Полиморфизмы генов репарации днк, клеточного цикла и

На правах рукописи
Уржумов Павел Валерьевич
ПОЛИМОРФИЗМЫ ГЕНОВ РЕПАРАЦИИ ДНК, КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА И
АПОПТОЗА КАК ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ
РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЧЕЛОВЕКА
03.01.01 – радиобиология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва - 2015
Работа выполнена на базе Федерального государственного бюджетного
учреждения науки «Уральский научно-практический центр радиационной
медицины» Федерального медико-биологического агентства.
Научный руководитель:
Аклеев Александр Васильевич, доктор медицинских наук, профессор,
заслуженный деятель науки РФ, директор ФГБУН УНПЦ РМ ФМБА РФ.
Официальные оппоненты:
Газиев Ажуб Ибрагимович, доктор биологических наук, профессор,
председатель Российского радиобиологического общества, главный научный
сотрудник Института теоретической и экспериментальной биологии РАН.
Сальникова Любовь Ефимовна, доктор биологических наук, главный
научный сотрудник лаборатории экологической генетики ИОГен РАН.
Ведущая организация:
ФГБУ ГНЦ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России, г. Москва.
Защита диссертации состоится «___» ___________ 2015 г. в _____ на
заседании
диссертационного
совета
Д501.001.65
при
Московском
государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, г.
Москва, Ленинские горы, д.1, стр. 12, МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический
факультет, ауд. 389.
С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке МГУ
имени М.В. Ломоносова, Ломоносовский пр. 27, сектор А, к. 812. Отзывы просим
присылать Веселовой Т.В. по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр.
12, МГУ им. М.В. Ломоносова, кафедра биофизики биологического факультета.
Автореферат разослан «___»_____________ 2015 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор биологических наук
Веселова Татьяна Владимировна
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы
Ионизирующее излучение
-
естественный и неразрывный спутник
эволюции жизни на Земле. И, поскольку естественный радиационный фон
достаточно стабилен во времени, живые существа хорошо к нему адаптированы.
Но с тех пор, как человечество начало активно использовать явление
радиоактивности в мирных и военных целях, вероятность облучения человека в
дозах, превышающих естественный радиационный фон, возросла. Реальность и
серьезность этой проблемы особенно отчетливо подтверждалась после таких
техногенных катастроф, как сбросы радиоактивных отходов в р. Теча (1949 - 1956
гг.), аварии на АЭС Три-Майл-Айленд в США (1979 г.), на Чернобыльской АЭС
(1986 г.) и на АЭС Фукусима I в Японии (2011 г).
Большинство из этих катастроф характеризовались острым облучением
персонала и ликвидаторов аварий в дозах, многократно превышающих
естественный фон, и их последствия достаточно хорошо изучены. Гораздо более
сложным вопросом остаются эффекты хронического облучения населения в
диапазонах средних и малых доз. Так, у жителей прибрежных сел реки Теча
спустя десятки лет после облучения выявляются такие эффекты, как повышенный
риск
развития
злокачественных
новообразований,
лейкозов
и
сердечно-
сосудистых заболеваний [Krestinina L. et al. 2005], увеличение частоты
нестабильных хромосомных аберраций (ХА) [Vozilova A. et al. 2013], а также
числа клеток с блоком клеточного цикла, TCR-мутаций [Маркина Т. и др. 2011,
Blinova E. et al. 2012] и мутациями белка P53 [Площанская О. и др. 2010].
Конечный эффект
воздействия ионизирующего излучения определяется
балансом между повреждениями генома и восстановительными процессами.
Поскольку человеческая популяция генетически неоднородна, эффективность
работы систем поддержания целостности генома у разных людей может
существенно варьироваться.
К настоящему времени в мировой литературе накоплено множество
данных, свидетельствующих о том, что точечные мутации (однонуклеотидные
3
полиморфизмы) в генах систем репарации ДНК, контроля клеточного цикла и
апоптоза связаны с повышенным уровнем мутаций в гене TP53 [Cho S. et al. 2011,
Li Y. et al. 2009, Mechanic L. et al. 2005], спонтанных и индуцированных
хромосомных аберраций [Дружинин В. и др. 2011, Минина В. 2012, Сальникова
Л. 2011,
Wang F. et al. 2010], со снижением эффективности и плохой
переносимостью химической и лучевой терапий [Burri R. et al. 2008, Duldulao M.
et al. 2013, Hirata H. et al. 2009, Ott K. et al. 2011, Strom S. et al. 2010, Yin M. et al.
2011],
а
также
являются
факторами
повышенного
риска
целого
ряда
онкопатологий различных типов и локализаций [Akulevich N. et al. 2009, Arizono
K. et al. 2008, Hung R. et al. 2007, Jiang D. et al. 2011, McWilliams R. et al. 2008,
Rajaraman P. et al. 2008, Shi M. et al. 2012, Srivastava K. et al. 2010, Zhou C. Et al.
2009], что может говорить об их потенциальном вкладе в формирование
индивидуальной чувствительности организма к генотоксичным факторам в целом
и к хроническому низкоинтенсивному облучению в частности.
Тотальный онкоскрининг больших по численности групп людей в течение
длительного времени после радиационных аварий - очень сложный в реализации
и дорогостоящий подход для профилактики и своевременного выявления
злокачественных новообразований.
Тогда как массовое генотипирование и
формирование групп риска для последующего наблюдения, основанное на
индивидуальной генетической предрасположенности, уже сейчас представляется
экономически
обоснованным
методом
первичной
профилактики
онкозаболеваний. С развитием молекулярной биологии и биоинформатики
себестоимость подобных исследований будет только снижаться.
Цель: исследовать значение полиморфизмов генов репарации ДНК,
апоптоза и клеточного цикла в формировании индивидуальной чувствительности
человека к хроническому воздействию ионизирующего излучения.
Задачи исследования:
1) Исследовать частоту хромосомных аберраций и TCR-мутаций в
лимфоцитах периферической крови у носителей полиморфных аллелей генов
OGG1, APEX, ERRC2, XPC, XRCC1, PARP1, NBS1, XRCC4, XRCC3, ATM, TP53,
4
MDM2, CDKN1A, BCL2 и BAX , проживавших в прибрежных селах реки Теча и
подвергавшихся хроническому радиационному воздействию.
2) Изучить уровень апоптоза в лимфоцитах периферической крови у
облученных лиц -носителей вариантных аллелей исследуемых генов.
3) Оценить зависимость частоты хромосомных аберраций, TCR-мутаций и
спонтанного апоптоза в лимфоцитах периферической крови носителей аллельных
вариантов генов OGG1, XRCC1, PARP1 и TP53 от дозы облучения красного
костного мозга.
4) Проанализировать взаимодействие полиморфизмов исследуемых генов и
их совместное влияние на уровень хромосомных аберраций, TCR-мутаций и
апоптоза в лимфоцитах периферической крови у облученных лиц.
Научная новизна
Впервые в гетерогенной по полу, возрасту и состоянию здоровья группе
лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию в результате
сброса жидких радиоактивных отходов ПО «Маяк» в реку Теча, проведена
комплексная оценка частоты ОНП генов систем эксцизионной репарации
оснований (OGG1 rs1052133, APEX rs1130409), эксцизионной репарации
нуклеотидов (ERRC2 rs13181, XPC rs2228001, XRCC1 rs1799782, XRCC1 rs25487,
PARP1 rs1136410), негомологичного соединения концов (NBS1 rs13312840,
XRCC4 rs2075685), гомологичной рекомбинации ДНК (XRCC3 rs861539),
контроля клеточного цикла (ATM rs664677, TP53 rs1042522, MDM2 rs2279744,
CDKN1A rs1801270) и апоптоза (BCL2 rs2279115, BAX rs4645878), частоты
нестабильных хромосомных аберраций
и TCR-мутаций, а также апоптоза
лимфоцитов периферической крови.
Впервые был проведен анализ связи частоты нестабильных хромосомных
аберраций, мутаций TCR и спонтанного апоптоза в лимфоцитах периферической
крови облученных лиц с носительством полиморфных вариантов генов OGG1,
APEX, ERRC2, XPC, XRCC1, PARP1, NBS1, XRCC4, XRCC3, ATM, TP53, MDM2,
CDKN1A, BCL2 и BAX. Была выявлена ассоциативная связь ОНП PARP1
rs1136410 с частотой апоптоза. Для остальных исследованных полиморфизмов
5
значимой связи с частотой хромосомных аберраций, TCR-мутаций или апоптоза
обнаружено не было.
Впервые было проанализировано совместное влияние полиморфизмов
OGG1 rs1052133, XRCC1 rs25487, PARP1 rs1136410 и TP53 rs1042522 на частоту
нестабильных хромосомных аберраций, TCR- мутаций и спонтанного апоптоза в
лимфоцитах
периферической
воздействию
ионизирующего
крови
лиц,
излучения.
подвергшихся
Выявлено,
что
хроническому
ряд
ОНП,
не
обнаруживавших связь с изучаемыми эффектами по отдельности, в определенных
сочетаниях друг с другом имеют значимую ассоциативную связь с частотой
хромосомных аберраций (OGG1 rs1052133 Cys / XRCC1 rs25487 Gln / PARP1
rs1136410 Val / TP53 rs1042522 Arg), TCR-мутаций (OGG1 Ser / XRCC1 Arg /
PARP1 Val / TP53 Arg) и апоптоза в лимфоцитах периферической крови (OGG1
Cys / XRCC1 Arg / PARP1 Ala / TP53 Arg).
Положения, выносимые на защиту
1) Полиморфизмы генов систем эксцизионной репарации оснований
(rs1052133, rs1130409), эксцизионной репарации нуклеотидов (rs13181, rs2228001,
rs1799782, rs25487), негомологичного соединения концов (rs13312840, rs2075685),
гомологичной рекомбинации ДНК (rs861539), контроля клеточного цикла
(rs664677, rs1042522, rs2279744, rs1801270) и апоптоза (rs2279115, rs4645878), за
исключением варианта PARP1 rs1136410, нельзя рассматривать в качестве
самостоятельных и однозначных маркеров индивидуальной чувствительности
человека к хроническому воздействию ионизирующего излучения.
2) Для оценки индивидуальной чувствительности человека к хроническому
облучению предпочтительнее использовать в анализе совместное носительство
совокупностей аллельных вариантов генов OGG1, XRCC1, PARP1 и TP53, а не
их отдельных полиморфизмов.
Теоретическая и практическая значимость
Результаты исследования дополняют имеющиеся в радиобиологии данные о
молекулярных механизмах и генетической детерминированности отдаленных
эффектов хронического воздействия ионизирующего излучения на организм
6
человека.
Полученные
данные
могут
быть
использованы
для
оценки
индивидуальной чувствительности человека к хроническому облучению и
формирования групп повышенного риска в отношении отдаленных соматикостохастических эффектов среди облученных. Подходы к выявлению лиц,
имеющих
высокий
риск
развития
канцерогенных
эффектов,
позволяют
оптимизировать наблюдение за большими группами облученного населения после
радиационных аварий, повысить эффективность лечебно-профилактических и
диагностических мероприятий, направленных на выявление злокачественных
новообразований. Материалы работы могут быть использованы в учебнометодическом процессе подготовки студентов, обучающихся на кафедре
радиобиологии Челябинского государственного университета.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на
конференции
«Полипатии
в
семейной
медицине,
профилактической
и
клинической кардиологии» (Челябинск, 2013 г.), на конференции, посвященной
15-летию
биологического
факультета
Челябинского
государственного
университета (Челябинск, 2013 г.), на 58 и 59 ежегодных конференциях Health
Physics Society (Мэдисон, США, 2013 г. и Балтимор, США, 2014 г.,
соответственно), а также на VII Международной студенческой электронной
научной конференции «Студенческий научный форум» (Москва, 2015 г.).
Публикации: по материалам диссертации было опубликовано 10 печатных
работ, из них 3 статьи в изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной
комиссией Российской Федерации.
Структура диссертации
Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста и состоит
из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования,
результатов исследования, их обсуждения и выводов, а также списка литературы.
Работа содержит 24 таблицы, 8 рисунков. Список литературы включает 181
источников, из них 17 отечественных и 164 зарубежных.
7
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Характеристика обследованной группы
В ходе работы нами было исследовано 407 человек, непосредственно
подвергавшихся хроническому радиационному воздействию с 1949 по 1956 годы
в результате деятельности производственного объединения «Маяк». Средний
возраст обследованных на момент забора крови для генетического исследования
составил 66 лет, а общий возрастной диапазон от 52 до 90 лет. Большая часть
(65,45%) представлена женщинами, что достаточно характерно для данной
возрастной группы. В этническом составе преобладают тюркские национальности
(в основном башкиры и татары) - 63,75%, так как являются коренным населением
данного региона, представителей славянских народов (по большей части русских,
украинцев и белорусов) меньше, всего 36,25%. Однако эти две крупные
этнические группы практически не отличаются друг от друга по возрастному и
половому составу.
Население прибрежных сел реки Теча подверглось комбинированному
внешнему (преимущественно γ-) и внутреннему γ- и β- облучению с низкой ЛПЭ.
Основным дозообразующим радионуклидом был
90
Sr. Будучи химическим
аналогом кальция, стронций активно накапливался и удерживался в костной
ткани на продолжительные периоды [Аклеев А. 2012]. В связи с этим основной
количественной мерой воздействия ионизирующего излучения на организм
обследованных лиц была выбрана доза облучения красного костного мозга,
реконструированная и рассчитанная сотрудниками биофизической лаборатории
УНПЦ РМ с использованием дозиметрической системы TRDS 2009 [Tolstykh E.I.
et.al. 2011].
Средняя доза на красный костный мозг у обследованных составила 0,95 ±
0,04 Гр. При этом минимальной дозой являлись 0,002 Гр, в то время как
максимальная накопленная доза на красный костный мозг составила 4,457 Гр.
Более половины группы имело накопленную дозу в диапазоне от 0,002 до 1 Гр.
Почти 23% облученных имели дозу от 1 до 1,5 Гр, а для 21% обследованных
накопленная доза составила более 1,5 Гр.
8
Наиболее интенсивно загрязнение речной системы Теча-Исеть-ТоболИртыш-Обь радиоактивными отходами происходило в 1950 и 1951 годы с пиком
выбросов в октябре 1951 года [Degteva M. et al. 2000]. Мощность дозы за этот год
для абсолютного большинства обследованных людей (92%) составила менее 0,5
Гр в год (средняя мощность 0,19 ± 0,01 Гр/год). Небольшая группа (7,63%)
подверглась более интенсивному облучению — от 0,51 до 1 Гр, включительно. И
лишь один человек за год получил дозу более 1Гр (1,26 Гр/год). Средняя
мощность для всей группы составила 0,23 ± 0,01 Гр/год.
Перед забором крови обследованные лица проходили анкетирование.
Опрос, в том числе, включал в себя вопросы о табакокурении и употреблении
алкоголя [Калев О.Ф., Волкова Э.Г. 1996]. Большинство людей из обследованной
группы (75%) не курят и не курили табак вообще, курильщиков 25%.
Стратификация
по
этнической
принадлежности
изменила
процентное
соотношение групп незначительно. Около половины обследованных лиц (52%) не
употребляют алкоголь или выпивают крайне редко (до 250 мл в месяц в водочном
эквиваленте суммарно). 38% опрошенных выпивают 1-3 раза в месяц (до 1 литра
в водочном эквиваленте) или чаще (вплоть до алкоголизма). Как и в случае с
табакокурением,
этническая
принадлежность
практически
не
влияет
на
соотношение групп.
Методы исследования
Для генотипирования использовались замороженные при -80°C образцы
венозной крови, полученные из банка тканей ФБГУН УНПЦРМ. Выделение ДНК
осуществлялось методом фенол-хлороформной экстракции, описанным в работе
Sambrook и Russel [Sambrook J., Russell D. 2006] с небольшими модификациями.
К 700 мкл размороженной крови добавляли 700 мкл 1х SSC (цитрат натрия)
для отмывки. Далее центрифугировали 2 минуты при 12000 об./мин., после чего
сливали надосадочную жидкость. К оставшемуся осадку добавляли 1400 мкл 1х
SSC, центрифугировали при 12000 об./мин. 2 минуты и вновь сливали
надосадочную жидкость. К полученному осадку добавляли 30 мкл 10% SDS
(додецилсульфат натрия), 270 мкл ацетатного буфера и термостатировали при
9
37°С 1 час. Далее к содержимому пробирки добавлялось 500 мкл фенолхлороформной смеси (соотношение 50/50), тщательно перемешивалось и
центрифугировалось
при
12000
об./мин.
10
минут.
Образовавшуюся
надосадочную жидкость с помощью дозатора переносили в чистую пробирку и
осаждали из нее ДНК путем добавления 1 мл 100% этилового спирта. После
кратковременного центрифугирования и повторной отмывки 70% этиловым
спиртом осадок ДНК высушивали и растворяли в 100 мкл деионизованной воды.
Концентрация выделенной ДНК измерялась спектрофотометром Nano Drop
2000c (Thermo Scientific, США) и, если требовалось, доводилась до 30-50 нг/мкл
путем добавления деионизированной воды. Полученную ДНК хранили в
морозильной камере при температуре -20°С.
В исследование были включены полиморфизмы генов, являющихся
важными звеньями систем эксцизионной репарации оснований (OGG1 rs1052133,
APEX rs1130409), эксцизионной репарации нуклеотидов (ERRC2 rs13181, XPC
rs2228001,
XRCC1
rs1799782,
XRCC1
rs25487,
PARP1
rs1136410),
негомологичного соединения концов (NBS1 rs13312840, XRCC4 rs2075685),
гомологичной рекомбинации ДНК (XRCC3 rs861539), контроля клеточного цикла
(ATM
rs664677, TP53 rs1042522, MDM2 rs2279744, CDKN1A rs1801270) и
апоптоза (BCL2 rs2279115, BAX rs4645878).
Генотипирование образцов и детекция результатов проводились методом
полимеразной цепной реакции в реальном времени на приборе «Applied
Biosystems StepOnePlus» (США) с использованием наборов реагентов «ФЛЭШ»
производства фирмы «Gen-Expert» (Москва, Россия). Смесь реагентов для
амплификации
приготавливалась
согласно
инструкции
производителя
к
конкретному набору.
Цитогенетическое
обследование
лиц
проводилось на
Т-лимфоцитах
человека, выделенных из венозной крови. Клетки культивировались 52 часа с
фитогемагглютинином.
Обработку
клеток
проводили
по
методике,
представленной в работе Возиловой А.В. [Vozilova A. et al. 2013]. В настоящем
исследовании использовались данные по частоте обменных нестабильных
10
аберраций,
которые
суммировали
частоту
дицентрических
и
кольцевых
хромосом, а также ацентрических колец. Исследование проводилось кандидатом
биологических наук А. В. Возиловой.
Определение
апоптотической
гибели
лимфоцитов
проводилось
по
показателям поздней стадии апоптоза, на основании данных о фрагментации
ДНК. Анализ апоптотических клеток проводился с использованием методов
TUNEL (terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick and labeling), Annexin VFITC и CD-типирование на проточном цитофлуориметре серии EPICS XL - MCL,
производства компании Becman Culter (США) [Блинова Е. и др. 2011]. Данное
исследование проведено кандидатом биологических наук Е. А. Блиновой.
Анализ TCR-мутаций CD3-CD4-положительных клеток проводился в
клеточной
суспензии
лимфоцитов
периферической
крови
человека
с
использованием моноклональных антител IgG1-PE/ IgG1–FITC и CD3-FITC/CD4PE (BeckmanCoulter, США). Анализ проб проводили на проточном цитометре
(Becman Culter, США) [Маркина Т. и др. 2011]. Исследование проведено
кандидатом биологических наук Т. Н. Маркиной.
Статистическая обработка результатов
Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием
программного пакета «SPSS Statistics» и приложения «SNPStats». Для проверки
соответствия
генотипов
равновесному
распределению
Харди-Вайнберга,
сравнения распределения генотипов между различными этническими группами, а
также для сопоставления групп по табакокурению и злоупотреблению алкоголем
использовался
критерий
χ2.
Анализ
связи
полиморфизмов
с
уровнем
хромосомных аберраций, TCR-мутаций и апоптоза, а также сопоставление групп
по дозе на ККМ и возрасту проводились с помощью U-критерия Манна-Уитни.
Дозовые зависимости анализировались с помощью линейного регрессионного
анализа. Совместное влияние нескольких полиморфизмов на изучаемые эффекты
оценивалось с помощью логистического регрессионного анализа.
11
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Частота аллелей и генотипов исследованных полиморфизмов
По результатам проведенного генотипирования 407 жителей прибрежных
сел реки Теча была оценена частота аллелей исследуемых полиморфизмов,
распределение
генотипов
генов
эксцизионной
репарации
основания
и
нуклеотидов (Таблица 1).
Таблица 1. Частота аллелей и генотипов генов эксцизионной репарации
основания и нуклеотидов
ОНП
OGG1
rs1052133
ERСC2
rs13181
XPC
rs2228001
XRCC1
rs1799782
XRCC1
rs25487
PARP1
rs1136410
APEX
rs1130409
Количество
358
356
255
357
229
305
255
Частота аллелей, %
Частота генотипов, %
(количество)
(количество)
Ser
Cys
Ser/Ser
Ser/Cys
Cys/Cys
75 (539)
25 (177)
56 (201)
38 (137)
6 (20)
Lys
Gln
Lys/Lys
Lys/Gln
Gln/Gln
65 (466)
35 (246)
43 (153)
45 (160)
12 (43)
A
C
A/A
A/C
C/C
60 (305)
40 (205)
35 (89)
50 (127)
15 (39)
C
T
C/C
C/T
T/T
92 (659)
8 (55)
85 (304)
14 (51)
1 (2)
Gln
Arg
Gln/Gln
Gln/Arg
Arg/Arg
72 (331)
28 (127)
55 (125)
35 (81)
10 (23)
Val
Ala
Val/Val
Val/Ala
Ala/Ala
79 (482)
21 (128)
62 (188)
35 (106)
4 (11)
A
C
A/A
A/C
C/C
54 (273)
46 (237)
32 (82)
43 (109)
25 (64)
Частота аллелей исследуемых полиморфизмов, распределение генотипов
для генов систем негомологичного соединения концов и гомологичной
рекомбинации представлены в Таблице 2.
12
Таблица 2. Частота аллелей и генотипов генов репарации двунитевых
разрывов ДНК
ОНП
Количество
NBS1
rs13312840
224
XRCC4
rs2075685
85
XRCC3
rs861539
225
Частота аллелей, %
(количество)
Частота генотипов, %
(количество)
T
C
T/T
T/C
C/C
86 (386)
14 (62)
82 (184)
8 (18)
10 (22)
C
A
C/C
C/A
A/A
65 (110)
35 (60)
41 (35)
T
C
T/T
57 (225)
43 (195)
43 (97)
47 (40) 12 (10)
T/C
C/C
27 (61) 30 (67)
Аналогичные показатели по генам систем контроля клеточного цикла и
апоптоза приведена в Таблице 3.
Таблица 3. Частота аллелей и генотипов генов контроля клеточного цикла и
апоптоза
ОНП
Количество
ATM
rs664677
386
TP53
rs1042522
257
MDM2
rs2279744
147
CDKN1A
rs1801270
247
BCL2
rs2279115
345
BAX
rs4645878
357
Частота аллелей, %
(количество)
Частота генотипов, %
(количество)
T
C
T/T
T/C
C/C
55 (421)
45 (351)
29 (111)
52 (199)
20 (76)
Arg
Pro
Arg/Arg
Arg/Pro
Pro/Pro
72 (368)
28 (146)
49 (127)
44 (114)
6 (16)
A
C
A/A
A/C
C/C
66 (184)
34 (100)
50 (74)
31 (46)
18 (27)
C
A
C/C
C/A
A/A
74 (364)
26 (130)
55 (137)
36 (90)
8 (20)
A
C
A/A
A/C
C/C
64 (445)
36 (245)
48 (164)
34 (117)
19 (64)
C
T
C/C
C/T
T/T
93 (666)
7 (48)
88 (314)
11 (38)
1 (5)
Как отмечалось, исследованная выборка состоит из людей, относящихся к
различным этносам. При сравнении распределения генотипов в различных
13
этнических подгруппах было выявлено значимое различие в распределении
генотипов по полиморфизму XRCC4 rs2075685, P = 0,002. В подгруппе тюрков
практически отсутствовали гомозиготы по минорному аллелю (A/A), а самым
распространенным генотипом являлись гомозиготы C/C (55%), в то время как у
славян отношение частот генотипов было близко к 1:2:1. Также выявлено не столь
явное, но достоверное отличие в распределении генотипов по полиморфизму
BAX rs4645878. В подгруппе тюрков наблюдалось абсолютное доминирование
генотипа C/C (91%), тогда как у славян оно было выражено меньше (83%) за счет
большого количества гетерозигот C/T: 14% по сравнению с 9% у тюрков. Для
остальных генов значимых отличий между указанными группами обнаружено не
было. Обнаруженные отличия могут быть вызваны тем, что генетический обмен
между этими группами долгое время был затруднен сначала из-за географической
изоляции (тюрки являются коренным населением Урала, тогда как славяне начали
активно заселять эту территорию только в XVII веке), а затем в виду культурных
различий (например, религиозного характера).
Связь исследуемых полиморфизмов с хромосомными аберрациями и
соматическими мутациями в отдаленные сроки после радиационного
воздействия
Как было указано выше, люди из исследуемой группы подвергались
хроническому воздействию ионизирующего излучения [Аклеев А. 2012] и в
отдаленные сроки после облучения у них выявлялись такие эффекты, как
повышенный риск развития злокачественных новообразований и лейкозов
[Krestinina L. 2005], увеличение числа клеток с блоком клеточного цикла, TCRмутаций [Маркина Т. и др. 2011] и мутаций в гене TP53 [Площанская О. и др.
2010], а также наблюдалось повышение частоты нестабильных хромосомных
аберраций
[Vozilova
A.
2013].
Данные
эффекты,
по
мнению
многих
радиобиологов, являются качественными критериями чувствительности человека
к хроническому облучению. Исходя из первоначальной гипотезы о том, что
полиморфные варианты генов репарации ДНК, контроля клеточного цикла могут
оказывать влияние на чувствительность клеток к радиационному воздействию,
нами была проанализирована связь исследуемых полиморфизмов с частотой
хромосомных аберраций, TCR-мутаций и уровнем апоптоза в лимфоцитах крови
14
облученных лиц, проживавших в прибрежных селах р. Теча.
Для ряда полиморфизмов была выявлена связь на уровне тенденции.
Например, у гомозигот OGG1 rs1052133 Cys/Cys уровень нестабильных
хромосомных обменов был ниже, чем у гетерозигот и гомозигот по аллелю Ser (Р
= 0,096). Еще более выраженное различие (0,082) было между группами PARP1
rs1136410 Val/Val и Val/Ala + Ala/Ala, у носителей минорного аллеля Ala уровень
обменов был выше. В случае
с полиморфизмом TP53 rs1042522 среднее
количество аберраций было больше у гомозигот по мажорному аллелю Arg,
нежели у носителей минорного аллеля (P = 0,099). А в группе гомозигот XRCC1
rs25487 Gln/Gln количество клеток с TCR-мутациями было выше, чем у носителей
других генотипов по данному гену (P = 0,064).
Обнаруженные тенденции могли быть обусловлены накопленной на ККМ
дозой, а не генотипом. Мы провели линейный регрессионный анализ и сравнили
зависимости доза-эффект у носителей различных генотипов.
Рисунок 1. Зависимость частоты ХА от
дозы на ККМ у носителей OGG1
rs1052133 Ser/Ser и Ser/Cys
Рисунок 2. Зависимость частоты ХА от
дозы на ККМ у носителей OGG1
rs1052133 Cys /Cys
15
Рисунок 3. Зависимость частоты ХА от
дозы на ККМ у носителей PARP1
rs1136410 Ala/Ala и Val/Ala
Рисунок 4. Зависимость частоты ХА от
дозы на ККМ у носителей PARP1
rs1136410 Val/Val
Рисунок 5. Зависимость частоты ХА от
дозы на ККМ у носителей TP53
rs1042522 Arg/Pro и Pro/Pro
Рисунок 6. Зависимость частоты ХА от
дозы на ККМ у носителей TP53
rs1042522 Arg/ Arg
16
Однако анализ показал отсутствие дозовых зависимостей в сравниваемых
группах. Как видно из Рисунков 1-6, частота нестабильных хромосомных
аберраций у носителей различных генотипов изучаемых генов не обнаружила
зависимости даже на уровне тенденции от накопленной дозы на красный костный
мозг у облученных жителей прибрежных сел р. Теча.
Аналогичные результаты были получены для частоты TCR-мутаций
(рисунок 7 и рисунок 8).
Рисунок 7. Зависимость частоты TCRмутаций от дозы на ККМ у носителей
XRCC1 rs25487 Gln/Arg и Arg/Arg
Рисунок 8. Зависимость частоты TCRмутаций от дозы на ККМ у носителей
XRCC1 rs25487 Gln/Gln
Результаты анализа говорят об отсутствии влияния накопленной красным
костным мозгом дозы на наблюдаемые зависимости клеточных эффектов от
носительства того или иного генотипа.
Связь исследуемых полиморфизмов с частотой апоптоза в отдаленные
сроки после радиационного воздействия
Единственным полиморфизмом, обнаружившим связь с активностью
спонтанного апоптоза в лимфоцитах периферической крови, стал вариант PARP1
17
rs1136410. В группе гомозигот Ala/Ala средний уровень апоптоза была
достоверно ниже (P = 0,041), чем у носителей аллеля Val.
Однонуклеотидный полиморфизм rs1136410 приводит к аминокислотной
замене валина на аланин в 762 кодоне белка PARP1, а так как этот фермент
является одним из ключевых звеньев систем репарации ДНК [Isabelle M. et al.
2010], возможно, замена в его аминокислотной последовательности приводит к
повышению активности данного фермента, что, в свою очередь, приводит к более
качественной репарации повреждений ДНК и, как следствие, к снижению частоты
спонтанного апоптоза в лимфоцитах.
Нужно понимать, что итоговый результат апоптоза зависит от множества
факторов внутренней и внешней природы. Люди из обследованной группы
принадлежат к различным этническим группам, подвергались хроническому
воздействию ионизирующего излучения в различных дозах, а также различаются
по возрасту, табакокурению и злоупотреблению алкогольными напитками. Все
это так или иначе могло повлиять на частоту апоптоза.
Для того чтобы прояснить этот момент, мы сопоставили группы носителей
аллеля PARP1 rs1136410 Val и всех остальных по указанным выше факторам.
Однако выяснилось, что группы совершенно не отличались по этническому
составу (P = 0,54), а также количеству курящих табак (P = 0,83) и употребляющих
алкоголь (P = 0,33). Более того, и по таким показателям, как накопленная доза на
ККМ и возраст, исследуемые группы оказались сопоставимы (P = 0,81 и P = 0,53,
соответственно). Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что
генетический полиморфизм PARP1 rs1136410 является независимым фактором
изменения активности спонтанного апоптоза в лимфоцитах периферической
крови в отдаленные сроки после облучения, в то время как этническая
принадлежность, накопленная доза на красный костный мозг, употребление
алкоголя и табакокурение не обнаруживают связи с данным показателем.
Взаимодействие полиморфизмов
Процессы обнаружения повреждений и репарации ДНК плотно и
неразрывно связаны с системами контроля клеточного цикла и апоптоза [Brown E.
18
et al. 2003, Miyashita 1, Morgan 1, Rass 1, Shell 1, Volker 1]. В этой связи важно
было изучить совместное влияние полиморфизмов генов этих систем на
изучаемые эффекты, так как несущественные или малозначимые сами по себе
отклонения в активности отдельных ферментов-звеньев этих цепей могут
накладываться и каскадно усиливать друг друга, приводя к серьезным
изменениям работы всей системы в целом. Что на фоне радиационноиндуцированной нестабильности генома, может приводить как к усилению, так и
к компенсации наблюдаемых отдаленных эффектов хронического облучения. В
анализ были включены полиморфные варианты генов, которые показали
самостоятельную связь с изучаемыми показателями на уровне тенденции
и
значимости (P < 0,10).
Таблица 4. Совместное влияние полиморфизмов на частоту хромосомных
аберраций, TCR-мутаций и апоптоза
Сочетание аллелей
Показатель
Хромосомные
аберрации
OGG1 XRCC1 PARP
TP53
rs1052133 rs25487 rs1136410 rs1042522
Частота, Log(ОШ) (95%
%
ДИ)
Ser
Gln
Val
Arg
35
0,00
Cys
Gln
Val
Arg
1
2,44
(1,66 - 3,21)
Ser
Gln
Val
Arg
32
0,00
TCR-мутации
Ser
Arg
Val
Arg
11
-0,41
(-0,78 – (0,03))
Ser
Arg
Val
Arg
32
0,00
Cys
Arg
Ala
Arg
1
1,18
(0,66 - 1,70)
Апоптоз
19
Как видно из Таблицы 4, при совместном носительстве аллелей OGG1
rs1052133 Cys, XRCC1 rs25487 Gln, PARP1 rs1136410 Val и TP53 rs1042522 Arg
достоверно повышен риск высокого уровня хромосомных обменов по сравнению
с самым распространенным вариантом Ser/Gln/Val/Arg (P < 0,01). Для носителей
совокупности аллелей OGG1 Ser / XRCC1 Arg / PARP1 Val / TP53 Arg шанс TCRмутаций был значимо ниже по сравнению с наиболее распространенным
вариантом (P = 0,03). А редкое сочетание OGG1 Cys / XRCC1 Arg / PARP1 Ala /
TP53 Arg значительно повышает шанс высокого уровня апоптоза в лимфоцитах
крови по сравнению с самым частым Ser/Arg/Val/Arg (P< 0,01). В тоже время по
отдельности ни для одного из указанных аллелей подобных закономерностей
выявлено не было. Нужно отметить, что оба сочетания, для которых были
обнаружены повышенные шансы высокого уровня хромосомных аберраций и
апоптоза, содержали аллели OGG1 rs1052133 Cys и TP53 rs1042522 Arg.
Возможно, взаимодействие белковых продуктов именно этих вариантов генов
приводит к значимому снижению эффективности работы систем поддержания
целостности генома, что отражается на регистрируемых показателях.
Выводы
1) Не выявлено достоверной связи полиморфизмов генов систем репарации
ДНК (OGG1 rs1052133, APEX rs1130409, ERRC2 rs13181, XPC rs2228001, XRCC1
rs1799782, XRCC1 rs25487, PARP1 rs1136410, NBS1 rs13312840, XRCC4
rs2075685, XRCC3 rs861539), контроля клеточного цикла (ATM rs664677, TP53
rs1042522, MDM2 rs2279744, CDKN1A rs1801270) и апоптоза (BCL2 rs2279115,
BAX rs4645878) с частотой нестабильных хромосомных аберраций и TCRмутаций в отдаленные сроки у жителей прибрежных сел реки Теча, подвергшихся
хроническому облучению в диапазоне доз на красный костный мозг от 0,002 до
4,46 Гр (средняя 0,95 ± 0,04 Гр).
2) Активность спонтанного апоптоза в лимфоцитах периферической крови
у носителей аллеля PARP1 rs1136410 Val значимо выше (Р = 0,041), чем у
20
гомозигот PARP1 rs1136410 Ala/Ala, при том, что эти группы являются
сопоставимыми
по
возрасту,
дозе
облучения
ККМ,
табакокурению
и
употреблению алкоголя.
3) Не обнаружено зависимости частоты хромосомных аберраций, TCRмутаций и спонтанного апоптоза в лимфоцитах периферической крови носителей
различных аллельных вариантов полиморфизмов OGG1 rs1052133, XRCC1
rs25487, PARP1 rs1136410 и TP53 rs1042522 от дозы облучения красного костного
мозга.
4) Облученные носители совокупностей аллелей OGG1 rs1052133 Cys /
XRCC1 rs25487 Gln / PARP1 rs1136410 Val / TP53 rs1042522 Arg в отдаленные
сроки имеют повышеный уровень хромосомных обменов (P < 0,01), OGG1 Ser /
XRCC1 Arg / PARP1 Val / TP53 Arg - TCR-мутаций (P = 0,03), OGG1 Cys / XRCC1
Arg / PARP1 Ala / TP53 Arg, высокий уровень апоптоза в лимфоцитах
периферической крови (P < 0,01) в сравнении с носителями наиболее
распространенных аллельных сочетаний.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в российских журналах из списка ВАК:
1) Донов П. Н., Уржумов П. В., Блинова Е. А., Аклеев А. В. Полиморфизмы
генов TNFa, IL1b, IL4, IL8 и уровень интерлейкинов в плазме крови человека //
Российский Иммунологический Журнал. – Т. 7 (16). - № 2-3 (1).- Апрель –
Сентябрь 2013 с. 28-29
2) Уржумов П.В., Возилова А.В., Донов П.Н., Блинова Е.А., Аклеев А.В.
Связь полиморфизма генов систем репарации ДНК с повышенным уровнем
хромосомных аберраций у облученных лиц // Медико-биологические проблемы
жизнедеятельности. г. Гомель. № 1 (11), апрель 2014. с. 59-65. ISSN 2074-2088
3) Донов П.Н., Уржумов П.В., Блинова Е.А., Аклеев А.В. Связь
полиморфизмов генов цитокинов, оксидативного ответа, клеточного цикла и
21
репарации с хромосомными аберрациями у лиц, подвергшихся хроническому
радиационному
воздействию
на
реке
Теча
//
Вопросы
радиационной
безопасности. №3 (75). 2014. С. 61-68
Статьи в иных изданиях:
1) Уржумов П. В., Погодина А. В., Аклеев А. В. Полиморфизмы генов NBS1
и PARP1 и эффективность репарации ДНК // Вестник ЧелГУ. 2013. № 7 (298).
Биология. Вып. 2. С. 107–108.
2) Уржумов П.В., Блинова Е.А., Аклеев А.В. Полиморфизмы генов OGG1,
ERCC2, PARP1, XRCC4, XRCC3 и ATM у лиц, подвергшихся хроническому
радиационному воздействию // Вестник КарГУ, Серия «Биология. Медицина.
География». № 3(71)/2013, С. 45-50
3) Донов П. Н., Уржумов П. В., Блинова Е. А., Аклеев А. В. Определение
частот полиморфизмов генов CYP1A1 И GSTP1 в группе облученных когорты
реки Течи // Вестник ЧелГУ. 2013. № 7 (298). Биология. Вып. 2. С. 109–111.
Тезисы докладов:
1) Donov, P., Urzhumov, P., Blinova, E., Akleyev, A. Assessment of
polymorphism frequency in detoxification genes for a sample of persons exposed to
chronic radiation // Health Physics. - July 2013 - Volume 105 - Supplement 1. Abstracts of Papers Presented at the Fifty-Eighth Annual Meeting of the Health Physics
Society Madison, Wisconsin 7-11 July 2013 1.-, pp: S14
2) Urzhumov, P., Pogodina, A., Akleyev, A. Polymorphisms of the NBS1 and
PARP1 genes and dna repair efficiency in individuals exposed to chronic radiation //
Health Physics. - July 2013 - Volume 105 - Supplement 1. - Abstracts of Papers
Presented at the Fifty-Eighth Annual Meeting of the Health Physics Society Madison,
Wisconsin 7-11 July 2013 1.-, pp: S13-S14
2) Уржумов П. В., Донов П. Н., Аклеев А. В. Исследование связи
генетических и средовых факторов с развитием сердечно-сосудистой патологии у
потомков облученных лиц // Полипатии в семейной медицине, профилактической
22
и клинической кардиологии. Материалы всероссийской научно-практической
конференции,
посвященной
75-летию
Заслуженного
деятеля
науки
РФ,
профессора О.Ф. Калева / Под редакцией профессора О.Ф. Калева.- Челябинск.:
Изд-во ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава России, 2013.- С. 197-200. - УДК 616031.14
3) Donov, P., Urzhumov, P., Blinova, E., Akleyev, A. The study of association of
interleukin gene polymorphysms with cancer in people exposed to chronic irradiation //
Health Physics, Volume 107, No. 1, July 2014, Supplement 1, Abstracts of Papers
Presented at the Fifty-Ninth Annual Meeting of the Health Physics Society Baltimore,
Maryland 13 July - 17 July 2014, pp. S21-S22
4)
Донов
П.Н.,
Уржумов
П.В.,
Аклеев
А.В.
Однонуклеотидные
полимофризмы генов оксидативного стресса и иммунитета в группе лиц,
подвергшихся хроническому радиационному воздействию на реке Теча (Южный
Урал) // Материалы VII Международной студенческой электронной научной
конференции
«Студенческий
научный
форум»
URL:
http://www.scienceforum.ru/2015/1337/14708
23
24