локализацию, на постсинаптических мембранах обнаружены все типы рецепторов [82, 222]. D1-рецепторы обнаружены в лобных долях коры больших полушарий, стриатуме, чёрной субстанции, амигдале, обонятельной луковице, в меньшей концентрации в гиппокампе, мозжечке, таламической и гипоталамической областях. D5-рецепторы в небольших количествах встречаются в различных участках мозга, в том числе в чёрной субстанции, зубчатой извилине, гиппокампе и гипоталамусе. При стимуляции этих рецепторов увеличивается уровень цАМФ, повышается гидролиз фосфоинозитолдифосфата, кальция и активация протеинкиназ [86, 106]. происходит мобилизация 13 D2-рецепторы в высокой концентрации присутствуют в стриатуме, чёрной субстанции, вентральной области покрышки, амигдале, обонятельной луковице, гипоталамусе. D3-рецепторы найдены в прилежащем ядре и обонятельной луковице, в меньшей концентрации в чёрной субстанции, вентральной области покрышки, мозжечке. D4-рецепторы – в коре больших полушарий, гиппокампе, стриатуме, амигдале. При их стимуляции понижается уровень цАМФ, увеличивается калиевая проницаемость плазматических мембран и снижается потенциал-зависимый ток ионов Са2+ [86, 106]. Синтез и секреция дофамина модулируются через пресинаптические ауторецепторы, их активация ингибирует высвобождение медиатора. Помимо этого, через дофаминовые рецепторы осуществляется регуляция высвобождения норадреналина и ацетилхолина [9]. 1.1.3. Норадренергическая система Нейроны норадренергической системы локализованы в продолговатом мозге, ядре одиночного тракта, голубом пятне, латеральной ретикулярной формации моста, нейроны голубого пятна образуют проекции в отделы ЦНС: таламус, гипоталамус, лимбическую систему, кору больших полушарий, спинной мозг [5, 10, 105]. Система осуществляет регуляцию двигательной активности, сердечной деятельности, вовлечена в механизмы сна и бодрствования, формирования эмоционального статуса. [9]. В норадренергических нейронах синтезированный в цитоплазме дофамин транспортируется в везикулы, где превращается в норадреналин при участии дофамин-β-гидроксилазы. Регуляция синтеза осуществляется по принципу отрицательной обратной связи путем ингибирования тирозингидроксилазы норадреналином. Посредством специфического транспортера медиатор из синаптической щели переносится внутрь нейронов. В деградации норадреналина принимают участие два фермента: моноаминооксидаза и катехол-О-метилтрансфераза [10]. В результате конечным продуктом деградации служит либо 4гидрокси-3-метоксифенилгликоль, либо ванилилминдальная кислота [105]. 14 В зависимости от чувствительности к симпатомиметическим аминам выделяют два класса адренорецепторов - α- и β-, которые в свою очередь подразделяются на подклассы. Все адренорецепторы относятся к суперсемейству рецепторов, связанных с G-белками, и обладают типичной 7-доменной трансмембранной структурой [63]. Адренорецепторы присутствуют в нервной ткани в небольшом количестве. Стимуляция пресинаптических медиатора, β-адренорецепторов α2-адренорецепторов – усиливает тормозит секрецию. секрецию Активация α 1- адренорецепторов головного и спинного мозга приводит к усилению обмена фосфатидилинозитола, повышению уровня цАМФ. Стимуляция постсинаптических α2-адренорецепторов индуцирует снижение внутриклеточного уровня цАМФ посредством ингибирования аденилатциклазы. Уровни цАМФ и цГМФ, активность Na+, К+-АТФазы и проницаемость мембраны для Ca2+ и К+ изменяются при воздействии на пресинаптические α2-адренорецепторы [63]. 1.2. Процессинг регуляторных пептидов и их биологическая роль Регуляторные пептиды представляют собой малые и средние по размеру молекулы, состоящие из 2-60 остатков аминокислот, широко представленные во всех тканях организма [82]. Они служат основой межклеточного взаимодействия различной модальности, выступают в качестве нейротрасмиттеров, образуя самостоятельные пути, нейромодуляторов, сосуществуя с классическими нейромедиаторами и регулируя их активность [19, 20, 87]. Регуляторные пептиды оказывают влияние на поведенческие и соматические реакции организма, эмоциональное состояние, процессы сна и бодрствования, внимания и памяти, регулируют пищевое поведение, активность цитокинов, обладают обезболивающим эффектом [82, 87, 105]. Каждый из пептидов обладает уникальными эффектами, вместе с тем имеет перекрывающийся обеспечивает с плавный другими переход пептидами от одной спектр биоактивностей, совокупности что модулирующих 15 воздействий на функции организма к другой. Всё множество регуляторных пептидов образует функциональный континуум [5, 40]. При этом каждый регуляторный пептид контролирует выход нескольких других пептидов, уровни воздействия касаются как синтеза и секреции, так и деградации. Каждый индуцированный пептид модулирует уровень ряда других регуляторных пептидов. Таким образом, формируются каскадные цепи, биологическое значение которых состоит в увеличении гибкости ответной реакции организма при изменении условий. В связи с широким спектром действия регуляторных пептидов вызывает интерес изучение их роли в формировании различных состояний организма, в том числе патологических [5, 19, 40]. Классификация пептидов основана на сочетании топологического, структурного, функционального принципов, при этом среди регуляторных пептидов выделяют вазоактивные пептиды (адреномедуллин, ангиотензины, брадикинин и др.), опиоидные пептиды (динорфин, эндорфин, энкефалин, орфанин и др.), пептиды из мозга (галанин, нейротензин, нейропептид Y и др.), нейропептиды (кортистатин, орексин и др.), тахикинины (вещество Р и др.), пептидные гормоны (окситоцин, вазопрессин, АКТГ, кортиколиберин и др.) [19, 82]. Уровень биологически активных пептидов зависит от соотношения скоростей их синтеза и деградации [54]. Регуляторные пептиды получают из высокомолекулярных неактивных молекул-предшественников, синтезирующихся на рибосомах шероховатой эндоплазматической сети [18, 19, 47]. Перенос молекул в просвет ЭПС происходит при взаимодействии N-концевой сигнальной последовательности из 15-20 остатков гидрофобных аминокислот с рецепторами на поверхности. Посттрансляционной процессинг осуществляется по мере передвижения молекул к комплексу Гольджи. При этом ограниченный протеолиз является одним из ключевых механизмов [18, 19, 47, 54, 90], играющий важную роль в процессах синтеза и деградации регуляторных пептидов. Посттрансляционная модификация (сульфирование, гликозилирование, ацетилирование, амидирование) предотвращает возникновение нарушений 16 процессинга и образование нетипичных пептидов [5]. Эндопротеолиз протекает внутри секреторных везикул, при этом полипептид расщепляется по парам остатков основных аминокислот при участии трипсиноподобных протеаз [1, 90]. Экзопротеолиз протекает под действием амино- и/или карбоксипептидаз. Таким образом, ферменты, участвующие в реакциях синтеза и деградации регуляторных пептидов, обеспечивают их определенное соотношение в различных тканях организма [105, 282]. Секреторные везикулы транспортируются к терминалям [237], выделяются в синаптическую щель или окружающее межклеточное пространство. В разных типах клеток из одной молекулы-предшественника могут быть получены различные пептиды [237], что связано с разными наборами ферментов, действующих на молекулу предшественника. Например, в аденогипофизе из проопиомеланокортина образуются АКТГ, β-липотропин и β-эндорфин, в промежуточной доле гипофиза происходит их расщепление до α- меланоцитстимулирующего гормона и фрагментов β-эндорфина [5]. Для понимания механизмов образования различных регуляторных пептидов из одних предшественников в разных тканях необходимы исследования ферментов процессинга со сходной субстратной специфичностью. Особый интерес представляет изучение карбоксипептидаза-В-подобных ферментов, отщепляющих остатки лизина и аргинина с С-конца пептидов на конечной стадии их процессинга. Так, при помощи ферментов обмена регуляторных пептидов осуществляется регуляция физиологических эффектов пептидов на этапах их биосинтеза и инактивации [18, 19, 252]. 1.3. Функциональное взаимодействие моноаминовых и пептидергической нейромедиаторных систем в норме и при патологиях Многосичленные исследования последних лет свидетельствуют о том, что моноаминовые нейромедиаторные системы имеют тесные функциональные взаимодействия с пептидергической системой. Модулирующее влияние 17 моноаминов на синтез и секрецию различных регуляторных пептидов обеспечивается наличием множественных синаптических контактов с этими системами [40, 105]. В пресинаптических окончаниях многих нейронов выявлена совместная локализация везикул, содержащих моноаминовые медиаторы (серотонин, норадреналин, дофамин) и нейропептиды [5, 105]. Так, солокализация дофамина и нейротензина отмечена в стриатуме, гиппокампе, амигдале [109]; серотонина и вещества Р в гипоталамусе, мосте и продолговатом мозге [102]; серотонина и энкефалина в продолговатом мозге [105], норадреналина и нейропептида Y [283]. В одних и тех же отделах мозга могут присутствовать рецепторы для моноаминов и нейропептидов. Например, в чёрной субстанции обнаружены рецепторы для дофамина, серотонина, нейротензина, вещества Р и соматостатина [63, 138, 164]. Неостриатум содержит рецепторы для дофамина, опиоидных пептидов, вещества Р, холецистокинина, нейропептида Y, соматостатина [63, 164, 268, 277]. Взаимодействия нейромедиаторных систем осуществляются как на пре -, так и на постсинаптическом уровнях, при этом моноамины и пептиды регулируют содержание друг друга. Дофамин подавляет секрецию кортиколиберина и АКТГ, что подтверждено исследованиями влияния агонистов D1 и D2-рецепторов на уровень этих пептидов [108]. Медиатор оказывает модулирующее влияние на секрецию аргининвазопрессина [111], тиролиберина и вызывает увеличение продукции окситоцина в гипоталамусе [148]. Блокирование дофаминергических синапсов в стриатуме и аккумбенсе галоперидолом вызывает накопление Met5-энкефалина [162]. Стимуляция дофаминовых рецепторов снижает содержание нейротензина в базальных ганглиях [93]. Серотонин, воздействуя на 5-НТ1А-рецепторы, ингибирует высвобождение тиролиберина в гипоталамусе [177], посредством активации 5-НТ1А, 5-НТ2А, 5НТ4-рецепторов повышает экспрессию мРНК окситоцина, аргинин-вазопрессина, АКТГ в гипоталамусе [176, 265]. В ряде исследований выявлено, что секреция аргинин-вазопрессина индуцируется опосредованно ангиотензин II [240]. 18 Активация серотонинергических нейронов в мозге угнетает систему опиоидных пептидов. Снижение уровня серотонина фенфлурамином вызывает повышение содержания Met5-энкефалина и β-эндорфина в гипоталамусе и стриатуме и снижение содеражния β-эндорфина в гипофизе [199]. Норадреналин, связываясь с пресинаптическими α2-рецепторами, подавляет секрецию нейропептида Y в симпатической нервной системе [221]. Норадреналин увеличивает экспрессию мРНК галанина, кортиколиберина, окситоцина и аргинин-вазопрессина в гипоталамусе; стимулирует высвобождение галанина [274], кортиколиберина [123], окситоцина, аргинин-вазопрессина [263], тиролиберина [174], АКТГ [258]. Конечный физиологический эффект регуляторных пептидов определяется конкретной регуляторную нейромедиаторной функцию системой. других Нейропептиды нейрохимических могут систем по изменять механизму торможения возбудимости вставочных нейронов путём пресинаптической модуляции секреции медиатора [105]. Многие регуляторные пептиды стимулируют секрецию дофамина, в том числе опиоидные пептиды, вещество Р, нейропептид Y, нейротензин [193, 151]. У крыс с дефицитом аргинин-вазопрессина отмечен повышенный уровень дофамина в структурах лимбической системы [111]. Тиролиберин ингибирует секрецию дофамина и норадреналина [116], увеличивает количество 5-НТ1-рецепторов в переднем мозге крыс [145], ускоряет обмен серотонина в центральном сером веществе среднего мозга [269]. Кортиколиберин повышает уровень дофамина в гипоталамусе и снижает в стриатуме, по-видимому, данные эффекты опосредованы через рецепторы кортиколиберина [181]. Также кортиколиберин увеличивает активность норадренергических нейронов голубого пятна, повышает секрецию медиатора в префронтальной коре и гиппокампе [128]. Центральное введение пептида вызывает повышение активности серотонинергических нейронов гиппокампа [194]. АКТГ способствует увеличению содержания норадреналина в плазме крови человека [275], внутрибрюшинное введение пептида повышает уровень серотонина в гипоталамусе [191]. Окситоцин снижает 19 содержание серотонина в гипоталамусе, среднем мозге, увеличивает в стриатуме [33], вместе с аргинин-вазопрессином стимулирует секрецию норадреналина в гипоталамусе крыс [219]. Аргинин-вазопрессин снижает синтез и высвобождение серотонина из гиппокампа [96]. Центральное введение ангиотензина II крысам ускоряет обмен норадреналина в головном мозге [147], снижает активность серотонинергических нейронов в субфорникальном органе головного мозга крыс [260]. Предположительно через D2-рецепторы опосредовано модулирующее влияние вещества Р на дофаминергическую систему, что подтверждается увеличением секреции дофамина в ипсилатеральном хвостатом ядре при локальном введении вещества Р в чёрную субстанцию [217]. Активация нейротензиновых рецепторов, обнаруженных на дофаминергических нейронах в чёрном веществе, вентральной тегментальной области, коре, экстрапирамидных и лимбических структурах мозга, вызывает повышение уровня дофамина [109]. Многие эффекты опиоидов (анальгезия, кататония, гипертермия) опосредованы через моноаминовые системы. Динорфин, β-эндорфин оказывают супрессорное воздействие на серотонинергическую систему [127], β-эндорфин повышает уровень норадреналина в гипоталамусе крыс [205]. Динорфин, Leu5энкефалин, β-эндорфин снижают уровень норадреналина в плазме крови кроликов [126]. Системное 8-дневное введение налтрексона, блокирующего опиоидные рецепторы, усиливает кругооборот серотонина во фронтальной коре, дофамина – в гиппокампе, таламусе, снижает мезолимбическую норадренергическую активность. В стриатуме, гипоталамусе и центральном сером веществе изменения в работе моноаминовых систем не обнаружены [244]. Нейропептид Y, являясь котрансмиттером серотонина и норадреналина, регулирует секрецию медиаторов по механизму отрицательной обратной связи [146]. Стимуляция рецепторов нейропептида Y приводит к подавлению секреции норадреналина в гипоталамусе [156]. 20 Галанин in vitro усиливает секрецию норадреналина в мозговом слое надпочечников [94], подавляет высвобождение серотонина и норадреналина в гиппокампе [276]. Рядом авторов было установлено значительное изменение уровня некоторых регуляторных пептидов при действии селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов [242]. Таким образом, данные факты подтверждают существование тесной взаимосвязи между серотонинергической, норадренергической, дофаминергической и пептидергической системами, модулирующее влияние регуляторных пептидов на работу моноаминовых систем и наоборот, что делает вполне обоснованным предположение об опосредованности антидепрессантного эффекта селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов через компоненты пептидергической системы. Поскольку уровень пептидов зависит от соотношения скоростей их синтеза и деградации, особый интерес представляет изучение активностей ферментов обмена регуляторных пептидов, в частности фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы Е, карбоксипептидазы, лизинкарбоксипептидазы, пептидил-дипептидазы А при введении селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов: флуоксетина, ребоксетина, бупропиона. Результаты данных исследований представляют теоретический интерес и могут быть использованы при разработке методов коррекции нарушений функционирования моноаминовых систем посредством изменения активностей ферментов обмена регуляторных пептидов. 21 1.4. Нейрохимические основы депрессии Моноаминовые нейромедиаторные системы мозга – норадренергическая, серотонинергическая и дофаминергическая – участвуют в формировании эмоций и поведенческих реакций. Им принадлежит ведущая роль в развитии психических заболеваний [234]. Депрессию связывают с уменьшением серотонинергической, норадренергической, дофаминергической активностей в ЦНС, что может быть связано со снижением секреции нейромедиаторов, уменьшением количества рецепторов, нарушением опосредованной рецепторами сигнальной трансдукции [21, 69]. Согласно теории моноаминового дефицита, именно снижение концентраций серотонина, норадреналина и дофамина является основной причиной развития заболевания множественных [154, 166, 215]. В связи с наличием морфологических и функциональных связей между нейромедиаторными системами, воздействие на одну из них вызывает изменения в других [262]. Исследования по определению концентраций метаболитов норадреналина, серотонина и дофамина показали снижение их уровней в плазме и цереброспинальной жидкости у больных депрессией [223]. Диета с низким содержанием аминокислоты триптофана, из которой синтезируется серотонин, приводит к появлению вторичных симптомов заболевания у пациентов с эффективной предшествующей терапией селективными ингибиторами обратного захвата серотонина [243]. При депрессии наблюдается уменьшение активности триптофангидроксилазы 1, приводящее к снижению уровня периферического серотонина, и компенсаторная активация триптофангидроксилазы 2 в головном мозге [144]. Также усиление симптоматики заболевания возникает при приёме αметилпаратирозина – ингибитора важнейшего фермента синтеза катехоламинов тирозинкарбоксилазы [115]. Эти данные являются косвенными доказательствами наличия дефицита моноаминов в структурах мозга больных депрессией. Ангедония и психомоторная заторможенность являющиеся симптомами заболевания, связаны со снижением дофаминергической активности в чечевидном 22 ядре [225]. Косвенными подтверждениями участия дофаминергической системы в развитии патологии служат высокая распространенность депрессии при болезни Паркинсона, депрессогенный эффект резерпина, эффективность прямого агониста дофаминовых рецепторов прамипексола при терапии заболевания [259] и лечебный эффект бупропиона, обладающего вторичными дофаминергическими эффектами [229]. Высокая эффективность большинства современных антидепрессантов является клиническим доказательством существования моноаминового дефицита при данном заболевании [27, 44]. Селективные ингибиторы обратного захвата моноаминов блокируют обратный захват пресинаптическими окончаниями серотонина, норадреналина и дофамина, что сопровождается увеличением их концентрации в синаптической щели и усилением их действия на постсинаптическую мембрану. Ингибиторы МАО, обладающие антидепрессивной активностью, блокируют фермент, разрушающий моноамины в пресинаптических окончаниях, что также вызывает повышение их содержания в синаптической щели [27, 59]. Однако, часть пациентов оказываются резистентными к лекарственной терапии [51], поэтому логично предположить возможное участие ряда других нейрохимических факторов в этиопатогенезе заболевания. При длительном лечении антидепрессантами были выявлены адаптивные изменения моноаминовых рецепторов, возникновение которых ассоциируют с началом терапевтического эффекта [254]. Посмертные исследования мозговых структур больных депрессией показали снижение содержания белка p11, усиливающего активность 5HT1В-рецепторов пресинаптической мембраны, регулирующих по механизму обратной связи высвобождение серотонина [255]. У нокаутных мышей с дефицитом белка р11 отмечалось поведение, напоминающее депрессивное, тогда как избыточная экспрессия р11 усиливала функцию 5-HT1B-рецепторов в клетках и воспроизводила поведение, наблюдаемое после терапии антидепрессантами. Длительное лечение, включающее электросудорожную терапию, увеличивает 23 уровень р11 и противодействует проявлению депрессивноподобного фенотипа [256]. При заболевании наблюдается снижение чувствительности 5HT1Арецепторов пре- и постсинаптической мембраны, участвующих в механизме передачи нервного импульса в серотонинергических путях [114, 198, 224]. У пациентов с депрессией отмечено увеличение количества 5-НТ2А-рецепторов, предполагается их вовлеченность в реализацию антидепрессантного эффекта препаратов, применяемых в клинической практике. [211]. 5-НТ2С-рецепторы широко представлены в лимбических структурах мозга и участвуют в регуляции ритмичeской организации сна [63]. Селективные ингибиторы обратного захвата серотонина уменьшают их чувствительность, что, по-видимому, является одним из механизмов действия препаратов [135]. Кроме того 5-НТ2С-рецепторы ГАМКергических нейронов дофаминергическую и вентротегментальное ядро Следовательно, блокада дофаминергической оказывают опосредованное норадренергическую гипоталамуса и влияние нейропередачи голубоватое и норадренергической с симптомами трансмиссии, через пятно этих рецепторов вызывает активацию на [249]. корковой сниженных при депрессии [51]. У пациентов заболевания наблюдаются изменения количества и чувствительности адренорецепторов. На генетической модели депрессии у крыс линии Flinders Sensitive Line была установлена связь депрессивно-подобного фенотипа животных с функциональными изменениями в норадренергической системе [186]. Наблюдаемое при депрессии снижение высвобождения норадреналина может быть связано с повышенной чувствительностью α2-рецепторов пресинаптической мембраны, регулирующих секрецию нейромедиатора путем ингибирования обратной связи [220]. Тем самым можно объяснить положителый терапевтический эффект антагонистов α2рецепторов. Длительное ингибирование нейронального захвата норадреналина вызывает снижение количества пресинаптических α2-рецепторов, в результате чего усиливается высвобождение нейромедиатора. Также антидепрессантная терапия приводит к увеличению плотности α1-рецепторов [251]. 24 Изменения постсинаптических рецепторов моноаминов происходят совместно с изменениями внутриклеточных молекул-передатчиков. Имеются сведения о нарушениях внутриклеточной передачи импульса при депрессии, не зависящих от числа рецепторов на мембранах или уровня моноаминов в синаптической щели. Посмертные исследования мозга лиц, погибших вследствие суицидов, и исследования мозга больных депрессией с использованием магниторезонансной спектроскопии показали уменьшение концентрации инозитола в лобной коре [125] и снижение активности аденилатциклазы при β- адренергической стимуляции [264]. Также при депрессии отмечено изменение активности G-белка, отвечающего за передачу сигнала между рецепторами и вторичными мессенджерами антидепрессантами [97]. усиливает Установлено, функцию что белка длительное CREB, лечение являющегося транскрипционным фактором, контролируемым цАМФ в клетке [113]. Гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая ось – нейроэндокринная система, ответственная за поддержание гомеостаза организма, адаптацию к факторам внешней среды и выживание во время стресса [30, 68]. Её активация является одним из главных эндокринных нарушений при депрессивных расстройствах [253], при этом отмечают повышение уровней кортиколиберина, АКТГ и кортизола в период депрессивного эпизода и их нормализацию после клинической ремиссии [250]. Кортиколиберин участвует в регуляции стрессорных, агрессивных и фобийных поведенческих реакций животных и синтезируется в гипоталамусе. Стимуляция гипофизарных рецепторов кортиколиберином приводит к секреции АКТГ в плазму крови, который активирует кортикотропиновые рецепторы коры надпочечников, что вызывает высвобождение кортизола в кровь [257]. Активация гипоталамических кортизоловых рецепторов в норме приводит к снижению выработки кортиколиберина по механизму обратной связи [51, 68, 131]. У больных наиболее тяжелыми формами депрессивных расстройств нарушена реакция подавления выработки кортизола, о чем свидетельствет положительный дексаметазоновый тест [118]. Также при депрессии отмечено 25 повышение уровней кортизола в плазме, кортиколиберина в ЦСЖ и увеличение содержания мРНК и белка-переносчика кортиколиберина в структурах лимбической системы [208]. Повышение содержания моноаминовых нейромедиаторов в синапсе при приеме препаратов оказывает влияние на ГГНО и приводит к уменьшению последствий хронического стресса, являющегося одной из причин развития депрессии [24, 79, 167]. Высокий уровень активности гипоталамо-гипофизарнонадпочечниковой оси в течение первых недель приёма антидепрессантов, повидимому, связан с низким уровнем раннего ответа на лекарственную терапию [157]. В исследованиях на животных было установлено, что классические антидепрессанты надпочечниковой регулируют оси путём активность повышения гипоталамо-гипофизарно- экспрессии глюкокортикоидных рецепторов, что улучшает работу механизма обратной связи [103]. Также был обнаружен положительный терапевтический эффект антагонистов рецепторов кортиколиберина [110, 134], блокаторов глюкокортикоидных рецепторов, например, мифепристона [112], усиливающего нейрогенез [204] и повышающего чувствительность 5-НТ2А-рецепторов [261]. О вовлечённости ГАМКергической системы в патогенез депрессии свидетельствует снижение концентрации ГАМК в мозге пациентов с симптомами заболевания. В качестве возможных фармакологических препаратов для лечения депрессии рассматриваются агонисты GABA-В-рецепторов, преимущественно локализованных в струтурах лимбической системы [185]. Ряд исследований свидетельствуют о вовлеченности многих регуляторных пептидов в патогенез депрессии, в частности орексина [122], орфанина FQ / ноцицептина [272], вещества P, нейропептида Y [173], холецистокинина [133], галанина [271], нейротензина, аргинин-вазопрессина [167], окситоцина [101], βэндорфина [159], энкефалинов [206]. Отмечается кооперативность стресс-активируемых реакций орексина-А и кортиколиберина, реализуемых на уровне паравентрикулярных ядер гипоталамуса 26 и ядер миндалины [236]. Депрессивно-подобное поведение крыс коррелирует со снижением уровня орексина-А в гиппокампе и увеличением экспрессии мРНК Orx1-рецептора в миндалине [95]. Орфанин FQ/ ноцицептин усиливает анксиогенное поведение, связанное с повышением уровня АКТГ и кортикостерона в крови крыс [139]. Также в регуляции анксиогенной активности животных участвуют аргинин-вазопрессин и окситоцин [107]. На генетической модели депрессии у крыс линии Flinders Sensitive Line была установлена связь депрессивно-подобного фенотипа животных с изменениями уровня нейропептида Y и тахикининов в структурах мозга [173]. Было отмечено снижение уровня вещества P в стриатуме, нейропептида Y в гиппокампе, повышение содержания вещества P во фронтальной коре. Фармакологическая блокада тахикининовых рецепторов приводила к заметному снижению страха и тревожности у мышей и сопровождалась активацией серотонинергических нейронов шва дорзального ядра. Блокада рецепторов галанина вызывала повышение уровня кортикостерона в сыворотке крови в ответ на стрессовое воздействие, что сопровождалось снижением времени иммобильности в тесте вынужденного плавания [48]. Было установлено участие холецистокинина и его фрагментов в патогенезе психических заболеваний, в том числе депрессии [133]. Ряд исследований указывают на атрофические изменения структур мозга как возможные причины развития заболевания. Посмертное изучение мозга больных депрессией и исследования с использованием магнитно-резонансной томографии выявили следующие нарушения: уменьшение объема гиппокампа [197], апоптоз клеток в дорсолатеральной префронтальной и орбитофронтальной коре, в поясной извилине префронтальной коры, уменьшение числа нервных клеток в дорсальной части ядра шва и гипоталамусе [182]. Причиной данных изменений может быть наблюдаемое при депрессии повышенное содержание глюкокортикоидов, снижающее нейропластичность и способность к нейрогенезу. При депрессивных расстройствах обнаружено усиление глутаматной нейротрансмиссии [248], при этом высвобождение глутамата и возбуждающих 27 нейропептидов увеличивают нейротоксичность и усиливают клеточный апоптоз [278]. Таким образом, депрессия может являться результатом нарушения работы нейрональных сетей [26, 49]. По-видимому, образованием новых нейрональных сетей в ответ на хроническое воздействие антидепрессантов можно объяснить задержку терапевтического эффекта препаратов, применяемых для лечения [235]. Длительное применение антидепрессантов приводит к усилению нейрогенеза в гиппокампе [120, 238]. Исследования показали, что большинство препаратов снижают аффинитет глициновой части NMDA-рецепторного комплекса [165], с чем может быть связан кратковременный антидепрессивный эффект при приеме антагонистов NMDA-рецепторов [129]. На молекулярном уровне NMDAантагонисты блокируют обусловленные стрессом атрофию гиппокампальных пирамидальных нейронов и подавление нейрогенеза за счет усиления экспрессии CREB и BDNF [266]. Поскольку нейротрофические ростовые факторы вовлечены в регуляцию процессов нейропластичности, включая выживание клеток, увеличение числа синапсов и рост аксонов [184], ряд исследований посвящены их роли в модуляции тревожности и депрессивных состояний [11, 117, 121, 178, 241]. Установлено, что вызываемая хроническим глюкокортикоидных рецепторов стрессовым воздействием сопровождается уменьшением активация экспрессии мозгового нейротрофического фактора BDNF [267], что может быть причиной развития заболевания. Снижение уровня BDNF в гиппокампе обнаружено при посмертных исследованиях мозга жертв суицидов, страдавших депрессией [178]. Прием антидепрессантов и электросудорожная терапия повышает выработку BDNF за счет усиления экспрессии гена [270]. Блокирование гена BDNF у мышей не вызывает появление депрессоподобных симптомов, однако снижает эффективность антидепрессантов [136]. Важную роль в развитии депрессии играют нарушения в работе иммунной системы организма [51, 52, 210]. Повышенный при данной патологии уровень интерлейкина-6, гамма-интерферона, простагландина Е2 и α-фактора некроза 28 опухолей снижается при терапии антидепрессантами [216]. У животных при введении этих факторов наблюдается психомоторная заторможенность и ангедония [175]. Также повышенный уровень цитокинов вызывает активацию гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси и серотонина [192], что отмечается при депрессии. предположить антидепрессивноподобную снижение содержания Эти данные позволяют активность антагонистов провоспалительных цитокинов, ингибиторов циклооксигеназы-2, уменьшающих синтез простагландина Е2 в головном мозге [187]. Предположение подтвердилось для ингибитора TNFα инфликсимаба и ингибитора циклооксигеназы-2 целекоксиба [92, 212]. Поскольку депрессия часто сопутствует сердечно-сосудистым заболеваниям, можно предположить наличие общих механизмов, лежащих в основе этих патологий [12, 34, 35]. Стрессовое воздействие, приводящее к развитию заболевания, вызывает увеличение уровня ангиотензина II, что также наблюдается при различных сердечно-сосудистых заболеваниях [77]. Активация гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси и повышение уровня цитокинов, отмеченные при депрессии, могут быть опосредованы через изменение содержания ангиотензина II [57, 58, 152]. Активация АТ(1) рецепторов, локализованных в паравентрикулярных ядрах гипоталамуса, стимулирует секрецию кортиколиберина [218]. На модели культуры клеток крови человека in vitro было установлено, что ангиотензин II индуцирует синтез множества провоспалительных цитокинов, а ингибитор ПДПА каптоприл обладает выраженным антицитокиновым эффектом [71]. Установлено, что риск развития депрессивных расстройств связан с функциональным полиморфизмом гена пептидил-дипептидазы А [98]. При депрессии отмечены нарушения биологических ритмов, в том числе цикла сон-бодрствование. Моноамины, стрессорные гормоны и нейротрофические факторы могут влиять на циркадные ритмы, эндогенным генератором которых является мелатонин, секретирующийся в эпифизе и действующий через супрахиазмальное ядро гипоталамуса [3, 227]. Агомелатин, 29 являющийся агонистом рецепторов мелатонина МТ1 и МТ2 и антагонистом 5НТ2С-рецепторов, депрессии, чувствительность способствует которых синхронизации повышается циркадных при ритмов тревоге и и обладает антидепрессивной активностью [130, 179]. Генетические факторы играют существенную роль в развитии депрессии. Вклад в наследственную предрасположенность к проявлению заболевания вносят гены, обеспечивающие активность систем нейротрансмиссии, стрессорного, иммунного ответов, нейротрофических и апоптотических процессов [28]. Хотя вклад аллелей отдельных генов в формирование депрессивного состояния невелик, суммирование эффектов аллелей нескольких генов, увеличивающих риск патологии, а также стрессового воздействия, могут предрасполагать к развитию заболевания [28]. Таким образом, депрессия может быть связана с дезадаптивными изменениями в цепи нейротрансмиттеров, изменением уровня регуляторных пептидов, нейротрофических ростовых факторов, эндокринными нарушениями, атрофическими изменениями структур мозга, нарушением работы нейрональных сетей, циркадных ритмов, иммунной системы, изменением экспрессии генов [20, 23, 51, 56, 213]. В настоящее время для лечения заболевания широкое применение находят препараты, воздействующие на моноаминовые нейромедиаторные системы. Однако, резистентность некоторых пациентов к современным антидепрессантам стимулирует поиск новых терапевтических мишеней и подходов к лечению заболевания. В качестве таких мишеней рядом авторов рассматриваются регуляторные пептиды, вовлеченные в формирование эмоционального статуса, например, кортиколиберин, урокортин 1, урокортин 2, урокортин 3, аргининвазопрессин, нейропептид Y, галанин, окситоцин, нейротензин, вещество Р, холецистокинин [183, 233, 280]. По-видимому, именно биологически активным пептидам принадлежит ключевая роль в функциональной интеграции различных нейромедиаторных систем организма. На основании существующих данных можно предположить, 30 что снижение уровня моноаминов в мозге связано с изменением уровней регуляторных пептидов, участвующих в запуске адаптивных реакций организма в ответ на стрессовое воздействие и в формировании патологических состояний [19]. Знание путей синтеза и деградации регуляторных пептидов, позволит, избирательно воздействуя на ферменты их обмена, регулировать уровень биологически активных пептидов, участвующих в патогенезе данного заболевания [105]. Поэтому необходимым является изучение молекулярных механизмов изменений в функционировании моноаминовых и пептидергической систем при депрессии и антидепрессантной терапии, знание которых позволит производить направленное лечение заболевания. В связи с этим интерес вызывает изучение влияния препаратов из группы селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов, применяемых для лечения депрессии, на активность ферментов обмена регуляторных пептидов, в том фенилметилсульфонилфторид-ингибируемую числе карбоксипептидазу карбоксипептидазу, Е, пептидил- дипептидазу А, лизинкарбоксипептидазу. 1.5. Общая характеристика и физико-химические свойства ферментов нелизосомальной локализации Клетки животных и человека содержат сложную систему протеолиза, включающую протеолитические ферменты с различной специфичностью действия и внутриклеточной локализацией [155]. Выделяют полный или неограниченный протеолиз, при котором протеиназы полностью расщепляют белки, регулируя тем самым их концентрацию, и ограниченный протеолиз, при котором образование и инактивация биологически активных пептидов происходит благодаря расщеплению ограниченного числа пептидных связей в молекулах-предшественниках. Интенсивная протеолитическая деградация белков и пептидов осуществляется как в лизосомах, так и в цитоплазме [90], и в соответствии с локализацией и функциональной ролью выделяют 31 пептидгидролазы лизосом и внелизосомальные ферменты [18]. В отличие от лизосомальной протеолитической системы, осуществляющей генерализованный распад белка, ферменты нелизосомальной локализации имеют отношение к образованию регуляторных пептидов, необходимых для функционирования клетки и организма в целом [1, 20, 47, 245]. Реакции ограниченного протеолиза являются универсальным механизмом регуляции уровня биологически активных пептидов и лежат в основе функционирования важнейших физиологических систем, таких как ренинангиотензиновая, калликреин-кининовая, иммунитета, гемостаза, комплемента, апоптоза и т.д. [4, 19, 90, 91, 105, 252]. В нервной ткани система протеолиза также представлена большим набором ферментов с различной специфичностью действия, непосредственно участвующих в реакциях процессинга секретируемых белков и пептидов [155], тем самым регулируя их уровень в организме. В связи с этим большой интерес представляет изучение ферментативной активности при различных физиологических и патологических состояниях организма с сопутствующим изменением уровня регуляторных пептидов. Сайты, в которых происходит расщепление пептидных связей, содержат послеовательности основных аминокислот, например, Arg-Arg, Lys-Lys, Lys-Arg, Arg-X-X-Arg, Arg-Lys. Эндопротеолиз осуществляется при участии прогормонконвертаз. Образовавшийся при этом продукт подвергается дальнейшему экзопротеолизу при участии аминопептидазо-В- и/или карбоксипептидазо-Вподобных ферментов [279, 281]. В тканях млекопитающих обнаружен ряд ферментов, участвующих в процессинге регуляторных пептидов: КПB (КФ 3.4.17.2), ЛКП (КФ 3.4.17.3), КПЕ (КФ 3.4.17.10), КПM (КФ 3.4.17.12), КПU (3.4.17.20), КПD (3.4.17.22), ПДПА (КФ 3.4.15.1), ФМСФ-КП и т.д. [155, 230]. Ферменты КПB, КПM, КПU, КПD, КПЕ, ЛКП являются Zn2+-содержащими металлокарбоксипептидазами и способны отщеплять аргинин и лизин с С-конца 32 пептидов, ПДПА предстаявляет собой Zn2+-содержащий мембраносвязанный гликопротеин, отщепляющий С-концевой дипептид [155, 245]. Данные ферменты отличаются между собой оптимумом рН, например, оптимум рН 5,5-6,0 имеют КПЕ, ФМСФ-КП, КПD [18, 142, 155, 245], при рН 7,09,0 максимальную активность проявляют другие кабоксипептидазы и ПДПА [132, 155, 226]. Различные ионы металлов могут оказывать активирующее или ингибирующее воздействие на эти ферменты. Так, ионы Со2+ повышают пептидазную активность КПB, КПM, КПD, КПЕ, ЛКП, ПДПА, но снижают активность КПU [155]. Ионы Cd2+ снижают активность ЛКП [226], КПM [132], КПB, повышают активность КПU [155]. Дикарбоновые кислоты ГЭМЯК, ГПЯК и АПМЯК, а также хелатирующие агенты ЭДТА и 1,10-фенантролин ингибируют КПВ, КПM, КПD, КПЕ, КПU, ЛКП [155]. Большинство металлокарбоксипептидаз образуются в виде неактивных проферментов, преобретающих активность под влиянием трипсиноподобных ферментов [155, 169, 230]. КПВ (Mr 34 кДа), КПМ (Mr 62 кДа) и КПЕ (Mr 53-55 кДа) состоят из одной полипептидной цепи, в составе КПU (Mr 60 кДа) две субъединицы, КПD (Mr 180 кДа) – три субъединицы, ЛКП (Mr 280 кДа) – четыре субъединицы (две с Mr 88 кДа, без ферментативной активности, одна с Mr 55 кДа и одна с Mr 48 кДа) [155]. Аминокислотные последовательности активных субъединиц металлокарбоксипептидаз гомологичны между собой, что предполагает общее эволюционное происхождение этих ферментов. В частности, аминокислотная последовательность КПM на 41% идентична КПЕ, на 15% – КПB и КПA [155]. А последовательность аминокислот ЛКП на 41% совпадает с КПM, на 43% – с КПЕ, на 29% – с КПA и на 18% – с КПB. Кроме того, два остатка гистидина (His173, His66) и остаток глутаминовой кислоты (Glu69), связывающие Zn2+ в КПА и КПВ, присутствуют и в КПМ, что свидетельствует об эволюционной связи металлокарбоксипептидаз между собой [155]. 33 Аминокислотные последовательности С-концевых участков КПМ, ЛКП, КПЕ не имеют сходств, что объясняется различиями в локализации и функциональной активности данных ферментов. Так, у КПМ С-концевой участок служит трансмембранным якорем, у КПЕ опосредует связывание с мембранами везикул путем формирования амфипатической спирали, у ЛКП содержит множество остатков основных аминокислот, чем можно объяснить быстрое превращение субъединицы с Mr 55 кДа в субъединицу с Mr 48 кДа под действием сериновых протеаз [18]. Ферменты отличаются между собой распределением в тканях организма. Так, КПB обнаружена в мозге, ЦСЖ, в поджелудочном соке, экзокринных клетках поджелудочной железы, надпочечниках и в фибробластах кожи [18, 155, 202, 245]. ЛКП присутствует в амниотической жидкости, лёгких, плаценте, плазме крови, костном мозге, почках, печени [155, 230, 246]. КПM обнаружена в адипоцитах, печени, плаценте, амниотической жидкости, плазме крови, мозге, почках, костном мозге, клетках эндотелия [132, 201, 246]. КПU присутствует в плазме, печени, лёгких [155]. ПДПА обнаружена в плаценте, лёгких, почках, печени, сердце, ЦСЖ [273, 284]. КПЕ присутствует в лёгких, надпочечниках, мозге, опухолевых клетках [158]. Также очень разнообразна биологическая роль данных ферментов. КПB принимает участие в переваривании белков, в процессинге энкефалинов в надпочечниках [155, 230]. КПЕ и КПD являются ключевыми ферментами процессинга широкого спектра биологически активных пептидов [141, 155, 247]. ПДПА участвует в регуляции артериального давления, водно-солевого обмена, развитии воспалительной реакции [29, 155]. ЛКП, КПM вовлекаются в инактивацию кининов, анафилотоксинов, принимают участие в превращения предшественников энкефалинов. Кроме этого, ЛКП вовлекается в постсинаптическую модификацию креатинкиназы и енолазы [155, 246]. КПU принадлежит ключевая роль в поддержании гемостаза, фермент вовлекается в процессы локального воспаления, например, при ревматоидном артрите [155, 188]. 34 1.5.1. Карбоксипептидаза Е (КФ 3.4.17.10) КПЕ (КПН, энкефалинконвертаза) – тиолзависимая карбоксипептидаза, впервые выделенная Fricker и Snyder из хромаффинных гранул надпочечников быка [142], позднее очищена из гипофиза и поджелудочной железы [155]. Название фермента связано с участием его в процессинге энкефалинов. КПЕ представляет собой одноцепочечный Zn2+-содержащий растворимый или мембраносвязанный фермент с pI 4,9 и оптимумом рН 5,5-6,0, активность которого сильно уменьшается с повышением рН [142, 150]. Фермент синтезируется в виде неактивного предшественника с молекулярной массой 75 кДа, состоящего из 476 аминокислот, образование активных форм с молекулярными массами 52-53 кДа и 55-57 кДа происходит в секреторных везикулах при участии трипсиноподобных ферментов [170]. Препрокарбоксипептидаза Е содержит гидрофобный сигнальный пептид, состоящий из 25 аминокислотных остатков, который направляет молекулу фермента в ЭПС. По мере продвижения к коплексу Гольджи происходит отщепление участка, содержащего 5 остатков аргинина, и участка из 17 аминокислотных остатков и образуется зрелая молекула КПЕ43-476, гликозилированная по двум сайтам Asn139 и Asn390 [155]. Около 40 аминокислотных остатков на С-конце мембраносвязанной КПЕ образуют амфифильную -спираль, служащую гидрофобным мембранным якорем. Различают две формы мембраносвязанного фермента, отличающиеся друг от друга прочностью связывания, так, одна из них экстрагируется 1 M раствором NaCl при pH 5,6, вторая – при совместном воздействии 1 M NaCl и 1% Тритона X100 [18]. Дальнейший процессинг протекает в везикулах по Arg455-Lys456, при этом мембраносвязанная форма (Mr 53 кДа) переходит в растворимую (Mr 50 кДа), которая является ферментативно более активной и участвует в процессинге многих биологически активных пептидов наряду прогормонконвертазами. Также переходу мембраносвязанной формы в растворимую способствует повышение рН, 35 что, вероятно, связано с комбинированными полярными и гидрофобными взаимодействиями С-конца пептида [155]. Активаторами КПЕ служат ионы Co2+ и Ni2+, ионы Ca2+ могут способствовать тепловой дестабилизации фермента, его агрегации в комплексе Гольджи и освобождению из клетки. Ингибирующее влияние оказывают ионы Cu2+, Hg2+, ЭДТА, 1,10-фенантролин, ПХМФС, АПМЯК, ГЭМЯК и ГПЯК [155]. В исследованиях in vitro катехоламины снижают активность КПЕ [160]. Также фермент ингибируется рядом регуляторных пептидов, например, веществом Р, аргинин-вазопрессином, окситоцином, Met5- и Leu5-энкефалинами, тиролиберином [170]. Концентрации окситоцина и АКТГ, достаточные для ингибирования фермента, составляют 2-20 мМ [170]. Константы ингибирования для Met5-энкефалина, Leu5-энкефалина, Met5-энкефалин-Arg6-Gly7-Leu8 и Met5энкефалин-Arg6-Phe7 равны 12,0, 6,5, 7,0 и 5,5 мМ соответственно. Лизин и аргинин также являются конкурентными ингибиторами КПЕ с константами ингибирования 7,6±1,9 и 4,6±1,3 [142, 155, 170]. Ген, кодирующий КПЕ, расположен в 4 хромосоме в локусе 4q32.3. [155]. Транскрипция осуществляется с единственного сайта, мРНК КПЕ включает 2100 нуклеотидов [143]. В ходе ряда исследований была установлена корреляция между уровнем мРНК КПЕ и активностью фермента в различных тканях. Причём для разных видов животных и человека характерно схожее тканевое и региональное распределение фермента [155]. Наибольшее содержание мРНК КПЕ обнаружено в клетках передней и промежуточной долях гипофиза, гиппокампа, амигдале, ядрах гипоталамуса, клетках боковых желудочков мозга. Средний уровень мРНК КПЕ у крыс характерен для таламуса, медиального коленчатого ядра, коры мозжечка и промежуточной оливы. Наименьший уровень выявлен в латеральном гипоталамусе, гранулярном клеточном слое гиппокампа, в ретикулярной формации ножки мозга и бледном шаре [143]. Иммуногистохимические исследования на крысах показали, что КПЕ локализована в структурах, характеризующихся широким спектром регуляторных 36 пептидов, таких как срединное возвышение, супраоптическое, паравентрикулярное и супрахиазматическое ядра гипоталамуса, передняя доля гипофиза, гиппокамп, зубчатая извилина, амигдала, мозговой слой надпочечников [155]. Распределение активности фермента коррелирует с уровнем нейропептидов в различных отделах мозга [281]. Максимальная активность обнаружена в гипофизе [18, 72], ниже в стриатуме, гиппокампе, коре больших полушарий, гипоталамусе, продолговатом мозге и четверохолмии [18, 72]. Кроме нервной ткани фермент обнаружен в лёгких, эпителиальных клетках желудка, слизистой кишечника, маточных труб, поджелудочной железе, сердце и опухолевых клетках. мРНК КПЕ не обнаружена в почках, печени, селезёнке, молочных железах крыс [231]. Внутриклеточно фермент локализован в секреторных гранулах совместно с различными биологически активными пептидами, такимим как инсулин, глюкагон, энкефалины, эндорфины, АКТГ, аргинин-вазопрессин, окситоцин, вещество P, нейротензин, Многочисленные атриальный исследования натрийуретический физико-химических фактор свойств, [155]. субстратной специфичности, локализации, особенностей изменения активности фермента при различных фармакологических воздействиях свидетельствуют об участии его в процессинге широкого спектра биологически активных пептидов. КПЕ играет важную роль в биосинтезе большинства нейропептидов и пептидных гормонов. Фермент обладает высокой специфичностью по отношению к пептидным субстратам с остатками основных аминокислот на С-конце [142]. КПЕ отщепляет остатки лизина и аргинина от 125I-Met-энкефалин-Lys, 125I-Met-энкефалин-Arg и Arg8-вазопрессин-Gly-Lys-Arg, также остатки аргинина с С-конца гиппурил-L-Arg и Leu5-энкефалин-Arg6, остатки -Lys15-Lys16-Arg17 с карбоксильного конца фрагмента АКТГ (АКТГ1-14), с низким сродством отщепляет остаток гистидина от проокситоцина [169]. Роль КПЕ в биосинтезе большинства нейроэндокринных гормонов и регуляции эмоционального состояния подтверждают исследования на мутантных 37 мышах со сниженной в результате точечной мутации кодирующего гена активностью фермента. Мутация связана с заменой Ser202 на Pro, что приводит к потере ферментативной активности и развитию депрессивно-подобного поведения у животных [232, 281]. Замена Ser202 на Phe также приводит к потере ферментативной активности, в то время как наличие аланина или глутамата в положении 202 не влияет на активность мутантной карбоксипептидазы Е [155]. Обработка AtT20 клеток дексаметазоном приводит к снижению уровня мРНК КПЕ и ПОМК на 30%. Последующее воздействие кортикотропин-рилизинг фактора вызывает 2-кратное увеличение содержания мРНК КПЕ и ПОМК. Повидимому, их уровни совместно регулируются кортиколиберином и стероидными гормонами [231]. Кроме того, независимо от ферментативной активности КПЕ может выступать в качестве трофического фактора, активирующего сигнальный путь ERK, что свидетельствует о роли КПЕ в нейропротекции и патогенезе нейродегенеративных заболеваний [124]. Таким образом, КПЕ играет важную роль в процессинге биологически активных пептидов, везикулярном транспорте и секреции нейромедиаторов. Фермент регулирует функциональную активность эндокринной и нервной систем, вовлечен в развитие патологических состояний, таких как сахарный диабет, ожирение, бесплодие, рак и т.д. [239]. Помимо этого, КПЕ участвует в регуляции эмоционального состояния, в ответной реакции организма на стрессовое воздействие [7], в развитии физической зависимости от этанола [67]. Актуальным является изучение её роли в формировании депрессии и агрессивного поведения, а также в реализации антидепрессантного эффекта применяемых в клинической практике препаратов. 1.5.2. Фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая карбоксипептидаза Информация о ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазе, отщепляющей лизин и аргинин с С-конца пептидов, но вместе с тем отличающейся физикохимическими свойствами от всех известных металлокарбоксипептидаз, впервые 38 была опубликована в 1993 году [15]. Согласно результатам тонкослойной хроматографии, фермент отщепляет аргинин от дансил-Phe-Leu-Arg. В ходе дальнейших исследований было установлено, что его молекулярная масса составляет 100-110 кДа, максимальная активность отмечена при pH 5,6-6,5 [13, 17]. ФМСФ, ПХМБ, йодоацетамид являются ингибиторами фермента. Установлено, что N-этилмалеимид, ЭДТА, ГЭМЯК, ионы Co2+ не влияют на активность фермента. Также повышение рН вызывыет инактивацию ФМСФ-КП, а NaCl оказывает стабилизирующее действие [18]. Km для субстратов дансил-PheAla-Arg и дансил-Phe-Leu-Arg равны 96 и 48 мМ соответственно [18]. По физико-химическим свойствам ФМСФ-КП схожа с карбоксипептидазой С (КФ 3.4.16.5), но отличается от неё тканевым и региональным распределением, субстратной специфичностью [18, 155]. Тканевое и региональное распределения фермента были изучены на нескольких видах млекопитающих [14, 18]. Максимальная активность ФМСФ-КП у ежа европейского (Erinaceus europaeus) отмечена в гипофизе, ниже активность в семенниках, лёгких, почках, надпочечниках и селезёнке [14, 18]. У кошки максимальная активность обнаружена также в гипофизе, далее в порядке уменьшения активности следуют семенники, надпочечники, печень и почки [16]. У крыс наибольшая активность фермента выявлена в надпочечниках, по сравнению с ними активность в гипофизе и семенниках ниже в 1,6 и 2,5 раза соответственно [18]. По сравнению с гипофизом активность ФМСФ-КП в различных отделах головного мозга ежа ниже в 3-4 раза, кошки – в 4-10 раз, в периферических тканях в 2 раза ниже [14, 16]. Отделы головного мозга можно расположить в порядке снижения активности ФМСФ-КП следующим образом: 1) у ежа: кора обонятельные больших доли, полушарий, стриатум, мозжечок, варолиев гиппокамп, мост, гипоталамус, продолговатый мозг, четверохолмие; 2) у кошки: кора больших полушарий, мозжечок, гипоталамус, четверохолмие, варолиев мост, спинной мозг; 3) у крысы: гипофиз, обонятельные доли, кора больших полушарий, гипоталамус, стриатум, мозжечок, гиппокамп, четверохолмие [14, 16, 18, 73]. 39 Таким образом, активность фермента выше в отделах мозга, богатых телами нейронов по сравнению с проводящими путями [18, 73]. Имеются сведения об изменении активности ФМСФ-КП в мозге и периферических тканях самцов крыс на разных этапах постнатального развития [14]. Обнаруженная в надпочечниках новорожденных крыс максимальная активность фермента уменьшается к 90-му и возрастает к 120-му дню. В гипофизе наибольшая активность выявлена у крыс в возрасте 120 дней. В гипоталамусе отмечена следующая динамика изменений: повышение к 20-му дню по сравнению с новорожденными, затем уменьшение к 90-му и вновь возрастание к 120-му дню жизни. В семенниках максимальная активность ФМСФ-КП обнаружена у новорожденных крыс, затем к 30-му дню происходит уменьшение активности, сохраняющееся до 120-го дня. Также были установлены различия в активности ФМСФ-КП у самок и самцов крыс [14]. Отличия обнаружены в гипофизе и гонадах крыс на 30 день постнатального развития, в гипоталамусе на 60 день. В гипофизе, гипоталамусе, надпочечниках и половых железах максимальные отличия активности ФМСФ-КП выявлены у половозрелых животных в возрасте 120 дней [72]. Данные результаты позволяют предположить участие ФМСФ-КП в процессинге ряда регуляторных пептидов [13, 18, 72]. В связи с этим представляет интерес изучение изменений активности фермента на фоне введении селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов для понимания роли фермента в реализации антидепрессантного эффекта и формировании тревожных и депрессивно-подобных состояний. 1.5.3. Пептидил-дипептидаза А (КФ 3.4.15.1) Пептидил-дипептидаза А (ангиотензинпревращающий фермент, дипептидилкарбоксипептидаза A, кининаза II, карбоксикатепсин) – Zn2+содержащий мембраносвязанный одноцепочечный гликопротеин, впервые 40 выделенный Skeggs из сыворотки крови лошади [230]. В различных тканях pI фермента находится в пределах от 4,6 до 5,1, рН-оптимум 7,0-8,5 [29]. Различают две изоформы фермента: тестикулярная отличается от соматической наличием короткого О-гликозилированного участка на N-конце [155]. Соматическая ПДПА представляет собой полипептидную цепь, состоящую из 1306 аминокислотных остатков, в которой выделяют N- и С-домены, высоко гомологичные друг другу и имеющие каталитически активные центры с различной субстратной специфичностью. В N-домене осуществляется расщепление гонадотропин-рилизинг фактора, ангиотензина 1-7, β-амилоидного пептида, в С-домене – ангиотензина I [155]. Тестикулярная ПДПА состоит из 732 аминокислот, идентична по структуре С-домену соматической ПДПА и содержит О-гликозилированный N-концевой участок из 36 аминокислот [155]. В обеих изоформах присутствует сигнальный пептид из 29 аминокислотных остатков, служащий для прикрепления молекулы к мембране. Оба домена имеют Zn2+связывающие сайты, три дисульфидных мостика и свободный цистеин, С-домен – два, N-домен – один Cl--связывающий сайт. Также соматическая ПДПА содержит 17 потенциальных участков гликозилирования, 10 в N-домене и 7 в С-домене. Молекула фермента почти полностью расположена вне клетки, прикрепляется к мембране локализованным на С-конце гидрофобным участком Val1228 - Ser1248 [155]. ПДПА присутствует во всех основных биологических жидкостях организма, обнаружена на поверхности плазматической мембраны клеток эндотелия, эпителия почечных канальцев, слизистой оболочки кишечника, сосудистого сплетения мозга, цилиарного тела глаза, плаценты, лёгких, нейронах, клетках мононуклеарного ряда, в репродуктивных органах [29]. Активаторами фермента являются ионы Сl-, NO3-, SO42-, ингибиторами – соединения, содержащие SH-группу, ЭДТА, 1,10-фенантролин, брадикининпотенциирующий фактор, 2-меркаптоэтанол, додецилсульфат натрия [155]. Многие биологически активные пептиды и их предшественники ингибируют активность фермента, в том числе неокиоторфин, Met5-энкефалин- 41 Arg6-Phe7, -липотропин, вещество Р, брадикинин и Leu5-энкефалин-Arg6 и т.д. [207]. Первый непептидный ингибитор ПДПА – каптоприл – получен в 1977 году, на его основе были синтезированы лизиноприл, эналиприлат, рамиприлат. В настоящее время для лечения сердечно-сосудистых заболеваний в клинической практике применяются около 18 различных препаратов [53]. Помимо этого, ингибиторы ПДПА обладают нейропротекторным действием и используются в терапии повреждений мозга [62]. Ген пептидил-дипептидазы А локализован в длинном плече 17-й хромосомы в локусе 17q23.3 и включает 26 экзонов и 2 промотора, один из которых на 5'конце первого экзона, другой на 5'-конце тринадцатого экзона. Последний 26 экзон кодирует трансмембранный участок [155]. Наиболее изученный I/D полиморфизм гена пептидил-дипептидазы А связан с наличием (вставкой, insertion, I) или отсутствием (выпадением, deletion, D) 287 пары нуклеотидов в интроне 16, что приводит к изменению уровня фермента в плазме крови, но нет точных доказательств его связи с развитием патологий [98]. Пептидил-дипептидаза А вовлечена в реализацию широкого спектра физиологических процессов в организме и принимает участие в процессинге целого ряда регуляторных пептидов [4, 19]. Фермент катализирует отщепление С-концевого дипептида от олигопептидов со свободным С-концом и аминокислотой в предпоследнем положении, отличной от пролина. Субстатами являются брадикинин, ангиотензин I, кроме того, in vitro пептидил-дипептидаза А гидролизует широкий спектр пептидов в том числе нейротензин, Меt5-энкефалин, Меt5-энкефалин-Arg6-Glu7Leu8, β-неоэндорфин, динорфины, β-цепь инсулина. Также фермент обладает эндопептидазной холецистокинин, активностью, расщепляет аргинин-вазопрессин, вещество окситоцин, Р, гастрин, вещество К, гонадотропин- рилизинг фактор, des-Arg9-брадикинин, ангиотензин 1-7, β-амилоидный пептид [155]. Кроме того, в мозге ПДПА вовлечена в метаболизм нейрокининов, 42 играющих важную роль в передаче боли, регулировании эмоций и развитии воспалительных реакций [88]. По-видимому, пептидил-дипептидазе А принадлежит важная роль в формировании эмоционального состояния и развитии психических заболеваний, которые сопутствуют сердечно-сосудистым патологиям [60, 74, 88]. Полиморфизм генов РАС коррелирует с проявлениями родового стресса, панических расстройств и депрессии [28, 39, 74]. Изучение однонуклеотидных полиморфизмов гена пептидил-дипептидазы А показало связь rs4291 полиморфизма с развитием униполярной депрессии и гиперкортизолизмом [98]. Установлено, что ангиотензин II, образующийся из ангиотензина I при участии ПДПА, способствуют активации гипоталамо-гипофизарно- надпочечниковой оси, оказывает стимулирующее влияние на секрецию АКТГ гипофизом и кортиколиберина гипоталамусом [31, 218]. Именно дисрегуляция гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, вызывающая повышение уровня циркулирующих в крови АКТГ и кортизола, является одним из главных эндокринных нарушений, наблюдаемых при депрессии [253]. Таким образом, ПДПА участвует в процессинге биологически активных пептидов, оказывая тем самым влияние на функционирование регуляторных систем организма. Являясь ключевым компонентом ренин-ангиотензиной и калликреин-кининовой систем, фермент вовлекается в ответные адаптивные реакции организма на стрессовое воздействие, в развитие воспаления. Не исключено его участие в патогенезе психических расстройств, в том числе депрессии [70]. Это делает перспективными дальнейшие исследования роли ПДПА в формировании депрессивно-подобного состояния и участия в проявлении эффектов антидепрессантов. 1.5.4. Лизинкарбоксипептидаза (КФ 3.4.17.3) Лизинкарбоксипептидаза (кининаза I, аргинин-карбоксипептидаза, карбоксипептидаза N, протаминаза) обнаружена Erdos и Sloane в 1960-х в плазме 43 крови человека, его регуляторная роль заключалась в инактивации брадикинина путем отщепления С-концевого остатка аргинина или лизина [230]. Фермент является ключевым компонентом калликреин-кининовой системы, синтезируется в печени и секретируется в кровь, где его концентрация может достигать 30 мкг/мл [155]. Представляет собой Zn2+-содержащий гликопротеин с нейтральным рН оптимумом, активность которого резко падает при снижении рН, что, повидимому, связано с потерей Zn2+. Например, при рН 5,5 сохраняется около 7% от максимальной активности [155]. Лизинкарбоксипептидаза имеет Mr 280 кДа [189, 226], при диссоциации в присутствии 3М гуанидина образуются три типа субъединиц с Mr 83 кДа, Mr 55 кДа и 48 кДа [189, 226]. Субъединица с Mr 83 кДа не обладает ферментативной активностью, каталитические функции выполняют субъединицы с Mr 55 кДа и 48 кДа [189, 226]. Лизинкарбоксипептидаза представляет собой димер, состоящий из гетеродимеров, в состав каждого входит одна субъединица с Mr 83 кДа и одна активная субъединица [189, 226]. Субъединица с Mr 83 кДа сильно гликозилирована (около 28% по массе), её основной функцией является стабилизация фермента в плазме крови и облегчение взаимодействия с большинством субстратов [189, 226]. В структуре выделяют 3 домена: Nконцевой домен, богатый остатками цистеина, центральный домен, содержащий 13 областей богатых лейцином, участвующих в связывании с активными субъединицами, С-концевой домен, богатый остатками цистеина [155]. Лизинкарбоксипептидаза и её субъединицы чувствительны к действию сериновых протеаз, таких как трипсин, плазмин и калликреин. В результате обработки нативного фермента плазмином или трипсином происходит диссоциация тетрамера на два активных гетеродимера с Mr 142 кДа. Протеолитическое расщепление субъединицы с Mr 55 кДа приводит к образованию субъединицы с Mr 48 кДа, при дальнейшем расщеплении образуются два фрагмента с Mr 27 и 21 кДа [155]. Ионы Co2+ активируют лизинкарбоксипептидазу в зависимости от субстрата в 2-6 раз при нейтральном рН [155]. Ингибиторами фермента являются ионы Cd2+, 44 хелатирующие агенты ЭДТА и 1,10-фенантролин, а также ГПЯК (Ki = 0,9 мкМ), ГЭМЯК (Ki =1 мкМ), АПМЯК (Ki = 52 мкМ), гистаргин и протамин (Ki = 0,32 мкМ) [155]. 2-меркаптоэтанол, ПХМФС, ПХМБ, ФМСФ и апротинин не влияют на активность фермента [18]. Ген каталитической субъединицы локализован в 10 хромосоме, ген регуляторной субъединицы в 8р22-р23. Согласно исследованиям на эмбрионах мышей, фермент обнаружен в эритроидных клетках-предшественниках на 8,5 день, в гепатоцитах на 16,5 день [155]. Лизинкарбоксипептидаза отщепляет C-концевые остатки лизина и аргинина от различных природных и синтетических пептидов, при этом скорость расщепления субстратов, содержащих остатки лизина, значительно выше. К настоящему моменту установлено, что кинины, анафилатоксины, креатинкиназа, рецепторы плазминогена, гемоглобин, SDF-1α также являются субстратами лизинкарбоксипептидазы [246]. Лизинкарбоксипептидаза предотвращает накопление кининов и анафилотоксинов в крови. Физиологические эффекты брадикинина и каллидина осуществляются посредством активации В2 кининовых рецепторов [91]. При участии лизинкарбоксипептидазы образуются des-Arg9-бpaдикинин и des-Arg10каллидин, являющиеся эндогенными агонистами B1 рецепторов, активируемых в ответ на повреждение или образование медиаторов воспаления в острой фазе реакции [203]. Взаимодействие с В1 рецепторами инициирует активацию сигнального пути ERK, увеличивает синтез простагландинов, генерацию NO, высвобождение цитокинов, таких как α-фактор некроза опухоли, интерлейкин-1 [78, 91]. Фермент способен подавлять активацию плазминогена за счёт нарушения его связывания с белками плазматической мембраны клеток при отщеплении от них С-концевых остатков лизина [155]. Также лизинкарбоксипептидаза отщепляет остатки лизина от M и В субъединиц креатинкиназы, уровень которой повышается в крови после инфаркта миокарда [246]. Удаление Arg141 из α-цепи гемоглобина человека ускоряется диссоциацию тетрамера на димеры, 45 увеличивает сродство к кислороду в 3 раза, снижает кооперативность связывания 2 раза и вызывает вазоконстрикцию [246]. Отщепление остатка лизина от SDF-1α снижает его способность действовать в качестве фактора роста пре-В-клеток и хемоаттрактанта [155]. Уровень фермента в плазме крови зависит от скорости синтеза белка в печени, уменьшается при циррозе печени и увеличивается при беременности. Отмечено повышение содержания при некоторых видах рака и артрите, при этом роль фермента в развитии данных заболеваний не установлена [155]. Калликреин-кининовая система крови является центральным звеном в комплексе гуморальных систем, регулирует гомеостаз и осуществляет адаптивнозащитные реакции организма. ККС имеет большое значение в контроле тонуса гладкой мускулатуры, снижении кровяного давления, увеличении проницаемости сосудистой стенки, реакции иммунного ответа, развитии воспаления и трансформации клеток [40, 78]. Лизинкарбоксипептидаза вносит вклад в расщепление многих эндогенных субстратов, в том числе кининов, участвующих в развитии воспалительной реакции. Таким образом, разнообразные функции фермента вызывают интерес к изучению его роли в формировании различных состояний организма, в том числе депрессии. 46 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы исследования Исследование проводилось на 126 самцах белых беспородных крыс массой 200-250 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище при температуре 22±1оС, 12-часовой сменой дня и ночи. В качестве селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов использовали флуоксетин, ребоксетин и бупропион [153, 229]. Через 12, 24 и 72 часа после однократного внутрибрюшинного введения препаратов и через 24 и 72 часа после последнего введения в течение 14 дней животных декапитировали, на холоду извлекали мозг и надпочечники. Отделяли гипофиз, четверохолмие, продолговатый мозг, гипоталамус, амигдалу, гиппокамп, стриатум. Полученные образцы тканей взвешивали, гомогенизировали с помощью стеклянного гомогенизатора с пестиком в 50 мМ натрий-ацетатном буфере (pH 5,6), содержащем 50 мМ хлорид натрия [73]. Определение активности ферментов проводили по схемам, описанным ниже. В качестве специфических ингибиторов использовали ФМСФ, ГЭМЯК, каптоприл, в качестве субстратов - дансил-PheAla-Arg, карбоксибензоил-Gly-Gly-Arg, гиппурил-Arg. Для оценки воздействия селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов на активность КПЕ, ФМСФ-КП, ПДПА, ЛКП гомогенаты тканей и сыворотку крови инкубировали с исследуемыми препаратами в дозировке, соответствующей эксперименту in vivo, в течение 60 мин при 4оС. Выбор данных отделов для исследования активности ферментов обмена регуляторных пептидов на фоне введения селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов обусловлен высоким содержанием в них нейронов моноаминовых нейромедиаторных систем [105]. Кроме того, гипофиз, гипоталамус, стриатум, гиппокамп, амигдала, надпочечники характеризуются высоким содержанием регуляторных пептидов и наибольшей активностью ферментов их обмена [5, 18, 19]. 47 2.2. Методы исследования 2.2.1. Модель эксперимента: метод введения препаратов При изучении влияния селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов на активность ферментов обмена регуляторных пептидов в нервной ткани и сыворотке крови в условиях in vivo исследуемые лекарственные препараты суспендировали в 0,2% Твин-80, приготовленном на физиологическом растворе. В эксперименте были использованы дозы, достаточные для проявления антидепрессантного эффекта препаратов: 1) 10 мг на кг массы в случае флуоксетина (СИОЗС); 2) 10 мг на кг массы в случае ребоксетина (СИОЗН); 3) 20 мг на кг массы в случае бупропиона (СИОЗД). Препараты вводили интраперитонеально в объеме 0,2-0,25 мл. Контрольным животным вводили равный объем раствора 0,2% Твин-80. Декапитацию производили через 12, 24 и 72 часа после однократной инъекции, через 24 и 72 часа после последней инъекции при системном введении препаратов в течение 14 дней. Данные сроки были выбраны исходя из длительного периода полужизни исследуемых препаратов [9]. 2.2.2. Метод определения активности карбоксипептидазы Е Активность КПЕ определяли флуориметрическим методом [18, 73]. Для определения активности КПЕ в опытной пробе к 50 мкл гомогената ткани добавляли 150 мкл 50 мМ натрий-ацетатного буфера, содержащего 50 мМ NaCl (рН 5,6), в контрольной пробе к 50 мкл гомогената ткани добавляли смесь 140 мкл буфера и 10 мкл 25 мкМ водного раствора ингибитора ГЭМЯК. Пробы преинкубировали при 37˚С в течение 8 минут. Реакцию начинали прибавлением 50 мкл водного 210 мкМ раствора дансил-Phe-Ala-Arg, нагретого до 37˚С. Пробы инкубировали при 37˚С в течение 60 минут. Для остановки реакции к пробам добавляли 50 мкл 1 М раствора HCl. 48 Продукт реакции дансил-Phe-Ala экстрагировали в 1,5 мл хлороформа при интенсивном встряхивании в течение 1 минуты. Для разделения хлороформной и водной фаз пробы центрифугировали (1000 об/мин) в течение 10 минут. Флуоресценцию хлороформной фазы измеряли на флюорате-02-АБЛФ-Т при λex=360 нм и λem=530 нм в кварцевой кювете К10. 1 мкМ раствор дансил-PheAla в хлороформе использовали в качестве стандарта. Здесь и далее количество белка определяли методом Lowry [196]. Активность фермента определяли по разности флуоресценции в пробах, не содержащих и содержащих ГЭМЯК, и выражали в нмоль дансил-Phe-Ala, образовавшегося за 1 минуту инкубации в пересчёте на 1 мг белка. 2.2.3. Метод определения активности фенилметилсульфонилфторидингибируемой карбоксипептидазы Активность ФМСФ-КП определяли флуориметрическим методом [18, 73]. В опытную пробу к 50 мкл гомогената ткани вносили 150 мкл 50 мМ натрий-ацетатного буфера, содержащего 50 мМ NaCl (рН 5,6), в контрольную пробу – 140 мкл буфера и 10 мкл 25 мкМ спиртового раствора ФМСФ. Пробы преинкубировали при 37˚С в течение 8 минут. Реакцию начинали прибавлением 50 мкл нагретого до 37˚С 210 мкМ водного раствора дансил-Phe-Ala-Arg. Пробы инкубировали при 37˚С в течение 60 минут. Для остановки реакции к пробам добавляли 50 мкл 1М раствора HCl. Продукт реакции дансил-Phe-Ala экстрагировали в 1,5 мл хлороформа при интенсивном встряхивании в течение 1 минуты. Пробы центрифугировали (1000 об/мин) в течение 10 минут. Флуоресценцию хлороформной фазы измеряли на флюорате 02 АБЛФ-Т при λex=360 нм и λem=530 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см. Активность фермента определяли по разности флуоресценции в пробах, не содержащих и содержащих ФМСФ, и выражали в нмоль дансил-Phe-Ala, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчёте на 1 мг белка. 49 2.2.4. Метод определения активности пептидил-дипептидазы А Активность пептидил-дипептидазы А определяли нингидриновым методом по отщеплению Gly-Arg от карбоксибензоил-Gly-Gly-Arg при рН=8,2 с использованием каптоприла в качестве ингибитора [72]. В опытные пробы к 40 мкл гомогената добавляли 20 мкл 100 мМ Трис-HCl (рН=8,2), контрольные пробы содержали 40 мкл гомогената и 20 мкл 35 мкМ каптоприла в 100 мМ Трис-НСl (рН=8,2). Реакцию начинали после 8 мин преинкубации при 37˚С прибавлением 10 мкл раствора карбоксибензоил-Gly-Gly-Arg в 100 мМ Трис-НСl (рН=8,2). Через 120 мин реакцию останавливали прибавлением 30 мкл 10% трихлоруксусной кислоты. После 30 мин центрифугирования при 4000 об/мин в 50 мкл надосадочной жидкости определяли количество образовавшегося Gly-Arg нингидриновым методом [10]. Для этого пробы колориметрировали на КФК-3 при =590 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см [72]. Активность пептидилдипептидазы А определяли по разности оптических плотностей проб, не содержащих и содержащих каптоприл, и выражали в нмоль Gly-Arg, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчёте на 1 мг белка. 2.2.5. Метод определения активности лизинкарбоксипептидазы Активность лизинкарбоксипептидазы определяли нингидриновым методом по отщеплению аргинина от гиппурил-Arg в присутствии ионов Со2+ в качестве активатора [72]. При этом опытные пробы содержали 20 мкл 3,5 мМ CoSO4 в 100 мМ Трис-HCl (рН=8,2) и 40 мкл разведенной сыворотки крови, а контрольные – 20 мкл 100 мМ Трис-HCl (рН=8,2) и 40 мкл сыворотки. Реакцию начинали после 8 мин преинкубации при 37˚С прибавлением 10 мкл раствора гиппурил-Arg. Через 120 минут инкубации при 37 °С реакцию останавливали прибавлением 30 мкл 10% трихлоруксусной кислоты. Осадок отделяли центрифугированием в течение 20 мин при 4000 об/мин. В 50 мкл надосадочной жидкости определяли количество образовавшегося аргинина нингидриновым методом, при =590 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см [72]. Активность лизинкарбоксипептидазы определяли по разности оптических плотностей проб, содержащих и не 50 содержащих Со2+, и выражали в нмоль аргинина, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчёте на 1 мг белка. 2.2.6. Метод определения активностей ферментов обмена регуляторных пептидов in vitro В опытах in vitro изучали влияние селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов на активность исследуемых ферментов в гомогенатах гипофиза, четверохолмия, продолговатого мозга, гипоталамуса, гиппокампа, амигдалы, стриатума и надпочечников и сыворотке крови крыс. Препараты добавляли непосредственно в среду инкубации, выдерживали гомогенаты при 4оС в течение 60 минут. Все последующие операции по определению активности ферментов проводили по схемам, описанным выше. 2.2.7. Статистическая обработка результатов исследования Проверка принадлежности распределения признаков к нормальному распределению производилась с использованием хи-квадрат критерия [45]. Достоверность отличий между средними значениями определяли с привлечением t-критерия Стьюдента [45]. Для оценки отсроченного влияния препаратов на активность фермента использовали дисперсионный анализ. Принадлежность подгрупп животных к разным гомогенным группам оценивали с помощью метода Шеффе [45, 73]. Сравнение значений каждой из подгрупп дисперсионного комплекса проводили по методике Ньюмена-Кейлса [45, 73]. 51 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Нервная ткань характеризуется морфологической, биохимической и функциональной гетерогенностью [105], в связи с этим особый интерес вызывают исследования особенностей состава, метаболизма и функций различных её зон, структур и отделов. Регуляторные пептиды представляют собой различную по структуре и функциям группу биологически активных веществ [19], в генезе и деградации которых принимает участие целый ряд протеолитических ферментов [155]. Содержание регуляторных пептидов и активность ферментов их обмена варьируются в разных структурах нервной ткани. С изменением уровня пептидов связывают различные патологические состояния организма, в том числе депрессивные расстройства [89]. До сих пор остается открытым вопрос о роли тех или иных пептидгидролаз в обмене конкретных регуляторных пептидов. Повидимому, именно с изменением активности ферментов процессинга связано изменение содержания регуляторных пептидов в различных отделах головного мозга, надпочечниках и сыворотке крови при патологических состояниях и при терапии лекарственными препаратами [249]. Отмеченные предпосылки послужили основанием для изучения активности ферментов обмена регуляторных пептидов нервной ткани и сыворотки крови крыс на фоне введения животным селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов. 3.1. Влияние введения 0,2% Твин-80 на активность ферментов обмена регуляторных пептидов Как отмечено выше, флуоксетин, ребоксетин и бупропион вводили животным интраперитонеально в виде растворов с детергентом 0,2% Твин-80 в 0,9% NaCl. После чего исследовали зависимость активности ферментов процессинга регуляторных пептидов в различных отделах мозга от времени после инъекции. 52 Так, однократное внутрибрюшинное введение раствора 0,2% Твин-80 в 0,9% NaCl (рисунок 1) вызывало повышение активности КПЕ в гипофизе относительно интактных животных через 12 ч после инъекции, снижение активности через 24 ч, сохраняющееся через 72 ч. В четверохолмии, продолговатом мозге, гипоталамусе, гиппокампе увеличение активности отмечено через 24 ч после инъекции, к 72 ч активность фермента возвращается к значениям 12 ч. В амигдале, стриатуме и надпочечниках на протяжении всего времени исследования изменения активности фермента не обнаружены. Также однократное внутрибрюшинное введение 0,2% Твин-80 в 0,9% NaCl приводит к изменению активности пептидил-дипептидазы А в исследуемых отделах мозга (рисунок 2). В гипофизе активность фермента снижалась к 24 ч и к 72 ч достигала уровня 12 ч. В четверохолмии снижение активности наблюдалось через 72 ч после инъекции. Через 24 ч снижение активности отмечено в гипоталамусе, гиппокампе и амигдале. Через 72 ч активность фермента остается сниженной в гипоталамусе и гиппокампе, повышается в амигдале относительно 12 ч. В продолговатом мозге и стриатуме измения активности фермента обнаружены не были. Активность фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы в надпочечниках крыс (рисунок 3) повышается через 24 ч и возвращается к первоначальным значениям через 72 ч после инъекции. Однократная инъекция 0,2% Твин-80 в 0,9% NaCl приводит к повышению активности пептидил-дипептидазы А в сыворотке крови (рисунок 4) крыс через 72 ч относительно уровня 12 ч и 24 ч, снижению активности лизнкарбоксипептидазы (рисунок 5) через 24 ч и 72 ч. По-видимому, однократное внутрибрюшинное введение 0,2% Твин-80 в 0,9% NaCl является стрессовым воздействием, приводящим к 53 Рисунок 1. Активность КПЕ при однократном введении 0,2% Твин-80 в 0,9% NaCl в нервной ткани крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, M ± m, n=4-6). Здесь: - интактные, - 0,2% Твин-80 в 0,9% NaCl. х - р<0,05, хх - p<0,01, ххх - p<0,001 относительно интактных. 54 Рисунок 2. Активность ПДПА при однократном введении 0,2% Твин-80 в 0,9% NaCl в отделах мозга крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, M ± m, n=4-6). Здесь: - интактные, - 0,2% Твин-80 в 0,9% NaCl. х - р<0,05, хх - p<0,01, ххх - p<0,001 относительно интактных. Рисунок 3. Активность ФМСФ-КП при однократном (А) и системном (Б) введении 0,2% Твин-80 в 0,9% NaCl в надпочечниках крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, M ± m, n=4-6). Здесь: - интактные, - 0,2% Твин-80 в 0,9% NaCl. х - р<0,05, хх - p<0,01, ххх - p<0,001 относительно интактных. Рисунок 4. Активность ПДПА при однократном (А) и системном (Б) введении 0,2% Твин80 в 0,9% NaCl в сыворотке крови крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, M ± m, n=4-6). Здесь: - интактные, - 0,2% Твин-80 в 0,9% NaCl. х - р<0,05, хх - p<0,01, ххх - p<0,001 относительно интактных. Рисунок 5. Активность ЛКП при однократном (А) и системном (Б) введении 0,2% Твин80 в 0,9% NaCl в сыворотке крови крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, M ± m, n=4-6). Здесь: - интактные, - 0,2% Твин-80 в 0,9% NaCl. х - р<0,05, хх - p<0,01, ххх - p<0,001 относительно интактных. 56 адаптивным изменениям в организме животного, связанным с активацией стресс-протекторных систем [22, 25, 81]. Отмеченное рядом авторов изменение уровней некоторых регуляторных пептидов в структурах мозга и плазме крови при стрессе [99, 101, 111] может быть следствием изменения активностей ферментов их обмена, в том числе КПЕ, ПДПА, ФМСФ-КП и ЛКП. Нами показано увеличение активности КПЕ в гипофизе через 12 ч, в гипоталамусе через 24 ч после инъекции, увеличение активности ФМСФ-КП в надпочечниках через 24 ч после инъекции. Поскольку исследуемые ферменты участвуют в процессинге регуляторных пептидов, данные изменения могут приводить к усилению синтеза и секреции АКТГ и энкефалинов в гипофизе, окситоцина и аргинин-вазопрессина в гипоталамусе, энкефалинов в надпочечниках. Также повышение активности КПЕ в четверохолмии, продолговатом мозге, гиппокампе может способствовать увеличению содержания вещества Р, холецистокинина и нейротензина в этих отделах. Таким образом, полученные результаты согласуются с существующими представлениями о молекулярных механизмах функционирования пептидергической системы в ответных реакциях на стрессовое воздействие, при котором главным эндокринным нарушением является активация гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, сопровождающаяся увеличением синтеза и секреции кортиколиберина, АКТГ, кортизола [253, 257]. Снижение активности пептидил-дипептидазы А в гипофизе, четверохолмии, гипоталамусе, гиппокампе и амигдале можно объяснить ингибирующим воздействием Met5-энкефалина, вещества Р, холецистокинина, окситоцина, вазопрессина, нейротензина, уровень которых повышается при стрессе [99, 233, 253, 257]. Повышение активности лизинкарбоксипептидазы в сыворотке крови может быть связано с усилением обмена кининов, уровень которых возрастает при стрессе [78, 91]. 57 Системное введение 0,2% Твин-80 в 0,9% NaCl в течение 14 дней приводит к увеличению активности КПЕ (рисунок 6) в гипофизе относительно интактных животных через 24 ч после последней инъекции и снижению через 72 ч. В других отделах головного мозга и надпочечниках крыс изменения активности фермента не обнаружены. Системное введение 0,2% Твин-80 в 0,9% NaCl в течение 14 дней приводит к снижению активности пептидил-дипептидазы А (рисунок 7) в гиппокампе через 24 ч, в гипофизе и четверохолмии через 24 ч и 72 ч, в гипоталамусе и амигдале через 72 ч после последней инъекции. Также не обнаружены изменения фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой активностей карбоксипептидазы в надпочечниках (рисунок 3) и пептидил-дипептидазы А (рисунок 4) в сыворотке крови, отмечено увеличение активности лизинкарбоксипептидазы (рисунок 5) в сыворотке крови через 72 ч после последней инъекции. Системное введение 0,2% Твин-80 в 0,9% NaCl является хроническим стрессовым воздействием и не вызывает столь выраженных изменений активностей данных ферментов. Тем не менее, отмечено повышение активности КПЕ в гипофизе, что может свидетельствовать об активации гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, наблюдаемой при стрессе [253]. Снижение активности пептидил-дипептидазы А также может быть связано с ингибирующим воздействием на исследуемый фермент ряда регуляторных пептидов. Увеличение активности лизинкарбоксипептидазы может быть связано с усилением обмена кининов. 58 Рисунок 6. Активность КПЕ при системном введении 0,2% Твин-80 в 0,9% NaCl в нервной ткани крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, M ± m, n=4-6). Здесь: - интактные, - 0,2% Твин-80 в 0,9% NaCl. х - р<0,05, хх p<0,01, ххх - p<0,001 относительно интактных. 59 Рисунок 7. Активность ПДПА при системном введении 0,2% Твин-80 в 0,9% NaCl в отделах мозга крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, M ± m, n=4-6). Здесь: - интактные, - 0,2% Твин-80 в 0,9% NaCl. х - р<0,05, хх p<0,01, ххх - p<0,001 относительно интактных. 60 3.2. Влияние однократного введения селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов на активность ферментов обмена регуляторных пептидов в отделах мозга и надпочечниках крыс 3.2.1. Активность карбоксипептидазы Е и пептидил-дипептидазы А при введении флуоксетина Установлены следующие закономерности изменения активности КПЕ в отделах мозга и надпочечниках крыс после инъекции животным флуоксетина (рисунок 8). Так, через 12 ч после введения флуоксетина активность исследуемого фермента снижалась только в гипофизе и гипоталамусе на 25% и 23%, соответственно. В четверохолмии, продолговатом мозге, гипоталамусе и гиппокампе активность КПЕ снижалась через 24 ч на 19%, 31%, 38% и 43% соответственно. В гипофизе к этому времени активность фермента увеличивалась на 35%, далее уменьшалась на 37% к 72 ч. В четверохолмии и гиппокампе к 72 ч наблюдалось увеличение активности КПЕ на 19% и 41%. В амигдале, стриатуме, надпочечниках через 12 ч и 24 ч активность фермента не отличалась от контроля. Однако, к 72 ч активность КПЕ в надпочечниках возрастала в 3 раза, а в амигдале и стриатуме уменьшалась на 22% в обоих отделах. Таким образом, внутрибрюшинное введение флуоксетина вызывало существенное изменение активности карбоксипептидазы Е по сравнению с контролем во всех отделах мозга и надпочечниках, причем наблюдались длительные, сохраняющиеся, по крайней мере, в гипофизе, гиппокампе, амигдале, стриатуме и надпочечниках в течение 72 часов изменения активности фермента. Отмечено снижение активности КПЕ в большинстве отделов мозга, приводящее, по-видимому, к уменьшению синтеза и секреции регуляторных пептидов, депрессии. вовлеченных в стресс-реакции и патогенез 61 Рисунок 8. Активность КПЕ при однократном введении флуоксетина в нервной ткани крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, M ± m, n=4-6). Здесь: - контроль, - флуоксетин 10 мг/кг. * - р<0,05, ** - p<0,01, *** p<0,001 относительно контроля. 62 Однократное введение флуоксетина приводит к активации гипоталамогипофизарно-надпочечниковой оси, что сопровождается усилением синтеза и секреции кортиколиберина, АКТГ и кортизола [149]. Увеличение активности КПЕ в гипофизе и надпочечниках также может свидетельствовать об активации ГГНО. Согласно результатам исследования активности ПДПА в отделах мозга крыс при введении флуоксетина (рисунок 9), в гипофизе через 12 ч после инъекции активность ПДПА снижалась на 26%, через 24 ч и 72 ч увеличивалась в 3 раза и на 26% соответственно по сравнению с контролем. В четверохолмии через 12 ч после введения активность исследуемого фермента не изменялась, а через 24 ч, 72 ч возрастала в 2,5 и 5,5 раз. В продолговатом мозге активность ПДПА через 12 ч не изменялась, через 24 ч и 72 ч снижалась на 54% и 31% относительно контроля. В гипоталамусе активность фермента увеличивалась в 2, 3,8, 2,5 раза через 12 ч, 24 ч, 72 ч соответственно. В гиппокампе увеличение активности наблюдалось к 24 ч и 72 ч после инъекции на 34% и в 2,4 раза соответственно. В амигдале активность ПДПА снижалась на 45%, 40%, 66% через 12 ч, 24 ч, 72 ч относительно контроля. В стриатуме отмечено повышение активности в 2 раза и в 2,4 раза через 12 ч и 24 ч по сравнению с контролем. В гипофизе и четверохолмии наблюдается постепенное увеличение активности ПДПА через 24 ч и 72 ч. В продолговатом мозге и амигдале отмечена скачкообразная динамика изменения активности: снижение к 24 ч и увеличение к 72 ч. В гипоталамусе и стриатуме активность возрастает к 12 ч и 24 ч. Активность ПДПА в гиппокампе снижается к 24 ч и 72 ч. Повышение активности исследуемого фермента, по-видимому, может способствовать гиперпродукции ангиотензина II, через который может быть опосредована активация гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, отмеченная при приеме флуоксетина [149]. Вместе с тем, биологическими субстратами пептидил-дипептидазы А также являются холецистокинин, 63 нейротензин, вещество Р, аргинин-вазопрессин, окситоцин [155] и, повидимому, именно с уменьшением их уровня связан антидепрессантный эффект препарата. Рисунок 9. Активность ПДПА при однократном введении флуоксетина в нервной ткани крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, M ± m, n=46). Здесь: - контроль, - флуоксетин 10 мг/кг. * - р<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001 относительно контроля. 64 3.2.2. Активность карбоксипептидазы Е и пептидил-дипептидазы А при введении ребоксетина После инъекции ребоксетина наблюдаются следующие закономерности в изменении активности КПЕ в отделах мозга и надпочечниках крыс (рисунок 10). Так, через 12 ч после введения препарата активность изучаемого фермента снижалась только в гипофизе на 56% по отношению к контролю. Через 24 ч после инъекции снижение активности КПЕ происходило в гипофизе, четверохолмии, продолговатом мозге, гипоталамусе, гиппокампе, амигдале на 20%, 46%, 66%, 68%, 55%, 25%, соответственно. Через 72 ч после инъекции активность фермента в гипофизе и стриатуме была снижена на 48% и 22%, повышена в гиппокампе и амигдале на 42% и 34% соответственно. Таким образом, однократное введение ребоксетина вызывает длительное изменение активности карбоксипептидазы Е по сравнению с контролем во всех отделах мозга крыс. Снижение активности исследуемого фермента, по-видимому, приводит к уменьшению синтеза и секреции ряда регулятрных пептидов, в том окситоцина, вещества Р, нейротензина, обусловливать числе антидепрессантный АКТГ, эффект аргинин-вазопрессина, энкефалинов, препарата. что может Увеличение активности фермента в амигдале и гиппокампе через 72 ч после инъекции, вероятно, приводит к накоплению нейротензина и вещества Р. Результаты исследования активности ПДПА в отделах мозга крыс при введении ребоксетина представлены на рисунке 11. Через 12 ч после инъекции наблюдалось снижение активности в гипофизе, продолговатом мозге, амигдале на 40%, 17% и 43% соответственно. Повышение активности отмечено в четверохолмии на 23% и в стриатуме в 2 раза относительно контроля. Через 24 ч после инъекции активность ПДПА четверохолмии, продолговатом мозге на 38% снижается в и 77%, 65 Рисунок 10. Активность КПЕ при однократном введении ребоксетина в нервной ткани крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, M ± m, n=46). Здесь: - контроль, - ребоксетин 10 мг/кг. * - р<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001 относительно контроля. 66 Рисунок 11. Активность ПДПА при однократном введении ребоксетина в нервной ткани крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, M ± m, n=4-6). Здесь: - контроль, - ребоксетин 10 мг/кг. * - р<0,05, ** - p<0,01, *** p<0,001 относительно контроля. 67 повышается в гипофизе, гиппокампе, стриатуме в 5 раз, в 7,7 раз, на 43% соответственно. Через 72 ч активность возрастает в гипофизе, четверохолмии, гипоталамусе, гиппокампе на 20%, 27%, 29%, 36%, снижается в продолговатом мозге на 22% соответственно. Таким образом, при введении ребоксетина наблюдается волнообразная динамика изменения активности ПДПА в гипофизе: увеличение к 24 ч и снижение к 72 ч. Подобная динамика отмечена в продолговатом мозге: снижение через 24 ч и увеличение через 72 ч. Плавное снижение активности наблюдается в четверохолмии и стриатуме. В гиппокампе отмечено увеличение активности к 24 ч, с последующим увеличением к 72 ч. Повышение активности пептидил-дипептидазы А, возможно, будет способствовать увеличению продукции ангиотензина II, Мet-энкефалина, снижению уровня нейрокининов, вещества Р, аргинин-вазопрессина, холецистокинина, окситоцина в нейротензина, соответствующих отделах мозга. Снижение активности фермента в продолговатом мозге и амигдале может быть связано с ингибирующим воздействием вещества Р и нейротензина, синтезирующихся в данных отделах мозга. 3.2.3. Активность карбоксипептидазы Е и пептидил-дипептидазы А при введении бупропиона Результаты исследования активности КПЕ в отделах мозга и надпочечниках самцов крыс при введении бупропиона представлены на рисунке 12. Так, через 12 ч после введения препарата активность изучаемого фермента снижалась только в гипофизе, четверохолмии и гипоталамусе на 35%, 39% и 28% по отношению к контролю. Через 24 ч после инъекции снижение активности КПЕ происходило в гипофизе, четверохолмии, продолговатом мозге, гипоталамусе, гиппокампе, амигдале, стриатуме на 19%, 59%, 63%, 62%, 49%, 28%, 30% соответственно. Через 72 ч после инъекции активность фермента в стриатуме была снижена на 40%, напротив, 68 Рисунок 12. Активность КПЕ при однократном введении бупропиона в нервной ткани крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, M ± m, n=4-6). Здесь: - контроль, - бупропион 20 мг/кг. * - р<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001 относительно контроля. 69 в продолговатом мозге, гипоталамусе, гиппокампе активность повышалась на 28%, 23% и 38% соответственно. Таким образом, однократная инъекция бупропиона вызывает длительные изменения активности карбоксипептидазы Е во всех отделах мозга крыс. Через 12 ч и 24 ч наблюдается уменьшение активности фермента, что подтверждает ингибирующее воздействие препарата на ГГНО [228]. Увеличение активности карбоксипептидаза Е в продолговатом мозге, гипоталамусе и гиппокампе через 72 ч после инъекции, вероятно, приводит к увеличению синтеза и секреции аргинин-вазопрессина, окситоцина, нейротензина и вещества Р. Однократное введение бупропиона вызывает измнение активности ПДПА в следующих отделах мозга крыс (рисунок 13). В гипофизе отмечено разнонаправленное изменение активности фермента. Через 12 ч после инъекции активность снижалась на 28%, затем наблюдалось повышение активности в 5 раз через 24 ч и на 30% через 72 ч. Также, повышение активности через 24 ч и 72 ч на 87% и в 4,2 раза отмечено в четверохолмии, через 12 ч, 24 ч и 72 ч на 70%, в 2,5 раза и 3,4 раза в гипоталамусе. В гиппокампе через 12 ч активность была снижена на 18%, а к 72 ч повышена в 2,8 раз. В стриатуме увеличение активности отмечено через 12 ч и 72 ч после инъекции на 87% и 24%, а в амигдале активность снижалась через 12 ч и 72 ч после инъекции на 40% и 65% соответственно. Таким образом, однократное введение бупропиона вызывает изменение активности пептидил-дипептидазы А практически во всех отделах мозга. В гипофизе и стриатуме наблюдается волнообразная динамика изменений: увеличение к 24 ч и снижение к 72 ч в гипофизе, снижение к 24 ч и увеличение к 72 ч в стриатуме. Плавное возрастание активности отмечено в четверохолмии, в то время как в гипоталамусе и гиппокампе наблюдается плавное снижение активности. 70 Рисунок 13. Активность ПДПА при однократном введении бупропиона в нервной ткани крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, M ± m, n=4-6). Здесь: - контроль, - бупропион 20 мг/кг. * - р<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001 относительно контроля. 71 Таким образом, изменение активности исследуемого фермента может приводить к изменению содержания регуляторных пептидов в отделах мозга, вовлеченных в развитие заболевания. 3.2.4. Активность фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы при введении флуоксетина, ребоксетина и бупропиона Результаты исследования активности ФМСФ-КП в надпочечниках крыс при однократном введении флуоксетина, ребоксетина и бупропиона представлены на рисунке 14. Рисунок 14. Активность ФМСФ-КП при однократном введении флуоксетина, ребоксетина, бупропиона в нервной ткани крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, M ± m, n=4-6). Здесь: * - р<0,05, ** - p<0,01, *** p<0,001 относительно контроля. А) - контроль, - флуоксетин 10 мг/кг. Б) - контроль, - ребоксетин 10 мг/кг. В) - контроль, - бупропион 20 мг/кг. 72 Введение флуоксетина вызывало следующую динамику изменения активности фермента: увеличение на 35% через 12 ч, последующее снижение на 26% к 24 ч и вновь возрастание активности фермента на 28% относительно контроля через 72 ч после инъекции. При введении ребоксетина активность снижалась через 12 ч на 22%, изменения сохранялись и к 24 ч, через 72 ч влияние препарата на активность фермента не обнаружено. Бупропион не оказывал влияния на активность ФМСФ-КП в надпочечниках крыс через 12 ч и 24 ч после инъекции, через 72 ч активность снижалась на 23% относительно контроля. Поскольку ФМСФ-КП, по-видимому, является важным ферментом процессинга регуляторных пептидов в надпочечниках, снижение его активности может свидетельствовать об ингибировании гипоталамо- гипофизарно-надпочечниковой оси при введении исследуемых препаратов. 3.3. Влияние системного введения селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов на активность ферментов обмена регуляторных пептидов в отделах мозга и надпочечниках крыс 3.3.1. Активность карбоксипептидазы Е и пептидил-дипептидазы А при введении флуоксетина Результаты исследования активности КПЕ в отделах мозга и надпочечниках крыс при системном введении флуоксетина в течение 14 дней и последующей декапитацией через 24 ч и 72 ч после последнего введения представлены на рисунке 15. Так, через 24 ч после последней инъекции снижение активности фермента наблюдалось лишь в гипофизе на 30%, к 72 ч активность, наоборот, увеличивалась на 75% относительно контроля. Через 72 ч после последней инъекции наблюдалось снижение активности КПЕ относительно контроля в четверохолмии, амигдале, стриатуме на 42%, 36% и 29% соответственно. 73 Рисунок 15. Активность КПЕ при системном введении флуоксетина в нервной ткани крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, M ± m, n=4-6). Здесь: - контроль, - флуоксетин 10 мг/кг. * - р<0,05, ** - p<0,01, *** p<0,001 относительно контроля. 74 Результаты исследования активности ПДПА в отделах мозга крыс при системном введении флуоксетина в течение 14 дней и последующей декапитацией через 24 ч и 72 ч после последнего введения представлены на рисунке 16. Активность ПДПА в гипофизе возрастала в 2,2 раза через 24 ч и в 7,2 раза через 72 ч после инъекции относительно контроля. В четверохолмии и продолговатом мозге наблюдалось повышение активности через 24 ч на 82% и 57% и снижение активности через 72 ч на 53% и 68%. В гиппокампе активность ПДПА увеличивалась на 48% относительно контроля через 24 ч после инъекции и не изменялась через 72 ч. В гипоталамусе, амигдале и стриатуме активность исследуемого фермента была повышенной в течение всего времени исследования: к 24 ч на 44% в гипоталамусе, в 2 раза в амигдале и на 84% в стриатуме, к 72 ч в 2,4 раза в гипоталамусе, в 3 раза в стриатуме и амигдале. Системное введение флуоксетина не оказывало влияние на активность карбоксипептидазы Е в продолговатом мозге, гипоталамусе, гиппокампе, надпочечниках на протяжении всего времени исследования. Активность исследуемого фермента снижалась в четверохолмии, амигдале, стриатуме, что, по-видимому, приводило к уменьшению уровней ряда регуляторных пептидов, вовлечённых в формирование эмоционального состояния организма [43]. Повышение активности в гипофизе через 72 ч после последней инъекции, по-видимому, приводит к усилению синтеза АКТГ. Повышение активности пептидил-дипептидазы А может обусловливать усиление распада кининов, способстующего нормализации уровня цитокинов, повышенное содержание которых характерно при хроническом стрессовом воздействии и депрессии [51, 78]. 75 Рисунок 16. Активность ПДПА при системном введении флуоксетина в нервной ткани крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, M ± m, n=4-6). Здесь: - контроль, - флуоксетин 10 мг/кг. * - р<0,05, ** - p<0,01, *** p<0,001 относительно контроля. 76 3.3.2. Активность карбоксипептидазы Е и пептидил-дипептидазы А при введении ребоксетина Результаты исследования активности КПЕ в отделах мозга и надпочечниках крыс при системном введении ребоксетина в течение 14 дней и последующей декапитацией через 24 ч и 72 ч после последнего введения представлены на рисунке 17. Через 24 ч после последней инъекции активность снижалась только в гипофизе и продолговатом мозге на 46% и 29% относительно контроля, причём через 72 ч в этих отделах не отмечено измений активности исследуемого фермента. В четверохолмии и амигдале уменьшение активности относительно контроля на 30% и 34% наблюдалось через 72 ч после инъекции. В данном случае введение ребоксетина не оказывало влияние на активность исследуемого фермента в гипоталамусе, гиппокампе, стриатуме и надпочечниках. Результаты исследования активности ПДПА в отделах мозга крыс при системном введении ребоксетина в течение 14 дней и последующей декапитацией через 24 ч и 72 ч после последнего введения представлены на рисунке 18. Наблюдалось повышение активности фермента в большинстве отделов мозга на протяжении всего времени исследования. Так, в гипофизе через 24 ч активность повышалась на 37%, тенденция сохранялась и через 72 ч, активность увеличивалась в 4,8 раза относительно контроля. В четверохолмии через 24 ч и 72 ч активность ПДПА была повышена в 3 раза и на 53% соответственно. В продолговатом мозге активность возрастала через 24ч после последней инъекции на 48% и не изменялась через 72 ч. В стриатуме повышение активности в 2,4 раза отмечено лишь через 72 ч после последней инъекции. В гиппокампе не наблюдалось изменения активности ПДПА. В гипоталамусе и амигдале активность возрастала на 46% и 84% через 24 ч, в 2 раза и в 6,3 раза через 72 ч относительно контроля. 77 Рисунок 17. Активность КПЕ при системном введении ребоксетина в нервной ткани крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, M ± m, n=4-6). Здесь: - контроль, - ребоксетин 10 мг/кг. * - р<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001 относительно контроля. 78 Рисунок 18. Активность ПДПА при системном введении ребоксетина в нервной ткани крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, M ± m, n=46). Здесь: - контроль, - ребоксетин 10 мг/кг. * - р<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001 относительно контроля. 79 Таким образом, системное введение ребоксетина приводило к снижению активности карбоксипептидазы Е в гипофизе, четверохолмии, продолговатом мозге и амигдале, что могло сказываться на уровня ряда регуляторных пептидов, вовлеченных в формирование эмоционального состояния организма. Повышение активности пептидил-дипептидазы А, повидимому, может приводить к увеличению уровня ангиотензина II, снижению уровня вещества Р, холецистокинина, нейротензина. 3.3.3. Активность карбоксипептидазы Е и пептидил-дипептидазы А при введении бупропиона Результаты исследования активности КПЕ в отделах мозга и надпочечниках крыс при системном введении бупропиона в течение 14 дней и последующей декапитацией через 24 ч и 72 ч после последнего введения представлены на рисунке 19. В гипофизе и продолговатом мозге отмечено снижение активности фермента через 24 ч на 41% и 50% соответственно. Через 72 ч в продолговатом мозге изменение активности не обнаружено, а в гипофизе наблюдается значительное повышение активности в 4,3 раза по сравнению с контролем. Также, отмечено увеличение активности КПЕ через 72 ч после поледней инъекции в четверохолмии в 1,5 раза, в гипоталамусе на 36%, в стриатуме на 47% и в надпочечниках в 2,4 раза. Напротив, в амигдале через 72 ч наблюдается снижение активности на 48%. В гиппокампе изменения активности фермента на протяжении всего времени исследования не обнаружены. Результаты исследования активности ПДПА в отделах мозга крыс при системном введении бупропиона в течение 14 дней и последующей декапитацией через 24 ч и 72 ч после последнего введения представлены на рисунке 20. 80 Рисунок 19. Активность КПЕ при системном введении бупропиона в нервной ткани крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, M ± m, n=4-6). Здесь: - контроль, - бупропион 20 мг/кг. * - р<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001 относительно контроля. 81 Рисунок 20. Активность ПДПА при системном введении бупропиона в нервной ткани крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, M ± m, n=46). Здесь: - контроль, - бупропион 20 мг/кг. * - р<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001 относительно контроля. 82 Повышение активности фермента наблюдалось через 72 ч после последнего введения препарата в гипофизе, четверохолмии, гиппокампе в 4,5 раза, в 2,5 раза, на 70% соответственно. В гипоталамусе, амигдале и стриатуме наблюдалась следующая динамика изменений активности исследуемого фермента: снижение к 24 ч на 71%, 37% и 70%, увеличение к 72 ч в 5,5 раза, 2,25 раза и в 2,7 раза соответственно. Таким образом, системное введение бупропиона приводило к повышению активности КПЕ в гипофизе, четверохолмии, гипоталамусе, надпочечниках, что может свидетельствовать об активации гипоталамогипофизарно-надпочечниковой оси. Исследование содержания свободного кортизола показало повышение его уровня в моче пациентов на фоне приёма бупропиона, что свидетельствует о повышенной активности ГГНО [228] и согласуется с полученными результатами. Снижение активности пептидилдипептидазы А через 24 ч после последней инъекции в гипоталамусе, стриатуме и амигдале может быть связано с ингибирующим воздействием аргинин-вазопрессина и окситоцина на активность исследуемого фермента в гипоталамусе, вещества Р и нейротензина в амигдале и стриатуме. Увеличение активности исследуемого фермента может быть следствием интенсификации обмена кининов, уровень которых повышается при депрессии [51]. 3.3.4. Активность фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы при введении флуоксетина, ребоксетина и бупропиона Результаты исследования влияния системного введения флуоксетина, ребоксетина и бупропиона на активность фенилметилсульфонилфторидингибируемой карбоксипептидазы в надпочечниках крыс представлены на рисунке 21. 83 Рисунок 21. Активность ФМСФ-КП при системном введении флуоксетина, ребоксетина, бупропиона в нервной ткани крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, M ± m, n=4-6). Здесь: * - р<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001 относительно контроля. А) - контроль, - флуоксетин 10 мг/кг. Б) - контроль, - ребоксетин 10 мг/кг. В) - контроль, - бупропион 20 мг/кг. Введение флуоксетина не влияло на активность фермента через 24 ч после последней инъекции, через 72 ч наблюдалось снижение активности на 30%. Ребоксетин не оказывал влияния на активность ФМСФ-КП в надпочечниках на протяжении всего времени исследования. При введении бупропиона через 24 ч активность возрастала в 2,7 раза относительно контроля и не изменялась через 72 ч. Таким образом, при системном введении препаратов был обнаружен выраженный ингибирующий эффект флуоксетина и активизирующий эффект бупропиона на активность ФМСФ-КП – ключевого фермента обмена регуляторных пептидов в надпочечниках [18, 72]. 84 3.4. Влияние селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов на активность ферментов обмена регуляторных пептидов в сыворотке крови крыс 3.4.1. Активность лизинкарбоксипептидазы и пептидилдипептидазы А при однократном введении флуоксетина, ребоксетина и бупропиона Результаты исследования влияния однократного введения флуоксетина, ребоксетина и бупропиона на активность лизинкарбоксипептидазы в сыворотке крови крыс через 12 ч, 24 ч и 72 ч после инъекции представлены на рисунке 22. Рисунок 22. Активность лизинкарбоксипептидазы при однократном введении флуоксетина, ребоксетина, бупропиона в сыворотке крови крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, M ± m, n=4-6). Здесь: * - р<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001 относительно контроля. А) - контроль, - флуоксетин 10 мг/кг. Б) - контроль, - ребоксетин 10 мг/кг. В) - контроль, - бупропион 20 мг/кг. 85 Так, однократное введение флуоксетина вызывало следующую динамику изменений активности фермента: снижение на 23% через 12 ч, последующее увеличение в 2,5 раза через 24 ч, и вновь снижение на 68% относительно контроля через 72 ч. Схожая тенденция отмечена и при введении бупропиона: снижение на 33% через 12 ч, увеличение на 67% через 24 ч, уменьшение на 35% через 72 ч. Введение ребоксетина не влияло на активность фермента через 12 ч и 72 ч, вызывало увеличение активности относительно контроля на 90% через 24 ч после инъекции. Таким образом, изучамые препараты вызывали увеличение активности лизинкарбоксипептидазы – фермента, предотвращающего накопление кининов, которые в свою очередь путем активации B1-рецепторов могут повышать уровень цитокинов, что отмечено при хроническом стрессе и депрессии [65, 78]. Результаты исследования влияния однократного введения флуоксетина, ребоксетина и бупропиона на активность пептидил-дипептидазы А в сыворотке крови крыс через 12 ч, 24 ч и 72 ч после инъекции представлены на рисунке 23. Однократная инъекция каждого из исследуемых препаратов приводила к значительному изменению активности фермента в сыворотке крови крыс на всех сроках исследования. Так, при введении флуоксетина активность возрастала в 3,8 раза через 12 ч, в 4,9 раза через 24 ч, не изменялась через 72 ч. Инъекция ребоксетина вызывала увеличение активности в 3,3 раза и в 2,6 раза через 12 ч и 24 ч после инъекции. Введение бупропиона приводило к росту активности ПДПА в 2,4 раза через 12 ч, в 3,9 раза через 24 ч и на 43% через 72 ч соответственно. Увеличение активности этого фермента также может способствовать усилению обмена кининов и предотвращению гиперпродукции цитокинов, наблюдаемой при депрессии [65]. 86 Рисунок 23. Активность ПДПА при однократном введении флуоксетина, ребоксетина, бупропиона в сыворотке крови крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, M ± m, n=4-6). Здесь: * - р<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001 относительно контроля. А) - контроль, - флуоксетин 10 мг/кг. Б) - контроль, - ребоксетин 10 мг/кг. В) - контроль, - бупропион 20 мг/кг. 3.4.2. Активность лизинкарбоксипептидазы и пептидилдипептидазы А при системном введении флуоксетина, ребоксетина и бупропиона Результаты исследования влияния системного введения флуоксетина, ребоксетина и бупропиона на активность лизинкарбоксипептидазы в сыворотке крови крыс через 24 ч и 72 ч после последней инъекции представлены на рисунке 24. 87 Рисунок 24. Активность лизинкарбоксипептидазы при системном введении флуоксетина, ребоксетина, бупропиона в сыворотке крови крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, M ± m, n=4-6). Здесь: * - р<0,05, ** - p<0,01, *** p<0,001 относительно контроля. А) - контроль, - флуоксетин 10 мг/кг. Б) - контроль, - ребоксетин 10 мг/кг. В) - контроль, - бупропион 20 мг/кг. Введение флуоксетина и ребоксетина приводило к снижению активности фермента на 21% и 63% относительно контроля через 72 ч после последней инъекции, не вызывая изменений активности через 24 ч. В то время как при введении бупропиона активность увеличивалась относительно контроля на протяжении всего времени исследования: в 2,7 раза к 24 ч и на 58% к 72 ч после последней инъекции. Результаты исследования влияния системного введения флуоксетина, ребоксетина и бупропиона на активность пептидил-дипептидазы А в сыворотке крови крыс через 24 ч и 72 ч после последней инъекции представлены на рисунке 25. 88 Рисунок 25. Активность ПДПА при системном введении флуоксетина, ребоксетина, бупропиона в сыворотке крови крыс (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, M ± m, n=4-6). Здесь: * - р<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001 относительно контроля. А) - контроль, - флуоксетин 10 мг/кг. Б) - контроль, - ребоксетин 10 мг/кг. В) - контроль, - бупропион 20 мг/кг. Системное введение флуоксетина и ребоксетина вызывало снижение активности фермента на 39% и 88% через 24 ч, на 53% и 64% через 72 ч соответственно. При введении бупропиона активность увеличивалась на 55% к 24 ч и в 2 раза к 72 ч. Таким образом, снижение активности исследуемого фермента, вероятно, способствовало уменьшению содержания ангиотензина II и, как следствие, ингибированию гипоталамо-гипофизарно- надпочечниковой оси, играющей важную роль в контроле эмоционального состояния организма. Таким образом, активность КПЕ, ПДПА, ФМСФ-КП и ЛКП при введении флуоксетина, ребоксетина и бупропиона изменялась разнонаправленно, что может быть связано с участием исследуемых 89 ферментов в процессинге различных регуляторных пептидов, уровень которых по-разному изменяется на фоне антидепрессантной терапии [168]. 3.5. Активность ферментов обмена регуляторных пептидов при действии селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов in vitro Для выяснения механизма действия селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов на активность карбоксипептидазы Е, пептидил-дипептидазы А в нервной фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой ткани крыс, карбоксипептидазы в надпочечниках, пептидил-дипептидазы А и лизинкарбоксипептидазы в сыворотке крови in vivo было исследовано влияние флуоксетина, ребоксетина, бупропиона на активность этих ферментов в условиях in vitro. Таблица 1. Активность КПЕ в нервной ткани крыс при введении селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов в условиях in vitro (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, M ± m, n=4-6) Отдел нервной ткани 0,9% NaCl Флуоксетин Ребоксетин Бупропион Гипофиз 0,71±0,05 0,76±0,04 0,78±0,05 0,68±0,03 Четверохолмие 0,53±0,06 0,5±0,03 0,51±0,05 0,54±0,04 Продолговатый мозг 0,42±0,01 0,45±0,03 0,4±0,04 0,39±0,01 Гипоталамус 0,49±0,03 0,48±0,02 0,48±0,02 0,5±0,01 Гиппокамп 0,5±0,05 0,49±0,03 0,51±0,04 0,5±0,02 Амигдала 0,51±0,06 0,49±0,03 0,5±0,02 0,5±0,04 Стриатум 0,31±0,04 0,33±0,01 0,32±0,03 0,3±0,02 Надпочечники 0,06±0,01 0,05±0,02 0,06±0,01 0,05±0,02 90 Таблица 2. Активность ПДПА в нервной ткани крыс при введении селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов в условиях in vitro (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, M ± m, n=4-6) Отдел нервной ткани 0,9% NaCl Флуоксетин Ребоксетин Бупропион Гипофиз 14,92±1,06 15,76±0,92 16,12±1,16 15,68±0,82 Четверохолмие 4,27±0,10 4,5±0,14 4,25±0,15 4,54±0,21 Продолговатый мозг 1,64±0,26 1,45±0,33 1,74±0,24 1,59±0,21 Гипоталамус 2,88±0,31 2,48±0,22 2,56±0,23 2,52±0,27 Гиппокамп 3,15±0,50 3,39±0,31 3,24±0,44 3,25±0,32 Амигдала 3,19 1±0,4 3,09±0,33 3,15±0,28 3,25±0,30 Стриатум 7,81±0,80 7,63±0,68 7,56±0,76 7,77±0,52 Таблица 3. Активность ФМСФ-КП в надпочечниках крыс при введении селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов в условиях in vitro (нмоль продукта, образовавшегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка, M ± m, n=4-6) Отдел нервной ткани 0,9% NaCl Флуоксетин Ребоксетин Бупропион Надпочечники 0,22±0,01 0,24±0,02 0,23±0,01 0,21±0,03 Согласно результатам исследования, данные фармакологические препараты непосредственно не влияют на активность изучаемых ферментов. Вместе с тем, в экспериментах in vivo активность ферментов изменялась при введении флуоксетина, ребоксетина, бупропиона. Следовательно, можно предположить, что влияние препаратов на активность карбоксипептидазы Е, пептидил-дипептидазы карбоксипептидазы, А, фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой лизинкарбоксипептидазы внутриклеточными механизмами. опосредовано 91 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ Моноаминовые нейромедиаторные системы являются важнейшими составляющими, обеспечивающими фундаментальные физиологические процессы, лежащие в основе многообразных функций центральной нервной системы животных и человека. Так, серотонинергическая, дофаминергическая, норадренергическая системы принимают участие в контроле многих психических и моторных функций, в процессах запоминания и обучения, регуляции эмоционального состояния, цикла сон бодрствование и т.д. [76, 80, 105]. Подтверждением тому являются многочисленные сведения о широком спектре нейврологических заболеваний, при которых отмечаются нарушения функционирования данных систем. Например, алкогольная и наркотическая зависимости, нейродегенеративные заболевания и психические расстройства, в том числе депрессии [105, 154, 166]. В настоящее время для лечения заболевания достаточно широко применяются селективные ингибиторы обратного захвата моноаминов [27, 59]. Фармакологическое воздействие, компенсирующее дефицит или избыток нейромедиатора выраженности в синаптической симптоматики щели, депрессивных способствует расстройств. снижению Однако, неэффективность препаратов в ряде случаев и широкий спектр побочных эффектов делает актуальным поиск новых терапевтических подходов к лечению заболевания. В современной фармакологии всё большее предпочтение отдается лекарственным средствам на основе природных компонентов и, в первую очередь, пептидам [50]. Поскольку биологически активным пептидам принадлежит важная роль в регуляции психоэмоционального состояния [43], достаточно перспективными представляются разработки лекарственных средств для 92 лечения психических расстройств на основе природных регуляторных пептидов и их синтетических аналогов [50, 84]. Некоторые успехи в данном направлении уже достигнуты. Так, ноопепт успешно применяют для коррекции когнитивных нарушений различного генеза, кортексин, дельтаран и семакс в терапии органических поражений головного мозга, положительный эффект селанка наблюдается у пациентов с болезнью Паркинсона [84]. Были обнаружены протекторные эффекты глипролинов [6] и карнозина [75], антидепрессантные эффекты селанка [37] и миметика BDNF ГСБ-106 [64], положительные эффекты миметика фактора роста нервов ГК-2 на моделях болези Альцгеймера и т.д. [55]. Установлено ингибирующее действие селанка и семакса на энкефалиндеградирующие ферменты сыворотки крови [41]. Также ведётся активный поиск биологических источников пептидов с целью разработки новых препаратов для коррекции психических расстройств [8]. Так, установлен выраженный ноотропный эффект биопрепарата на основе пептидов личинок трутневого расплода с молекулярной массой 5-10 кДа. Показано также, что полученный препарат при интраназальном введении вызывает существенные изменения активности ряда ферментов, участвующих в обмене регуляторных пептидов в мозге [8]. Известно, что пептидергическая система координирует работу других нейромедиаторных систем и оказывает модулирующее воздействие на моноаминовые системы через изменения уровней регуляторных пептидов в мозге и плазме крови [5, 40]. Так, опиоидные пептиды, вещество Р, нейропептид Y, нейротензин стимулируют секрецию дофамина [99, 151, 193], оказывают модулирующее действие на уровень серотонина и норадреналина [126, 127], аргинин-вазопрессин и тиролиберин ингибируют секрецию дофамина, серотонина и норадреналина в структурах лимбической системы [96, 111, 116]. Кортиколиберин повышает уровень дофамина в гипоталамусе и снижает в стриатуме, [181], также увеличивает активность 93 норадренергических и серотонинергических нейронов гиппокампа [128, 194]. АКТГ повышает уровень норадреналина в плазме крови человека [275], его внутрибрюшинное введение увеличивает содержание серотонина в гипоталамусе [191]. Окситоцин снижает уровень серотонина в гипоталамусе, среднем мозге, увеличивает содержание серотонина в стриатуме и норадреналина в гипоталамусе [33, 219]. Центральное введение ангиотензина II крысам ускоряет метаболизм норадреналина в головном мозге [147], ингибирует активность серотонинергических нейронов в субфорникальном органе головного мозга крыс [260]. Галанин in vitro стимулирует секрецию норадреналина в мозговом слое надпочечников крыс [94], подавляет высвобождение серотонина и норадреналина в гиппокампе [276]. Таким образом, модулирующее воздействие регуляторных пептидов на функциональную активность моноаминовых систем позволило сделать предположение селективных об опосредованности ингибиторов обратного антидепрессантного захвата моноаминов эффекта через пептидергическую систему. Совокупность регуляторных пептидов образует функциональный континуум, формирующий сложную, разветвлённую, взаимосопряжённую систему регуляции биологически важных функций организма [5, 40]. При этом каждый из пептидов обладает уникальным спектром действия и, вместе с тем, имеет перекрывающуюся с другими пептидами совокупность биоактивностей. Также большинство из них стимулируют или ингибируют выход других пептидов, образуют сложные индукционные связи с медиаторными системами организма [5, 40]. Данные о количественном содержании регуляторных пептидов в различных тканях не дают точных представлений о динамических процессах, происходящих в пептидергической системе. При различных патологических состояниях и их фармакологической коррекции наблюдаются изменения уровней ряда регуляторных пептидов, что напрямую зависит от активностей 94 ферментов, катализирующих реакции их синтеза и деградации [1, 18, 47]. Повидимому, введение лекарственных препаратов, применяемых в клинической практике, вызывает изменение активностей ферментов процессинга регуляторных пептидов, что приводит к изменению уровней пептидов, вовлеченных в развитие заболевания, и, как следствие, к уменьшению выраженности симптомов. Согласно ряду исследований, КПЕ и ПДПА вовлекаются в регуляцию эмоционального состояния организма [88, 141]. Так, поведенческие тесты, проведенные на мышах с точечной мутацией в гене карбоксипептидазы Е, приводящей к инактивации фермента, выявили развитие у животных депрессивноподобного состояния [141]. Также установлена связь между полиморфизмом гена ПДПА и депрессивноподобным состоянием у животных [98]. Известно, что на фоне приёма препаратов, воздействующих на серотонинергическую, дофаминергическую, норадренергическую системы и регулирующих происходит содержание выраженное нейромедиаторов изменение в уровней синаптической щели, биологически активных выделение различных пептидов [168]. Модулирующее влияние моноаминов на нейропептидов обеспечивается наличием множественных синаптических контактов с этими системами. Так, дофамин подавляет высвобождение кортиколиберина и АКТГ [108], снижает содержание нейротензина в базальных ганглиях [93], усиливает секрецию аргинин-вазопрессина [111], окситоцина в гипоталамусе [148], тиролиберина в гипофизе и гипоталамусе [190]. Серотонин ингибирует высвобождение тиролиберина [177], повышает экспрессию мРНК окситоцина, аргинин-вазопрессина, АКТГ и секрецию этих пептидов в гипоталамусе [176, 265]. Секреция аргинин-вазопрессина индуцируется опосредованно через ангиотензин II [240]. Активация 95 серотонинергических нейронов в мозге угнетает систему опиоидных пептидов [199]. Норадреналин ингибирует высвобождение нейропептида Y [221], увеличивает экспрессию мРНК галанина, кортиколиберина, окситоцина и аргинин-вазопрессина в гипоталамусе; стимулирует секрецию галанина [274], кортиколиберина [123], окситоцина, аргинин-вазопрессина [263], тиролиберина [174], АКТГ [258]. Регуляторные пептиды играют важную роль в этиологии и патогенезе многих психических расстройств. Исследователи отмечают изменение содержания АКТГ, кортиколиберина, орексина [122], орфанина FQ / ноцицептина [272], вещества P, нейропептида Y [173], холецистокинина [133], галанина [271], нейротензина, аргинин-вазопрессина [167], окситоцина [101], β-эндорфина [159], энкефалина [206] в мозге и плазме крови при стрессовом воздействии и депрессии. Данные сдвиги уровней биологически активных пептидов, по-видимому, могут быть обусловлены изменением активности ферментов их обмена, в том числе ФМСФ-КП, ЛКП, ПДПА, КПЕ. Максимальная активность КПЕ обнаружена в гипофизе, ниже в гипоталамусе, четверохолмии, гиппокампе и амигдале – отделах мозга участвующих в формировании психоэмоционального состояния организма и характеризующихся высоким содержанием регуляторных пептидов, минимальная – в надпочечниках. В гипофизе также отмечена максимальная активность ПДПА, ниже в стриатуме и четверохолмии. Наибольшая активность полученными ФМСФ-КП ранее в надпочечниках. результатами и, Данные по-видимому, согласуются с подтверждают вовлеченность этих ферментов в процессинг регуляторных пептидов в исследуемых отделах [18, 72]. В надпочечниках синтезируетя достаточно большое количество Metэнкефалина, однако, активность КПЕ низкая. Известно, что данный фермент 96 принимает участие в процессинге пептидов, отщепляя с С-конца остатки основных аминокислот, предпоследней аминокислотой является глицин или аланин. Энкефалины в надпочечниках в качестве предпоследнего аминокислотного остатка содержат лейцин или метионин. Вместе с тем, в надпочечниках отмечена высокая активность ФМСФ-КП. По-видимому, именно этот фермент играет существенную роль в процессинге энкефалинов в надпочечниках [13, 18]. КПЕ принимает участие в процессинге многих биологически активных пептидов, таких как нейротензин, энкефалины, АКТГ, эндорфины, аргининвазопрессин, окситоцин, меланоцитостимулирующий гормон, вещество Р, тиролиберин [155]. Пептидил-дипептидаза А участвует в образовании ангиотензина II, Met-энкефалина, инактивации брадикинина, расщеплении вещества Р, вещества К, холецистокинина, нейротензина, нейрокининов А и В, рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона, аргинин-вазопрессина и окситоцина [155]. Лизинкарбоксипептидаза гидролизует кинины и анафилотоксины в крови [155]. Рядом авторов были установлены значительные изменения содержания некоторых регуляторных пептидов при депрессии [242, 252, 271]. Приём селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов, вероятно, способствует нормализации их уровня, который зависит от соотношения скоростей реакций синтеза и деградации. Поскольку ПДПА, ЛКП, КПЕ и ФМСФ-КП участвуют в процессинге широкого спектра регуляторных пептидов, представляет интерес изучение их роли в патогенезе психических расстройств и реализации антидепрессантного эффекта препаратов. Согласно результатам исследования однократное внутрибрюшинное введениие 0,2 % Твин-80 вызывает увеличение активности КПЕ в отделах мозга и ФМСФ-КП в надпочечниках. При этом активация ГГНО в ответ на стресс спосбствует адаптации организма к внешнему воздействию [22, 81]. 97 При стрессе наблюдается повышение уровней целого ряда биологически активных пептидов в различных структурах мозга и плазме крови [101, 111, 131]. Изменение активностей исследуемых ферментов будет, по-видимому, сказываться на уровнях АКТГ и энкефалинов в гипофизе, кортиколиберина, окситоцина и аргинин-вазопрессина надпочечниках, вещества Р, в гипоталамусе, энкефалинов в холецистокинина и нейротензина в четверохолмии, продолговатом мозге и гиппокампе. Они запускают каскад биохимических реакций, адаптирующих организм к стрессовому воздействию. По-видимому, увеличение активности КПЕ в гипофизе и гипоталамусе и ФМСФ-КП в надпочечниках крыс связано с интенсификацией процессов синтеза и секреции указанных пептидов и свидетельствует об активации гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, что является воздействие и специфичным сопровождается ответом организма усилением на стрессовое и секреции синтеза кортиколиберина, АКТГ и кортизола. Кроме того, установлено, что кортиколиберин, усиливающий секрецию АКТГ и β-эндорфина, увеличивает экспрессию мРНК препрокарбоксипептидазы Е [231]. Снижение активности пептидил-дипептидазы гиппокампе и А в амигдале, гипофизе, четверохолмии, по-видимому, объясняется гипоталамусе, ингибирующим воздействием на активность фермента ряда регуляторных пептидов, уровень которых повышается при стрессовом воздействии, в том числе вещества Р, Met-энкефалина, нейротензина, окситоцина и аргинин-вазопрессина [155, 233]. Повышение активности лизинкарбоксипептидазы, вероятно, связано с усилением обмена кининов при стрессе [78, 155]. Системное внутрибрюшинное введениие в течение 14 дней 0,2 % Твин80 вызывает увеличение активности КПЕ в гипофизе, что также свидетельствует об активации гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси. Снижение активности пептидил-дипептидазы А в гипофизе, четверохолмии, гиппокампе, гипоталамусе и амигдале, вероятно, связано с 98 ингибирующим воздействием стресс-пептидов. Усиление обмена кининов, отмеченное при стрессовом воздействии, по-видимому, приводит к увеличению активности лизинкарбоксипептидазы. Стоит отметить, что системное введение 0,2 % Твин-80 не вызывает столь выраженных изменений в активности исследуемых ферментов, поскольку является хроническим воздействием и сопровождается возникновением адаптационных изменений в организме животного, в том числе в пептидергической системе. Введение флуоксетина, ребоксетина и бупропиона вызывает изменения в функционировании пептидергической системы, в том числе изменение активностей ферментов процессинга регуляторны пептидов и, как следствие, вероятные изменения уровней самих биологически активных пептидов. Однократное внутрибрюшинное введение каждого из препаратов вызывало существенные изменения активностей исследуемых ферментов во всех отделах мозга и надпочечниках, при этом наблюдались длительные изменения, сохраняющиеся в течение 72 часов. Наблюдалась схожая динамика изменений активностей ферментов обмена регуляторных пептидов относительно контрольной группы: снижение активности КПЕ и повышение ПДПА в большинстве отделов мозга, снижение активности ФМСФ-КП в надпочечниках, увеличение активности ПДПА и ЛКП в сыворотке крови. Инъекция каждого из препаратов вызывала через 12 ч снижение активности КПЕ (рисунок 26) в гипофизе, введение флуоксетина и бупропиона также приводило к снижению активности в гипоталамусе. Через 24 ч флуоксетин, ребоксетин и бупропион вызывали снижение активности КПЕ в четверохолмии, продолговатом мозге, гипоталамусе и гиппокампе. В гипофизе отмечено снижение активности при введении ребоксетина и бупропиона, увеличение при введении флуоксетина. Также введение флуоксетина вызывало повышение активности фермента в надпочечниках. Согласно имеющимся данным однократное введение флуоксетина приводит 99 к активации ГГНО [149], что подтверждают полученные нами результаты о повышении активности КПЕ в гипофизе и надпочечниках. Через 72 ч каждый из препаратов вызывал увеличение активности КПЕ в гиппокампе, что может быть связано с усилением нейрогенеза при приёме антидепрессатов [198]. По-видимому, снижение активности исследуемого фермента в большинстве отделов мозга приводит к уменьшению синтеза и секреции регуляторных пептидов, уровень которых повышается при стрессе и депрессии. Это, вероятно, приводит к уменьшению последствий стрессового воздействия и снижению выраженности симптомов заболевания. Повидимому, именно изменение содержания АКТГ, аргинин-вазопрессина, окситоцина, вещества Р, энкефалинов и нейротензина может лежать в основе антидепрессантного эффекта препаратов. 100 Рисунок 26. Активность КПЕ при однократном введении селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов в нервной ткани крыс (% относительно контрольной группы, n=4-6). 101 Введение исследуемых препаратов вызывало увеличение активности пептидил-дипептидазы А (рисунок 27) в гипофизе, четверохолмии, гипоталамусе, гиппокампе и стриатуме, снижение в продолговатом мозге. Рисунок 27. Активность ПДПА при однократном введении селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов в нервной ткани крыс (% относительно контрольной группы, n=4-6). 102 По-видимому, повышение активности фермента может приводить к увеличению содержания ангиотензина II, который опосредует активацию гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, при которой происходит усиление секреции АКТГ гипофизом и кортиколиберина гипоталамусом, что также отмечается при однократном приёме флуоксетина. Кроме того, повышение активности ПДПА может приводить к снижению уровня нейротензина, холецистокинина, вещества Р, аргинин-вазопрессина, окситоцина. Вероятно, именно с изменением уровней регуляторных пептидов в отделах мозга, вовлеченных в развитие заболевания, может быть связан антидепрессантный эффект препаратов. Поскольку ФМСФ-КП является ключевым ферментом процессинга энкефалинов в надпочечниках, снижение его активности (рисунок 28) может свидетельствовать об ингибирующем влиянии исследуемых препаратов на ГГНО, что может обусловливать снижение выраженности симптомов заболевания при терапии антидепрессантами. Увеличение активности фермента после инъекции флуоксетина, по-видимому, является еще одним доказательством активирующего воздействия препарата на ГГНО. Рисунок 28. Активность ФМСФ-КП при однократном (А) и системном (Б) введении селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов в надпочечниках крыс (% относительно контрольной группы, n=4-6). 103 Системное введение селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов вызывает снижение активности КПЕ (рисунок 29) в гипофизе через 24 ч, увеличение через 72 ч при введении флуоксетина и бупропиона. Рисунок 29. Активность КПЕ при системном введении селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов в нервной ткани крыс (% относительно контрольной группы, n=4-6). 104 Снижение активности фермента при введении флуоксетина и ребоксетина отмечено также в четверохолмии, амигдале, стриатуме через 72 ч, что, по-видимому, приводило к снижению уровней ряда регуляторных пептидов. Активация фермента в гипофизе, вероятно, способствовала усилению секреции АКТГ, что отмечается при приеме флуоксетина. Системное введение бупропиона привело к увеличению активности фермента помимо гипофиза в четверохолмии, гипоталамусе, стриатуме и надпочечниках, что, вероятно, свидетельствует об активации гипоталамогипофизарно-надпочечниковой оси и повышении уровней АКТГ, аргининвазопрессина, окситоцина, холецистокинина, вещества Р, энкефалинов, нейротензина. Известно, что депрессия сопровождается повышением уровня цитокинов, таких как интерлейкин-1 (IL-1), фактор некроза опухоли (TNFa) [51]. К их высвобождению может приводить активация В1 кининовых рецепторов инициирующая активацию сигнального пути ERK, что также увеличивает синтез простагландинов, генерацию NO [51]. Повышение активности ПДПА (рисунок 30), выявленное практически во всех исследуемых отделах мозга, вероятно, способствует снижению уровня кининов и цитокинов, что также может лежать в основе антидепрессантного эффекта препаратов. Повышение активности фермента может привести к увеличению уровня ангиотензина II, снижению вещества Р, холецистокинина, нейротензина. Снижение активности пептидил- дипептидазы А через 24 ч после инъекции бупропиона может быть результатом ингибирующего воздействия регуляторных синтезированных в исследуемых отделах мозга при пептидов, участии КПЕ. Активность ФМСФ-КП снижалась при системном введении (рисунок 28) флуоксетина, возрастала при введении бупропиона, что также свидетельствует об активирующем воздействии препарата на ГГНО [228]. 105 Рисунок 30. Активность ПДПА при системном введении селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов в нервной ткани крыс (% относительно контрольной группы, n=4-6). 106 Однократное внутрибрюшинное введение селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов приводило к изменению активности ферментов обмена регуляторных пептидов в сыворотке крови (рисунок 31, рисунок 32). Рисунок 31. Активность ПДПА при однократном (А) и системном (Б) введении селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов в сыворотке крови крыс (% относительно контрольной группы, n=4-6). Рисунок 32. Активность ЛКП при однократном (А) и системном (Б) введении селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов в сыворотке крови крыс (% относительно контрольной группы, n=4-6). Увеличение активности лизинкарбоксипептидазы и пептидил- дипептидазы А, по-видимому, вызывает усиление обмена кининов и предотвращению гиперпродукции цитокинов путем ингибирования сигнального пути ERK. Системное введение флуоксетина и ребоксетина вызывало снижение активности лизинкарбоксипептидазы и пептидилдипептидазы А, бупропиона – повышение. Снижение активности, вероятно, приводило к уменьшению ангиотензина II, что оказывало ингибирующе 107 воздействие на ГГНО, играющую важную роль в контроле эмоционального состояния. Таким образом, активность КПЕ, ПДПА, ЛКП, ФМСФ-КП при введении селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов изменялась разнонаправленно, что, по-видимому, может быть связано с участием ферментов в процессинге пептидов различной функциональной направленности, уровень которых по-разному изменяется при появлении симптомов заболеваний и на фоне приёма антидепрессантов. Полученные нами результаты исследования активности ферментов обмена регуляторных пептидов – карбоксипептидазы Е, фенилметилсульфонилфторидингибируемой-карбоксипептидазы, пептидилдипептидазы А, лизинкарбоксипептидазы – на фоне введения селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов согласуются с данными об изменении уровней регуляторных пептидов при депрессии и терапии антидепрессантами, что говорит о вовлеченности в данные процессы пептидергической системы. Знание роли регуляторных пептидов и ферментов их процессинга в патогенезе того или иного заболевания позволит направленно влиять на биосинтез биологически активных пептидов путем контролируемого воздействия на активность ферментов их обмена. Также полученные результаты дают основание предположить возможность применения методов определения активности ферментов для исследования изменения обмена регуляторных пептидов при различных физиологических и патологических состояниях организма. Однако, механизмы регуляции активности ферментов обмена регуляторных пептидов до конца не изучены. В литературе описана зависимость активности ферментов от продуктов реакции образования биологически активных пептидов. Так, изменение уровня ряда регуляторных пептидов может сказываться на активности ферментов их обмена. Met5- и Leu5-энкефалины, аргинин-вазопрессин, 108 окситоцин, вещество Р, тиролиберин, АКТГ 1-14 ингибируют КПЕ [155], ангиотензин II, брадикинин, вещество Р, неокиоторфин, Met5-энкефалинArg6-Phe7, Leu5-энкефалин- Arg6 ингибируют ПДПА [38, 155]. Кроме того, характерным отмеченного при депрессии, проявлением является оксидативного интенсификация стресса, процессов перекисного окисления липидов и белков, что приводит к повреждению мембран. Поскольку КПЕ и ФМСФ-КП представлены в организме в виде двух форм – растворимой и мембраносвязанной – нарушение структурнофункциональных свойств плазматических мембран может сказываться на их активности, приводя к изменению уровня регуляторных пептидов, в процессинге которых участвуют исследуемые ферменты. По-видимому, активность исследуемых ферментов может регулироваться на уровне экспрессии генов. Подтверждением этого можно считать отсутствие влияния селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов на активность исследуемых ферментов в условиях in vitro. Предположение о модуляции активности ферментов при введении селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов путем воздействия этих препаратов на уровень экспрессии генов исследуемых ферментов, повидимому, позволит объяснить отсроченное влияние препаратов на активность ферментов. Так, в структуре генов различных ферментов обмена регуляторных пептидов обнаружены участки связывания тиреоидных гормонов, стероидных гормонов, цАМФ, участки связывания регуляторных белков. Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о влиянии селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов на активности КПЕ, ЛКП, ПДПА и ФМСФ-КП, изменение которых может сказываться на уровнях регуляторных пептидов в мозге и плазме крови. Несмотря на то, что в работе исследовалось воздействие препаратов, влияющих на уровень различных моноаминов, была обнаружена схожая 109 динамика изменения активности ферментов обмена регуляторных пептидов, что свидетельствует о координирующей роли пептидергической системы. По-видимому, именно изменение уровня ряда регуляторных пептидов лежит в основе патогенеза депрессии, а нормализация их содержания может приводить к снижению выраженности симптомов заболевания. Биологически активные пептиды оказывают модулирующее действие на функционирование других нейромедиаторных систем, изменяя уровень моноаминов и цитокинов, влияя на активность гипоталамо-гипофизарнонадпочечниковой оси, они также могут быть вовлечены в механизмы антидепрессантного действия селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов. 110 ВЫВОДЫ 1. Установлено, что внутрибрюшинное введение 0,2% Твин-80 в 0,9% NaCl вызывает активацию стресс-протекторных систем организма, что сопровождается увеличением активности карбоксипептидазы Е в гипофизе и гипоталамусе, фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипетидазы в надпочечниках, снижением активности пептидилдипептидазы А практически во всех отделах мозга. 2. Выявлены изменения активности исследуемых ферментов при введении флуоксетина, ребоксетина и бупропиона, что свидетельствует об их роли связующего звена посредством регуляторных в механизмах взаимодействия пептидов моноаминовых и пептидергической систем и участии в реализации антидепрессантного эффекта препаратов. 3. Показана схожая динамика изменений активности ферментов на фоне введения различных селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов: снижение активности карбоксипептидазы Е и повышение пептидил-дипептидазы А в большинстве отделов мозга, снижение активности карбоксипетидазы фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой в надпочечниках, увеличение активностей пептидил-дипептидазы А и лизинкарбоксипептидазы в сыворотке крови. 4. Выявлено отсутствие изменений активности исследуемых ферментов in vitro при действии селективных ингибиторов обратного захвата моноаминов. 111 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ERK – extracellular signal-regulated kinase SDF-1 – stromal cell-derived factor-1 5-НТ – 5-гидрокситриптамин BDNF – нейротрофический фактор мозга CREB – цАМФ-зависимый транскрипционный фактор NMDA – N-метил-D-аспартат TNFα – фактор некроза опухоли АКТГ – адренокортикотропный гормон АПМЯК – аминопропилмеркаптоянтарная кислота ГАМК – γ-аминомасляная кислота ГГНО – гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая ось ГПЯК – гуанидинопропилянтарная кислота ГЭМЯК – гуанидиноэтилмеркаптоянтарная кислота ККС – калликреин-кининовая система КПD – карбоксипептидаза D КПM – карбоксипептидаза M КПU – карбоксипептидаза U КПВ – карбоксипептидаза В КПЕ – карбоксипептидаза Е ЛКП – лизинкарбоксипептидаза МАО – моноаминоксидаза ПДПА – пептидил-дипептидаза А ПОМК – проопиомеланокортин ПХМБ – п-хлормеркурибензоат ПХМФС – п-хлормеркурифенилсульфонат РАС – ренин-ангиотензиновая система СИОЗД – селективный ингибитор обратного захвата дофамина 112 СИОЗН – селективный ингибитор обратного захвата норадреналина СИОЗС – селективный ингибитор обратного захвата серотонина ФМСФ – фенилметилсульфонилфторид ФМСФ-КП – фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая карбоксипептидаза цАМФ – циклический аденозинмонофосфат цГМФ – циклический гуанозинмонофосфат ЦНС – центральная нервная система ЦСЖ – цереброспинальная жидкость ЭДТА – этилендиаминтетраацетат натрия ЭПС – эндоплазматическая сеть 113 ЛИТЕРАТУРА 1. Азарян, А.В. Пептидгидролазы нервной системы и их биологические функции / А.В. Азарян. – Ереван: Айастан, 1989. – 208 с. 2. Амелин, А.В. Роль серотонина и серотониновых рецепторов в патогенезе мигрени и механизмах действия антимигренозных препаратов / А.В. Амелин, А.А. Скоромец, Ю.Д. Игнатов // Журн. неврологии и психиатрии. – 2000. – № 7. – С. 15-19. 3. Арушанян, Э.Б. Участие мозговой железы эпифиза в регуляции поведения / Э.Б. Арушанян // Медицинский вестник Северного Кавказа. – 2009. – Т. 16, № 4. – С. 66-75. 4. Асташкин, Е.И. Новые данные о функционировании ренин- ангиотензиновой системы: роль внутриклеточной (интракринной) системы / Е.И. Асташкин, М.Г. Глезер // Проблемы женского здоровья. – 2012. – Т. 7, № 4. – С. 47-54. 5. Ашмарин, И.П. Нейрохимия / И.П. Ашмарин, А.Е. Антипенко, В.В. Ашапкин. – М.: изд-во Института биомедицинской химии РАМН, 1996. – 464 с. 6. Бадмаева, С.Е. Протекторные (профилактические) эффекты интраназального введения глипролинов (pro-gly-pro, gly-pro, pro-gly) в отношении стрессогенных нарушений поведения крыс / С.Е. Бадмаева, Г.Н. Копылова, Г.Е. Самонина, Б.А. Умарова, Н.Н. Абушинова // Вестник Московского университета. Серия 16: Биология. – 2005. – № 4. – С. 3-7. 7. Бардинова, Ж.С. Влияние стресса на активность карбоксипептидаз в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла: дис. ... канд. биол. наук: 03.00.04 / Ж.С. Бардинова. – Пенза, 2004. – 145 с. 8. Бегутов, М.М. Разработка лекарственных препаратов и биологически- активных добавок на основе пептидов из продуктов пчеловодства / М.М. 114 Бегутов, В.Б. Соловьев, М.Т. Генгин // Наука и современность. – 2014. – № 31. – С. 16-19. 9. Белова, Е.И. Основы нейрофармакологии / Е.И. Белова. – М.: Аспект пресс, 2006. – 176 с. 10. Болдырев, А.А. Нейрохимия / А.А. Болдырев, Н.Д. Ещенко, В.А. Илюха, Е.И. Кяйвяряйнен. – М.: Дрофа, 2010. – 402 с. 11. Брусов, О.С. Структурные и функциональные изменения в головном мозге при эмоциональных расстройствах: основы нейроциркуляторной и нейротрофической гипотезы депрессии / О.С. Брусов, М.И. Фактор, А.Б. Катасонов // Журнал неврологии и психиатрии. – 2012. – № 7. – С. 83-88. 12. Ватутин, Н.Т. Депрессивные расстройства и сердечно-сосудистые заболевания / Н.Т. Ватутин, Н.В. Калинкина, Е.В. Дзюба, М.А. Христиченко // Сердце и сосуды. – 2012. – Т. 38, № 2.– С. 117-126. 13. Величко, А.К. Частичная характеристика структуры основной фенилметилсульфонилфторидингибируемой карбоксипептидазы из печени крыс / А.К. Величко, И.Н. Соломадин, Н.М. Генгина, В.Б. Соловьев, М.Т. Генгин // Известия Пензенского государственного педагогического университета им. В.Г. Белинского. – 2008. – № 10. – С. 161-164. 14. Вернигора, А.Н. Активность PMSF-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях и отделах головного мозга ежа европейского (ERINACEUS EUROPAEUS) / А.Н. Вернигора, Н.В. Щетинина, М.Т. Генгин // Укр. биохим. журн. – 1996. – Т. 68, № 5. – С. 118-121. 15. Вернигора, А.Н. Множественность молекулярных форм растворимых карбоксипептидазо-Б-подобных ферментов головного мозга кошки / А.Н. Вернигора, Н.Н. Никишин, М.Т. Генгин // Укр. биохим. журн. – 1993. – Т. 65, № 4. – С. 17-21. 16. Вернигора, А.Н. Распределение активности фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы в нервной 115 ткани котов / А.Н. Вернигора, М.Т. Генгин, Д.А. Салдаев, Н.В. Щетинина // Нейрохимия. – 1997. – Т. 14, № 4. – С. 423-425. 17. Вернигора, А.Н. Частичная фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой характеристика основной карбоксипептидазы из головного мозга кошки / А.Н. Вернигора, Н.Н. Никишин, М.Т. Генгин // Биохимия. – 1995. – Т. 60, № 11. – С. 1860-1866. 18. Генгин, М.Т. Особенности структурно-функциональной организации и физико-химические свойства нелизосомальных пептидгидролаз мозга животных: дис. ... докт. биол. наук: 03.00.04 / М.Т. Генгин. – Пенза, 2002. – 330 с. 19. Гомазков, О.А. Нейропептиды и ростовые факторы мозга / О.А. Гомазков. – М., 2002. – 239 с. 20. Гомазков, О.А. Нейротрофические и ростовые факторы мозга: регуляторная специфика и терапевтический потенциал / О.А. Гомазков // Успехи физиологических наук. – 2005. – Т. 36, №. 2. – С. 22-40. 21. Гречко, Т.Ю. Основные патогенетические механизмы депрессий (обзор литературы) / Т.Ю. Гречко, Е.А. Семёнова // Научно-медицинский вестник Центрального Черноземья. – 2010. – № 39-1. – С. 61-66. 22. Григорьев, А.И. Молекулярные механизмы адаптации: агрессия и стресс / А.И. Григорьев, А.Г. Тоневицкий // Молекулярная медицина. – 2008. – № 3. – С. 29-40. 23. Григорьян, Г.А. Молекулярно-клеточные механизмы депрессии. Роль глюкокортикоидов, цитокинов, нейротрансмиттеров и трофических факторов в генезе депрессивных расстройств / Г.А. Григорьян, Н.Н. Дыгало, А.Б. Гехт, М.Ю. Степаничев, Н.В. Гуляева // Успехи физиологических наук. – 2014. – Т. 45, № 2. – С. 3-19. 24. Григорьян, Г.А. Стресс-реактивность и стресс-устойчивость в патогенезе депрессивных расстройств: роль эпигенетических механизмов / 116 Г.А. Григорьян, Н.В. Гуляева // Журнал высшей нервной деятельности им. И.П. Павлова. – 2015. – Т. 65, № 1. – С. 19. 25. Гусакова, Е.А. Стресс и протеолитические ферменты лизосом / Е.А. Гусакова, И.В. Городецкая // Вестник витебского государственного медицинского университета. – 2012. – Т. 11, № 4. – С. 15-25. 26. Гусев, Е.И. Роль процессов нейропластичности в развитии депрессивных расстройств / Е.И. Гусев, А.Н. Боголепова // Трудный пациент. – 2010. – Т. 8, № 10. – С. 11-16. 27. Давыдов, А.Т. Современные антидепрессанты, их роль и место в психиатрической и общемедицинской практике / А.Т. Давыдов, Н.Н. Петрова, С.В. Литвинцев, Д.Ю. Вутко, А.А. Стрельников // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. – 2007. – Т. 5, № 2. – С. 49-62. 28. Дыгало, Н.Н. Экспрессия в мозге генов, ассоциированных с проявлениями депрессии / Н.Н. Дыгало, М.Ю. Степаничев, Н.В. Гуляева, Г.Т. Шишкина // Вавиловский журнал генетики и селекции. – 2014. – Т. 18, № 4-3. – С. 1124-1132. 29. Елисеева, Ю.Е. Ангиотензин-превращающий фермент, его физиологическая роль / Ю.Е. Елисеева // Вопросы медицинской химии. – 2001. – Т. 47, № 1. – С. 43-54. 30. Ермакова, И.В. Современные представления о механизмах регуляции функции гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы / И.В. Ермакова // Новые исследования. – 2014. – № 4 (41). – С. 77-86. 31. Животова, Е.Ю. Участие ренин-ангиотензиновой системы в поддержании тканевого гомеостаза в различных клеточных популяциях / Е.Ю. Животова, С.С. Тимошин // Современные технологии в медицине. – 2011. – № 4. – С. 120-125. 32. Зефиров, А.Л. Синаптическая везикула и механизм высвобождения медиатора / А.Л. Зефиров, А.М. Петров. – Казань, 2010. – 324 с. 117 33. Ибрагимов, Р.Ш. Влияние окситоцина на активность серотонинергических систем мозга у наркотически-зависимых крыс / Р.Ш. Ибрагимов, Н.К. Керимова, Р. Рагимов // Физиол. журн. им. И.М.Сеченова. – 1989. – Т. 75, № 10. – С. 1355-1360. 34. Иванов, С.В. Депрессия и сердечно-сосудистая патология / С.В. Иванов // Кардиология. – 2009. – Т. 49, № 7-8. – С. 115-117. 35. Кательницкая, Л.И. Механизмы формирования тревожно- депрессивного синдрома у женщин с острым инфарктом миокарда / Л.И. Кательницкая, Д.Н. Иванченко, А.М. Менджерицкий, Г.В. Карантыш // Проблемы женского здоровья. – 2010. – Т. 5, № 3. – С. 33-38. 36. Коган, Б.М. Патогенетические механизмы развития депрессивных расстройств / Б.М. Коган, А.З. Дроздов // Системная психология и социология. – 2013. – № 7. – С. 46-50. 37. Козловская, М.М. Влияние гептапептида селанка на депрессию поведения высоко- и низкотревожных мышей Вalb/c и С57Вl/6 и крыс с наследуемой депрессивностью поведения WAG/Rij / М.М. Козловская, К.Ю. Саркисова, И.И. Козловский // Психофармакология и биологическая наркология. – 2005. – Т. 5, № 2. – С. 939-945. 38. Комаревцева, И.А. Роль опиоидов в регуляции активности ренин- ангиотензиновой системы / И.А. Комаревцева, Е.В. Комаревцева, Н.А. Бука, О.И. Филиппова, А.В.Заика, В.Н. Комаревцев, К.В. Хворастяной, А.В. Тачко, А.Е. Мажник, М.С.Ю. Рами, И.В. Соловьева, Д.В. Бриндак // Український журнал екстремальної медицини імені Г.О.Можаєва. – 2011. – Т. 12, №. 1. – С. 65-70. 39. Коробейникова, Л.А. Генетические основы предрасположенности к паническому расстройству / Л.А. Коробейникова, О.И. Рудько, Ю.Э. Азимова, Н.М. Фокина, Е.А. Климов // Успехи современной биологии. – 2012. – Т. 132, №. 1. – С. 21-35. 118 40. Королева, С.В. Исследование структурно-функциональных особенностей континуума регуляторных пептидов и медиаторов: дис. ... д-ра биол. наук: 03.03.01 / С.В. Королева. – М., 2010. – 355 с. 41. Кост, Н.В. Ингибирующее действие семакса и селанка на энкефалиндеградирующие ферменты сыворотки крови человека / Н.В. Кост, О.Ю. Соколов, М.В. Габаева,И.А. Гривенников, Л.А. Андреева, Ф. Мясоедов, А.А. Зозуля // Биоорганическая химия. – 2001. – Т. 27, № 3. – С. 180-183. 42. Крупина, H.A. Недостаточность дофаминергической нигростриатной системы как дизрегуляционный механизм дофаминзависимого депрессивного синдрома / Н.А. Крупина, Г.Н. Крыжановский // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С.Корсакова. – 2003. – № 4. – С. 42-47. 43. Крупина, Н.А. Пептидергические механизмы регуляции эмоционально- мотивационного поведения / Н.А. Крупина, Н.Н. Хлебникова // Успехи физиологических наук. – 2010. – Т. 41, № 2. – С. 3-26. 44. Кудрин, В.С. Влияние амитриптилина, флуоксетина и тианептина на содержание моноаминов и их метаболитов в структурах мозга крыс / В.С. Кудрин, В.М. Мосин, П.М. Клодт, В.Б. Наркевич, Г.М. Молодавкин, Т.А. Воронина // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2010. – Т. 73, № 3. – С. 7-10. 45. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. – М.: Высшая школа, 1990. – 352 с. 46. Левчук, Л. А. Серотонинергическая система в патогенезе и терапии депрессивных расстройств (обзор литературы) / Л.А. Левчук, М.В. Шмиголь, С.А. Иванова // Сибирский вестник психиатрии и наркологии. – 2012. – Т. 71, № 2. – С. 75-79. 47. Локшина, Л.А. Реакции ограниченного протеолиза и их регуляторное значение / Л.А. Локшина // Усп. биол. химии. – 1987. – № 18. – С. 162-184. 48. Людыно, В.И. Роль нейропептида галанина в формировании типовых особенностей поведения / В.И. Людыно, И.Н. Абдурасулова, В.М. Клименко 119 // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. – 2006. – Т. 92, № 10. – С. 1204-1211. 49. Мартюшев-Поклад, А.В. Стресс-лимитирующие системы и нейрональная пластичность в патогенезе психических и неврологических расстройств / А.В. Мартюшев-Поклад, Т.А. Воронина // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. – 2003. – Т. 2, № 4. – С. 15-25. 50. Мезенцева, лекарственных М.В. Перспективы препаратов, создания обладающих новых пептидных противоинфекционной и иммуномодулирующей активностью / М.В. Мезенцева, А.Н. Наровлянский, И.Ю. Нагаев, И.М. Шаповал, В.Э. Щербенко, Л.И. Руссу, Н.Ф. Мясоедов, Л.А. Андреева // Инфекция и иммунитет. – 2011. – Т. 1, № 2. – С. 171-176. 51. Мосолов, С.Н. Современные биологические гипотезы рекуррентной депрессии (обзор) / С.Н. Мосолов // Журнал неврологии и психиатрии. – 2012. – № 11. – С. 29-40. 52. Мюльберг, А.А. Цитокины как медиаторы нейроиммунных взаимодействий / А.А. Мюльберг, Т.В. Гришина // Успехи физиологических наук. – 2006. – Т. 37, № 1. – С. 18-27. 53. Новиков, В.Е. Фармакокинетика и фармакодинамика ингибиторов АПФ / В.Е. Новиков // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. – 2007. – Т. 5, № 2. – С. 43-48. 54. Панченко, Л.Ф. Регуляторные пептиды и ферменты их обмена при стрессе / Л.Ф. Панченко, Н.В. Фирстова, Н.В. Митюшина, М.Т. Генгин // Нейрохимия. – 2000. – Т. 17, № 2. – С. 83-92. 55. Поварнина, П.Ю. Оригинальный дипептидный миметик фактора роста нервов гк-2 восстанавливает нарушенные когнитивные функции в крысиных моделях болезни Альцгеймера / П.Ю. Поварнина, О.Н. Воронцова, Т.А. Гудашева, Р.У. Островская, С.Б. Середенин // Acta Naturae (русскоязычная версия). – 2013. – Т. 5, № 3. – С. 88-95. 120 56. Подсеваткин, В.Г. Современные представления о механизмах возникновения и методах лечения депрессивных расстройств / В.Г. Подсеваткин, С.В. Кирюхина, В.Г. Подсеваткин // Психическое здоровье. – 2013. – Т. 11, № 10 (89). – С. 49-61. 57. Прожерина, Ю.А. Физиологическая роль ангиотензина II и IV как активных компонентов ренин-ангиотензиновой системы / Ю.А. Прожерина // Журнал высшей нервной деятельности им. И.П. Павлова. – 2008. – Т. 58, № 6. – С. 649-662. 58. Прожерина, Ю.А. Физиологически активные ангиотензины и рецепторы к ним / Ю.А. Прожерина // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. – 2009. – Т. 7, №. 5. – С. 3-9. 59. Раевский, К.С. Антидепрессанты: нейрохимические аспекты механизма действия / К.С. Раевский // Психиатрия и психофармакотерапия. – 2001. – Т. 3, №5. – С. 162-166. 60. Решетников, функционирования Е.А. Молекулярно-генетические сердечно-сосудистой системы и механизмы роль ренин- ангиотензиновой системы в обеспечении сердечно-сосудистых реакций в организме / Е.А. Решетников, Л.Ю. Акулова, И.В. Батлуцкая // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина. Фармация. – 2013. – Т. 22, №. 11. – С. 179-184. 61. Романов, Б.К. Лекарственная регуляция активности лизосомальных ферментов / Б.К. Романов // Российский медико-биологический вестник им. академика И.П. Павлова. – 2003. – № 1-2. – С. 75-82. 62. Сафронова, Е.С. Нейропротекторный эффект ингибиторов ренин- ангиотензин-альдостероновой системы при диффузном аксональном повреждении мозга / Е.С. Сафронова, С.В. Юнцев, Ю.А. Белозерцев // Медицина и образование в Сибири. – 2013. – №. 3. – С. 42. 63. Сергеев, П.В. Рецепторы физиологически активных веществ / П.В. Сергеев, Н.Л. Шимановский, В.Н. Петров. – Волгоград, 1999. – 640 с. 121 64. Середенин, С.Б. Антидепрессивный эффект оригинального низкомолекулярного миметика BDNF, димерного дипептида ГСБ-106 / С.Б. Середенин, Т.А. Воронина, Т.А. Гудашева, Т.Л. Гарибова, Г.М. Молодавкин, С.А. Литвинова, О.А. Елизарова, В.И. Посева // Acta Naturae (русскоязычная версия). – 2013. – Т. 5, № 4 (19). – С. 116-120. 65. Сидорчук, Л.П. Апоптоз-цитокиновая сигнальная система и генетический полиморфизм у больных с артериальной гипертензией / Л.П. Сидорчук // Сердце и сосуды. – 2007. – Т. 20, № 4. – С. 066-074. 66. Силькис, пластичность И.Г. в Влияние нейромодуляторов дофаминергических структурах (гипотетический механизм) / И.Г. Силькис на синаптическую среднего мозга //Журнал В.Н.Д. им. И.П. Павлова. – 2003. – Т. 53, № 4. – С. 464-479. 67. Сметанин, В.А. Влияние алкогольной интоксикации на активность основных карбоксипептидаз в тканях самок крыс на разных стадиях эстрального цикла: дис. ... канд. биол. наук: 03.00.04 / В.А. Сметанин. – Пенза, 2004. – 162 с. 68. Смирнов, А.Н. Элементы эндокринной регуляции / А.Н. Смирнов. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. – 352 с. 69. Смулевич, А.Б. Депрессии в общей медицине / А.Б. Смулевич. — М.: Медицинское информационное агентство, 2001. —256 с. 70. Смулевич, А.Б. Депрессии при сердечно-сосудистых заболеваниях / А.Б. Смулевич // Психические расстройства в общей медицине. – 2013. – № 4. – С. 4-9. 71. Соловьев, А.Г. Провоспалительные цитокининдуцирующие свойства ангиотензина II и механизм антицитокиновых эффектов ингибитора ангиотензинпревращающего фермента каптоприла / А.Г. Соловьев, Л.Л. Резников, П.Г. Назаров, C.A. Dinarello // Цитокины и воспаление. – 2006. – Т. 5, № 3. – С. 40-45. 122 72. Соловьев, В.Б. Активность пептидил-дипептидазы А и карбоксипептидазы N в сыворотке крови пациентов с болезнью Альцгеймера / В.Б. Соловьев, М.Т. Генгин // Украинский биохимический журнал. – 2007. – Т. 79, № 6. – С. 103–105. 73. Соловьев, В.Б. Влияние холинотропных препаратов на активность основных карбоксипептидаз в нервной ткани крыс: дис. ... канд. биол. наук: 03.00.04 / В.Б. Соловьев. – Москва, 2006. – 114 с. 74. Спивак, И.М. Полиморфизмы генов ренин-ангиотензиновой системы и их корреляция с психологическими проявлениями родового стресса / И.М. Спивак, H.А. Сейлиева, Т.Ю. Смирнова, В.М. Болотских, В.В. Абрамченко, Д.Л. Спивак // Цитология. – 2008. – Т. 50, №. 10. – С. 899-906. 75. Стволинский, С.Л. Нейропротекторные эффекты карнозина в условиях «эндо-экологической катастрофы», вызванной гипобарической гипоксией / С.Л. Стволинский, Т.Н. Федорова // Вестник российского университета дружбы народов. Серия: экология и безопасность жизнедеятельности. – 2006. – № 1. – С. 56-63. 76. Стояк, В.А. Нейромедиаторные системы в регуляции агрессивного поведения (обзор литературы) / В.А. Стояк, С.А. Иванова // Сибирский вестник психиатрии и наркологии. – 2010. – Т. 60, № 3. – С. 70-76. 77. Титов, В.Н. Биологическая функция стресса, врожденный иммунитет, реакция воспаления и артериальная гипертония / В.Н. Титов // Клиническая лабораторная диагностика. – 2008. – № 12. – С. 3-16. 78. Третьякевич, З.Н. Калликреин-кининовая система как адаптационно- защитное звено организма / З.Н. Третьякевич, А.М. Левчин, В.В. Анцупова, А.М. Федота // Современная медицина: актуальные вопросы. – 2013. – № 22. – С. 49-58. 79. Узбеков, М.Г. систем и Взаимосвязь моноаминергических и гормональных эндогенная интоксикация в патогенетических механизмах 123 тревожной депрессии / М.Г. Узбеков, Н.М. Максимова // Нейрохимия. – 2014. – Т. 31, № 4. – С. 341. 80. Фролова, Г.А. Влияние селективного стимулирования активности моноаминергических нейромедиаторных систем мозга на психоэмоциональный статус самцов белых крыс / Г.А. Фролова, Ю.О. Федотова, И.Э. Кузнецов // Вестник проблем биологии и медицины. – 2012. – Т. 1, № 92. – С. 101-106. 81. Фурдуй, Ф.И. Физиологические механизмы стресса и адаптации при остром действии стресс-факторов: дис. ... д-ра биол. наук: 03.00.13 / Ф.И. Фурдуй. – Кишинев, 1987. – 178 с. 82. Хомутов, А.Е. Регуляторные пептиды / А.Е. Хомутов, К.А. Пурсанов, З.В. Перепелюк. – Н. Новгород: изд-во ННГУ, 2014. – 73 с. 83. Шабанов, П.Д. Дофамин и подкрепляющие системы мозга / П.Д. Шабанов, A.A. Лебедев, Ш.К. Мещеров. – С.-Пб.: Лань, 2002. – 208 с. 84. Шабанов, П.Д. Психофармакологический профиль ноотропоподобных пептидов / П.Д. Шабанов, А.А. Лебедев, В.А. Корнилов, Н.В. Лавров, А.В. Любимов, А.В. Яклашкин // Психофармакология и биологическая наркология. – 2009. – Т. 9, № 1-2. – С. 2517-2523. 85. Шабанов, П.Д. Роль дофамина в формировании эмоционального поведения / П.Д. Шабанов, А.А. Лебедев, Ш.К. Мещеров, В.П. Павленко, В.Ф. Стрельцов // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. – 2003. – Т. 2, № 1. – С. 23-45. 86. Шабанов, П.Д. Структура и функции рецепторов дофамина / П.Д. Шабанов // Обзоры по клин. фармакол. и лек. терапии. – 2002. – Т. 1, № 1. – С. 2-18. 87. Шатаева, Л.К. Пептидная саморегуляция живых систем (факты и гипотезы) / Л.К. Шатаева, В.Х. Хавинсон, И.Ю. Ряднова. – СПб.: Наука, 2003. – 222 с. 124 88. Шлепцова, В.А. Участие ренин-ангиотензиновой системы в формировании эмоционального состояния человека / В.А. Шлепцова, Н.В. Малюченко, М.А. Куликова, М.А. Тимофеева, Ю.В. Щеголькова, A.M. Всдяков, О.В. Сысоева, А.Г. Тоневицкий // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2008. – Т. 145, № 4. – С. 368-371. 89. Яковлев, А.А. Анализ спектра пептидов крови – новое направление поиска биомаркеров депрессии /А.А. Яковлев // Нейрохимия. – 2015. – Т. 32, № 2. – С. 112. 90. Яровая, Г.А. Биорегулирующие функции и патогенетическая роль протеолиза / Г.А. Яровая // Лабораторная медицина. – 2002. – № 5. – С. 39-45. 91. Яровая, Г.А. Калликреин - кининовая система: новые факты и концепции (обзор) / Г.А. Яровая // Вопросы медицинской химии. – 2001. – Т. 47, № 1. – С. 20-42. 92. Akhondzadeh, S. Clinical trial of adjunctive celecoxib treatment in patients with major depression: a double blind and placebo controlled trial / S. Akhondzadeh, S. Jafari, F. Raisi, A.A. Nasehi, A. Ghoreishi, B. Salehi, S. Mohebbi-Rasa, M. Raznahan, A. Kamalipour // Depress. Anxiety. – 2009. – Vol. 26, № 7. – P. 607-611. 93. Alburges, M.E. Responses of the rat basal ganglia neurotensin systems to low doses of methamphetamine / M.E. Alburges, A.J. Hoonakker, N.M. Cordova, C.M. Robson, L.M. McFadden, A.L. Martin, G.R. Hanson // Psychopharmacology (Berl). – 2014. – Vol. 231, №15. – P. 2933-2940. 94. Andreis, P.G. Evidence for a paracrine role of endogenous adrenomedullary galanin in the regulation of glucocorticoid secretion in the rat adrenal gland / P.G. Andreis, C. Tortorella, A. Ziolkowska, R. Spinazzi, L.K. Malendowicz, G. Neri, G.G. Nussdorfer // Int. J. Mol. Med.– 2007. –Vol. 19, № 3. – P. 511-515. 95. Arendt, D.H. Depressive behavior and activation of the orexin/hypocretin system / D.H. Arendt, P.J. Ronan, K.D. Oliver, L.B. Callahan, T.R. Summers, C.H. Summers // Behav Neurosci. – 2013. – Vol. 127, № 1. – P. 86-94. 125 96. Auerbach, S. Vasopressin augments depolarization-induced release and synthesis of serotonin in hippocampal slices / S. Auerbach, P. Lipton // J. Neurosci. – 1982. – Vol. 2, № 4. – P. 477-482. 97. Avissar, S. Reduced G proteinиfunctions and immunoreactive levels in mononuclear leukocytes of patients with depression / S. Avissar, Y. Nechamkin, G. Roitman, G. Schreiber // Am. J. Psychiatry. – 1997. – Vol. 154, № 2. – P. 211217. 98. Baghai, T.C. Polymorphisms in the angiotensin-converting enzyme gene are associated with unipolar depression, ACE activity and hypercortisolism / T.C. Baghai, E.B. Binder, C. Schule, D. Salyakina, D. Eser, S. Lucae, P. Zwanzger, C. Haberger, P. Zill, M. Ising, T. Deiml, M. Uhr, T. Illig, H.E. Wichmann, S. Modell, C. Nothdurfter, F. Holsboer, B. Müller-Myhsok, H.J. Möller, R. Rupprecht, B. Bondy // Mol. Psychiatry. – 2006. – Vol. 11, № 11. – P. 10031015. 99. Bali, A. Stress and opioids: role of opioids in modulating stress-related behavior and effect of stress on morphine conditioned place preference / A. Bali, P.K. Randhawa, A.S. Jaggi // Neurosci Biobehav Rev. – 2015. – Vol. 51. – P. 138150. 100. Bankson, G.M. 3, 4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA) as a unique model of serotonin receptor function and serotonin dophamine interactions / G.M. Bankson, K.A. Cunningham // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 2001. – Vol. 297, № 3. – P. 846-852. 101. Bao, A.M. The stress systems in depression: a postmortem study / A.M. Bao, D.F. Swaab // Eur. J. Psychotraumatol. – 2014. – Vol. 5. – P. 26521. 102. Bao, X. A possible involvement of beta-endorphin, substance P, and serotonin in rat analgesia induced by extremely low frequency magnetic field / X. Bao, Y. Shi, X. Huo, T. Song // Bioelectromagnetics. – 2006. – Vol. 27, № 6. – P. 467-472. 126 103. Barden, N. Do antidepressants stabilize mood through actions on the hypothalamic-pituitary-adrenocortical system? / N. Barden, J.M. Reul, F. Holsboer // Trends. Neurosci. – 1995. – Vol. 18, № 1. – P. 6-11. 104. Barker, E.L. Norepinephrine and serotonin transporters. Molecular targets of antidepressant drugs / E.L. Barker, R.D. Blakey // Psychopharmacology. The Forth Generation of Progress. – 1995. – Vol. 59. – P. 321-333. 105. Basic neurochemistry. Principles of molecular, cellular and medical neurobiology. Eighth edition / S.T. Brady, G.J. Siegel, R.W. Albers, D.L. Price. – Elsevier Ltd., 2012 – 1093 p. 106. Beaulieu, J.M. Dopamine receptors / J.M. Beaulieu, S. Espinoza, R.R. Gainetdinov // Br J Pharmacol. – 2015. – Vol. 172, № 1. – P. 1-23. 107. Bielsky, I.F. Profound impairment in social recognition and reduction in anxiety-like behavior in vasopressin V1a receptor knockout mice / I.F. Bielsky, S.B. Hu, K.L. Szegda, H. Westphal, L.J. Young // Neuropsychopharmacology. – 2004. – Vol. 29, № 3. – P. 483-493. 108. Bina, K.G. Dopaminergic agonists normalize elevated hypothalamic neuropeptide Y and corticotropin-releasing hormone, body weight gain, and hyperglycemia in ob/ob mice / K.G. Bina, A.H. Cincotta // Neuroendocrinology. – 2000. – Vol. 71, № 1. – P. 68-78. 109. Binder, E.B. Neurotensin and dopamine interactions / E.B. Binder, B.Kinkead, M.J.Owens, C.B. Nemeroff // Pharmacol Rev. – 2001. – Vol. 53, № 4. – P. 453-486. 110. Binneman, B. A 6-week randomized, placebo-controlled trial of CP-316, 311 (a selective CRH1 antagonist) in the treatment of major depression / B. Binneman, D. Feltner, S. Kolluri, Y. Shi, R. Qiu, T. Stiger // Am. J. Psychiatry. – 2008. – Vol. 165, № 5. – P. 617-620. 111. Bisagno, V. Stress, sex, and addiction: potential roles of corticotropinreleasing factor, oxytocin, and arginine-vasopressin / V. Bisagno, J.L. Cadet // Behav Pharmacol. – 2014. – Vol. 25, № 5-6. – P. 445-457. 127 112. Blasey, C.M. A multisite trial of mifepristone forthe treatment of psychotic depression: a site-by-treatment interaction / C.M. Blasey, C. Debattista, R. Roe, T. Block, J.K. Belanoff // Contemp. Clin. Trials. – 2009. – Vol. 30, № 4. – P. 284288. 113. Blendy, J.A. The role of CREB in depression and antidepressant treatment / J.A. Blendy // Biol. Psychiatry. – 2006. – Vol. 59, № 12. – P. 1144-1150. 114. Blier, P. Is there a role for 5-HT1A agonists in the treatment of depression? / P. Blier, N.M. Ward // Biol. Psychiatry. – 2003. – Vol. 53, № 3. – P. 193-203. 115. Bremner, J.D. Regional brain metabolic correlates of alpha- methylparatyrosine-induced depressive symptoms: implications for the neural circuitry of depression / J.D. Bremner, M. Vythilingam, C.K. Ng, E. Vermetten, A. Nazeer, D.A. Oren, R.M. Berman, D.S. Charney // JAMA. – 2003. – Vol. 289, № 23. – P. 3125-3134. 116. Brunetti, L. Synthesis and neuromodulatory effects of TRH-related peptides: inhibitory activity on catecholamine release in vitro / L. Brunetti, A. Chiavaroli, A. Cocco, C. Ferrante, A. Ferrucci, G. Luisi, G. Orlando, F. Pinnen, M. Vacca // Pharmacol Rep. – 2013. – Vol. 65, № 4. – P. 823-835. 117. Calabrese, F. Neuronal plasticity: a link between stress and mood disorders / F. Calabrese, R. Molteni, G. Racagni, M.A. Riva // Psychoneuroendocrinology. – 2009. – Vol. 34, № 1. – P. 208-216. 118. Carroll, B.J. Pathophysiology of hypercortisolismin depression / B.J. Carroll, F. Cassidy, D. Naftolowitz, N.E. Tatham, W.H. Wilson, A. Iranmanesh, P.Y. Liu, J.D. Veldhuis // Acta. Psychiatr. Scand. – 2007. – Vol. 433. – P. 90-103. 119. Castren, E. Is mood chemistry? / E. Castren // Nat.Rev.Neurosci. – 2005. – Vol. 6. – P. 241-246. 120. Castren, E. Neurotrophic effects of antidepressant drugs / E. Castren // Curr. Opin. Pharmacol. – 2004. – Vol. 4, № 1. – P. 58-64. 128 121. Castren, E. Role of neurotrophic factors in depression / E. Castren, V. Voikar, T. Rantamaki // Curr Opin Pharmacol. – 2007. – Vol. 7, № 1. – P. 1821. 122. Chen, Q. The hypocretin/orexin system: an increasingly important role in neuropsychiatry / Q. Chen, L. de Lecea, Z. Hu, D. Gao // Med. Res. Re. – 2015. – Vol. 35, № 1. – P. 152-197. 123. Chen, X.Q. Regulation of hypoxia-induced release of corticotropin-releasing factor in the rat hypothalamus by norepinephrine / X.Q. Chen, J.Z. Du, Y.S. Wang // Regul. Pept. – 2004. – Vol. 119, № 3. – P. 221-228. 124. Cheng, Y. Carboxypeptidase E (NF-α1): a new trophic factor in neuroprotection / Y. Cheng, N.X. Cawley, Y.P. Loh // Neurosci. Bull. – 2014. – Vol. 30, № 4. – P. 692-696. 125. Coupland, N.J. Decreased prefrontal Myo-inositol in major depressive disorder / N.J. Coupland, C.J. Ogilvie, K.M. Hegadoren, P. Seres, C.C. Hanstock, P.S. Allen // Biol. Psychiatry. – 2005. – Vol.57, № 12. – P. 1526-1534. 126. Cozzolino, D. Acute pressor and hormonal effects of beta-endorphin at high doses in healthy and hypertensive subjects: role of opioid receptor agonism / D. Cozzolino, F.C.Sasso, DCataldo, D. Gruosso,A.Giammarco, A.Cavalli, C. Di Maggio, G. Renzo, T.Salvatore, D. Giugliano, R.Torella // J. Clin. Endocrinol.Metab. – 2005. – Vol. 90, № 9. – P. 5167-5174. 127. Csaba, G. Effect of neonatal beta-endorphin imprinting on sexual behavior and brain serotonin level in adult rats / G. Csaba, B. Knippel, C. Karabélyos, A.Inczefi-Gonda, M. Hantos, L. Tóthfalusi, K.Tekes // Life Sci. – 2003. – Vol. 73, № 1.– P. 103-114. 128. Curtis, A.L. Sexually dimorphic responses of the brain norepinephrine system to stress and corticotropin-releasing factor / A.L. Curtis, T. Bethea, R.J. Valentino // Neuropsychopharmacology. – 2006. – Vol. 31, № 3. – P. 544-554. 129 129. Dang, Y.H. Targeting of NMDA receptors in the treatment of major depression / Y.H. Dang, X.C. Ma, J.C. Zhang, Q. Ren, J. Wu, C.G. Gao, K. Hashimoto // Curr. Pharm. Des. – 2014. – Vol. 20, № 32. – P. 5151-5159. 130. De Berardis, D. The emerging role of melatonin agonists in the treatment of major depression: focus on agomelatine / D. De Berardis, G. Di Iorio, T. Acciavatti, C. Conti, N. Serroni, L. Olivieri, M. Cavuto, G. Martinotti, L. Janiri, F.S. Moschetta, P. Conti, M. Di Giannantonio // CNS Neurol. Disord. Drug Targets. – 2011. – Vol. 10, № 1. – P. 119-132. 131. de Kloet, E.R. Stress and the brain: from adaptation to disease / E.R. de Kloet, M. Joels, F. Holsboer // Nat. Rev. Neurosci. – 2005. – Vol. 6, № 6. – P. 463475. 132. Deiteren, K. Carboxypeptidase M: Multiple alliances and unknown partners / K. Deiteren, D. Hendriks, S. Scharpe, A.M. Lambeir // Clin. Chim. Acta. – 2009. – Vol. 399, № 1-2. – P. 24-39. 133. Del Boca, C. Cholecystokinin knock-down in the basolateral amygdala has anxiolytic and antidepressant-like effects in mice / C. Del Boca, P.E. Lutz, J. Le Merrer, P. Koebel, B.L. Kieffer // Neuroscience. – 2012. – Vol. 218. – P. 185-195. 134. Dournes, C. Deep brain stimulation in treatment-resistant depression in mice: comparison with the CRF1 antagonist, SSR125543 / C. Dournes, S. Beeske, C. Belzung, G. Griebel // Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. – 2013. – Vol. 40. – P. 213-220. 135. Dremencov, E. Modulation of dopamine transmission by 5HT2C and 5HT3 receptors: a role in the antidepressant response / E. Dremencov, Y. Weizmann, N. Kinor, I. Gispan-Herman, G. Yadid // Curr. Drug Targets. – 2006. – Vol. 7, № 2. – P. 165-175. 136. Duman, R.S. A neurotrophic model for stress-related mood disorders / R.S. Duman, L.M. Monteggia // Biol. Psychiatry. – 2006. – Vol.59, № 12. – P. 1116-1127. 130 137. Ebmeier, K.P. Recent developments and current controversies in depression / K.P. Ebmeier, C. Donaghey, J.D. Steele // Lancet. – 2006. – Vol. 367. – P. 153167. 138. Elde, R. Localization of neuropeptide receptor mRNA in rat brain: initial observations using probes for neurotensin and substance P receptors / R. Elde, M. Schalling, S. Ceccatelli, S. Nakanishi, T. Hökfelt // Neurosci Lett. – 1990. – Vol. 120, № 1. – P. 134-138. 139. Fernandez, F. Nociceptin/orphanin FQ increases anxiety-related behavior and circulating levels of corticosterone during neophobic tests of anxiety / F. Fernandez, M.A. Misilmeri, J.C. Felger, D.P. Devine // Neuropsychopharmacology. – 2004. – Vol. 29, № 1. – P. 59-71. 140. Fitzpatrick, P.F. Tetrahydopterin-dependent amino acid hydroxylases / P.F. Fitzpatrick // Ann. Rev. Biochem. – 1999. – Vol. 68. –P. 355-381. 141. Fricker, L.D. Carboxypeptidase E activity is deficient in mice with the fat mutation. Effect on peptide processing / L.D. Fricker, Y.L. Berman, E.H. Leiter, L.A. Devi // J. Biol. Chem. – 1996. – Vol. 271, № 48. – P. 30619–30624. 142. Fricker, L.D. Enkephalin convertase: purification and charasterization of a specific enkephalin-synthesizing carboxypeptidase localized to adrenall chromaffin granules / L.D. Fricker, S.H. Snyder // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1982. – Vol. 79, № 12. – P. 3886-3890. 143. Fricker, L.D. Isolation and sequence analysis of cDNA for rat carboxypeptidase E [EC 3.4.17.10], a neuropeptide processing enzyme / L.D. Fricker, J.P. Adelman, J. Douglass, R.C. Thompson, R.P. von Strandmann, J.A.D. Hutton // Mol. Endocrinol. – 1989. – Vol. 3, № 4. – P. 666-673. 144. Fukuda, K. Etiological classification of depression based on the enzymes of tryptophan metabolism / K. Fukuda // BMC Psychiatry. – 2014. – Vol. 14. – P. 372. 145. Funatsu, K. Thyrotropin releasing hormone increases 5- hydroxytryptaminelreceptors in the limbic brain of the rat / K. Funatsu, S. Teshima, K. Inanaga // Peptides. – 1985. – Vol. 6, № 3. – P. 563-566. 131 146. Gehlert, D.R. Monoaminergic compensation in the neuropeptide Y deficient mouse brain / D.R. Gehlert, L.K.Thompson, S.K.Hemrick-Luecke, J. Shaw // Neuropeptides. –2008. – Vol. 42, № 3. – P. 367-375. 147. Georgiev, V. Effects of angiotensin II on regional brain noradrenaline metabolism in non-stressed and stressed rats / V. Georgiev, M. Tanaka, A. Tsuda, C. Koga, S. Takeda, H. Yokoo, M. Yoshida // Kurume Med. J. –1992. – Vol. 39, № 4. – P. 235-244. 148. Goessler, U.R. Physiology, role and neuropharmacology of yawning / U.R. Goessler, G. Hein, H. Sadick, J.T. Maurer, K. Hormann, T. Verse // Laryngorhinootologie. – 2005. – Vol. 84, № 5. – P. 345-351. 149. Gomez, F. Short-term fluoxetine treatment induces neuroendocrine and behavioral anxiogenic-like responses in adolescent male rats / F. Gomez, C. Venero, M.P. Viveros, L. García-García // Exp. Brain Res. – 2015. – Vol. 233, № 3. – P. 983-995. 150. Greene, D. Regulation of carboxypeptidase E: effect of pH, temperature, and Co2+ on kinetic parameters of substrate hydrolysis / D. Greene, B. Das, L.D. Fricker // Biochem. J. – 1992. – Vol. 285. – P. 613-618. 151. Gruber, S.H. d-Amphetamine-induced increase in neurotensin and neuropeptide Y outflow in the ventral striatum is mediated via stimulation of dopamine D1 and D2/3 receptors / S.H. Gruber, G.G. Nomikos, A.A. Mathe //J. Neurosci. Res. – 2002. – Vol. 69, № 1. – P. 133-139. 152. Guo, F. Role of angiotensin II type 1 receptor in angiotensin II-induced cytokine production in macrophages / F. Guo, X.L. Chen, F. Wang, X. Liang, Y.X. Sun, Y.J. Wang // J. Interferon Cytokine Res. – 2011. – Vol. 31, №. 4. – P. 351-361. 153. Hajos, M. The selective norepinephrine reuptake inhibitor antidepressant reboxetine: pharmacological and clinical profile / M. Hajos, J.C. Fleishaker, J.K. Filipiak-Reisner, M.T. Brown, E.H. Wong // CNS Drug Rev. – 2004. – Vol. 10, № 1. – P. 23-44. 132 154. Hamon, M. Monoamine neurocircuitry in depression and strategies for new treatments / M. Hamon, P. Blier // Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. – 2013. – Vol. 45. – P. 54-63. 155. Handbook of proteolytic enzymes / N.D. Rawlings, G. Salvesen. Third edition. – Elsevier Ltd., 2013. – 4545 p. 156. Hastings, J.A. NPY and NPY Y1 receptor effects on noradrenaline overflow from the rat brain in vitro / J.A. Hastings, M.J. Morris, G. Lambert, E. Lambert, M. Esler // Regul.Pept.– 2004. –Vol. 120, № 1-3. – P. 107-112. 157. Hatzinger, M. The combined DEX-CRH test in treatment course and longterm outcome of major depression / M. Hatzinger, U.M. Hemmeter, K. Baumann, S. Brand, E. Holsboer-Trachsler // J. Psychiatr. Res. – 2002. – Vol. 36, № 5. – P. 287-297. 158. He, P. Identification of carboxypeptidase E and gamma-glutamyl hydrolase as biomarkers for pulmonary neuroendocrine tumors by cDNA microarray / P. He, L. Varticovski, E.D. Bowman, J. Fukuoka, J.A. Welsh, K. Miura, J. Jen, E. Gabrielson, E. Brambilla, W.D. Travis, C.C. Harris // Hum. Pathol. – 2004. – Vol. 35, № 10. – P. 1196-1209. 159. Hegadoren, K.M. The role of beta-endorphin in the pathophysiology of major depression / K.M. Hegadoren, T. O'Donnell, R. Lanius, N.J. Coupland, N. LacazeMasmonteil // Neuropeptides. – 2009. – Vol. 43, № 5. – P. 341-353. 160. Helwig, M. Regulation of Neuropeptide Processing Enzymes by Catecholamines in Endocrine Cells / M. Helwig, M. Vivoli, L.D. Fricker, I. Lindberg // Mol. Pharmacol. – 2011. – Vol. 80, № 2. – P. 304-313. 161. Herbert, J. Cortisol and depression: three questions for psychiatry / J. Herbert // Psychol. Med. – 2013. – Vol. 43, № 3. – P. 449-469. 162. Herman, Z.S. Chronic treatment with chlorpromazine, thioridazine or haloperidol increases striatal enkephalins and their release from rat brain / Z.S. Herman, M. Huzarska, K. Kmieciak-Kolada, J. Psychopharmacology (Berl). –1991. – Vol. 104, № 1. – P. 106-112. Kowalski // 133 163. Hernandez, I. Abnormalities in 5-HTR2A receptor mRNA expression in frontal cortex of chronic elderly schizophrenics with varying histories of neuroleptic treatment / I. Hernandez, B.P. Sokolov // J. Neurosci. Res. – 2000. – Vol. 59. – P. 218-225. 164. Hervieu, G. Visualisation of somatostatin receptor sst(3) in the rat central nervous system / G. Hervieu, P.C. Emson // Brain Res. Mol. Brain Res. – 1999. – Vol. 71, № 2. – P. 290-303. 165. Hillhouse, T.M. A brief history of the development of antidepressant drugs: From monoamines to glutamate / T.M. Hillhouse, J.H. Porter // Exp. Clin. Psychopharmacol. – 2015. – Vol. 23, № 1. – P. 1-21. 166. Hirschfeld, R.M. History and evolution of the monoamine hypothesis of depression / R.M. Hirschfeld // J. Clin. Psychiatry. – 2000. – Vol. 61, № 6. – P. 4– 6. 167. Holsboer, F. The corticosteroid receptor hypothesis of depression / F. Holsboer // Neuropsychopharmacology. – 2000. – Vol. 23, № 5. – P. 477-501. 168. Holsboer, F. The role of peptides in treatment of psychiatric disorders / F. Holsboer // J. Neural. Transm. Suppl. – 2003. – Vol. 64. – P. 17-34. 169. Hook, V.Y. Carboxypeptidase B-like converting enzyme activity in secretory granules of rat pituitary / V.Y. Hook, Y.P. Loh // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. – 1984. – Vol. 81, № 9. – P. 2776-2780. 170. Hook, V.Y. Product inhibition of carboxypeptidase H / V.Y. Hook, E.F. LaGamma // J. Biol. Chem. – 1987. – Vol. 262, № 26. – P. 12583–12588. 171. Huang, M. Asenapine increases dopamine, norepinephrine, and acetylcholine efflux in the rat medial prefrontal cortex and hippocampus / M. Huang, Z. Li, J. Dai, M. Shahid, E.H. Wong, H.Y. Meltzer // Neuropsychopharmacology. – 2008. – Vol. 33, № 12. – P. 2934-2945. 172. Humble, M. Noradrenaline and serotonin reuptake inhibition as clinical principles: a review of antidepressant efficacy / M. Humble // Acta Psychiatr. Scand. Suppl. – 2000. – Vol. 402. – P. 28–36. 134 173. Husum, H. Changed concentrations of tachykinins and neuropeptide Y in brain of a rat model of depression: lithium treatment normalizes tachykinins / H. Husum, P.A. Vasquez, A.A. Mathé // Neuropsychopharmacology. – 2001. – Vol. 24, № 2. – P. 183-191. 174. Ishibashi, H. Excitation of locus coeruleus noradrenergic neurons by thyrotropin-releasing hormone / H. Ishibashi, Y. Nakahata, K. Eto, J.Nabekura // J. Physiol. – 2009. – Vol. 587, №. 23. – P. 5709-5722. 175. Janicki-Deverts, D. Infection-induced proinflammatory cytokines are associated with decreases in positive affect, but not increases in negative affect / D. Janicki-Deverts, S. Cohen, W.J. Doyle R.B. Turner, J.J. Treanor // Brain. Behav. Immun. – 2007. – Vol. 21, № 3. – P. 301-307. 176. Jorgensen, H. Serotonin stimulates hypothalamic mRNA expression and local release of neurohypophysial peptides / H. Jorgensen, A. Kjaer, U. Knigge, M. Moller, J. Warberg // J. Neuroendocrinol. – 2003. – Vol. 15, № 6. – P. 564-571. 177. Kadono, Y. Effects of antidepressants on thyroid stimulating hormone release in rats under ether stress / Y. Kadono, H. Kaneda, K. Maeda // Psychiatry Clin. Neurosci. – 1995. – Vol. 49, №. 4. – P. 231-236. 178. Karege, F. Neurotrophin levels in postmortem brains of suicide victims and the effects of antemortem diagnosis and psychotropic drugs / F. Karege, G. Vaudan, M. Schwald, N. Perroud, R. La Harpe // Mol. Brain Res. – 2005. – Vol. 136, № 1-2. – P. 29-37. 179. Kennedy, S.H. Placebo-controlled trial of agomelatine in the treatment of major depressive disorder / S.H. Kennedy, R. Emsley // Eur. Neuropsychopharmacol. – 2006. – Vol. 16, № 2. – P. 93-100. 180. Kessler, R.C. Epidemiology of women and depression / R.C. Kessler // J. Affect. Disord. – 2003. – Vol. 74. – P. 5-13. 181. Kim, Y. Regulation of somatodendritic dopamine release by corticotrophinreleasing factor via the inhibition of voltage-operated Ca2+ channels / Y. Kim, M.K. Park, S. Chung // Neurosci. Lett. – 2009. – Vol. 465, № 1. – P. 31-35. 135 182. Koolschijn, P.C. Brain volume abnormalities in major depressive disorder: a meta-analysis of magnetic resonance imaging studies / P.C. Koolschijn, N.E. van Haren, G.J. Lensvelt-Mulders, H.E. Hulshoff Pol, R.S. Kahn // Hum. Brain Mapp. – 2009. – Vol. 30, № 11. – P. 3719-3735. 183. Kormos, V. Role of neuropeptides in anxiety, stress, and depression: from animals to humans / V. Kormos, B. Gaszner // Neuropeptides. – 2013. – Vol. 47, № 6. – P. 401-419. 184. Kozlovsky, N. Long-term down-regulation of BDNF mRNA in rat hippocampal CA1 subregion correlates with PTSD-like behavioural stress response / N. Kozlovsky, M.A. Matar, Z. Kaplan M. Kotler, J. Zohar, H. Cohen // Int. J. Neuropsychopharmacol. – 2007. – Vol. 10, № 6. – P. 741-758. 185. Kumar, K. Therapeutic potential of GABA(B) receptor ligands in drug addiction, anxiety, depression and other CNS disorders / K. Kumar, S. Sharma, P. Kumar, R. Deshmukh // Pharmacol. Biochem. Behav. – 2013. – Vol. 110. – P. 174-184. 186. Landau, A.M. Decreased in vivo α2 adrenoceptor binding in the Flinders Sensitive Line rat model of depression / A.M. Landau, J.A. Phan, P. Iversen, T.P. Lillethorup, M. Simonsen, G. Wegener, S. Jakobsen, D.J. Doudet // Neuropharmacology. – 2015. – Vol. 91. – P. 97-102. 187. Leonard, B.E. The immune system, depression and the action of antidepressants / B.E. Leonard // Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. – 2001. – Vol. 25, № 4. – P. 767-780. 188. Leung, L.L. Regulation of tissue inflammation by thrombinactivatable carboxypeptidase B (or TAFI) / L.L. Leung, T. Myles, T. Nishimura, J.J. Song, W.H. Robinson // Mol. Immunol. – 2008. – Vol. 45, № 16. – P. 4080-4083. 189. Levin, Y. Isolation and characterization of the subunits of human plasma carboxypeptidase N (kininase i) / Y. Levin, R.A. Skidgel, E.G. Erdös // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. – 1982. – Vol. 79, № 15. – Р. 4618-4622. 136 190. Lewis, B.M. Dopamine stimulates release of thyrotrophin-releasing hormone from perfused intact rat hypothalamus via hypothalamic D2-receptors / B.M. Lewis, C. Dieguez, M.D. Lewis, M.F. Scanlon // J. Endocrinol. – 1987. – Vol. 115, № 3. – P. 419-424. 191. Li, X.C. Serotonin of hippocampus and hypothalamus taking part in the analgesic effect of adrenocorticotropic hormone in rats / X.C. Li, H.D. Li, B.Y. Zhao // Zhongguo Yao Li Xue Bao. – 1990. – Vol. 11, № 1. – P. 89-92. 192. Lichtblau, N. Cytokines as biomarkers in depressive disorder: current standing and prospects / N. Lichtblau, F.M. Schmidt, R. Schumann, K.C. Kirkby, H. Himmerich // Int. Rev. Psychiatry. – 2013. – Vol. 25, № 5. – P. 592-603. 193. Lindblom, J. The MC4 receptor mediates alpha-MSH induced release of nucleus accumbens dopamine / J. Lindblom, B. Opmane, F. Mutulis, I. Mutule, R. Petrovska, V. Klusa, L. Bergstrom, J.E. Wikberg // Neuroreport. – 2001. – Vol. 12, № 10. – P. 2155-2158. 194. Linthorst, A.C. Forced swim stress activates rat hippocampal serotonergic neurotransmission involving a corticotropin-releasing hormone receptor-dependent mechanism / A.C. Linthorst, R.G. Peñalva, C. Flachskamm, F. Holsboer, J.M. Reul // Eur. J. Neurosci. – 2002. – Vol. 16, № 12. – P. 2441-2452. 195. Lopez-Munoz, F. Monoaminergic neurotransmission: the history of the discovery of antidepressants from 1950s until today / F. Lopez-Munoz, C. Alamo // Curr Pharm Des. – 2009. – Vol. 15, № 14. – P. 1563-1586. 196. Lowry, O.H. Protein measurement with Folin phenol reagent / O.H. Lowry, N.J. Rosebrought, A.L. Farr, R.J. Randall // J. Biol. Chem. – 1951. – Vol. 193, № 1. – P. 265-275. 197. MacQeen, G.M. Course of illness, hippocampal function, and hippocampal volume in major depression / G.M. MacQeen, S. Campbell, B.S. McEwen, K. Macdonald, S. Amano, R.T. Joffe, C. Nahmias, L.T. Young // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 2003. – Vol. 100, № 3. – P. 1387-1392. 137 198. Mahar, I. Stress, serotonin, and hippocampal neurogenesis in relation to depression and antidepressant effects / I. Mahar, F.R. Bambico, N. Mechawar, J.N. Nobrega // Neurosci. Biobehav. Rev. – 2014. – Vol. 38. – P. 173-192. 199. Majeed, N.H. Serotonergic regulation of the brain and gut beta-endorphin and dynorphin content in the rat / N.H. Majeed, W. Lasoń, B. Przewłocka, R. Przewłocki // Pol J Pharmacol Pharm. – 1985. – Vol. 37, №. 6. – P. 909-918. 200. Manji, H.K. The cellular neurobiology of depression / H.K. Manji, W.C. Drevets, D.S. Charney // Nat. Med. – 2001. – Vol. 7, № 5. – P. 541-547. 201. Marquez-Curtis, L. Carboxypeptidase M expressed by human bone marrow cells cleaves the C-terminal lysine of stromal cell-derived factor-1alpha: another player in hematopoietic stem/progenitor cell mobilization? / L. Marquez-Curtis, A. Jalili, K. Deiteren, N. Shirvaikar, A.M. Lambeir, A. Janowska-Wieczorek // Stem. Cells. – 2008. – Vol. 26, № 5. – P. 1211-1220. 202. Matsumoto, A. Expression of human brain carboxypeptidase B, a possible cleaving enzyme for beta-amyloid precursor protein, in peripheral fluids / A. Matsumoto, K. Motozaki, T. Seki, R. Sasaki, T. Kawabe // Neurosci. Res. – 2001. – V. 39. – № 3. – P. 313-317. 203. Matthews, K.W. Carboxypeptidase N: a pleiotropic regulator of inflammation / K.W. Matthews, S.L. Mueller-Ortiz, R.A. Wetsel // Mol. Immunol. – 2004. – Vol. 40, № 11. – Р. 785-793. 204. Mayer, J.L. Brief treatment with the glucocorticoid receptor antagonist mifepristone normalises the corticosterone-induced reduction of adult hippocampal neurogenesis / J.L. Mayer, L. Klumpers, S. Maslam, E.R. de Kloet, M. Joels, P.J. Lucassen // J. Neuroendocrinol. – 2006. – Vol. 18. – P. 629-631. 205. McIntosh, T.K. Effects of morphine, beta-endorphin and naloxone on catecholamine levels and sexual behavior in the male rat / T.K. McIntosh, M.L.Vallano, R.J.Barfield // Pharmacol. Biochem. Behav.–1980. – Vol. 13, № 3. – P. 435-441. 138 206. Melo, I. Enkephalin knockout male mice are resistant to chronic mild stress / I. Melo, E. Drews, A. Zimmer, A. Bilkei-Gorzo // Genes Brain Behav. – 2014. – Vol. 13, № 6. – P. 550-558. 207. Menard, J. Angiotensin-converting enzyme inhibitors / J. Menard, A.A. Patchett // Adv. Protein Chem. – 2001. – Vol. 56. – P. 13-75. 208. Merali, Z. Dysregulation in the suicide brain: mRNAexpression of corticotropin-releasing hormone receptors and GABA(A) receptorsubunits in frontal cortical brain region / Z. Merali, L. Du, P. Hrdina, M. Palkovits, G. Faludi, M.O. Poulter, H. Anisman // J. Neurosci. – 2004. – Vol. 24, № 6. – P. 1478-1485. 209. Millan, M. Signaling at G-protein-coupled serotonin receptors: recent advances and future research directions / M. Millan, P. Marin, J. Bockaert, C. Mannoury La Cour // Trends. Pharmacol. Sci. – 2008. – Vol. 29. – P. 454–464. 210. Miller, A.H. Inflammation and its discontents: the role of cytokines in the pathophysiology of major depression / A.H. Miller, V. Maletic, C.L. Raison // Biol. Psychiatry. – 2009. – Vol. 65, № 9. – P. 732-741. 211. Morrissette, D.A. Modulating the serotonin system in the treatment of major depressive disorder / D.A. Morrissette, S.M. Stahl // CNS Spectr. – 2014. – Vol. 19, № 1. – P. 57-67. 212. Muller, N. COX-2 inhibitors as antidepressants and antipsychotics: clinical evidence / N. Muller // Curr. Opin. Investig. Drugs. – 2010. – Vol. 11, № 1. – P. 31-42. 213. Nestler, E.J. Neurobiology of depression / E.J. Nestler, M. Barrot, R.J. DiLeone, A.J. Eisch, S.J. Gold, L.M. Monteggia // Neuron. – 2002. – Vol. 34, № 1. – P. 13–25. 214. Neurotransmitters, drugs and brain function / R.A. Wester. – John Wiley & Sons Ltd., 2001. – 530 p. 215. Nutt, D.J. Relationship of neurotransmitters to the symptoms of major depressive disorder / D.J. Nutt // J. Clin. Psychiatry. – 2008. – Vol. 69, № E1. – P. 4-7. 139 216. O’Brien, S.M. Plasma cytokine profiles in depressed patients who fail to respond to selective serotonin reuptake inhibitor therapy / S.M. O’Brien, P. Scully, P. Fitzgerald, L.V. Scott, T.G. Dinan // J. Psychiatr. Res. – 2007. – Vol. 41, № 3-4. – P. 326-331. 217. Oblin, A. Involvement of the D-2 dopamine receptor in the neurolepticinduced decrease in nigral substance P / A. Oblin, B. Zivkovic,G. Bartholini // Eur. J. Pharmacol.–1984. – Vol. 105, № 1-2. – P. 175-177. 218. Oldfield, B.J. Efferent neural projections of angiotensin receptor (AT1) expressing neurones in the hypothalamic paraventricular nucleus of the rat / B.J. Oldfield, P.J. Davern, M.E. Giles, A.M. Allen, E. Badoer, M.J. McKinley // J. Neuroendocrinol. – 2001. – Vol. 13, № 2. – P. 139-146. 219. Onaka, T. Facilitative role of endogenous oxytocin in noradrenaline release in the rat supraoptic nucleus / T. Onaka, K. Ikeda, T. Yamashita, K. Honda // Eur. J. Neurosci. – 2003. – Vol. 18, № 11. – P. 3018-3026. 220. Ordway, G.A. Elevated agonist binding to alpha-2-adrenoceptors in the locus coeruleus in major depression / G.A. Ordway, J. Schenk, C.A. Stockmeier, W. May, V. Klimek // Biol. Psychiatry.– 2003. – Vol. 53, № 4. – P. 315-323. 221. Pablo Huidobro-Toro, J. Sympathetic co-transmission: the coordinated action of ATP and noradrenaline and their modulation by neuropeptide Y in human vascular neuroeffector junctions / J. Pablo Huidobro-Toro, M. Verónica Donoso // Eur. J Pharmacol. – 2004. – Vol. 500, № 1-3. – P. 27-35. 222. Palermo-Neto, J. Dopaminergic systems. Dopamine receptors / J. PalermoNeto // Psychiatr. Clin. North. Am. – 1997. – Vol. 20, № 4. – P. 705-721. 223. Pålhagen, S. Monoamines, BDNF, IL-6 and corticosterone in CSF in patients with Parkinson's disease and major depression / S. Pålhagen, H. Qi, B. Mårtensson, J. Wålinder, A.K. Granérus, P. Svenningsson // J. Neurol. – 2010. – Vol. 257, № 4. – P. 524-532. 140 224. Pitchot, W. 5-Hydroxytryptamine 1A receptors, major depression, and suicidal behavior / W. Pitchot, M. Hansenne, E. Pinto, J. Reggers, S. Fuchs, M. Ansseau // Biol. Psychiatry. – 2005. – Vol.58, № 11. – P. 854-858. 225. Pizzagalli, D.A. Depression, stress, and anhedonia: toward a synthesis and integrated model / D.A. Pizzagalli // Annu. Rev. Clin. Psychol. – 2014. – Vol. 10. – P. 393-423. 226. Plummer, T.H.J. Human plasma carboxypeptidase N: Isolation and characterization / T.H.J. Plummer, M.Y. Hurwitz // J. Biol. Chem. – 1978. – Vol. 253, № 11. – P. 3907-3912. 227. Quera Salva, M.A. Mood disorders, circadian rhythms, melatonin and melatonin agonists / M.A. Quera Salva, S. Hartley // J. Cent. Nerv. Syst. Dis. – 2012. – Vol. 4. – P. 15-26. 228. Rao, U. Effect of bupropion on nocturnal urinary free cortisol and its association with antidepressant response / U. Rao, G.E. Ott, K.M. Lin, L. Gertsik, R.E. Poland // J. Psychiatr. Res. – 2005. – Vol. 39, № 2. – Р. 183-190. 229. Raskin, S. Bupropion as the treatment of choice in depression associated with Parkinson's disease and it's various treatments / S. Raskin, R. Durst // Med. Hypotheses. – 2010. – Vol. 75, № 6. – P. 544-546. 230. Reznik, S.E. Carboxypeptidases from A to Z: implications in embryonic development and Wnt binding / S.E. Reznik, L.D. Fricker // Cell. Mol. Life Sci. – 2001. – Vol. 58, № 12-13. – P. 1790-1804. 231. Rodríguez, C. Rat preprocarboxypeptidase H. Cloning, characterization, and sequence of the cDNA and regulation of the mRNA by corticotropin-releasing factor / C. Rodríguez, K.A. Brayton, M. Brownstein, J.E. Dixon // J. Biol. Chem. – 1989. – Vol. 264, № 10. – P. 5988-5995. 232. Rodriguiz, R.M. Emergence of anxiety-like behaviours in depressive-like Cpefat/fat mice / R.M. Rodriguiz, J.J. Wilkins, T.K. Creson, R. Biswas, I. Berezniuk, A.D. Fricker, L.D. Fricker, W.C. Wetsel // Int. J. Neuropsychopharmacol. – 2013. – Vol. 16, № 7. – Р. 1623-1634. 141 233. Rotzinger, S. Behavioral effects of neuropeptides in rodent models of depression and anxiety / S. Rotzinger, D.A. Lovejoy, L.A. Tan // Peptides. – 2010. – Vol. 31, № 4. – P. 736-756. 234. Ruhe, H.G. Mood is indirectly related to serotonin, norepinephrine and dopamine levels in humans: a meta-analysis of monoamine depletion studies / H.G. Ruhe, N.S. Mason, A.H. Schene // Mol. Psychiatry. – 2007. – Vol. 12, № 4. – P. 331-359. 235. Sairanen, M. Brain-derived neurotrophic factor and antidepressant drugs have different but coordinated effects on neuronal turnover, proliferation, and survival in the adult dentate gyrus / M. Sairanen, G. Lucas, P. Ernfors, M. Castrén, E. Castrén // J. Neurosci. – 2005. – Vol. 25, № 5. – P. 1089-1094. 236. Sakamoto, F. Centrally administered orexin-A activates corticotropinreleasing factor-containing neurons in the hypothalamic paraventricular nucleus and central amygdaloid nucleus of rats: possible involvement of central orexins on stress-activated central CRF neurons / F. Sakamoto, S. Yamada, Y. Ueta // Regul. Pept. – 2004. – Vol. 118, № 3. – P. 183-191. 237. Salio, C. Neuropeptides as synaptic transmitters / C. Salio, L. Lossi, F. Ferrini, A. Merighi // Cell Tissue Res. – 2006. – Vol. 326, № 2. – P. 583-598. 238. Santarelli, L. Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants / L. Santarelli, M. Saxe, C. Gross, A. Surget, F. Battaglia, S. Dulawa, N. Weisstaub, J. Lee, R. Duman, O. Arancio, C. Belzung, R. Hen // Science. – 2003. – Vol. 301, № 5634. – P. 805-809. 239. Sapio, M.R. Carboxypeptidases in disease: insights from peptidomic studies / M.R. Sapio, L.D. Fricker // Proteomics Clin. Appl. – 2014. – Vol. 8, № 5-6. – P. 327–337. 240. Saydoff, J.A. Neuroendocrine and cardiovascular effects of serotonin: selective role of brain angiotensin on vasopressin / J.A. Saydoff, P.A. Rittenhouse, M. Carnes, J. Armstrong, L.D. Van De Kar, M.S. Brownfield //Am. J. Physiol.– 1996. – Vol. 270, № 3. – E513-521. 142 241. Schmidt, H.D. The role of neurotrophic factors in adult hippocampal neurogenesis, antidepressant treatments and animal models of depressive-like behavior / H.D. Schmidt, R.S. Duman // Behav. Pharmacol. – 2007. – Vol. 18, № 6. – P. 391-418. 242. Schüle, C. Neuroendocrinological mechanisms of actions of antidepressant drugs / C. Schüle // J. Neuroendocrinol. – 2007. – Vol. 19, № 3. – P. 213-226. 243. Shabbir, F. Effect of diet on serotonergic neurotransmission in depression / F. Shabbir, A. Patel, C. Mattison, S. Bose, R. Krishnamohan, E. Sweeney, S. Sandhu, W. Nel, A. Rais, R. Sandhu, N. Ngu, S. Sharma // Neurochem. Int. – 2013. – Vol. 62, № 3. – P. 324-329. 244. Sharma, T.R. Effect of chronic naltrexone administration and its withdrawal on the regional activity of neurons that contain norepinephrine, dopamine and serotonin / T.R. Sharma, W.C. Chan, A.R. Gintzler // Brain Res. –1988. – Vol. 442, № 2. – P. 379-386. 245. Skidgel, R.A. Basic carboxypeptidases: regulators of peptide hormone activity / R.A. Skidgel // Trends Pharmacol. Sci. – 1988. – Vol. 9, № 8. – P. 299304. 246. Skidgel, R.A. Structure and function of human plasma carboxypeptidase N, the anaphylatoxin inactivator / R.A. Skidgel, E.G. Erdös // Int. Immunopharmacol. – 2007. – Vol. 7, № 14. – P. 1888-1899. 247. Song, L. Purification and characterization of carboxypeptidase D, a novel carboxypeptidase E-like enzyme, from bovine pituitary / L. Song, L.D. Fricker // J. Biol. Chem. – 1995. – Vol. 270, № 42. – P. 25007-25013. 248. Spencer, A.E. Glutamatergic dysregulation in pediatric psychiatric disorders: a systematic review of the magnetic resonance spectroscopy literature / A.E. Spencer, M. Uchida, T. Kenworthy, C.J. Keary, J. Biederman // J. Clin. Psychiatry. – 2014. – Vol. 75, № 11. – P. 1226-1241. 249. Stahl, S.M. Essential psychopharmacology. Neuroscientific basis and practical application / S.M. Stahl. – Cambridge University Press, 2008. – 1117 р. 143 250. Stetler, C. Depression and hypothalamic-pituitary-adrenal activation: a quantitative summary of four decades of research / C. Stetler, G.E. Miller // Psychosom. Med. – 2011. – Vol. 73, № 2. – P. 114-126. 251. Stone, E.A. Central alpha1-adrenergic system in behavioral activity and depression / E.A. Stone, D. Quartermain, Y. Lin, M.L. Lehmann // Biochem. Pharmacol. – 2007. – Vol. 73, № 8. – P. 1063-1075. 252. Strand, F.L. Neuropeptides: general characteristics and neuropharmaceutical potential in treating CNS disorders / F.L. Strand // Prog. Drug. Res. – 2003. – Vol. 61. – P. 1-37. 253. Strohle, A. Stress responsive neurohormones in depression and anxiety / A. Strohle, F. Holsboer // Pharmacopsychiatry. – 2003. – Vol. 3. – P. 207-214. 254. Sugrue, M.F. Chronic antidepressant therapy and associated changes in central monoaminergic receptor functioning / M.F. Sugrue // Pharmacol. Ther. – 1983. – Vol. 21, № 1. – P. 1-33. 255. Svenningsson, P. Alterations in 5-HT1B receptor function by p11 in depression-like states / P.Svenningsson, K. Chergui, I. Rachleff, M. Flajolet, X. Zhang, M, El Yacoubi, J.M. Vaugeois, G.G. Nomikos, P. Greengard // Science. – 2006. – Vol. 311, № 5757. – P. 77-80. 256. Svenningsson, P. p11 and its role in depression and therapeutic responses to antidepressants / P. Svenningsson, Y. Kim, J. Warner-Schmidt, Y.S. Oh, P. Greengard // Nat. Rev. Neurosci. – 2013. – Vol. 14, № 10. – P. 673-680. 257. Swaab, D.F. The stress system in the human brain in depression and neurodegeneration / D.F. Swaab, A.M. Bao, P.J. Lucassen // Ageing Res. Rev. – 2005. – Vol. 4, № 2. – P. 141-194. 258. Szafarczyk, A. Further evidence for a central stimulatory action of catecholamines on adrenocorticotropin release in the rat / A. Szafarczyk, F. Malaval, A. Laurent, R. Gibaud, I. Assenmacher // Endocrinology. – 1987. – Vol. 121, №. 3. – P. 883-892. 144 259. Taguchi, S. Dyskinesia-hyperpyrexia syndrome in a patient with Parkinson's disease: a case report / S. Taguchi, J. Niwa, T. Ibi, M. Doyu // Rinsho Shinkeigaku. – 2015. – Vol. 55, № 3. – P. 182-184. 260. Tanaka, J. Angiotensin II reduces serotonin release in the rat subfornical organ area / J. Tanaka, K. Kariya, M. Nomura // Peptides. – 2003. – Vol. 24, № 6. – P. 881-887. 261. Trajkovska, V. Activation of glucocorticoid receptors increases 5-HT2A receptor levels / V. Trajkovska, L. Kirkegaard, G. Krey, A.B. Marcussen, M.S. Thomsen, S. Chourbaji, C. Brandwein, S. Ridder, C. Halldin, P. Gass, G.M. Knudsen, S. Aznar // Exp. Neurol. – 2009. – Vol. 218, № 1. – P. 83-91. 262. Tremblay, P. Catecholaminergic strategies for the treatment of major depression / P. Tremblay, P. Blier // Curr. Drug Targets. – 2006. – Vol. 7, № 2. – P. 149-158. 263. Vacher, C.M. Activation by serotonin and noradrenaline of vasopressin and oxytocin expression in the mouse paraventricular and supraoptic nuclei / C.M. Vacher, P. Fretier, C. Creminon, A. Calas, H. Hardin-Pouzet // J. Neurosci. – 2002. – Vol. 22, № 75. – P. 1513-1522. 264. Valdizan, E.M. Adenylatecyclase activity in postmortem brain of suicide subjects: redused response to beta-adrenergic stimulation / E.M. Valdizan, O. Utierrez, A. Pazos // Biol. Psychiatry. – 2003. – Vol. 54, № 12. – P. 1457-1464. 265. Van de Kar, L.D. 5-HT2A receptors stimulate ACTH, corticosterone, oxytocin, renin, and prolactin release and activate hypothalamic CRF andoxytocinexpressing cells / L.D. Van de Kar, A. Javed, Y. Zhang, F. Serres, D.K. Raap, T.S. Gray // J. Neurosci. – 2001. – Vol. 21, №. 10 – P. 3572-3579. 266. Vasquez, C.E. NMDA receptor dysregulation in chronic state: a possible mechanism underlying depression with BDNF downregulation / C.E. Vasquez, R. Riener, E. Reynolds, G.B. Britton // Neurochem. Int. – 2014. – Vol. 79. – P. 8897. 145 267. Vollmayr, B. Brain-derived-neurotrophic-factor (BDNF) stress response in rats bred for learned helplessness / B. Vollmayr, H. Faust, S. Lewicka, F.A. Henn // Mol. Psychiatry. – 2001. – Vol. 6, № 4. – P. 471-474. 268. Wang, C. Immunohistochemical localization of mu opioid receptor in the marginal division with comparison to patches in the neostriatum of the rat brain / C. Wang, S.Y. Shu, Z. Guo, Y.F. Cai, X. Bao, C. Zeng, B. Wu, Z. Hu, X. Liu // J. Biomed. Sci. – 2011. – Vol. 18 (34). – P. 1-9. 269. Waragai, M. Efficacy of TRH-T for spinocerebellar degeneration-the relation between clinical features and effect of TRH therapy / M. Waragai, K. Ogawara, Y. Takaya, M. Hayashi // Rinsho Shinkeigaku. – 1997. – Vol. 37, № 7. – P. 587594. 270. Watanabe, K. Effect of antidepressants on brain-derived neurotrophic factor (BDNF) release from platelets in the rats / K. Watanabe, E. Hashimoto, W. Ukai, T. Ishii, T. Yoshinaga, T. Ono, M. Tateno, I. Watanabe, T. Shirasaka, S. Saito, T. Saito // Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. – 2010. – Vol. 34, № 8. – P. 1450-1454. 271. Werner, F.M. Classical neurotransmitters and neuropeptides involved in major depression in a multi-neurotransmitter system: a focus on antidepressant drugs / F.M. Werner, R. Covenas // Curr. Med. Chem. – 2013. – Vol. 20, № 38. – P. 4853-4858. 272. Witkin, J.M. The biology of Nociceptin/Orphanin FQ (N/OFQ) related to obesity, stress, anxiety, mood, and drug dependence / J.M. Witkin, M.A. Statnick, L.M. Rorick-Kehn, J.E. Pintar, M. Ansonoff, Y. Chen, R.C. Tucker, R. Ciccocioppo // Pharmacol. Ther. – 2014. – Vol. 141, № 3. – P. 283-299. 273. Wu, C.K. Demonstrating the pharmacogenetic effects of angiotensinconverting enzyme inhibitors on long-term prognosis of diastolic heart failure / C.K. Wu, J.L. Luo, C.T. Tsai, Y.T. Huang, C.L. Cheng, J.K. Lee, L.Y. Lin, J.W. Lin, J.J. Hwang, F.T. Chiang // Pharmacogenomics J. – 2010. – Vol. 10, № 1. – P. 46-53. 146 274. Yang, X. Effects of norepinephrine on galanin expression in dorsal root ganglion neurons in vitro / X. Yang, Z. Liu, Z. Li // Curr. Ther. Res. Clin. Exp. – 2009. – Vol. 70, №. 1. – P. 19-28. 275. Yoshida-Pliroi, M. Intranasal administration of ACTH(l-24) stimulates catecholamine secretion / M. Yoshida-Pliroi, Y. Tsuchida, G. Yoshino, N. Hiroi // Plorm. Metab.Res. – 2005. – Vol. 37, № 8. – P. 489-493. 276. Yoshitake, T. Enhanced hippocampal noradrenaline and serotonin release in galanin-overexpressing mice after repeated forced swimming test / T. Yoshitake,F.H. Wang, E. Kuteeva, K. Holmberg, M. Yamaguchi, J.N. Crawley, R. Steiner, T. Bartfai, S.O. Ogren, T. Hökfelt, J. Kehr // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2004. – Vol. 101, № 1. – P. 354-359. 277. You, Z.B. Modulation of neurotransmitter release by cholecystokinin in the neostriatum and substantia nigra of the rat: regional and receptor specificity / Z.B. You, M. Herrera-Marschitz, E.Pettersson, I. Nylander, M. Goiny, H.Z. Shou, J. Kehr, O. Godukhin, T. Hökfelt, L. Terenius, U. Ungerstedt // Neuroscience. – 1996. – Vol. 74, № 3. – P. 793-804. 278. Zarate, C.A.Jr. Regulation of cellular plasticity cascades in the pathophysiology and treatment of mood disorders: role of the glutamatergic system / C.A.Jr. Zarate, J. Du, J. Quiroz, N.A. Gray, K.D. Denicoff, J. Singh, D.S. Charney, H.K. Manji // Ann. NY Acad. Sci.– 2004. – Vol. 1003. – P. 273-291. 279. Zhang, X. Peptidomics of Cpe(fat/fat) mouse brain regions: implications for neuropeptide processing / X. Zhang, F.Y. Che, I. Berezniuk, K. Sonmez, L. Toll, L.D. Fricker // J. Neurochem. – 2008. – Vol. 107, № 6. – P. 1596-1613. 280. Zhao, X. The role of galanin system in modulating depression, anxiety, and addiction-like behaviors after chronic restraint stress / X. Zhao, R.R. Seese, K. Yun, T. Peng, Z. Wang // Neuroscience. – 2013. – Vol. 246. – P. 82-93. 281. Zheng, M. The developmental expression in rat of proteases furin, PC1, PC2, and carboxypeptidase E: implications for early maturation of proteolytic processing 147 capacity / M. Zheng, R.D. Streck, R.E. Scott, N.G. Seidah, J.E. Pintar // J. Neurosci. – 1994. – Vol. 14, № 8. – P. 4656-4673. 282. Zhou, A. Proteolytic processing in the secretory pathway / A. Zhou, G. Webb, X. Zhu, D.F. Steiner // J. Biol. Chem. – 1999. – Vol. 274. – P. 2074520748. 283. Ziołkowska, N. Neuropeptide Y as a presynaptic modulator of norepinephrine release from the sympathetic nerve fibers in the pig pineal gland / N. Ziołkowska, B. Lewczuk, B. Przybylska-Gornowicz // Pol. J. Vet. Sci. – 2015. – Vol. 18, № 1. – P. 53-61. 284. Zou, K. Angiotensin-converting enzyme as a potential target for treatment of Alzheimer's disease: inhibition or activation? / K. Zou, M. Michikawa // Rev. Neurosci. – 2008. – Vol. 19, № 4-5. – P. 203-212.
