1.3. Эволюционная генетика прокариот Дерево жизни

1.3. Эволюционная генетика прокариот
Дерево жизни
Происхождение жизни. Гипотеза «РНК-мира»
Молекулярные часы эволюции
Эндосимбиотическая теория
Сравнительная организация генома Архей, Эубактерий и Эукариот
Эволюционная генетика прокариот
Эволюция жизни – процесс, стартовавший на планете около 4 млрд. лет назад,
который привел к возникновению первых протоклеток, способных к размножению.
Дальнейшее развитие привело к возникновению 3 групп, называемых
в наше время
тремя доменами жизни: Бактерии, Археи и Эукариоты. Изучение эволюционных
взаимоотношений между этими группами и создание универсального дерева жизни
составляют один из главных вызовов современной биологии. Предполагается, что Археи и
Эукариоты имеют общего предка, отличного от Бактерий. Предполагается, что первой
самореплицирующейся молекулой была РНК, она была основой первых примитивных
клеток. Остается неясным происхождение клеточного ядра эукариот; митохондрии и
гидрогеносомы некоторых анаэробных простейших, а также хлоропласты, согласно
эндосимбиотической
теории,
произошли
от
протеобактерий
и
цианобактерий
соответственно.
Говоря о биологическом разнообразии, обычно представляют многообразие
растений и животных, в то же время разнообразие микробных форм жизни огромно и
исследовано недостаточно. Метаболическая пластичность микробов позволила им занять
огромное число экологических ниш – гораздо большее, чем у любой другой группы
организмов.
Дерево жизни
3 домена жизни. Изучение зарождения жизни и ранних этапов эволюции
представляет весьма непростую задачу, требующую нестандартных подходов и методов.
Это самая продолжительная эпоха известной нам истории Земли. 3/4 времени от момента
появления жизни до наших дней биосфера была представлена только микробными
формами жизни. При этом жизнь на первобытной Земле не оставила никаких ископаемых
свидетельств, за исключением строматолитов и некоторых свидетельств геохимической
деятельности микроорганизмов. Единственный шанс заглянуть в прошлое – изучение
1
генетических текстов бактерий, что стало доступно в наше время с развитием методов
молекулярной
биологии.
Исследование
нуклеотидных
и
аминокислотных
последовательностей получило распространение лишь в последние 3 десятилетия и стало
настоящим прорывом в микробиологии и эволюционной биологии.
Основы современной классификации микроорганизмов были заложены в 1977 г.,
когда Карл Войес и Джордж Фокс, исследуя малые субъединицы рРНК, разделили живое
на три домена: Археи, Бактерии и Эукариоты (рис. 1.30). Основой для этих открытий
послужила работа Цукеркандла и Полинга (1965 г.), в которой предлагалась концепция
«молекулярных часов». Сиквенс рРНК позволил также определить эволюционное
расстояние между организмами. Для последовательностей рРНК характерна крайне
высокая консервативность, поскольку любые изменения структуры рибосом могут
повлиять на функцию синтеза белков. Нейтральные замены в структуре рРНК
накапливаются очень медленно (около 1 замены на 10 млн. лет).
Рис.
1.30.
Современное
«Дерево
жизни»,
построенное
последовательностей рРНК [Joanne M. Willey et al., 2008]
2
на
основе
анализа
Для прояснения эволюционных отношений 3 доменов жизни также необходимо
проанализировать основные генетические и биохимические особенности представителей
каждого из групп. Некоторые характеристики приведены в таблице 1. Очевидно, что по
ряду признаков, включая некоторые особенности функционирования генома, Археи
весьма близки к Эукариотам.
Таблица 1. Сравнение ряда черт организации Бактерий, Археев и Эукариот.
Свойство
Бактерии
Археи
Эукариоты
Окруженное мембраной
Нет
Нет
Есть
Нет
Нет
Есть
Почти всегда
Разная, без
Без муреиновых
пептидогликаны с
муреиновых
кислот
муреиновыми
кислот
ядро с ядрышком
Комплекс мембранных
органоидов
Клеточная стенка
кислотами
Липиды мембраны
Эфирные связи,
Эфирные связи,
Эфирные связи,
прямые цепи
разветвленные
прямые цепи
жирных кислот
алифатические
жирных кислот
цепи
Газовые пузырьки
Есть
Есть
Нет
Транспортная РНК
Тимин в составе
Нет тимина в Т и
Тимин есть.
тРНК.
ТφС плечах тРНК.
тРНК – инициатор
тРНК – инициатор
тРНК – инициатор
переносит
переносит N-
переносит
метионин.
формилметионин.
метионин.
Полицистронная мРНК
Есть
Есть
Нет
Интроны в составе мРНК
Нет
Нет
Есть
Сплайсинг, кэпирование,
Нет
Нет
Есть
70S
70S
80S
полиаденилирование
мРНК
Рибосомы:
Размер
3
Фактор элонгации II
Нет
Да
Да
Чувствителен
Нечувствителен
Нечувствителен
Число ферментов
1
1
3
Структура
Простая (6
Сложная, близка к
Сложная (12-14
субъединиц)
эукариотам (8-12
субъединиц)
взаимодействует с
дифтерийным токсином
Чувствительность к
хлорамфениколу и
канамицину
ДНК-зависимые РНК
полимеразы
субъединиц)
Чувствительность к
Чувствительны
Нечувствителен
Нечувствителен
Схожие АТФазы
Нет
Да
Да
Метаногенез
Нет
Есть
Нет
Фиксация азота
Есть
Есть
Нет
Хлорофилловый
Есть
Нет
Есть
Есть
Есть
Нет
рифампицину
Метаболизм
фотосинтез
Хемолитоавтотрофия
Скорее всего, Археи и Эукариоты эволюционировали независимо от Бактерий,
имея одного на 3 группы общего предка. В пользу этого предположения свидетельствует
то, что часть генов Археев аналогична Эукариотам, другая, еще большая часть –
Бактериям.
Другая перспективная теория предусматривает происхождение Эукариот от
слияния древних Археев с бактериальными клетками. Эта «Гипотеза слияния геномов»
предполагает
слияние
древней
архейной
клетки
с
клеткой
примитивной
грамотрицательной протеобактерии. Слияние геномов объясняет происхождение ядра и
присутствие у Эукариотов генов Архей и Бактерий одновременно (рис. 1.31).
4
Рис. 1.31. 3 предполагаемых схемы образования 3 доменов жизни. а) расхождение Архей и
эукариот от общего предка; б) аналогично, но также особо выделяют группу Эоцитов –
экстремальных серозависимых термофилов; в) происхождение Эукариот от слияния
бактериальной и архейной клеток (слияние геномов) [Joanne M. Willey et al., 2008]
Единого мнения о ключевых этапах эволюции 3 доменов жизни не существует:
сравнение генов обработки генетического материала или «домашнего хозяйства» дает
разные результаты. Возможно существование многих факторов, искажающих картину
эволюции: дупликации генов, неравномерная скорость эволюции, потеря информации.
Царства живого мира по 2 классификациям (Уиттакера и Кавалье-Смита)
представлены на рисунке 1.32: Животные (многоклеточные, гетеротрофные без клеточной
стенки); Растения (многоклеточные, с клеточной стенкой, фотоавтотрофы); Эубактерии;
Археи; Протисты (Эукариоты одноклеточные и многоклеточные без истинных тканей);
Грибы (эукариоты, многоядерные, мицелиальные).
5
Рис. 1.32. 6 царств живого мира Уиттакера (слева) и 8 царств по классификации КавальеСмита (справа)
Происхождение жизни. Гипотеза «РНК-мира»
Возраст нашей планеты, по данным радиоизотопного анализа метеоритов,
оценивается в 4,5-4,6 млрд. лет. Первые 100 млн. лет условия на планете не могли
поддерживать ни одного из типов жизни. Первые прямые данные о клеточных формах
жизни были получены в 1977 году в Южной Африке. Эти микробные организмы, подобно
археям, обнаруженным в Австралии, были датированы возрастом в 3,5 млрд. лет.
Основная масса воды в то время находилась в гидратированном состоянии,
Мировой Океан содержал менее 10% от современного количества воды, показатель рН =
8-9, атмосфера была восстановительная, в которой преобладали аммиак, метан, водород,
сероводород, циановодород. Накопление кислорода в атмосфере связывают с активностью
фотосинтетических цианобактерий. Они применяли более совершенную фотосистему II,
приспособившись использовать воду в качестве донора электронов. До появления
цианобактерий
энергия
солнца
использовалась
в
малоэффективных
процессах
бактериального фотосинтеза пурпурными и зелеными бактериями, нуждавшимися в
аммиаке и сероводороде в качестве донора электронов.
Гипотеза о предбиологическом отборе, Опарина и Холдейна (1929)
1.
Синтез низкомолекулярных органических соединений (биологических
мономеров) из газов первичной атмосферы.
2.
Образование биологических полимеров.
3.
Формирование
фазообособленных
систем
отделенных от внешней среды мембранами (протобионтов).
6
органических
веществ,
4.
Возникновение простейших клеток, обладающих свойствами живого, в том
числе репродуктивным аппаратом, обеспечивающим передачу дочерним клеткам свойств
клеток родительских.
Возможность синтеза простых органических веществ была показана в ряде
экспериментов:
Миллера – синтез аминокислот, органических кислот, альдегидов и углеводов: из
формальдегида – сахара, из метана и воды – жирные кислоты;
Оро – синтез АТФ;
Фокс – синтез протеиноидных микросфер;
Шрамм – синтез полинуклеотидов.
Протеиноидные
микросферы
–
стабильны,
не
разрушаются
при
центрифугировании, более устойчивы, чем коацерваты. Микросферы, сформированные из
кислых аминокислот – грамотрицательны, из основных – грамположительны, они
характеризуются
избирательной
проницаемостью,
способны
к
почкованию,
контактированию с другими микросферами и могут наращивать массу.
Важными событиями в предбиологической эволюции было возникновение
оптической активности, матричного синтеза, каталитической активности.
Оптическая активность. За исключением глицина, все аминокислоты имеют
оптическую активность, в составе белков L-форма, полисахариды – D-формы.
Способностью к репликации обладают только молекулы, состоящие из одного типа
изомеров.
Ферментативная активность. Протоклетки создавали благоприятные условия
для протекания реакций, катализаторы неорганические, простейшие молекулы из
«бульона» –
коферменты.
Простые
пептиды
служили
в
качестве
простейших
катализаторов. Субстратная специфичность возникла гораздо позже.
Матричный синтез. Экспериментально показана возможность комплементарного
связывания мононуклеотидов с полинуклеотидной матрицей и образование ковалентных
связей.
Возникновение аэробной среды
2 млрд. лет на Земле обитали первые цианеи, выделяющие кислород; 1,5 млрд. лет
назад появились первые эукариоты. Для осуществления процессов дыхания достаточно
0,2% кислорода. О2 высокотоксичен для анаэробных клеток, поскольку образует
семейство радикальных частиц (перикиси, гидроксильные радикалы, супероксид радикал
и т. д.).
7
В то же время кислород является самым эффективным окислителем, его
использование дает наибольший выход энергии. Накопление кислорода привело к
бурному развитию прокариотических и эукариотических организмов,
в том числе
многоклеточных форм жизни. Реакции окисления кислородом делятся на несколько
типов: диоксигеназы – переносят молекулу О2, что не связано с получением энергии,
оксидазы – перенос 1,2 или 4 электронов на О2, монооксигеназы – перенос 2 атомов
кислорода согласно механизму:
Эволюция энергетических включала появление системы переноса электронов.
Питер Митчелл предположил (хемиосмотическая теория, 1961 г.), что система
переноса электронов и АТФаза возникли независимо друг от друга, как разные механизмы
выработки
дМН+,
необходимого
для
избирательного
транспорта.
Сопряжение
электронного транспорта и фосфорилирования аналогично у всех организмов, что
свидетельствует об их древнем происхождении.
АТФаза обнаружена в клетках всех организмов. Первично питательные вещества
поступали пассивно. Энергия гидролиза АТФ использовалась для создания градиента
протонов. 1 АТФ = 2 протона. Сопровождающее брожение выделение кислот создает
протонный градиент, что может обеспечивать до 30% энергии вырабатываемой клеткой
(рис. 1.33).
Рис. 1.33. Создание протонного градиента в результате реакции брожения
[Современная микробиология. Прокариоты, 2005]
Следующий этап после брожения – достройка фотосистемы к цепям переноса
электронов. Первично сформировался циклический транспорт, восстановитель клетки
получали при брожении или тратили часть АТФ, образованной в процессе обратного
переноса электронов. Следующий этап – нециклический транспорт, выделение О2.
8
Первые самореплицирующиеся молекулы – РНК
Трудно сказать с уверенностью, каким образом воспроизводили себя первые
древние клетки, очевидно, они были проще любых современных клеток. На первобытной
Земле имелось огромное разнообразие химических соединений, которые, взаимодействуя
случайным образом, тестировали продукты реакций, отбирая наиболее устойчивые.
Первые клетки эволюционировали в условиях высокой температуры, в атмосфере из
водорода, диоксида углерода, азота и аммиака. Живая структура должна содержать ДНК,
РНК и белки. Для жизни необходимы молекулы, способные реплицироваться и выполнять
клеточную работу, ДНК может реплицироваться, но не выполняет работы, белки же,
напротив, напрямую задействованы в выполнении молекулярной работы в клетке.
Решение проблемы предложил Томас Чех в 1981 г., открывший РНК
эукариотического организма Tetrahymena, способную осуществлять сплайсинг самой себя.
Сидни Алтман в 1984 г. обнаружил РНКазу на основе РНК, способную резать
фосфоэфирные связи. Такие молекулы назвали рибозимами. В 1986 Уолтер Гилберт
предложил концепцию «мира РНК»: первые самореплицирующиеся молекулы РНК
обладали
ферментативной
активностью.
Почти
полмиллиарда
лет
происходил
статистический перебор, пока не появилось образование, подобное современной молекуле
РНК, заключенной в липидный пузырек. Сам образ функционирования РНК указывает на
ее древнее происхождение, большая часть РНК находится в рибосомах, рРНК
катализирует конформационные изменение пептидов, рибосомы, используя тРНК и иРНК,
осуществляют синтез белка. РНК также служит основой для синтеза ДНК, основной
энергетической молекулой клеток служит рибонуклеотид АТФ, РНК может регулировать
экспрессию генов.
Доводы против гипотезы РНК-жизни: условия на Земле затрудняли синтез рибозы,
фосфатов, пуринов, пиримидинов, нестабильность полимеров РНК. Джеймс Феррис в
1996 г. описал явление высокой устойчивости полимеров РНК в присутствии некоторых
минералов, позже подобные свойства открыты для полипептидных цепочек в присутствии
гидроксиаппатита, иллита. Однако неясно, как могли реплицироваться РНК – рибозима,
способного реплицировать РНК, не обнаружено и не создано искусственно.
Молекулярные часы эволюции
Молекулярные часы: в гомологичных белках разных организмов количество
различий в аминокислотах прямо пропорционально времени, прошедшему от момента
расхождения от общего предка в процессе эволюции. Зная количество различий по
9
аминокислотам, можно вычислить время возникновения таксона. Этот же принцип
справедлив и для различий по генам нуклеиновых кислот (рис. 1.34).
Концепция «молекулярных часов» была выдвинута Цукеркандлом и Полингом в
1965 г. В дальнейшем эта гипотеза была подкреплена работами Мотоо Кимура. В 1968 г.
Он выдвинул предположение о том, что большая часть эволюционных преобразований
происходит за счет случайной фиксации нейтральных или слабоадаптивных мутаций.
«Давней мечтой специалистов по генетике популяций было определение скорости
замещения генов в процессе эволюции видов. Эта величина должна более однозначно
характеризовать темпы эволюции, чем любая другая мера скорости, основанная на
сравнении фенотипов» (Кимура, 1985).
Первые результаты проверки этой гипотезы, были приведены в работе Кимуры
(1985), концепция молекулярных часов получила весомое подтверждение. Было доказано,
что на скорость изменения нейтральных признаков не влияет размер популяций и частота
смены поколений и что она выражается формулой: k=v,
где k – скорость эволюции, выраженная через число мутационных замен, а v –
скорость мутирования на гамету в поколение.
Однако эта закономерность резко меняется в случае отбора. Результаты
экспериментов свидетельствовали о том, что аминокислотные замены в белках
происходят достаточно регулярно, хотя для каждого конкретного типа белка характерны
свои темпы эволюции: например, вероятность замены произвольной аминокислоты в αцепи гемоглобина – 1,2·10-9 в год, а в инсулине – 0,44·10-9 в год.
10
Рис. 1.34. Филогенетические связи между 8 группами позвоночных животных
(верхняя схема) и различия по числу аминокислотных замен (Каа) у тех же видов (нижний
график) по α-цепям гемоглобинов (черные точки) и β-цепям (светлые точки) [Кимура,
1985]
В то же время применение гипотезы молекулярных часов практически не дает
информации о деталях эволюционного процесса. Дается лишь приблизительная оценка
времени расхождения таксонов, которое более точно определяется палеонтологическими
методами. Часто при отсутствии ископаемых останков молекулярные часы остаются
единственным источником информации о родстве таксонов и времени их расхождения.
Однако в тех случаях, когда ископаемых останков интересующих нас организмов нет,
молекулярные часы являются единственным источником данных о родстве таксонов и
времени их расхождения.
Более подробный анализ показал, что аминокислотные замены в белках далеко не
равнозначны. Разумеется, речь не идет об активном центре фермента – здесь любая замена
резко влияет на приспособленность организма. Однако замены в периферической части
молекулы влияют на ее трехмерную конфигурацию. Некоторые аминокислотные
радикалы притягиваются друг к другу, а некоторые – отталкиваются; размеры соседних
аминокислот влияют на распределение водородных связей и т. д. Некоторые мутации
вообще не сказываются на строении белка: многие аминокислоты кодируются
несколькими триплетами и возникновение «синонимичных замен» в ДНК при анализе
белка выявить невозможно. Технически проще и надежнее сосредоточиться именно на
анализе «точковых мутаций» нуклеиновых кислот. Однако и на этом уровне возникают
сложности: замена пурина на пурин «более нейтральна», чем замена пурина на
пиримидин; замена нуклеотида в третьей позиции триплета чаще всего оказывается
синонимичной (считывается та же аминокислота), а замена первого нуклеотида меняет
аминокислоту.
Более надежным, в сравнении с белками, является метод оценки генетических
расстояний с использованием текстов рибосомальной РНК. рРНК есть у всех организмов,
она изменяется исключительно медленно, последовательность рРНК полностью или
частично расшифрована у многих тысяч организмов. В настоящее время молекулярная
эволюция оценивается в основном по рРНК.
11
На
рисунке
1.35
филогенетическое
показано
дерево, составленное на основе
различий
й
в
нуклеотидных
последовательностях
тРНК.
Каждая
аждая
дерева
ветвь
определяется
числом
нуклеотидных замен, и число
замен между двумя точками на
дереве равно сумме замен в
ветвях,
соединяющих
эти
точки. Например, количество
различий (нуклеотидных замен)
между
тРНК
эубактерии
и
хлоропласта равно 125 + 121 =
Рис. 1.35.. Аддитивное дерево, построенное по 246,
различиям
в
транспортных
РНК
поскольку
тточки
[Омельянчук, «эубактерия» и «хлоропласт»
соединены двумя ветвями – 125
Колчанов, 1987]
и 121 замен, соответственно.
Расшифровка нуклеотидных последовательностей рРНК началась еще в 70
70-х годах
с простейшей молекулы 5S рРНК и почти сразу привела к результату огромной важности
– обнаружению Вёзе и его сотрудниками фундаментальных различий между двумя
группами бактерий, которые впоследствии получили ранг царств – бактерий и Архей.
Анализ 5S рРНК послужил основой создания современной систематики бактерий, однако
он оказался малоинформативным
ормативным при исследовании эукариот; более того, данные,
полученные при анализе 18S рРНК во многом противоречили схемам, основанным на
анализе 5S рРНК. Крупная молекула 18S рРНК полностью расшифрована у немногих
организмов,, в большинстве случаев родство таксонов
таксонов 18S рРНК эукариот (или его
отсутствие) определяется по фрагментам 18S рРНК.
Полученные результаты подтверждают
под
теорию молекулярных часов: в сестринских
ветвях «эубактерия» – «хлоропласт» и «архебактерия» – ««эукариот» количество
нуклеотидных замен приблизительно
риблизительно равно.
равно Очевидно локальное нарушение теории
молекулярных часов: количество замен в митохондрии много больше (309), чем в
12
сестринской ветви (в ветвлении «общий с митохондрией предок» – эубактерии замен
125+131=256 и «общий с митохондрией предок» – хлоропласты 121+131=252). Известно,
что практически все гены в митохондриях мутируют значительно чаще, чем ядерные
гены и гены прокариот. Известно также, что молекулярная эволюция у симбионтов и
паразитов зачастую идет гораздо быстрее, чем у свободноживущих организмов.
Эндосимбиотическая теория
Эндосимбиотическая гипотеза принята в качестве объяснения происхождения
хлоропластов и митохондрий. Оба органоида имеют бактериальные рибосомы и
кольцевую хромосому. В наше время известна альфа-протеобактерия Rickettsia prowazekii
– облигатный внутриклеточный паразит, геном которого очень близок к геному
митохондрий. Аналогично, происхождение хлоропластов связывается с эндосимбиозом
цианобактерий Prochloron – единственным прокариотом, имеющий хлорофилл а и b.
В последнее время гипотеза была дополнена данными о эндосимбиотическом
происхождении гидрогеносом. Анаэробные альфа-протеобактерии, продуцирующие
водород и СО2 в процессах брожения, образовали гидрогеносомы. Возможно,
митохондрия и гидрогеносома являются аэробной и анаэробной вариациями, имеющими
общего предка.
Последовательная эндосимбиотическая теория описывает эволюцию Эукариот
как серию эндосимбиотических слияний. Вначале произошло развитие подвижности в
результате слияния анаэробной спирохеты и другого анаэроба, затем сформировалось
ядро в результате развития внутренних мембран, далее эволюция митохондрий. Все это
привело к формированию клеток предковых форм грибов и животных, далее с развитием
– хлоропластов и растений.
Сравнительная организация генома Архей, Бактерий и Эукариот
Геном Архей отличается малыми размерами в сравнении с Бактериями. У
кренархеота Pyrobaculum aerophilum размер геном составляет 2,22 Мп.н., у эуриархеота
Methanobacterium thermoautotrophicum – 1,75 Мп.н. Содержание GC пар варьирует от 21%
до 68%. Обнаружено также несколько плазмид архей.
Около 30% генов Архей являются общими с Эукариотами, также имеется
значительная часть генов метаболизма общая для Эубактерий и Археев и лишь небольшая
группа генов встречается во всех 3 группах. Репликация ДНК сочетает черты
13
бактериальной и эукариотической репликации. Большая часть археев имеет кольцевую
ДНК с одной точкой двунаправленной репликации (рис. 1.36).
В геноме Археев точка ori фланкирована последовательностями, кодирующими
белок, инициирующий репликацию, схожий с белком Эукариот. Позже были обнаружены
белки, аналогичные белкам бактерий, и некоторые не имеющие аналогов архейные белки.
Бактериальные хромосомы некоторых археев снабжены гистоноподобными белками,
схожими с белками Эукариот.
Рис. 1.36. Двунаправленная репликация бактериальной хромосомы.
Транскрипция Археев также имеет черты Эукариот и Эубактерий. Как и у
Эубактерий, иРНК Археев полицистронна и не проходит сплайсинга. Механизм
трансляции уникален, имеются особенности в строении тРНК, первая тРНК переносит
метионин, подобно Эукариотам, рибосомы также отличается от бактериальных и
эукариотных.
14