АКТГ (Адренокортикотропный гормон) (ACTH [Adrenocorticotropic

ACTH [Adrenocorticotropic Hormone] ELISA, Biomerica, Inc.
1
_____________________________________________________________________________________________________
Регистрационное удостоверение ФС №2008/01111 от 26.02.2008 г
АКТГ (Адренокортикотропный гормон)
(ACTH [Adrenocorticotropic Hormone] ELISA)
Иммуноферментный тест для количественного определения адренокортикотропного гормона в плазме
крови.
Номер по каталогу: 7023
Набор рассчитан на 96 определений
1. НАЗНАЧЕНИЕ
ИФА тест Biomerica АКТГ (Biomerica ACTH ELISA) предназначен для количественного определения
адренокортикотропного гормона в плазме крови человека. Только для in vitro диагностики.
2. ВВЕДЕНИЕ
АКТГ (адренокортикотропный гормон, кортикотропин) является пептидным гормоном с молекулярным
весом 4500, состоящим из 39 аминокислот. Он секретируется гипофизом и регулирует продукцию
стероидных гормонов корой надпочечников. Секреция АКТГ передней долей гипофиза контролируется как
классическим механизмом обратной связи, так и центральной нервной системой посредством стрессорных
медиаторов.1 Различные типы стресса или боли воспринимаются при повышении уровней регулируемой
мозгом секреции гипоталамического нейросекреторного гормона, кортикотропин-высвобождающего
гормона (corticotropin releasing hormone, CRH), состоящего из 41 аминокислоты. CRH стимулирует секрецию
гипофизом АКТГ. Вторым пептидом, контролирующим секрецию АКТГ, является вазопрессин (AVP).
Выделение вазопрессина также стимулируется стрессом и оказывает синергетический эффект совместно с
CRH, усиливая секрецию АКТГ в систему кровообращения гипофиза. АКТГ увеличивает синтез и
высвобождение всех стероидов надпочечников, альдостерона, кортизола и андрогенов надпочечников. Это
главный модулятор кортизола, наиболее важного глюкокортикоида человека. При повышении уровня
кортизола в крови высвобождение АКТГ ингибируется непосредственно на уровне гипофиза. Посредством
этого же механизма снижение уровней кортизола приводит к повышению уровней АКТГ. 2,3,4,5
Биологически активный АКТГ образуется при расщеплении большой молекулы предшественника, проопиомеланокортина (РОМС). В структуре этой молекулы содержатся аминокислотные последовательности
АКТГ, про-АКТГ, β-меланоцитостимулирующего гормона, липотропина, а также эндорфина и энкефалинов.
Поскольку реакционоспособность в иммуноанализах предопределяется антигенной структурой, а не
биологической функцией, в обычной тест-системе АКТГ РИА выявляется реакция с РОМС, про-АКТГ, АКТГ
и некоторыми фрагментами АКТГ. 5
Секреция АКТГ, как и других гипофизарных гормонов, происходит пульсирующе. Небольшие выбросы
складываются в характерные суточные колебания большей амплитуды. У здоровых людей концентрация
АКТГ достигает пика ранним утром (6:00 – 8:00 часов), а минимума – в поздние дневные часы и в начале
периода сна. Из-за этого суточного ритма принято брать образцы плазмы крови для определения АКТГ
между 8:00 и 10:00 часами. Однако для дифференцировки пациентов с болезнью Кушинга и здоровых
людей предпочтительно использовать образцы плазмы, взятые вечером (16:00 – 18:00 часов). При болезни
Кушинга и синдроме эктопического АКТГ суточные колебания секреции АКТГ обычно отсутствуют. Стресс
также может перекрыть суточные колебания.
3. КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
Определение концентрации АКТГ в плазме крови используется для дифференциальной диагностики
гипофизарной болезни Кушинга, болезни Аддисона, гипофизарных опухолей, автономно продуцирующих
АКТГ (например, синдром Нельсона), гипопитуитаризма с недостаточностью АКТГ и синдрома
эктопического АКТГ. 5,6,7,8,9,10
Синдром Кушинга возникает под действием избытка глюкокортикоидов. Во всех случаях синдрома Кушинга,
за исключением лечения глюкокортикоидами, происходит увеличение концентрации кортизола в суточной
моче. Наиболее часто причиной синдрома Кушинга является двусторонняя гиперплазия надпочечников изза гиперсекреции гипофизарного АКТГ (болезнь Кушинга) при аденоме гипофиза или кортикотропной
гиперплазии. 5,6,7,8,9,10 Лабораторная диагностика болезни Кушинга основывается на следующем: (1)
понижение концентрации АКТГ и кортизола в плазме крови при введении высоких доз (2,0 мг каждые 6 ч х
8) дексаметазона; (2) отсутствие подавления АКТГ и кортизола при введении низких доз (0,5 мг каждые 6 ч
х 8 или 1 мг в 23:30 часа) дексаметазона; (3) больший, чем в норме, ответ на стимуляцию метирапоном
(metyrapone) (метопироном, Metopirone) и нормальные или повышенные уровни АКТГ в плазме крови4.
______________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО “АНАЛИТИКА”, Москва, 2010
Тел.: 737-0363, Факс: 737-0365, E-mail: info@analytica.ru
ACTH [Adrenocorticotropic Hormone] ELISA, Biomerica, Inc.
2
_____________________________________________________________________________________________________
Если синдром Кушинга вызван первичной аномалией надпочечников (аденомой или карциномой), то
надпочечник действует независимо от АКТГ, и секреция гипофизарного АКТГ подавляется. 5,6,7,8,9,10 Таким
образом, не будет ответа на супрессию дексаметазоном или стимуляцию метирапоном. Этот тип синдрома
Кушинга характеризуется очень низкими или неопределяемыми уровнями АКТГ.
Следовательно, измерение концентрации АКТГ в плазме крови способствует дифференциальной
диагностике гипофизарного синдрома Кушинга. У пациентов с опухолями надпочечников уровни АКТГ
низкие. Высокие концентрации АКТГ наблюдаются у пациентов с синдромом эктопического АКТГ. Пациенты
с двусторонней гиперплазией надпочечников будут иметь уровни АКТГ непропорционально высокие для
имеющейся у них степени гиперкортизолизма, который должен подавлять АКТГ. Однако в большинстве
случаев концентрации АКТГ будут в пределах нормальных значений.
Недостаточность коры надпочечников или недостаточная выработка кортизола может быть вызвана
деструкцией коры надпочечников или аномалиями гипофиза или гипоталамуса. Результатом является
недостаточная продукция и секреция АКТГ. 5,6,7,8,9,10 Для первичной недостаточности коры надпочечников,
болезни Аддисона, свойственно значительное повышение уровней АКТГ в плазме крови и неспособность
надпочечников отреагировать на стимуляцию экзогенным АКТГ. Гипопитуитаризм с пониженным уровнем
АКТГ, являющийся вторичной недостаточностью коры надпочечников, характеризуется низкими
концентрациями АКТГ и кортизола в плазме крови и субнормальным, хотя обычно регистрируемым,
ответом надпочечников на стимуляцию синтетическим АКТГ (кортрозином, Cortrosyn®). Если для постановки
диагноза требуется гипогликемический стресс или стимуляция метирапоном, реакция АКТГ и кортизола
бывает ниже, чем в норме.
Агрессивные и инвазивные продуцирующие АКТГ гипофизарные опухоли, обнаруживаемые до или вслед за
двусторонней адреналэктомией при болезни Кушинга (синдром Нельсона), характеризуются развитием
Аддисоновой пигментации. Часто это происходит у пациентов с удаленными надпочечниками,
принимающими адекватную глюкокортикоидзамещающую терапию. У этих пациентов уровни АКТГ в плазме
крови значительно повышены, ответ на супрессию дексаметазоном снижен.
4. ПРИНЦИП МЕТОДА
Тест Biomerica АКТГ (Biomerica ATCH ELISA) является твердофазным иммуноферментным анализом (ИФА)
«сэндвич»-типа, и предназначен для определения концентрации биологически активной цепи АКТГ,
состоящей из 39 аминокислот. В тесте используются козьи поликлональные антитела к АКТГ человека,
очищенные с помощью аффинной хроматографии, и мышиные моноклональные антитела к АКТГ человека,
специфичные к строго определенным областям молекулы АКТГ. Одному, биотинилированному, антителу
придано свойство связываться только с С-концевыми 34-39 аминокислотами молекулы АКТГ. Другому
антителу придано свойство связываться только с центральной областью и N-концевыми 1-24
аминокислотами молекулы АКТГ; это антитело мечено пероксидазой из корня хрена (HRP) для проявления.
Лунки со стрептавидином - биотинилированные антитела анти-АКТГ (34-39) – АКТГ –
конъюгированные с пероксидазой антитела анти-АКТГ (1-24)
В данном анализе калибраторы, контроли или образцы плазмы крови пациентов одновременно инкубируют
с конъюгированными с ферментом антителами и меченными биотином антителами в лунках
микропланшета, покрытыми стрептавидином. После инкубации лунки планшета промывают для удаления
несвязавшихся компонентов. Фермент, связавшийся с твердой фазой, инкубируют с субстратом,
тетраметилбензидином (ТМБ). Реакцию останавливают добавлением в лунки кислотного стоп-реагента, при
этом цвет раствора становится желтым. Интенсивность желтого окрашивания прямо пропорциональна
концентрации АКТГ в образце. По калибраторам строится кривая зависимости оптической плотности от
концентрации АКТГ. По этой калибровочной кривой определяют концентрацию кальцитонина в контролях и
исследуемых образцах.
5. МАТЕРИАЛЫ И РЕАГЕНТЫ
ИФА набор Biomerica АКТГ содержит реагенты, достаточные для выполнения 96 определений (включая
калибраторы и контроли).
______________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО “АНАЛИТИКА”, Москва, 2010
Тел.: 737-0363, Факс: 737-0365, E-mail: info@analytica.ru
ACTH [Adrenocorticotropic Hormone] ELISA, Biomerica, Inc.
3
_____________________________________________________________________________________________________
Необходимые реагенты, входящие в состав набора
Компоненты набора
RGT 1 – Реагент 1
RGT 2 – Реагент 2
RGT А
Реагент А
RGT В
Реагент В
SOLN – Стоп-реагент
PLA – Микропланшет
CAL – Калибраторы
A: 0 пг/мл
B:
C: Точные концентрации
D: указаны на этикетках
E: флаконов
F:
CTRL – Контроли 1 и 2
Точные диапазоны
концентраций указаны на
этикетках флаконов
Описание
Биотинилированные антитела к АКТГ (аффинно
очищенные козьи антитела к АКТГ человека)
Меченные пероксидазой (ферментом) антитела к
АКТГ (мышиные моноклональные антитела к АКТГ
человека)
Промывочный раствор, концентрат (солевой раствор
с добавкой поверхностно-активного вещества)
Субстрат ТМБ (тетраметилбензидин)
Количество
1 х 2,7 мл
Стоп-реагент (1 N раствор серной кислоты)
Рамка со стрипами, покрытыми стрептавидином
1 х 20 мл
12 х 8-луночных
стрипов
1 х 4 мл для
калибратора 0
Лиофилизованный синтетический человеческий
АКТГ (за исключением калибратора 0).
Калибратор 0 (раствор БСА в лошадиной сыворотке)
в жидком виде, готов к использованию. Все
остальные калибраторы содержат раствор
синтетического человеческого АКТГ (1-39) с БСА в
лошадиной сыворотке
Лиофилизованные. 2 уровня. Растворы
синтетического человеческого АКТГ (1-39) с БСА в
лошадиной сыворотке
1 х 2,7 мл
1 х 30 мл
1 х 15 мл
1 х 2 мл для
остальных
калибраторов
1 х 2 мл каждого
уровня
Необходимое оборудование и материалы, не входящие в состав набора
•
•
•
•
Планшетный фотометр.
Устройство для промывки микропланшетов (при отсутствии устройства возможна ручная промывка).
Аттестованные автоматические пипетки, позволяющие вносить объемы 25, 200, 100 и 150 мкл.
Многоканальная пипетки, позволяющая вносить объемы 25, 100 и 150 мкл (желательно).
6. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Хотя все реагенты данного набора специально разработаны так, чтобы они не содержали компонентов
крови человека, исследуемые образцы крови пациентов могут быть положительными по антигенам
гепатитов В и С или антителам к ВИЧ, их следует считать потенциально инфекционно опасными. С ними
нужно обращаться, соблюдая необходимые меры предосторожности, как со всеми непроверенными
образцами.
Стоп-реагент содержит 1 N раствор серной кислоты. Это сильная кислота. Хотя в наборе используется
разведенная кислота, тем не менее, обращаться с ней следует осторожно. Она способна вызвать ожоги,
поэтому при работе с нею необходимо надевать защитные перчатки и очки, а также соответствующую
защитную одежду. При ее расплескивании немедленно промойте поверхности большим количеством воды.
Не вдыхайте ее пары, избегайте ингаляций кислоты.
7. ВЗЯТИЕ И ХРАНЕНИЕ ОБРАЗЦОВ
Определение АКТГ следует проводить в образцах плазмы крови, взятой в ЭДТА. Для проведения анализа в
дубликатах требуется 400 мкл плазмы крови, взятой в ЭДТА. Возьмите кровь из вены в пробирки,
содержащие ЭДТА. Тщательно отделите фракцию плазмы, предпочтительно на охлаждающей центрифуге.
Образцы хранят при температуре минус 20°С и ниже. Можно хранить образцы взятой на ЭДТА плазмы при
температуре 2–8оС до 8 часов. Замороженные при температуре минус 20°С образцы взятой на ЭДТА
плазмы стабильны до 4 месяцев.
8. ПРИГОТОВЛЕНИЕ И ХРАНЕНИЕ РЕАГЕНТОВ
Все компоненты набора, за исключением концентрата промывочного раствора и стоп-реагента,
необходимо хранить при температуре 2 – 8оС.
______________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО “АНАЛИТИКА”, Москва, 2010
Тел.: 737-0363, Факс: 737-0365, E-mail: info@analytica.ru
ACTH [Adrenocorticotropic Hormone] ELISA, Biomerica, Inc.
4
_____________________________________________________________________________________________________
1.
2.
3.
Все реагенты, за исключением калибраторов (кроме 0), контролей набора и концентрата
промывочного раствора, готовы к использованию. Все компоненты набора, за исключением
концентрата промывочного раствора, необходимо хранить при температуре 2 – 8оС. Концентрат
промывочного раствора следует хранить при комнатной температуре до разведения во избежание
выпадения осадка.
В каждый флакон с калибратором, кроме 0 (калибраторы B – F), а также во флаконы с контролями
набора 1 и 2 внести по 2 мл дистиллированной или деионизированной воды и перемешать. Оставьте
флаконы на 10 минут, затем тщательно перемешайте, осторожно переворачивая флаконы, до
полного растворения их содержимого. После растворения используйте калибраторы и контроли
как можно скорее. Оставшееся содержимое флаконов с калибраторами и контролями
заморозьте (при температуре минус 20°С) как можно скорее после использования.
Стандарты и контроли стабильны при температуре минус 20°С в течение 6 недель после
растворения и выдерживают 3 цикла замораживания-оттаивания при соблюдении рекомендаций по
обращению с ними, описанных в разделе «Замечания по процедуре исследования».
Реагент А; Промывочный раствор, концентрат. Тщательно перемешайте содержимое флакона с
концентратом промывочного раствора. Если во флаконе с концентратом выпал осадок из-за
хранения при пониженной температуре, такой как 4оС, растворите его, поместив флакон в водяную
баню при 37оС или в термостат, взбалтывая или перемешивая. Добавьте концентрат промывочного
раствора (30 мл) к 570 мл дистиллированной или деионизированной воды и перемешайте.
Разведенный рабочий раствор промывочного концентрата стабилен с течение 90 дней при хранении
при комнатной температуре.
9. ПРОЦЕДУРА ИССЛЕДОВАНИЯ
1.
Вставить в рамку-держатель необходимое количество стрипов, покрытых стрептавидином. При
расчете количества лунок следует учесть лунки, необходимые для внесения всех шести (6)
КАЛИБРАТОРОВ АКТГ от A до F (точные концентрации АКТГ указаны на этикетках флаконов),
контролей набора и исследуемых образцов плазмы. Составить схему или пронумеровать лунки.
2.
Внести с соответствующие лунки стрипов по 200 мкл образцов. Оставшиеся калибраторы и
контроли заморозить (при температуре минус 20°С) как можно скорее после использования.
3.
Внести во все лунки, уже содержащие образцы, по 25 мкл Реагента 1 (биотинилированных антител).
4.
Внести во все (те же самые) лунки по 25 мкл Реагента 2 (меченных ферментом антител).
Закрыть планшет(ы) алюминиевой фольгой или крышкой для предотвращения попадания света.
Поместить планшет(ы) на орбитальный шейкер или вращающую мешалку при 170 + 10 об/мин и
инкубировать в течение 4 + 0,5 часов при комнатной температуре (22-28оС).
5.
Удалить полностью содержимое лунок. Затем тщательно промыть их пять (5) раз с помощью
автоматического устройства для промывки микропланшетов (режим промывка/отсасывание). Каждый
раз следует вносить по 0,35 мл разведенного рабочего раствора промывочного концентрата
(приготовленного из Реагента А) в каждую лунку.
6.
Внести во все лунки по 150 мкл Реагента В (субстрата ТМБ).
7.
Закрыть планшет(ы) алюминиевой фольгой или крышкой для предотвращения попадания света.
Поместить планшет(ы) на орбитальный шейкер или вращающую мешалку при 170 + 10 об/мин и
инкубировать в течение 30 + 5 минут при комнатной температуре (22-28оС).
8.
Внести во все лунки по 100 мкл стоп-реагента. Осторожно перемешать содержимое лунок планшета.
9.
Измерить оптическую плотность (ОП) раствора не позже, чем через 10 минут с помощью планшетного
спектрофотометра при длине волны 450 нм против 250 мкл дистиллированной или деионизированной
воды.
Снова измерить оптическую плотность раствора при длине волны 405 нм
против
дистиллированной или деионизированной воды.
Примечание: второе измерение оптической плотности необходимо для повышения аналитической
точности измерений по калибровочной кривой для значений, лежащих в области высшего
калибратора (обычно около 500 пг/мл). Таким образом, измерение концентрации АКТГ в образце
плазмы крови пациента с концентрациией >150 пг/мл проводится по калибровочной кривой,
построенной с использованием длины волны 405 нм, а не длины волны с максимумом поглощения,
поскольку концентрации АКТГ исследуемого образца эквивалентны концентрации наивысшего
калибратора. В целом, концентрации АКТГ в образцах плазмы крови пациентов и в контролях
следует измерять при 450 нм, если концентрации АКТГ менее 150 пг/мл. Если концентрации АКТГ
превышают 150 пг/мл, следует проводить интерполяцию с использованием длины волны 405 нм.
10. Используя значения оптических плотностей, полученные на предыдущем этапе, построить
калибровочную кривую с помощью режимов кубического сплайна, 4-параметрической логистики или
интерполяции от точки к точке и вычислить концентрацию АКТГ.
______________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО “АНАЛИТИКА”, Москва, 2010
Тел.: 737-0363, Факс: 737-0365, E-mail: info@analytica.ru
ACTH [Adrenocorticotropic Hormone] ELISA, Biomerica, Inc.
5
_____________________________________________________________________________________________________
ЗАМЕЧАНИЯ ПО ПРОЦЕДУРЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
• АКТГ 1-39 – очень лабильная молекула. Проводите анализ сразу после растворения
или
размораживания всех калибраторов, контролей или исследуемых образцов плазмы крови пациентов.
• Рекомендуется исследовать все калибраторы, контроли или образцы сыворотки крови пациентов в
дубликатах. Среднее арифметическое значение оптической плотности дубликатов следует затем
использовать для обработки данных и вычисления результатов.
• Образцы следует вносить в лунки, избегая образования пузырьков воздуха. Для этого рекомендуется
использовать способ «обратного пипетирования», описанный производителем на вкладыше к
автоматической пипетке.
• Образцы плазмы крови пациентов с концентрацией, превышающей концентрацию АКТГ в наивысшем
калибраторе (калибраторе F), которая составляет около 500 пг/мл (точная концентрация указана на
этикетке флакона), могут быть разведены калибратором А (0 пг/мл) и исследованы снова. Полученный
результат умножают на фактор разведения.
• Не допускается использование реагентов из наборов других серий.
• Предпочтительно смешать в равных объемах необходимое для анализа количество Реагента 1
(биотинилированных антител) и Реагента 2 (меченных ферментом антител) в чистом желтом флаконе.
Затем внести в каждую лунку по 50 мкл смеси антител. Этот альтернативный способ заменяет пункты
(3) и (4). Вслед за этим планшет инкубируют на орбитальном шейкере.
• При перемешивании избегайте выплескивания реагентов из лунок. Это влияет на воспроизводимость и
точность анализа.
10. РАСЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ
Расчет вручную
Для измерения при длине волны 450 нм построить калибровочную кривую, используя имеющиеся в
1.
наборе первые пять калибраторов, т.е. калибраторы A, B, C, D и E. Для измерения при длине волны
405 нм построить другую калибровочную кривую, используя три калибратора с самой высокой
концентрацией, т.е. калибраторы D, E и F.
2.
Уточнить концентрацию каждого калибратора, указанную на этикетке флакона в пг/мл. На
миллиметровой бумаге отложить значения концентраций АКТГ в калибраторах на оси Х, значения
соответствующих оптических плотностей - на оси Y.
3.
Соединить соседние точки на графике прямой линией. Такой математический алгоритм обычно
называется построением «от точки к точке». Вычислить концентрацию АКТГ в образце, откладывая
значение оптической плотности на оси Y и находя соответствующее значение концентрации на оси Х.
При концентрации АКТГ до 150 пг/мл оптическую плотность исследуемых образцов плазмы крови и
контрольных образцов измеряют при длине волны 450 нм, При концентрации АКТГ выше 150 пг/мл
следует проводить интерполяцию концентраций, используя для измерения оптической плотности
длину волны 405 нм.
Автоматический расчет
Оптимальные результаты обычно получают при использовании компьютерных программ с применением
кубического сплайна, 4 PL (4-параметрической логистики) или построения от точки к точке.
Пример расчета при 450 нм (ОП в рядах против дистиллированной или деионизированной воды)
Концентрация
АКТГ, пг/мл,
результат в
распечатке
Калибратор A
0,020
0,018
0,019
0
Калибратор B
0,077
0,074
0,076
5
Калибратор C
0,221
0,229
0,225
18
Калибратор D
0,624
0,692
0,685
55
Калибратор E
1,802
1,934
1,868
165
Контроль 1
0,417
0,398
0,408
33,5
33,5
Контроль 2
2,868
2,774
2,821
> 150
*
Образец 1
0,072
0,078
0,075
4,9
4,9
Образец 2
0,185
0,177
0,181
14,0
14,0
Образец 3
0,495
0,491
0,493
40,8
40,8
Образец 4
2,090
2,122
2,106
> 150
*
* Поскольку концентрация АКТГ > 150 пг/мл, рекомендуется использовать данные, полученные при длине
волны 405 нм, из таблицы Пример расчета, приведенной ниже.
Лунки
планшета
1-е измерение,
ОП
2-е измерение,
ОП
Среднее
значение, ОП
Концентрация
АКТГ, пг/мл
______________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО “АНАЛИТИКА”, Москва, 2010
Тел.: 737-0363, Факс: 737-0365, E-mail: info@analytica.ru
ACTH [Adrenocorticotropic Hormone] ELISA, Biomerica, Inc.
6
_____________________________________________________________________________________________________
Пример расчета при 405 нм (ОП в рядах против дистиллированной или деионизированной воды)
Концентрация
АКТГ, пг/мл,
результат в
распечатке
Калибратор A
0,011
0,008
0,0095
0
Калибратор D
0,032
0,032
0,032
55
Калибратор E
0,074
0,081
0,078
165
Калибратор F
1,838
1,817
1,828
500
Контроль 1
0,138
0,132
0,135
< 150
¶
Контроль 2
0,921
0,894
0,908
256
256
Образец 1
0,030
0,032
0,031
< 150
¶
Образец 2
0,068
0,062
0,065
< 150
¶
Образец 3
0,165
0,159
0,162
< 150
¶
Образец 4
0,663
0,677
0,670
188
188
Для образцов со значением концентрации АКТГ < 150 пг/мл рекомендуется использовать данные,
полученные при длине волны 450 нм, из таблицы Пример расчета, приведенной выше. При таком способе
получают результаты с оптимальной чувствительностью данного анализа.
Лунки
планшета
1-е измерение,
ОП
2-е измерение,
ОП
Среднее
значение, ОП
Концентрация
АКТГ, пг/мл
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти данные приведены только с иллюстративными целями, их не следует
использовать вместо данных, получаемых во время анализа.
11. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Контрольные образцы плазмы или пулы плазмы следует вводить в каждый анализ наряду с калибраторами
и исследуемыми образцами плазмы крови пациентов. Правильность результатов анализа контрольных
образцов следует оценивать с помощью соответствующих статистических методов. Если концентрации
АКТГ в одном или более образцах контроля качества выходят за рамки рассчитанных диапазонов,
результаты анализа образцов плазмы крови пациентов могут оказаться неправильными.
12. ОГРАНИЧЕНИЯ ТЕСТА
Набор Biomerica АКТГ ИФА не дает прозонного эффекта до концентрации АКТГ (внесенного в образцы)
20 000 пг/мл. Несмотря на это, для получения верных результатов образцы с уровнем АКТГ, превышающем
концентрацию наивысшего калибратора, следует развести и исследовать повторно.
Как и в случае любого аналита, использующегося для целей диагностики, результаты анализа АКТГ всегда
должны интерпретироваться в совокупности с другими клиническими данными и результатами других
лабораторных исследований.
13. ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
Концентрацию АКТГ измеряли с помощью набора Biomerica АКТГ ИФА у 134 здоровых жителей США.
Полученные значения варьировали от 7,0 до 63 пг/мл. На основании статистических тестов асимметрии и
эксцесса при логарифмической трансформации установлено, что для популяции характерно нормальное
или Гауссово распределение, что и показано на гистограмме. Геометрическая средняя + 2 стандартных
отклонения от средней составила от 6,17 до 58,2 пг/мл.
14. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Правильность
300 образцов плазмы крови пациентов с концентрацией АКТГ от 1,0 до 640 пг/мл исследовали предыдущей
версией набора Biomerica АКТГ ИФА и новым улучшенным набором Biomerica АКТГ ИФА. С помощью
линейно-регрессионного анализа получены следующие статистические значения:
Biomerica ИФА = 1,02 -1,58 пг/мл
r = 0,995 N = 300
Чувствительность
Чувствительность или минимально определяемую концентрацию анализа оценивали как наименьшее
значение концентрации, которое можно отличить от нуля при 95% доверительном интервале. Набор
Biomerica АКТГ ИФА имеет чувствительность 0,22 пг/мл.
______________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО “АНАЛИТИКА”, Москва, 2010
Тел.: 737-0363, Факс: 737-0365, E-mail: info@analytica.ru
ACTH [Adrenocorticotropic Hormone] ELISA, Biomerica, Inc.
7
_____________________________________________________________________________________________________
Точность и воспроизводимость
Точность набора Biomerica АКТГ ИФА оценивали по коэффициенту вариации в пределах одной постановки,
проводя 25 повторных исследований двух образцов плазмы крови с различной концентрацией АКТГ.
Вариабельность в пределах постановки
Образец
А
В
Среднее значение (пг/мл)
42,2
269,9
N
25
25
Коэффициент вариации, %
6,71
2,27
Общую точность набора Biomerica АКТГ ИФА оценивали по коэффициенту вариации между постановками,
проводя исследования двух образцов плазмы крови с различной концентрацией АКТГ в 21 разной
постановке тремя разными сериями наборов реагентов на протяжении четырехнедельного периода, причем
анализы ставили трое лаборантов.
Вариабельность между постановками
Образец
А
В
Среднее значение (пг/мл)
42,3
287,8
N
21
21
Коэффициент вариации, %
7,1
6,9
Специфичность и перекрестная реактивность
Перекрестную реактивность набора Biomerica АКТГ ИФА определяли, добавляя различные реагенты в
стандарт АКТГ. Получены следующие результаты:
Добавляемый
реагент
АКТГ (1-24)
АКТГ (18-39)
α-MSH
ß-Эндорфин
Концентрация
добавляемого
реагента
Концентрация
АКТГ без
добавляемого
реагента
(пг/мл)
Концентрация
АКТГ с
добавляемым
реагентом
(пг/мл)
Изменения
концентрации АКТГ
(пг/мл)
%
перекрестной
реакции
100 000 пг/мл
10 000 пг/мл
1000 пг/мл
200 пг/мл
5 000 пг/мл
2000 пг/мл
500 пг/мл
100 000 пг/мл
10 000 пг/мл
1000 пг/мл
200 пг/мл
100 000 пг/мл
50 000 пг/мл
62,9
62,9
62,9
62,9
61,2
61,2
61,2
88,1
88,1
88,1
88,1
73,8
73,8
0,8
5,05
28,6
43,4
2
13,6
24,3
65,7
69,1
70,7
74,8
60,5
56,9
-62,1
-57,85
-34,3
-19,5
-59,2
-47,6
-36,9
-22,4
-19
-17,4
-13,3
-13,3
-16,9
-0,06%
-0,58%
-3,43%
-9,75%
-1,2%
-2,4%
-7,4%
-0,02%
-0,19%
-1,7%
-6,7%
-0,01%
-0,03%
Открытие
Для теста на открытие к четырем различным образцам плазмы крови пациентов добавляли разные
количества АКТГ. Результаты приведены в таблице:
Образец
плазмы
Эндогенный
АКТГ
(пг/мл)
A
13,3
B
17,7
C
14,8
D
27,1
Добавленный
АКТГ
(пг/мл)
50,0
100,0
50,0
100,0
Ожидаемые
значения
(пг/мл)
63,3
113,5
67,7
117,7
Измеренные
значения
(пг/мл)
62,4
116
62,1
121,7
50,0
100,0
50,0
100,0
64,8
114,8
77,1
127,1
64,2
114,2
67,4
119
Открытие
(%)
99%
102%
92%
103%
99%
99%
87%
94%
Кинетика анализа
Для определения, имеется ли какой-либо кинетический сдвиг между началом и концом анализа, три пула
плазмы крови с разным количеством добавленного АКТГ последовательно вносили в лунки одного
______________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО “АНАЛИТИКА”, Москва, 2010
Тел.: 737-0363, Факс: 737-0365, E-mail: info@analytica.ru
ACTH [Adrenocorticotropic Hormone] ELISA, Biomerica, Inc.
8
_____________________________________________________________________________________________________
цельного или стипованного (состоящего из двенадцати 8-луночных стрипов) микропланшета на протяжении
анализа.
Линейность при разведении образца плазмы крови пациента: параллелизм
Пять образцов плазмы крови пациентов разводили калибратором А (нулевым калибратором). Результаты в
пг/мл приведены ниже:
Образец
A
B
C
D
Е
Разведение
Неразведенный
1:2
1:4
1:8
Неразведенный
1:2
1:4
1:8
Неразведенный
1:2
1:4
1:8
Неразведенный
1:2
1:4
1:8
Неразведенный
1:2
1:4
1:8
Ожидаемые
значения
(пг/мл)
144
75
37,5
234
117
58,5
135
67,5
333,75
168
84
42
226
113
56,5
Измеренные
значения
(пг/мл)
288
150
70,9
35,7
468
278
135
65,5
270
146
68
33,5
336
149
83
47
452
268
126
68,9
% Измеренные ÷
ожидаемые
значения
104%
95%
95%
119%
115%
112%
108%
101%
99%
89%
99%
112%
119%
112%
122%
15. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Список литературы приведен в оригинале инструкции на английском языке.
Внимание! Перевод сделан с английского оригинала инструкции. Перед постановкой исследования
сверьте номер и дату издания вложенного в набор оригинала с указанными в настоящем переводе (см.
внизу справа). При несовпадении номеров или дат обратитесь в «Аналитику» за новым переводом, либо
руководствуйтесь оригиналом инструкции.
ACTH-7023.doc
9/13/2010 3:23:00 PM
Оригинал: ACTH ELISA
67023-02_eng.doc
August 2010
______________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО “АНАЛИТИКА”, Москва, 2010
Тел.: 737-0363, Факс: 737-0365, E-mail: info@analytica.ru