Диссертация - Ивановский государственный химико
реклама
ИВАНОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ХИМИКО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ На правах рукописи ТЮНИНА ВАЛЕРИЯ ВАЛЕРЬЕВНА ЭНТАЛЬПИЯ СУБЛИМАЦИИ И СТРУКТУРНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НЕКОТОРЫХ АМИНОКИСЛОТ И ДИПЕПТИДОВ: ЭКСПЕРИМЕНТ И КВАНТОВО-ХИМИЧЕСКИЕ РАСЧЕТЫ Специальность: 02.00.04 – Физическая химия Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук Научный руководитель: д.х.н., профессор Г. В. Гиричев Иваново – 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ СПИСОК ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ ……………………...... ВВЕДЕНИЕ ………………………………………………………………….. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ……………………………………….. 1.1. Общая характеристика аминокислот и дипептидов ………………….. 1.2. Термодинамика процессов сублимации аминокислот и дипептидов ... 1.3. Водородные связи в аминокислотах и дипептидах …………………… 1.4. Масс-спектрометрическое исследование аминокислот и дипептидов . 1.5. Квантово-химические расчеты структуры аминокислот ……………... 1.6. Структурные исследования молекул аминокислот в газовой фазе ….. ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ………………………………... 2.1.МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ЭЛЕКТРОННОЙ ИОНИЗАЦИИ ……….. 2.1.1. Теоретические основы масс-спектрометрии электронной ионизации …………………………………………………………………….. 2.1.2. Эффузионный метод Кнудсена ………………………………………. 2.1.3. Расчет энтальпии сублимации ……………………………………….. 2.1.4.Магнитный масс-спектрометр МИ-1201, модифицированный для термодинамических исследований ………………………………………... 2.1.5. Методика эксперимента на МИ-1201 ………………………………... 2.2. ГАЗОВАЯ ЭЛЕКТРОНОГРАФИЯ …………………………………….. 2.2.1. Теоретические основы газовой электронографии …………………... 2.2.2. Температурные эффекты в газовой электронографии ……………… 2.2.3. Структурный электронографический анализ ………………………... 2.2.4. Комплекс аппаратуры «электронограф/масс-спектрометр» и методика эксперимента ……………………………………………………… 2.3. КВАНТОВО-ХИМИЧЕСКИЕ РАСЧЕТЫ ……………………………... 2.3.1. Теоретические методы расчета структуры и энергетики молекул … 2.3.2. Метод анализа электронной плотности в терминах натуральных орбиталей связи (NBO) ………………………………………………………. 2.4. ПОДГОТОВКА И ХАРАКТЕРИСТИКИ ИССЛЕДУЕМЫХ ВЕЩЕСТВ ……………………………………………………………………. ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ …………………………... 3.1. АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ И ЭНЕРГЕТИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК АМИНОКИСЛОТ И ДИПЕПТИДОВ ………………………………………. 3.1.1. Особенности масс-спектров и состава паров аминокислот и дипептидов …………………………………………………………………… 3.1.2. Энтальпии сублимации аминокислот и дипептидов ……………….. 3.1.3. Взаимосвязь молекулярных дескрипторов аминокислот и дипептидов с их энергетическими характеристиками …………………….. 3.2. ИССЛЕДОВАНИЕ СТРОЕНИЯ МОЛЕКУЛЫ L-ТРИПТОФАНА В ГАЗОВОЙ ФАЗЕ ……………………………………………………………. 4 6 14 14 18 24 28 31 38 43 43 43 45 47 48 50 53 53 57 59 61 65 65 68 71 72 72 72 78 90 100 3 3.2.1. Конформационные свойства L-триптофана по данным квантовохимических расчетов ………………………………………………………… 3.2.2. Электронографическое исследование L-триптофана ………………. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ ……………………………... ЛИТЕРАТУРА ………………………………………………………………. 100 106 115 117 4 СПИСОК ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ ∆subНmo – энтальпия сублимации Ala – аланин Arg – аргинин Asn - аспарагин Cys – цистеин DFT – теория функционала плотности DL-Ala-DL-Nvl (Ala-Nvl) – DL-аланил-DL-норвалин DL-Ala-DL-Val (Ala-Val) – DL-аланил-DL-валин EI (ЭИ) – масс-спектрометрия электронной ионизации f(r) – функция радиального распределения GED (ЭГ) – газовая электронография Gln – глутамин Gly – глицин Gly-L-Ala (Gly-Ala) – глицил-L-аланин His – гистидин HOMO (ВЗМО) – высшая заниятая молекулярная орбиталь L-Ala-L-Ala (Ala-Ala) – L-аланил-L-аланин L-Ala-L-Trp (Ala-Trp) – L-аланил-L-триптофан Leu – лейцин L-Met (Met) – L-метионин L-Phe (Phe) – L-фенилаланин L-Pro (Pro) – L-пролин L-Ser (Ser) – L-серин L-Thr (Thr) – L-треонин L-Trp (Trp) – L-триптофан L-Tyr (Tyr) – L-тирозин 5 LUMO (НСМО) – низшая свободная молекулярная орбиталь Lys – лизин m/z – отношение массы иона к его заряду NBO-анализ – метод анализа электронной плотности в терминах натуральных орбиталей связи sM(s) – приведённая молекулярная составляющая интенсивности рассеяния Val – валин ИК-спектроскопия – инфоракрасная спектроскопия КР- спектроскопия – спектроскопия комбинационного рассеяния МНК – метод наименьших квадратов ПК – персональный компьютер ЯМР-спектроскопия – спектроскопия ядерного магнитного резонанса 6 ВВЕДЕНИЕ Актуальность работы. Одной из центральных задач современной физической химии является всестороннее исследование различного рода систем, состоящих из биоорганических молекул, что объясняется неослабевающим интересом к поиску путей создания новых перспективных материалов с заданными свойствами [1]. Подобные системы могут выступать в качестве биодатчиков, оптических фильтров, носителей лекарственных препаратов и др. [1-5]. Для теоретического анализа устойчивости веществ в твердом состоянии важным параметром является энергия кристаллической решетки, которая при определенных условиях равнозначна энтальпии сублимации. Термохимические характеристики парообразования аминокислот и пептидов – структурных единиц белков – в комплексе со структурными характеристиками молекул позволяют выявить и охарактеризовать различные виды внутри- и межмолекулярных взаимодействий. Общепринято, что молекулярная структура соединения в значительной степени определяет его физико-химические свойства. Вместе с тем, без знания термодинамических харакиеристик невозможно обсуждение деталей организации более сложных систем, механизма их образования и стабилизации их структур. Таким образом, структура и энергетика – это две фундаментальные составляющие, изучаемые разными экспериментальными методами и необходимые для охарактеризования системы в целом. В связи с этим представляет большое теоретическое и практическое значение установление закономерностей связывающих структуру биологически активных веществ и их термодинамические свойства. Аминокислоты и пептиды - это соединения с асимметричным атомом углерода; они составляют основу живых организмов и участвуют во многих биологических процессах. Свойства кристаллических аминокислот и пептидов во многом определяются образованием цвиттер-ионов и существованием 7 межмолекулярных водородных связей. В то же время газовой фазе они находятся в молекулярной неионизированной форме. Уникальностью структуры аминокислот и пептидов и обоснован выбор указанных соединений в качестве объектов исследования. Аминокислоты, пептиды и их производные широко используются как модели биополимеров (полипептидов, протеинов) [6,7]. Несмотря на то, что на протяжении десятилетий аминокислоты, пептиды и их производные привлекают пристальное внимание исследователей [8-11], до сих пор весьма неполно изучены отдельные аспекты термохимического поведения этих веществ по сравнению с другими классами азотсодержащих органических соединений. Исследование термодинамики фазовых переходов аминокислот и пептидов способствует более глубокому пониманию особенностей кристаллического состояния этих веществ, имеющих донорные и акцепторные группы, способные к образованию водородных связей [6,12,13]. В литературе имеются немногочисленные надежные данные по термодинамике парообразования аминокислот и пептидов, а экспериментальному изучению структуры их молекул в газовой фазе посвящены лишь единичные работы. До сих пор не существует строгих теорий для прогнозирования энергетических параметров аминокислот и пептидов, содержащих в структуре молекул боковые радикалы различной химической природы. Ограниченность данных по энергетическим и геометрическим характеристикам аминокислот и пептидов затрудняет проведение корректного термодинамического анализа сольватации их молекул в жидких средах и сдерживает темпы развития структурной химии соединений данного класса. Следует отметить, что проведение квантовохимических расчетов строения многоатомных молекул, характеризующихся с конформационным многообразием, на высоком теоретическом уровне является сложной задачей. Вследствие невысокой термической устойчивости соединений рассматриваемых классов, экспериментальные исследования процессов их 8 парообразования тензиметрическими методами также представляются весьма непростыми. В плане последнего, перспективно сочетание эффузионного метода Кнудсена с масс-спектрометрическим контролем состава пара, позволяющее получить энтальпии сублимации аминокислот и пептидов и не требующего высоких давлений исследуемого пара. В отношении установления структуры свободных молекул этих соединений представляется перспективным использовать метод газовой электронографии – фактически единственный реально доступный метод, обеспечивающей исследование детальной структуры свободных многоатомных молекул, вне зависимости от их симметрии. Целью работы является определение энтальпии сублимации некоторых аминокислот и дипептидов с помощью эффузионного метода Кнудсена, выявление основных закономерностей влияния структуры боковой цепи их молекул на энергетические характеристики, установление детального геометрического строения L-триптофана методами газовой электронографии, масс-спектрометрии и квантовой химии. Объекты исследования: L--аминокислоты, содержащие в структуре боковые радикалы различной химической природы: L-серин, L-треонин, L-метионин, L-фенилаланин, L-тирозин, L-триптофан, L-пролин; дипептиды: глицил-L-аланин, L-аланил-L-аланин, DL-аланил-DL-валин, DL-аланил-DL-норвалин, L-аланил-Lтриптофан. Задачи исследования: 1. Исследование процесса сублимации семи аминокислот (L-серин, L-треонин, Lметионин, L-фенилаланин, L-тирозин, L-триптофан, L-пролин) и пяти дипептидов (глицил-L-аланин, L-аланил-L-аланин, DL-аланил-DL-валин, DL-аланил-DL- норвалин, L-аланил-L-триптофан) эффузионным методом Кнудсена с массспектрометрическим контролем состава пара. 9 2. Определение образования циклических форм исследуемых дипептидов и характера их фрагментации методами масс-спектрометрии и квантовой химии. 3. Экспериментальное (электронография) и теоретическое (квантово-химические расчеты) определение строения молекулы L-триптофана. 4. Установление наличия внутримолекулярной водородной связи в молекуле Lтриптофана с помощью NBO-анализа электронной плотности. 5. Установление взаимосвязи между структурными дескрипторами и энергетическими характеристиками исследуемых соединений. Методы исследования: масс-спектрометрия, квантово-химические расчеты, электронография. Научная новизна работы. Впервые электронографическим методом определена структура свободной молекулы L-триптофана. Установлено наличие внутримолекулярной водородной связи в изолированной молекуле L-триптофана с помощью NBO-анализа. Предложена систематизация структур L-триптофана, найденных в результате конформационного анализа. Кнудсена с масс-спектрометрическим контролем Эффузионным методом состава пара впервые определены энтальпии сублимации пяти дипептидов и семи аминокислот; выполнено их приведение к стандартным значениям при Т=298.15 К. Впервые получены масс-спектры электронной ионизации для DL-аланил-DL-норвалина и L-аланил-L-триптофана. Для алифатических дипептидов (глицил-L-аланин, Lаланил-L-аланин, DL-аланил-DL-валин, DL-аланил-DL-норвалин) установлено присутствие циклических форм в насыщенном паре методами масс- спектрометрии и квантовой химии. Разработана корреляционная модель «структура-свойство» для описания энтальпии сублимации аминокислот и дипептидов на основе использования молекулярных дескрипторов (дипольный момент, молекулярный объем, суммарное количество доноров/акцепторов Нсвязей). 10 Практическая значимость работы. Полученные результаты вносят значительный вклад в развитие представлений о взаимосвязи термодинамических и структурных свойств молекул аминокислот и пептидов. Энтальпии сублимации могут быть использованы при разработке и модификации парных потенциалов взаимодействия для теоретической оценки энергии кристаллических решеток. Результаты сублимационных экспериментов в совокупности со значениями тепловых эффектов растворения аминокислот и пептидов позволяют определить энтальпии сольватации в растворах различной химической природы, что открывает перспективы для использования растворителя как средства управления процессами в жидкой фазе. Высокая точность полученных новых экспериментальных данных позволяет использовать их в качестве справочного материала для создания баз структурных и термодинамических данных. Исследование молекулярного строения аминокислот имеет большое значение для развития теоретической химии, поскольку соединения этого класса оказываются исключительно гибкими в плане их использования для молекулярного дизайна более сложных структур. Подобная информация представляет интерес для исследователей, работающих в области физической, органической и биологической химии. Представленные в диссертации исследования поддержаны грантами РФФИ (07-03-00369а, 11-03-00013a, 12-03-31758мол_а) и Министерства образования РФ «Развитие научного потенциала высшей школы на 2009/2010 гг» №2.2.1.1/6088. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Строение молекулы L-триптофана в газообразном состоянии по данным газовой электронографии и квантово-химических расчетов. 2. Энтальпии сублимации аминокислот (L-серин, L-треонин, L-метионин, Lфенилаланин, L-тирозин, L-триптофан, L-пролин), полученные в рамках второго закона термодинамики. 11 3. Состав насыщенного пара и энтальпии сублимации дипептидов (глицил-Lаланин, L-аланил-L-аланин, DL-аланил-DL-валин, DL-аланил-DL-норвалина и Lаланил-L-триптофана), полученные в рамках второго закона термодинамики. 4. Данные по образованию циклических форм исследуемых дипептидов и характеру их фрагментации. 5. Корреляционное энергетических соотношение характеристик «структура-свойство» из структурных для расчета дескрипторов молекул аминокислот и дипептидов. Личный вклад автора заключается в непосредственном участии на всех этапах работы: постановка цели и задач исследования, планирование эксперимента, выполнение электронографических и масс- спектрометрических экспериментов, формулировка выводов. Автором лично проведена обработка данных электронографического и масс-спектрометрического экспериментов, выполнены квантово-химические расчеты структуры изученных молекул. Автор принимал активное участие в обсуждении и обобщении результатов исследований, а также в подготовке с соавторами основных публикаций по выполненной работе. Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю проф. Гиричеву Г.В. за помощь на всех этапах работы, проф. Гиричевой Н.И. (ИвГУ) за помощь в интерпретации результатов эксперимента и квантовохимических расчетов. Автор также благодарен ст.н.с. Краснову А.В. и асп. Жабанову Ю.А. за помощь в выполнении масс-спектрометрического эксперимента. Автор признателен вед.н.с. Баделину В.Г. (ИХР РАН) за полезные дискуссии при обсуждении результатов. Степень достоверности результатов проведенных исследований. Экспериментальные результаты, представленные в диссертационной работе, получены на протестированном современном научном оборудовании различными 12 взаимодополняющими физико-химическими методами. Результаты работы опубликованы в рецензируемых российских и зарубежных научных журналах. Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на научных конференциях «Фундаментальные науки — специалисту нового века» (Иваново, ИГХТУ, 2009-2011 гг.); III - VIII Всероссийских школахконференциях молодых учёных «Теоретическая и экспериментальная химия жидкофазных систем» (Крестовские чтения) (Иваново, ИХР РАН, 2008-2013 гг.); IV - VI Всероссийских молодежных школах-конференциях «Квантово- химические расчеты: структура и реакционная способность органических и неорганических молекул» (Иваново, ИГХТУ-ИвГУ, 2009-2013 гг.); 89-й ежегодной научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Неделя науки – 2009» (Иваново, ИвГМА, 2009 г.); XII Молодежной конференции по органической химии (Суздаль, 2009 г.); открытом конкурсе Министерства образования и науки РФ на лучшую работу студентов по естественным, техническим и гуманитарным наукам в вузах России по разделу 08 «Химические науки, химическая технология, химическое машиностроение» за 2008/2009 год; VI Международной научной конференции “Кинетика и механизм кристаллизации. Самоорганизация при фазообразовании” (Иваново, 2010 г.); V Российско-Германском научном семинаре по вопросам изучения структуры и энергетики молекул в газовой фазе (Иваново, ИГХТУ 2010 г.); XI Международной конференции «Проблемы сольватации и комплексообразования в растворах» (Иваново, 2011 г.); VII Международной конференции «Кинетика и механизм кристаллизации. Кристаллизация и материалы нового поколения» (Иваново, 2012 г.); Ивановском городском семинаре по структуре и энергетике молекул (Иваново, ИГХТУ, 2012-2013 г.); VII кристаллохимической конференции (Суздаль, 2013 г.); Национальной XV Европейском симпозиуме по газовой электронографии (Фрауенкимзе, Германия, 2013 г.). 13 Публикации. Основное содержание диссертационной работы изложено в 5 статьях, опубликованных в рецензируемых научных журналах и изданиях из Перечня ВАК, и тезисах 36 докладов на научных конференциях. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, посвященных обзору литературы, описанию экспериментальных и теоретических методов исследования, результатам масс-спектрометрических и электронографических исследований и квантово-химических расчетов аминокислот и дипептидов и их обсуждению, а также включает раздел «Основные результаты и выводы» и список цитируемой литературы (162 наименования). Материал работы изложен на 134 страницах машинописного текста, а также представлен в виде 20 таблиц и 28 рисунков. 14 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Общая характеристика аминокислот и дипептидов Аминокислоты – это органические соединения, физико-химическое поведение и разнообразие реакций, в которых они участвуют, объясняются одновременным присутствием в молекуле основной аминогруппы -NH2 и кислой карбоксильной группы –СООН [14]. -Аминокислоты представляют собой производные карбоновых кислот, у которых один водородный атом у -углерода замещен на аминогруппу (-NH2). Следует подчеркнуть, что все аминокислоты, входящие в состав природных белков, являются -аминокислотами, хотя аминогруппа в свободных аминокарбоновых кислотах может находиться в -, -, - и - положениях [15]. Аминокислоты, как составные части белков, участвуют в различных биохимических процессах наряду с нуклеиновыми кислотами, углеводами и липидами [15,16]: метионин (α-амино-γ-метилтиомасляная кислота) - незаменимая аминокислота, служит в организме донором метильных групп при биосинтезе холина, адреналина и многих других биологически важных веществ; серин (α-амино-β-оксипропионовая кислота) - заменимая аминокислота, входит в состав активного центра некоторых ферментов и сложных липидов; треонин (αамино-β-оксимасляная кислота) - незаменимая аминокислота, участвует в образовании водородных связей; фенилаланин (α-амино-β-фенилпропионовая кислота) - незаменимая аминокислота, является предшественником тирозина; тирозин (α-аминопарагидроксифе-нилпропионовая кислота) - заменимая аминокислота; в организме человека и животных – исходное вещество для синтеза гормонов щитовидной железы, адреналина и др.; триптофан (βиндолиламинопропионовая кислота) - незаменимая аминокислота, используется клетками млекопитающих для синтеза никотиновой кислоты (витамин РР); пролин (пирролидин-2-кардоновая кислота) - заменимая аминокислота, влияет на 15 характер укладки полипептидной цепи белка при формировании его третичной структуры. Аминокислоты используются в биосинтезе полипептидов и белков, а также в синтезе фосфатидов, нуклеотидов и др. Белки – высокомолекулярные природные полимеры, построенные из остатков аминокислот, соединенных амидной (пептидной) связью (-СО-NH-). Каждый белок характеризуется специфической аминокислотной последовательностью. -Аминокислоты, выполняющие роль структурных элементов в белках, отличаются друг от друга строением боковых групп (боковых цепей), обозначенных R; в состав белков входят, как правило, аминокислоты в L-конфигурации [16]. -Аминокислоты в белках соединены между собой пептидными связями, образованными карбоксильной группой одной аминокислоты и -аминогруппой другой. Познание биологических функций и, в частности, молекулярного механизма физиологического действия белка невозможно без детального знания его строения. Установление первичной структуры белка служит основой для определения вторичной и третичной структур, выяснения расположения функциональных групп в его активном центре и открывает путь к познанию механизма его фунционирования. Каждый белок или пептид специфическим образом свернут в пространстве, и эта конформация определяет его физико-химические и биологические свойства [14,16]. Пространственная структура белка (пептида) в целом кодируется его первичной структурой. Эта взаимосвязь создает предпосылки для теоретических расчетов и предсказаний вторичной структуры белков на основе их аминокислотной последовательности. Пространственная структура достаточно подвижна, т.е. способна изменяться под воздействием внешних условий или различных агентов, и в этом смысле правильнее говорить о предпочтительной 16 конформации белка или пептида, об одной из многих, энергетически наиболее выгодной пространственной структуре. Стереохимия аминокислот. Все встречающиеся в белках аминокислоты (кроме пролина) могут быть изображены формулой NH2CHRCOOH, где Rбоковая цепь различной природы. В общем случае эти соединения с асимметричным атомом углерода, и, следовательно, каждая аминокислота может существовать в пространстве в виде двух форм – с L- и D- конфигурацией асимметрического центра: COOH H H2N R COOH H NH2 R Рисунок 1.1.1 – Структурные формулы L- и D-аминокислот Принадлежность аминокислот к L- и D- ряду доказывается прямым сведением к соответствующему глицериновому альдегиду с помощью стереоспецифических превращений. В состав большинства природных белков входят L-аминокислоты. При получении аминокислот для исследовательских и практических целей с помощью микробиологического синтеза продуктами являются L-изомеры. При химическом синтезе обычно образуются смеси L- и D- изомеров аминокислот, т.е. рацематы. Для разделения рацемических аминокислот в последние годы в производственных условиях используются хроматография на оптически активных адсорбентах и иммобилизованные ферменты. Все приведенные рассуждения в полной мере применимы и к пептидам. Пептидная связь. Главной структурной единицей белков и пептидов является пептидная (амидная) связь –C(O)-N(H)-. Согласно современным представлениям, пептидная связь в белках является практически плоской (торсионный угол OCNH близок к нулю). В обычных условиях наблюдаются 17 лишь небольшие отклонения от плоской системы (до 5-10о); большие деформации возможны в напряженных циклических системах. Расстояние между атомами C и N в пептидной связи (равное 0.132 нм) является промежуточным между простой (ординарной) связью (связь -C-N-, длина которой равна 0.147 нм) и двойной связью (связь -С=N-, длина - 0.125нм). Это создает предпосылки для осуществления по месту двойной связи таутомерных перегруппировок и для образования енольной (лактимной) формы. Последняя, в свою очередь, дает молекуле белка ряд преимуществ (повышение реакционной способности, возникновение дополнительных возможностей вращения и др.) [15]. Обычно пептидная связь имеет транс-конфигурацию, т.е. является транспланарной. В напряженных циклических системах (некоторые циклопептиды, производные пролина и т.д.), а также при большом размере заместителей у атома азота, в N-алкилированных производных пептидная связь может существовать в плоской цис-форме. Цис- и транс- пептидные связи можно различить с помощью физических методов (ИК-, ЯМР- спектроскопии и др.). В белках пептидная связь практически всегда имеет транс-конфигурацию [16]. Уникальная особенность аминокислот и пептидов состоит в том, что в твердом состоянии и в сильнополярных растворителях аминокислоты и пептиды существуют в виде диполярных цвиттер-ионов, у которых аминогруппы протонированы (-NH3+), а карбоксильные группы диссоциированы (-СОО-). Это объясняет относительно высокую температуру разложения аминокислот (200300оС) и их низкую растворимость в неполярных растворителях. Доказателства ионного дипольного строения аминокислот получены методами ЯМР-, ИК- и КРспектроскопии: в спектрах отсутствуют полосы поглощения NH2- и СООН – групп [14]. Цвиттер-ионная форма аминокислоты и дипептида не реализуется в газовой фазе, что подтверждено экспериментально [17,18]. Для кристаллического состояния аминокислот и пептидов характерно образование межмолекулярных водородных связей N–H+ ··· –O–C, которые стабилизируют цвиттерионную форму 18 и играют важную роль в формировании структуры аминокислот и пептидов в кристаллах [19]. Энергия межмолекулярного взаимодействия может быть оценена на основе рентгеноструктурных данных [20] и теплот сублимации [21,22]. 1.2. Термодинамика процессов сублимации аминокислот и дипептидов Несмотря на то, что к настоящему времени выполнено большое число экспериментальных и теоретических исследований, посвященных изучению сублимации различных кристаллов (металлических, ионных, валентных, полупроводниковых) [23], самостоятельный интерес вызывают органические кристаллы, в узлах кристаллической решетки которых располагаются обычно молекулы, обладающие большими эффективными протяженностью и объемом. В самом общем случае энергия межмолекулярного взаимодействия в молекулярных кристаллах складывается из трех эффектов: ориентационного (эффект Кеезома), индукционного (эффект Дебая) и дисперсионного (эффект Лондона) [24]. Однако для кристаллов, содержащих полярные молекулы, в том числе цвиттер-ионы (аминокислоты, пептиды), значительный вклад в полную энергию могут вносить электростатические взаимодействия и образование водородных связей. По величине энтальпии сублимации можно судить о взаимодействиях в кристалле. Термодинамические параметры сублимации – процесса прямого перехода вещества из твердой в газовую фазу - имеют особую ценность при изучении молекулярных органических кристаллов. Хорошо известно, что тепловой эффект растворения кристалла определяется в равной мере как энергией Гиббса сольватации, так и величиной энергии Гиббса сублимации. Кроме того, она характеризует энергию кристаллической решетки. Экспериментально полученные значения энтальпии сублимации (∆subНmo) используются при изучении полиморфизма и анализе молекулярных упаковок. Они служат «реперными» значениями для нормировки функций парных потенциалов 19 взаимодействия, используемых для теоретических расчетов энергий кристаллических решеток [25]. Имеющиеся теоретические подходы к испарению твердых тел относятся преимущественно к идеальным моноатомным кристаллам. Традиционно использование уравнения Клаузиуса-Клапейрона или его модификаций для определения ∆subНmo по давлению пара [23,26,27]. При низком давлении пара (103 -10-5 Торр) энтальпию сублимации можно считать равной энергии решетки, взятой с обратным знаком. Однако следует заметить, что ∆subНmo может строго рассматриваться как энергия решетки соединения, только если при изменении агрегатного состояния существенно не меняется конфигурация молекул и энергия их колебаний, а также если исследуемому пару можно приписать свойства идеального газа [27]. Исследование тепловых свойств модельных соединений белков (аминокислот, пептидов) в твердом состоянии и, в частности, изучение энтальпий сублимации и теплоемкости в широком интервале температур, позволяет получить экспериментальные значения фундаментальных термодинамических параметров этих соединений и связать их с динамическими свойствами и с конформационными особенностями макромолекул [28]. Методы тепловых измерений биологических объектов находят все большее применение в молекулярно-биологических исследованиях [13,29,30]. Энтальпия сублимации относится к числу важнейших характеристик твердого состояния органических соединений, среди которых особый интерес вызывают аминокислоты и пептиды, являющиеся простейшими структурными элементами протеинов. Величины ∆subНmo этих соединений не только отражают степень межмолекулярных взаимодействий в кристаллической форме, но и во многом определяют характер взаимодействия биомолекул при растворении [23]. Молекулы аминокислот и пептидов и в растворе, и в кристаллическом состоянии находятся в цвиттер-ионной форме [26]. Структура кристаллических биовеществ 20 и природа водородных связей непосредственно обусловлена электронным строением их молекул, которые обладают значительными по величине эффективными зарядами на группах COO- и NH3+. Это объясняет довольно большие дипольные моменты аминокислот и дипептидов, их более высокую растворимость в воде, чем в органических растворителях [23,31]. Кроме того, как было отмечено выше, они имеют достаточно высокие температуры плавления (разложения). Как правило, пептиды разлагаются либо в кристаллической фазе при нагревании, либо в процессе сублимации [32]. Это осложняет прямое экспериментальное определение энтальпии сублимации и свидетельствует о том, что в кристаллах сила межмолекулярного взаимодействия соизмерима с прочностью внутримолекулярных ковалентных связей [23,33]. Поэтому определение ∆subНmo органических кристаллов не потеряло своей актуальности до сих пор. Методы оценки энтальпии сублимации сравнительно немногочисленны и ориентированы в основном на углеводороды, не содержащие атомов N и O [34,35]. Имеющиеся теоретические подходы к оценке тепловых эффектов испарения твердых тел относятся преимущественно к идеальным моноатомным кристаллам. Несмотря на то, что исследования процессов сублимации аминокислот и пептидов ведутся с начала XX века [36], достоверные термодинамические величины получены только для некоторых аминокислот и ацетилзамещенных пептидов [28]. Измерение энтальпии сублимации основывается на переносе массы и прямо или косвенно зависит от давления пара. Поэтому методы определения энтальпии сублимации в подавляющем большинстве случаев сводятся к методам определения давления насыщенного пара. Авторы [36] провели исследования 12 аминокислот и 6 дипептидов и установили, что сублимация этих соединений сопровождается сравнительно небольшим разложением, но давление паров столь мало, что получение величин энтальпий крайне затруднительно. 21 В работе [37] термодинамические параметры сублимации 13 алифатических аминокислот получены при 455.15 К с погрешностью 8 кДж/моль на основе измерения давления их паров эффузионным методом Кнудсена. Давления паров отдельных аминокислот изменялось от 0,19∙10-4 Торр (для норлейцина) до 0,451∙10-3 Торр (для амино-изобутановой кислоты), что являлось пределом чувствительности использованного метода. Энтальпии сублимации саркозина, Lпролина и L-метионина измерены с погрешностью 4 кДж/моль в интервале (380 – 420) К, используя тензиметрический метод [38,39], при этом определение энтальпии сублимации L-цистеина оказалось невозможным, поскольку давление паров этого соединения не превышало 10-5 Торр, а дальнейшее повышение температуры приводило к его разложению. Авторами работы [32] получены энтальпии сублимации 11 аминокарбоновых кислот; показано, что давление насыщенных паров каждого вещества должно составлять не менее 3·10-3 Торр для получения надежных данных по теплотам сублимации. Попытка исследования сублимации DL-серина, имеющего полярную ОН-группу, и дипептида глицилглицина оказалась неудачной – происходило разложение указанных веществ. В последующие годы для повышения летучести аминокислот и пептидов их подвергали ацетилированию и метилированию [40], и использовали полученные соединения, а также их амиды для термохимических исследований процессов парообразования [41-43]. Современное состояние экспериментальных измерений энтальпий испарения, сублимации и давления насыщенного пара органических соединений, включая аминокислоты, отражено в монографии [44] и обзорах [28,34,45,46]. В последнее десятилетие вновь наблюдается рост публикаций по термодинамическому исследованию кристаллических аминокислот, пептидов и их производных [47-49]. Этому способствовали модернизация и усовершенствование методов определения давления паров органических и 22 биоактивных соединений [50,51]. Эффузионным методом Кнудсена было проведено исследование сублимации цистеина [52]. Авторы использовали уравнение Клаузиуса-Клапейрона для вычисления значения энтальпии сублимации, равной 146.6±1.4 кДж/моль. Кроме этого, были получены и другие термодинамические параметры процесса испарения данной аминокислоты. Следует отметить, что в экспериментальной части работы [52] для цистеина не было зафиксировано переходов в твердой фазе для исследуемого интервала температур Т = (263 - 440) К. Тогда как известны несколько полиморфных форм цистеина, обусловленных SH-группой. Попытки определения энтальпии сублимации N-ацетил-цистеина не увенчались успехом вследствие разложения соединения в процессе проведения эксперимента. Авторам работы [53] удалось получить значение энтальпии сублимации саркозина в узком интервале температур (410 426) К эффузионным методом Кнудсена с более высокой точностью (0.7) кДж/моль. Тем же методом определены молярные энтальпии сублимации DL--аланина и -аланина при Т=298.15 К [54]. В работе [6] на основе аддитивной схемы по групповым вкладам проведен анализ экспериментальных значений энтальпий образования L-аминокислот и пептидов. Рассчитаны групповые вклады в энтальпию образования. Вычислены термохимические характеристики широкого ряда аминокислот и их производных. Для вычисления энтальпии сублимации аминокислот и их производных использовано термохимическое уравнение, ранее с успехом применявшееся при вычислении соответствующего параметра органических соединений различных классов. Но в данном случае не учитывается тот факт, что аминокислоты в кристаллическом состоянии представляют собой цвиттер-ионы, в отличие от молекул других органических соединений. Завышение опытного значения энтальпии сублимации авторы связывают с погрешностями при проведении 23 эксперимента, а наиболее надежными данными предлагают считать рассчитанные ими значения. Аминокислоты являются основными компонентами белковых соединений, температура плавления-разложения которых относительно невелика (редко превышает 373 К). Большинство самих аминокислот и пептидов плавится при более высоких температурах (в области 573 К) [55]. Имеющиеся в литературе [5557] данные о температурах плавления имеют значительный разброс. Данные о тепловых эффектах кристаллических дипептидов практически отсутствуют [58]. Теплоемкости ряда кристаллических веществ: семи аминокислот и десяти алифатических пептидов были определены методом ДСК в интервале температур 298348 К в работе [59]. Анализ экспериментальных данных показал, что молярная теплоемкость исследуемых веществ находится в линейной зависимости от числа атомов и суммы длин связей в молекуле, что может быть использовано для оценки неизвестных значений теплоемкости данного класса соединений. Следует отметить обзор имеющихся данных по теплоемкости и энтропии фазовых переходов органических соединений в конденсированной фазе, включая аминокислоты и пептиды, опубликованный в 1996 году [60]. Исследование термического поведения аминокислот методами дифференциального термического анализа и термогравиметрии, осуществленное в работах [61-63] показало, что высокие температуры разложения аминокислот могут быть приписаны электростатическим взаимодействиям между противоположно заряженными группами в кристаллической решетке. По термической стабильности, связанной с температурой начала разложения вещества, аминокислоты могут быть расположены в последовательности: Lys>Arg>Asn>Phe>Ala>Val>Leu>Gly>Met>Ser>Thr>Cys>Gln. Пептиды, состоящие из нескольких аминокислотных остатков, являются простейшими из биологически активных веществ объектами для изучения. С 24 другой стороны, они служат основой и сохраняют свои индивидуальности в более сложных полипептидных и белковых соединениях, поэтому не ослабевает интерес к дериватографическим и калориметрическим исследованиям аминокислот и некоторых дипептидов [30,59,64,65]. Показано, что для пептидов одного гомологического ряда характер фазовых превращений и их количественные параметры (тепловой эффект, температуры фазовых переходов) определяются строением молекулы дипептида и длиной боковой углеродной цепи. У веществ, имеющих линейную структуру, плавление сопровождается химическим разложением. При нагревании дипептидов, молекулы которых имеют аполярные аминокислотные группы, стадии плавления дипептида отсутствуют – происходит его разложение на составляющие аминокислоты [59,65]. Отмечено [30], что взаимное влияние двух аминокислотных остатков делает дипептиды менее стабильными, чем исходные компоненты. В твердой фазе метильная группа играет ключевую роль в термической стабильности дипептида. Потеря массы, соответствующая карбоксильной, амино- или функциональной группе, указывает на начало процесса разложения [30]. Подробное термогравиметрическое изучение разных аминокислот проведено в работе [66]. Анализ полученных дериватограмм позволяет заключить, что для всех образцов L-α-аминокислот не характерно присутствие как гигроскопической, так и кристаллизационной воды. Для некоторых аминокислот не представляется возможным однозначно фиксировать температуру плавления, поскольку этот процесс сопряжен с разложением. 1.3. Водородные связи в аминокислотах и дипептидах Среди факторов, оказывающих влияние на конформацию пептидов, значительную роль играют нековалентные взаимодействия, под которыми подразумеваются все взаимодействия атомов или групп атомов, не приводящие к возникновению ковалентных связей. Они могут образовываться между боковыми 25 цепями, между компонентами различных пептидных связей, а также между пептидными связями и боковыми группами. Эти нековалентные взаимодействия совместно с взаимодействием биовещество-растворитель не только ответственны за нативную конформацию белковой молекулы, но и имеют решающее значение как для реакций между белками, так и для взаимодействия белков с большими и малыми молекулами и ионами [19, 31]. Изучение водородных связей остается актуальной задачей научных исследований вследствие их значимости в прикладных науках о материалах, органической и неорганической химии, биохимии и медицины. Несмотря на то, что образование водородных связей является хорошо известной концепцией, продолжают проводиться исследования по выявлению Н-связей и определению энергетики водородного связывания различными теоретическими методами. В настоящее время большое внимание обращено на электронную природу водородной связи [67]. Под понятием водородной связи подразумевается взаимодействие водородного атома, связанного с электроотрицательным атомом (азот, кислород, сера), с другим электроотрицательным атомом [31]: X–H···Y. Расстояния между атомами X и Y, которые принято называть длинами Н-связи, лежат в пределах 2.2 < RXY < 3.5 Å. Это большой диапазон, поэтому говорят о сильной (RXY < 2.45 Å), промежуточной, или средней, (2.45 < RXY < 2.80 Å) и слабой (RXY > 2.45 Å) водородных связях[68]. 26 Таблица 1.3.1 – Приближенные характеристики разных типов водородных связей [68] Преимущественный тип взаимодействия Расстояние H···Y, Å Удлинение X-H, Å Сопоставление длин ковалентной и водородной связей Расстояние X···Y, Å Угол X-H···Y, град Энергия связи, ккал/моль Относительное смещение ИКчастоты Сильная Промежуточная Ковалентный Электростатический 1.2 – 1.5 0.08 – 0.25 1.5 – 2.2 0.02 – 0.08 Слабая Электростатический/ дисперсионный > 2.2 < 0.02 X-H ≈ H···Y X-H < H···Y X-H << H···Y 2.2 – 2.5 170 – 180 2.5 – 3.2 > 130 > 3.2 > 90 15 – 40 4 – 15 <4 25 % 10 – 25 % < 10 % В белковых молекулах содержится ряд групп, принимающих участие в образовании водородной связи: а) водородная связь между пептидными группами Ri- C=O…H-N -Rj б) водородная связь между нейтральными группами боковых цепей Ri- С=O…HO-C - Rj в) водородная связь между нейтральной и заряженной группами боковой цепи Ri – OH…CОО(-) - Rj г) водородная связь между заряженными группами боковых цепей внутри белковой молекулы Ri – NH3+… CОО(-) - Rj д) водородная связь между пептидной группой и группой боковой цепи Ri – OH…O=C-NH-Rj. Хорошо известно, что природа водородных связей есть наложение двух типов взаимодействий: ван-дер-ваальсового и кулоновского. При образовании водородных связей существенно изменяется расстояние между атомом акцептора 27 водородной связи и его донором. Более того, энергия такого связывания существенно зависит от угла между атомами во фрагменте X–H···Y. Эти факты и побудили ввести в рассмотрение новую параметризацию для водородной связи [69]. Общий квантово-химический подход к описанию водородной связи существенно не отличается от подхода, применяемого для межмолекулярных взаимодействий. Например, для слабых Н-связей, когда взаимодействия между молекулами рассматриваются как возмущение, можно выделить электростатическое взаимодействие невозмущенных молекул, поляризацию, перенос заряда, обменное и дисперсионное взаимодействия. Многочисленные исследования показали, что минимальный уровень расчета, который может быть рекомендован для расчета молекулярных систем с водородными связями, это MP2/6-31+G(d,p) или B3LYP/6-31+G(d,p) [68]. Проведенные нейтронографические исследования на монокристаллах малых молекул показали, что положения водородных атомов могут устанавливаться с точностью не хуже 0.02 Å. В отличие от этого, рентгеноструктурные исследования кристаллов биологических макромолекул лишь в редких случаях позволяют достичь подобного разрешения [19]. Выводы о существовании подавляющего большинства водородных связей в аминокислотах, пептидах и белках основаны на обнаружении в должной мере сокращенных расстояний между вероятными донорными и акцепторными группами в кристаллических структурах, установленных рентгенографическим методом. Следовательно, структурные доказательства существования конкретных водородных связей в белках имеют лишь косвенный характер. В работе [70] содержится обзор водородных связей в 28 структурах аминокислот, пептидов нейтронографическим рентгенографическим и методом, методом. родственных и Обзор в 68 молекул, исследованных структурах, исследованных современных кристаллографических 28 данных позволяет заключить, что существуют различия в длинах водородных связей, образуемых различными донорными и акцепторными группами в аминокислотах и пептидах, и, следовательно, в энергетике их образования. 1.4. Масс-спектрометрическое исследование аминокислот и дипептидов Масс-спектрометрия – метод определения химического, фазового состава и молекулярной структуры вещества, основанный на регистрации спектра масс ионов, образованных в результате ионизации атомов и (или) молекул пробы. Принцип масс-спектрометрического интенсивностей ионных токов, анализа величины основан на которых измерении пропорциональны концентрациям компонентов в пробе. По спектру масс (совокупность значений m/z и относительных интенсивностей соответствующих ионов I,%) определяют относительное содержание элементов, изотопов определенного элемента, концентрацию и структуру химических соединений в образце [71]. Массспектрометрия является универсальным аналитическим измерительным методом, а во многих случаях - единственным методом прецизионного контроля состава вещества в газообразном, твердом или жидком состоянии. Масс- спектрометрический метод получил широкое распространение для определения состава пара и структуры молекул, установления изотопного состава веществ, проведения элементного анализа образцов, исследования кинетики элементарных процессов, определения характеристик веществ. состава примесей, Исследования а также термодинамических парогазовых процессов в высокотемпературной химии построены на сочетании масс-спектрометрии с эффузионным методом Кнудсена. При изучении биообъектов масс-спектрометрия применяется в основном для определения аминокислотной последовательности белков и пептидов, идентификации веществ, изучения метаболических процессов при химическом и ферментативном расщеплении белков, в биотехнологии. 29 Первые масс-спектрометрические исследования аминокислот и пептидов были проведены в 50-х годах XX века. Работа [72] посвящена изучению массспектров и фрагментации спиртов полиаминов, поведение которых в газовой фазе сходно с пептидами. Успешное проведение эксперимента и определение основных направлений фрагментации позволило авторам надеяться на благоприятные результаты аналогичных исследований ацетилпроизводных ди- и трипептидов. Авторами [73] получены масс-спектры метионина и моногидрохлорида лизина. В работе обсуждается фрагментация молекул, выделяются как общие направления, так и индивидуальные особенности, делается вывод о возможности идентификации даже небольших количеств аминокислот с помощью массспектрометрии. Обширное исследование аминокислот методом масс-спектрометрии представлено в работе [74]. Изучены все важнейшие аминокислоты и некоторые их ацетилпроизводные. Подробно рассмотрен механизм фрагментации молекул под действием электронного удара, приведены основные пики интенсивности в спектре для каждой из групп соединений (ароматические, алифатические, серо- и гидроксилсодержащие аминокислоты). Определены наиболее характерные для них направления фрагментации: элиминирование боковой цепи R, карбоксильной группы и перегруппировка МакЛафферти. Для пролина и циклолейцина отмечено, что образование ионов [[M]-COOH]+ является преобладающим по сравнению с аминокислотами, имеющими такое же количество атомов углерода (валин, норвалин и лейцин, изолейцин, соответственно). Гидроксилсодержащие аминокислоты лучше всего вступают в перегруппировку МакЛафферти, вследствие чего в спектре регистрируются ионы m/z=75 а.е.м., имеющие довольно высокую интенсивность. В дальнейшем они переходят в m/z=57 а.е.м. вследствие отщепления m/z=18 а.е.м. Ионы [H2O]+ имеют в спектре приемлемую для регистрации интенсивность, а вот количество [M-[H2O]]+ - пренебрежимо мало, 30 поскольку либо образуется в ограниченном количестве, либо претерпевает дальнейшую фрагментацию до более стабильных ионов. Что касается серосодержащих аминокислот, то отмечено термическое разложение цистеина и невоспроизводимость его масс-спектра. Напротив, масс-спектр метионина очень богат на различные и весьма интенсивные ионы. Также отмечена возможность появления ионов [H3S]+ при некоторых условиях. Сохранение заряда на R (ионы R+) характерно для ароматических аминокислот. К примеру, в спектре фенилаланина пик иона PhCH2+ - второй по интенсивности. Согласно авторам [74], в ароматических аминокислотах происходит бензильный разрыв с образованием резонансно стабилизированного иона. Дальнейшие процессы приводят к полностью рандомизованному тропилий-катиону, который далее последовательно теряет две молекулы ацетилена. У фенилаланина высокую интенсивность имеет пик с m/z=74 а.е.м., тогда как у тирозина его интенсивность значительно ниже. Причиной этого является способность R-CH2-фрагмента тирозина локализовывать положительный заряд. Также отмечается возрастание πэлектронной плотности в кольце в серии фенилаланин – тирозин -триптофан. Таким образом, усиление электронной плотности возрастает со способностью локализовывать заряд. В работе [75] эти же авторы исследовали масс-спектры ряда дипептидов (22 молекулы), где, помимо подробных схем фрагментации, представили интересные данные по циклизации изначально ациклических дипептидов в твердой фазе при нагревании. Данный факт выявлен благодаря высокой интенсивности ионов состава [H2O]+ и [M-[H2O]]+, а также наличием пиков на массах, которые могут быть получены исключительно при фрагментации циклического дипептида. Коллективом авторов [76] исследованы масс-спектры протонированных аминокислот в режиме лэнгмюровского испарения при использовании химической ионизации оценена энтальпия сублимации и, с учетом известных теплот растворения, рассчитана энтальпия сольватации. 31 Интересна работа [77], посвященная изучению масс-спектров нескольких биологически активных соединений, полученных разными методами ионизации. Авторы подчеркивают, что электронная ионизация (ЭИ) дает более глубокую фрагментацию, тогда как химическая ионизация (ХИ), полевая ионизация (ПИ) и полевая десорбция (ПД) – более «мягкие» методы, приводящие к высокой интенсивности в масс-спектре молекулярного иона. Приводятся наглядные спектры лейцина, изолейцина и норлейцина. Авторами [77] отмечается невозможность получения спектров ЭИ, ХИ, ПИ цистеина и аргинина вследствие низкого давления их паров, но спектр ПД с высокой интенсивностью протонированного молекулярного иона получить вполне реально. В последнее десятилетие наблюдается рост интереса к масс-спектрометрии аминокислот, что связано с развитием экспериментальной техники. Появляются такие методы, как электроспрей-ионизация и матричная лазерная десорбционная ионизация (МЛДИ), которые очень удобны для анализа биологически активных веществ. В работе [78] рассматривается применение данных методов к изучению пептидов и белков, особенно к определению их молекулярного веса. Определение основности аминокислот в газовой фазе методом электроспрея предлагают авторы работы [79]. Таким образом, исключительно высокая чувствительность, высокое разрешение по массе, быстрота анализа – ключевые факторы, благодаря которым масс-спектрометрия стала лидером аналитических методов, используемых для идентификации и исследования биомолекул [80]. 1.5. Квантово-химические расчеты структуры аминокислот Неоценимую помощь в исследовании структуры и свойств аминокислот оказывают теоретические расчеты. Первые работы по определению различных параметров данных молекул относятся к середине 70-х годов XX века. К примеру, работа [81] посвящена установлению электронной структуры и типу связи в 32 аминокислотах. Здесь полуэмпирическими методами (CNDO, INDO) исследовались цвиттер-ионы. Различные энергетические характеристики, в том числе и сродство к протону, представлены как зависящие от энергии высшей занятой (ВЗМО) и низшей свободной (НСМО) молекулярной орбитали. Установлено, что использованный метод несколько завышает энергию ВЗМО. Сделано предположение, что отрыв электрона при ионизации должен происходить от карбоксилатной группы у неароматических аминокислот, тогда как у тирозина и триптофана электрон уходит из кольца, а в случае фенилаланина нельзя сделать однозначного вывода. Приведены таблицы со значениями полных энергий ВЗМО и НСМО, заряды на боковой цепи и характеристики молекулярных орбиталей. На более высоком теоретическом уровне проведены расчеты в работе [82]. Здесь использован метод самосогласованного поля (SCF), с базисными наборами 4-31G и 6-31G. Приведены величины полных энергий и дипольных моментов, потенциалов ионизации, сродства к протону и разницы в энергиях между молекулами, находящимися в разных агрегатных состояниях, для ряда аминокислот (глицин, аланин, серин, цистеин, треонин). Предложена диаграмма энергетических уровней для переходов аминокислот из твердой фазы в газ или раствор и схема вычисления теплот растворения, сольватации и сублимации. В работе [83] рассмотрены ближние взаимодействия между аминокислотными фрагментами в протонированных пептидах, находящихся в газовой фазе. В большинстве своем они представляют собой внутримолекулярные водородные связи типа N-H+···O=C И C=O-H+···O=C, для которых были проведены вычисления параметров реакционной способности, основности, сродства к протону. Также затронут вопрос возникновения водородных связей между протонированным фрагментом пептида и метанолом. Довольно остро стоит проблема поиска и адекватной идентификации конформеров аминокислот, поскольку данные молекулы имеют множество 33 вращательных степеней свободы и, как видно из исследований, множество конформеров, не сильно различающихся по энергии. Тщательное исследование конформационного многообразия аминокислот проведено в работе [84]. Авторы проанализировали все возможные конформеры для аланина, серина и цистеина. Расчеты проводились с постепенным повышением уровня теории: от полуэмпирических (AM1) до ab initio (MP2/6-31+G*) методов. В итоге число конформеров для аланина составило 10, для серина – 51, для цистеина – 42. Вычислены дипольные моменты, вращательные постоянные относительные энергии и энергии межатомных взаимодействий для всех конформеров. Для серина и цистеина построены графики зависимости относительной энергии от уровня теории. Предложены схемы образования внутримолекулярных водородных связей для данных аминокислот. ИК-спектроскопия, как и спектроскопия КР, является надежным инструментом для идентификации вещества. А в сочетании с квантовохимическими расчетами можно получать надежные данные, позволяющие определить строение молекулы в жидкой фазе. Для аминокислот это особенно актуально в свете того, что в растворе и кристалле они находятся в цвиттерионной форме, которая не реализуется в газовой фазе. Классическое исследование подобного рода описано в работе [85]. Для триптофана экспериментально сняли ИК-спектр в KBr и с применением метода «растворение-распыление-осаждение» (РРО), а также теоретически рассчитали структуру и интенсивности частот колебаний для трех конформеров методом самосогласованного поля на уровне тории HF/6-31G(d,p) в среде KBr. Полученные спектры сравнивались между собой, а структурные параметры конформеров сопоставлялись с результатами рентгеноструктурного анализа гидрохлорида триптофана. Частоты и интенсивности, полученные методом РРО, оказались в хорошем согласии с теоретическими данными для основного конформера аминокислоты. 34 Для аминокислот и дипептидов известны исследования ИК-спектров, в том числе и с использованием метода нанесения образца на ИК-прозрачную подложку посредством распыления раствора изучаемых соединений с последующим высушиванием. К примеру, в работе [86] рассматривается спектр цвиттер-ионных форм валил-аланина и аланил-валина, доказываются преимущества данного метода нанесения образца перед традиционными, описывается сравнение экспериментального спектра со спектром, полученным из квантово-химических расчетов. На основании последнего, делается вывод о структуре дипептида, указывается на существование 6 и 5 конформеров для DL-валил-DL-аланина и DL-аланил-DL-валина, соответственно, и определяются наиболее стабильные конформеры для каждой молекулы. Интересна работа [87], где также сопоставляются квантово-химические расчеты и ИК-спектр матричной изоляции серина. Теоретически были найдены 12 наиболее стабильных конформеров для этой аминокислоты. Но наиболее пристальное внимание уделяется первым четырем формам, разница в энергиях между которыми не превышает 4 кДж/моль. Для них были рассчитаны константы ротамеризации и проанализированы частоты и интенсивности полос в ИКспектрах, установлено положение внутримолекулярных водородных связей. В итоге, в экспериментальном спектре были найдены только три формы из рассматриваемых четырех. ИК-спектры матричной изоляции, дополненные расчетами, представлены для ароматических аминокислот фенилаланина [88] и триптофана [89]. Конформационное многообразие и колебательные спектры фенилаланина [88] теоретически исследованы с помощью теории функционала плотности (B3LYP/6311++G(d,p)). Получено 25 структур этой аминокислоты, из них 14 устойчивых, разница в энергиях между которыми составила менее 10 кДж/моль. Сопоставление с экспериментальными данными показало, что первые 6 конформеров из них вносят основной вклад в спектр, а содержание оставшихся – 35 пренебрежимо энергетическом мало. Установлено, отношении что наиболее структуры предпочтительные фенилаланина в имеют внутримолекулярную водородную связь. Приведены и проанализированы модели конформеров, экспериментальные и теоретические спектры молекулы, структурные и энергетические параметры. Практически аналогичное исследование проведено и для триптофана [89]. На том же уровне теории проведен конформационный анализ, выявивший 42 уникальных конформера, среди которых было 17 низкоэнергетических (с различием в энергиях менее 10 кДж/моль). Обозначены два наиболее значимых фактора при стабилизации структур триптофана: внутримолекулярная водородная связь и электростатическое взаимодействие. Структурные и энергетические параметры, модели молекул и спектры также приводятся. В работе [90] линейные и нелинейные оптические эффекты ароматических аминокислот, являющихся составными частями белков, исследуются с помощью TD-DFT. Особенное внимание уделяется нелинейным оптическим эффектам, возникающим из-за π-конъюгации электронной плотности, которая характеризуется высокой поляризуемостью и чувствительна к среде, окружающей белок, частью которого являются исследуемые аминокислоты. Установлено систематическое увеличение поляризуемости, зависящее от размера боковой цепи, тогда как гиперполяризуемость существенно зависит от состава среды. Одно из самых любопытных исследований описано в статье [91], в которой изучалось влияние боковой цепи на структуру и фрагментацию аминокислот при ионизации, в частности в масс-спектрометрических экспериментах с фотоионизацией. Конформационные свойства ряда аминокислот (Gly, Ala, Ser, Asp, Gln, Phe, Tyr, His) исследованы на различных уровнях теории (B3LYP/631++G(d,p), MPWB1K/6-31++G(d,p), CCSD(T)). Подтверждено, что элиминирование карбоксильной группы в виде радикала COOH· является наиболее типичным и выгодным путем фрагментации этих молекул. Для 36 ароматических же соединений возникает конкурирующее направление, приводящее к возникновению радикала R· или иона R+. Также подчеркивается, что для большинства ионизированных молекул аминокислот наиболее стабильным является конформер со внутримолекулярной водородной связью NH···OC. Проведение расчетов для молекулы, находящейся во взаимодействии с растворителем, представлено в работе [92]. Использованы три метода моделирования растворителя: поляризуемая проводящая модель (C-PCM), интегрально-равновесная поляризуемая модель (IEF-PCM) и самосогласованная буферная поляризуемая модель (SCI-PCM). Оптимизация геометрии проведена методом B3LYP с базисом 6-31+G(d,p) для каждой модели растворителя. Особое внимание уделено анализу различных типов погрешностей, возникающих как при расчете изолированной молекулы, так и молекулы, находящейся в среде растворителя. Попытка теоретически исследовать конформационно-зависимые свойства фенилаланина, тирозина и триптофана предпринята в работах [93, 94]. Расчеты проведены методом теории функционала плотности M05-2X с базисом 6311+G(d). Кроме оптимизированной геометрии конформеров были найдены и переходные состояния между ними, просканирован профиль реакции конформационных превращений, определены энергии ионизации и рассмотрена заселенность молекулярных орбиталей для основных конформеров. Сравнение с аналогичными данными, полученными методом B3LYP, показало преимущество метода M05-2X. Авторы работы [52] провели квантово-химические расчеты на теоретическом уровне G3(MP2)//B3LYP. Полученные 10 наиболее стабильных конформеров цистеина были оптимизированы методом B3LYP с базисом 631G(d). Разница в энергиях между первым и десятым конформером составила 9,4 кДж/моль. Геометрия основного, наинизшего по энергии конформера была 37 оптимизирована методом MP2 с базисом 6-31G(3df,2p), проведен NBO-анализ распределения электронной плотности на атомах. Необходимо конденсированном также отметить, состоянии что успешно аминокислоты исследуются и дипептиды методом в ядерного магнитного резонанса (ЯМР), который часто комбинируется с квантовохимическим расчетами. В работе [95] представлены результаты исследования кристаллов глицина и гистидина с помощью 1H CRAMPS и 13 C CP-MAS ЯМР- спектроскопии. Установлено, что эти методы полезны при структурном анализе аминокислот, особенно в случае распознавания полиморфных форм. Обнаружена высокая чувствительность химических сдвигов к магнитному полю и водородным связям, наличие которых характерно для кристаллов аминокислот. Комплексное исследование фрагментов дипептидов и белков, содержащих фенилаланин и тирозин проведено в работе [96]. Вещества в твердом состоянии изучали с помощью 13 C ЯМР-спектроскопии, кристаллографии и квантово- химических расчетов. Результаты эксперимента и расчета с использованием континуальной модели самосогласованного поля находятся в хорошем согласии друг с другом. Доказывается необходимость учета эффектов электростатического поля для химических сдвигов Сγ Phe и Tyr в пептидах и белках, а также предполагается, что она полезна при интерпретации сдвигов в других биоактивных молекулах, имеющих ароматические фрагменты. Методами 1H ЯМР-спектроскопии, молекулярного моделирования и теории функционала плотности (B3LYP/6-311G**) исследован дипептид L-серил-Lгистидин [97], представляющий интерес как биологически активное вещество, взаимодействующее с циклофилином А. Приведены и проанализированы конформеры дипептида, его структурные параметры и величины химических сдвигов. Как видно из представленных материалов, исследования аминокислот и пептидов квантово-химическими и спектроскопическими методами не теряет 38 актуальности на протяжении нескольких десятилетий. С развитием экспериментальной техники и уровней теории они становятся все более интересными, позволяют детальней изучить строение и свойства молекул. Анализ результатов, полученных различными теоретическими методами, показал, что наиболее приемлемым уровнем теории для описания структурных и энергетических характеристик аминокислот и дипептидов является метод, основанный на теории функционала плотности (DFT) с расширенными базисными наборами функций (B3LYP/6-31G**/6-31++G**/cc-pVTZ). 1.6. Структурные исследования молекул аминокислот в газовой фазе Несомненный интерес представляют исследования структуры молекул аминокислот в газовой фазе, когда полностью отсутствуют какие-либо влияния со стороны среды, в которой они находятся. Наиболее известный метод таких исследований – газовая электронография, когда электроны дифрагируют на молекулах вещества, испаряемого из ячейки. В начале 90-х годов XX века в Японии были получены первые электронограммы аминокислот. Сначала был исследован глицин [17]. На основе данных электронографии удалось установить строение основного конформера, тогда как квантово-химические расчеты предсказывали наличие трех форм. В газовой фазе молекула была не ионизирована (то есть не являлась цвиттер-ионом). Разница в энергиях между основным и двумя другими конформерами не превышала 4 ккал/моль. Были построены потенциальные функции барьера вращения вокруг связи С-С в молекуле и показана возможность существования в паре двух других конформеров в незначительных количествах. Исследование строения молекулы глицина неэмпирическими методами было продолжено в работе [98]. Было найдено 13 конформеров, рассчитаны их относительные энергии, геометрические параметры, вращательные постоянные и дипольные моменты, частоты колебаний и интенсивности полос. Расчеты 39 проведены с помощью методов самосогласованного поля (SCF) и ограниченного Хартри-Фока (RHF), учет электронной корреляции производился на втором, третьем и четвертом уровнях теории Меллера-Плессе (MP2, MP3 и MP4(SDTQ)) и двух видах теории возмущений методом связанных кластеров (CCSD, CCSD(T)). Проведено сравнение всех структурных и энергетических параметров, рассчитанных разными методами. Сопоставление с электронографическими данными из работы [17] показало удовлетворительное согласие в значениях энергий, расстояний и вращательных постоянных. Молекула аланина была исследована методом газовой электронографии в работе [99]. Были найдены геометрические параметры, амплитуды колебаний, оценены силовые постоянные. Проведено сравнение основных расстояний и углов для аланина в твердом и газообразном состояниях, газообразного глицина и уксусной кислоты. Авторы установили, что вращение вокруг связи С-С сильно затруднено вследствие высокого потенциального барьера, из чего был сделан вывод о существовании в паре только одного конформера аланина. Несколькими годами позже в работе [98] было проведено теоретическое исследование конформационного многообразия для аланина [100]. Как и в случае глицина, автором было обнаружено 13 конформеров. Расчеты проводились в рамках теории функционала плотности методом B3LYP. Были получены значения полной и относительной энергий, межъядерных расстояний и углов, вращательных постоянных, констант центробежного искажения и дипольных моментов, а также частот и интенсивностей полос в ИК-спектре. Проведено сопоставление рассчитанных геометрических параметров с экспериментальными, полученными методом газовой электронографии. Отмечено большое сходство в конформационном поведении глицина и аланина. Сделана рекомендация провести повторное электронографическое исследование аланина, поскольку в структурном анализе авторы учли только один основной конформер, что, на 40 основании проведенного теоретического исследования, представляется недостаточным. В связи с этим, в самом конце 1990-х вышла статья [18], посвященная повторному изучению строения этой молекулы в газовой фазе с учетом предыдущих замечаний и новых технических возможностей. Более тщательный структурный анализ позволил уточнить геометрические параметры и установить наличие двух конформеров. Отношение количества молекул в паре (конформер 1) : (конформер 2) составило 8:1, что, по мнению авторов, находится в хорошем согласии с данными миллиметровой волновой спектроскопии и результатами квантово-химическимх расчетов. Как было отмечено выше, аминокислоты, как и некоторые другие органические соединения, имеют большое количество близких по энергии конформеров, что затрудняет их исследование методом газовой электронографии. Низкая летучесть и невысокая термическая устойчивость также осложняют их экспериментальное исследование в газовой фазе. Поэтому часто аминокислоты исследуют в составе их ацетилпроизводных и эфиров. В работе [101] электронографически и квантово-химически изучили метиловый эфир аланина – был проведен конформационный анализ, определен основной конформер и его структурные параметры. Те же методы были использованы при изучении строения и свойств некоторых органических соединений, по своей структуре близких к аминокислотам. В работе [102] рассмотрено строение, индуктивные и стерические эффекты бутилацетата, подобного алифатическим аминокислотам, а также строение и конформации метилникотината и метилпиколината [103] и никотина [104], аналогичных ароматическим аминокислотам. Исследования небольших органических молекул с некоторым числом конформеров и ароматической системой успешно проводятся и в России. За последние десять лет вышло несколько интересных работ – по N,Nдиметиланилину [105], карфедону [106], бензолсульфоновой кислоте [107]. Во 41 всех этих работах приведены основные сведения об условиях проведения эксперимента, молекулярные интенсивности, функции радиального распределения и структурные параметры, полученные в результате обработки электронографических данных, величины энергий и геометрии конформеров, полученные из квантово-химических расчетов, сделаны сопоставления экспериментальных и теоретических данных, полученных разными методами. Представленный материал свидетельствует о возможности достаточно успешного выполнения электронографических исследований для ряда аминокислот, в том случае, если число конформеров, одновременно присутствующих в газовой фазе, сравнительно невелико. Следует отметить еще один экспериментальный метод получения структуры молекул в газовой фазе – микроволновая спектроскопия. В литературе можно найти серию работ, посвященных исследованию строения нескольких аминокислот этим методом: пролина [108], гидроксипролина [109], валина [110] и аланина [111]. Пролин, как и его производное гидроксипролин, представляет собой гетероциклическую аминокислоту. Эти соединения имеют некоторое количество конформеров, обусловленных изгибом пирролидинового цикла и различной ориентацией карбоксильной и гидроксильной групп. Установлено, что оба соединения имеют внутримолекулярные водородные связи. В работе [108], кроме всего прочего, доказывается возможность успешного применения основного метода – лазерной абляции молекулярного пучка в микроволновой спектроскопии с Фурье-преобразованием – для исследования структуры вещества в газовой фазе. Экспериментальные исследования дополнялись квантово-химическими расчетами методом MP2/6-311++G(d,p). Аналогичным образом исследованы алифатические аминокислоты в работах [110, 111]. В отличие от пролина, у аланина и валина число конформеров намного больше – за счет наличия метильных групп и гибкой 42 аминокислотной цепи. Отметим, что для наиболее устойчивых конформеров этих соединений установлено отсутствие внутримолекулярной водородной связи. Безусловно, метод микроволновой спектроскопии является основным при определении моментов инерции и дипольных моментов молекул. Однако, согласно [112], высокая точность определения вращательных постоянных частично утрачивает свою значимость при расчетах эффективных геометрических параметров молекул из-за сложности корректного учета колебательно- вращательного взаимодействия. Наряду с микроволновой спектроскопией представляется перспективным использование метода газовой электронографии для установления структуры молекул соединений рассматриваемого класса. 43 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ЭЛЕКТРОННОЙ ИОНИЗАЦИИ 2.1.1. Теоретические основы масс-спектрометрии электронной ионизации Определение переходов, термохимических энтальпии образования, характеристик энергии (энтальпии разрыва связей, фазовых константы равновесия реакций, энергии ионизации, сродство к электрону и т.д.) может быть проведено на основе анализа масс-спектров, характер которых зависит от условий проведения эксперимента: температуры, состава газовой и конденсированной фаз, энергии ионизирующих электронов, давления пара и т.д. Поскольку аминокислоты и пептиды имеют невысокую термостабильность, в массспектрометрических исследованиях вместо прямого термического испарения часто применяют иные способы перевода вещества в газовую фазу с одновременной мягкой ионизацией: матричная лазерная десорбционная ионизация (MALDI), ионизация электроспреем (ESI) и другие. Указанные методы служат в основном для аналитических целей, тогда как метод электронной ионизации (EI) позволяет решать ряд физико-химических задач, в числе которых определение термодинамических параметров. Основные достоинства данного метода – универсальность, надежность и более понятная физическая сущность процессов электронные формирования библиотеки анализируемых ионов. физико-химических Например, данных известные (Wiley, NIST) аккумулируют именно этот вид масс-спектров [113, 114]. Однако при исследовании аминокислот и пептидов в некоторых случаях (например, Ala-Nvl, Ala-Trp) не удается обнаружить в базах данных похожий масс-спектр, поэтому возникает необходимость интерпретации масс-спектров в соответствии с правилами и закономерностями фрагментации этих соединений [21,113]. Таким образом, выбор масс-спектрометрии электронной ионизации (электронного 44 удара) является логичным для достижения целей, поставленных в диссертационной работе. Типичная схема EI-масс-спектрометрического эксперимента включает в себя следующие основные стадии: - прямой ввод или испарение вещества в изотермической эффузионной ячейке с последующим формированием молекулярного пучка с помощью системы диафрагм для подачи в ионный источник; - генерация в ионном источнике пучка электронов за счет термической эмиссии из нагретого до высокой температуры катода и дальнейшим его ускорением до энергии 12-70 эВ; - ионизация в ионном источнике нейтральных молекул в пучке (при давлении 10 -5 – 10-6 Па) с образованием молекулярных и фрагментных (осколочных) ионов; - формирование ионного луча с помощью системы линз ионной оптики; - пространственное разделение ионного луча на составляющие с одинаковыми массовыми числами (точнее, в зависимости от отношения массы к заряду) с помощью масс-анализатора, роль которого обычно исполняет электромагнит, или радиочастотный масс-фильтр; - регистрация ионов, которая включает в себя детектирование и усиление сигнала с последующей его записью на диаграммной ленте или в память компьютера. Энергия ионизирующих электронов должна превышать энергию ионизации молекулы (~10 эВ). Стандартные масс-спектры EI принято снимать, используя ионизирующие электроны с энергией от 50 до 70 эВ. Минимальная энергия электронов, при которой появляется ион, называется потенциалом (энергией) появления иона. При низких энергиях электронов, близких к потенциалу ионизации молекулы, масс-спектр содержит в основном молекулярный ион. Увеличение энергии электронов приводит к диссоциативной ионизации и к относительному уменьшению выхода молекулярных ионов [21,112]. Ток ионов, возникающий в ионном источнике, определяется соотношением: 45 Ij= jnjlIе, (2.1.1.1) где Ij - ток ионов типа j, Iе - ток ионизирующих электронов, j - сечение ионизации молекулы (вероятность ионизации, которая зависит от природы вещества и энергии электронов в ионизирующем пучке), l - длина пути электронов в ионизируемом газе, nj -число ионизируемых атомов или молекул типа j в единице объема. Метод электронной ионизации обладает высокой чувствительностью, позволяет исследовать газообразные образцы, содержащие от (105-107) молекул. Возможные основные схемы образования ионов следующие: - прямая ионизация с образованием положительных ионов: - прямая _ _ А + е = А+ + 2 е , (2.1.1.2) _ _ А + е = А++ + 3 е ; (2.1.1.3) ионизация, сопровождающаяся фрагментацией молекулы (диссоциативная ионизация): _ _ _ АВ + е = АВ+ + 2 е = А+ + В + 2 е ; (2.1.1.4) - захват электрона с последующей фрагментацией (диссоциативный захват): _ АВ + е = АВ = А + В . (2.1.1.5) Отрицательные ионы при ионизации электронным ударом образуются в меньшем количестве, так как сечение ионизации с образованием положительных ионов на несколько порядков выше сечений с образованием отрицательных [112]. 2.1.2. Эффузионный метод Кнудсена Эффузионный определения метод давления Кнудсена насыщенного является пара, при динамическим методом использовании которого происходит непрерывный отбор пара, что неизбежно приводит к отклонению системы от состояния равновесия. Метод наиболее эффективен в диапазоне 46 давления насыщенного пара ниже 10 Па, вплоть до 10 -10 Па, а сочетание с массспектрометрическим анализом продуктов испарения сделало его универсальным при определении парциальных давлений компонентов пара [80,112]. Эффузионный метод Кнудсена основан на следующих допущениях: 1. Эффузионную ячейку можно считать закрытой, т.е. покидающий ее поток пара пренебрежительно мал. Для соблюдения этого условия необходимо, чтобы поверхность испарения была значительно больше площади эффузионного отверстия. 2. Возврат молекул обратно в ячейку за счет их соударений друг с другом и со стенками эффузионного отверстия пренебрежимо мал. Это соблюдается, если длина свободного пробега существенно больше диаметра эффузионного отверстия, а толщина стенок эффузионного отверстия незначительна по сравнению с его диаметром. 3. Молекулы имеют максвелловское распределение скоростей и равномерно распределены в объеме ячейки. В этих условиях можно считать, что внутри камеры устанавливается термодинамическое равновесие между конденсированной и газовой фазами, и эффузионный поток не влияет на равновесие. Связь между давлением пара внутри эффузионной ячейки и количеством вещества, покидающего эффузионную камеру, основана на следующих соотношениях [112]: интенсивность пучка молекул Ijо при молекулярном течении через эффузионное отверстие площадью δS определяется как Ijо = (1/4) njo vjδS, (2.1.2.1) где njo – число молекул в единице объема, vj – средняя скорость молекул. В ионном источнике nj пропорциональна отношению nj ~ Ijо/vjδS = (1/4) njo ~ (pi)/kT, (2.1.2.2) 47 где k- постоянная Больцмана, Т – термодинамическая температура, pi – парциальное давление пара, njo = (pi)/kT – уравнение идеального газа. Отсюда зависимость Ij от pi имеет вид: Ij= jnjlIе = К’ pij/Т, (2.1.2.3) где К’ – приборная постоянная. Таким образом, в эффузионном методе Кнудсена с масс-спектрометрическим контролем состава газовой фазы давление пара (pi) пропорционально величине ионного тока. Соотношение между pi и ионным током (IjT) задается уравнением (2.1.2.4) pi = KjIjT = KIjT/j, где Kj – коэффициент чувствительности для ионов типа j, K – константа чувствительности прибора. 2.1.3. Расчет энтальпии сублимации Зависимость логарифма давления насыщенного пара вещества от обратной температуры носит линейный характер и позволяет рассчитать энтальпию сублимации в рамках II закона термодинамики. Для этого следует воспользоваться уравнением Клаузиуса-Клапейрона: lnP/T = - subHmo(T)/RT2, (2.1.3.1) где subHmo(T) – молярная энтальпия сублимации при температуре эксперимента (Т), P – давление паров, являющееся отношением парциальных давлений (P = pi/po, где pi парциальное давление пара, po = 0.1 MPa), T - температура, R – универсальная газовая постоянная (R = 8.314472 ДжK-1моль-1). В узком температурном интервале можно пренебречь зависимостью subHmo(T) от температуры при установлении равновесия между твердой и газовой фазами [115]. Таким образом, уравнение (2.1.3.1) запишется в интегральной форме: ln(pi) = - subHmo(T)/RT + C, (2.1.3.2) где C – константа. С учетом уравнения (2.1.2.4) его можно представить в виде: 48 ln(IjT)= - B/T + C’, (2.1.3.4) где B = subHmo(T)/R, константа C’=[C- ln(K/)]. Сечение ионизации молекул рассчитывается путем суммирования сечений ионизации от каждого атома в молекуле [116]. Значение K определяется с помощью эталонных образцов [117]. При определении энтальпий по II закону не требуется градуировка прибора, нивелируются ошибки, связанные с оценкой сечений ионизации. Для нахождения энтальпии сублимации по II закону следует выбирать температурные зависимости наиболее интенсивных ионных токов для базовых фрагментов молекулы. Это позволяет избежать ошибок, возникающих при измерении сигналов низкой интенсивности. 2.1.4. Магнитный масс-спектрометр МИ-1201, модифицированный для термодинамических исследований Для исследования термодинамики сублимации аминокислот и дипептидов использован эффузионный метод Кнудсена с масс-спектрометрическим контролем состава пара, реализованный на масс-спектрометре МИ 1201 (900; r=200 мм) (“SELMI”, термодинамических Сумы, исследований Украина), (диапазон модифицированным температур 273-1500 для K). Регистрируемые токи ионов – вплоть до 110-12 А. Разрешение прибора позволяет определять массовые числа с точностью 2 а.е.м. в диапазоне масс 2-850 а.е.м. при ускоряющем напряжении 5 кВ. Согласно паспортным данным, чувствительность масс-спектрометра МИ 1201 по аргону не менее 40 Кл/кг (порог чувствительности по аргону не более 0.00001%). Рабочее давление в области масс-анализатора не хуже 10-6 Па (7,510-9 тор), а в области источника ионов не хуже 10-5 Па (7,510-8 тор). 49 Рисунок 2.1.4.1 – Принципиальная схема масс-спектрометра Модернизация серийных масс-спектрометров с целью создания приборов для высокотемпературных термодинамических исследований заключается в основном в дополнении масс-спектрометра устройством, формирующим молекулярный пучок из газовой фазы, находящейся в условиях, достаточно близких к равновесным. Источником молекулярного пучка служат эффузионные камеры, снабженные системой нагрева, измерения и стабилизации температуры. Для проверки работоспособности разработанной и изготовленной аппаратуры данного масс-спектрометра МИ-1201 авторами [118] было проведено исследование процессов испарения и сублимации серебра. Описание алгоритма эксперимента, техники, а также результаты исследований для различных соединений с использованием данного прибора описаны в работах [119-122]. 50 2.1.5. Методика эксперимента на МИ-1201 Описание эксперимента Образец массой 50-100 мг помещали в цилиндрическую эффузионную ячейку из молибдена и испаряли. Отношение «площадь испарения – площадь эффузионного отверстия» составляло 1000. Поскольку площадь испарения препарата намного превосходит площадь эффузионного отверстия, можно считать пар внутри эффузионой ячейки равновесным, а возмущение, вносимое эффузионным отверстием, пренебрежимо малым. Для охлаждения и уменьшения влияния фона на измерения ячейка с нагревателем помещалась в азотную ловушку, находящуюся в объеме, имеющем автономную систему откачки. Для поддержания нужной температуры использовались две вольфрам-рениевые термопары W/Re-5/20, откалиброванные по температурам плавления олова, алюминия и серебра [120,123]. Одна из термопар размещалась в области нагревателя, а другая - непосредственно в стенке ячейки. Измерения температуры проводились с точностью 0.5 K. Ионизация электронным вещества, ударом с эффундирующего энергией из ионизирующих ячейки, электронов проводилась 30-40 эВ. Исследования проводили в высоком вакууме (2-310-6 Па). Это обеспечивает минимальное столкновение исследуемых ионов с молекулами газа, что уменьшает потери ионов и предотвращает образование побочных продуктов [21,121]. Область испарителя индивидуальными и область системами ионизационной вакуумирования, камеры позволяющими снабжены достигать остаточного давления паров 5·10-5 Па и 3·10-6 Па соответственно. Азотная ловушка располагалась прямо под насосом аналитической части использован ионный в ионизационной камере. В насос типа НМД, который обеспечивает вакуум ниже 1·10-6 Па. Перед экспериментами аналитическую часть и ионизационную камеру прогревали в течение 2 часов при 200oC для 51 обезгаживания внутренних стенок. Молекулярный пучок, эффундирующий из ячейки Кнудсена, может перекрываться механическим затвором, установленным на выходном фланце азотной ловушки. Это позволяет вычитать так называемый «фон» ионного тока из общего сигнала. Ионный ток измерялся вторичным электронным умножителем в сочетании с электрометром. Усиленный сигнал записывался через аналого-цифоровой преобразователь с ПК. Полученный масс-спектр содержал набор пиков, имеющих приближенные целочисленные значения m/z и интенсивности, пропорциональные токам соответствующих ионов. Масс-спектры принято представлять в нормализованном виде. Известны два способа нормировки: по основному (наиболее интенсивному пику в спектре), который принимается за 100%, или по полному ионному току (обычно его принимают как сумму интенсивностей всех пиков в спектре). Мы использовали первый способ как наиболее распространенный (в каталогах, базах масс-спектров) и приемлемый для исследуемых объектов. Масс-спектры представляли в табличном виде или в виде графиков, в которых по оси абсцисс откладывали величины отношения массы иона к его заряду (m/z), а по оси ординат – их интенсивности, т.е. относительное количество ионов данного вида. Регистрация ионных токов фрагментированных молекул, образующихся при каждой установившейся температуре, позволило получить их температурные зависимости в виде функции ln(IT)=f(T-1), при этом их углы наклона идентичны молекулярному иону. Каждая температурная зависимость ионных токов включала в себя точки, полученные как при повышении, так и при понижении температуры. Эксперимент для каждого соединения проводили не менее чем дважды с целью получения достоверных результатов. Для исследуемых аминокислот и дипептидов явления гистерезиса не наблюдалось. Линейные температурные зависимости ионных 52 токов свидетельствуют, что испарение происходит конгруэнтно и в системе устанавливается равновесие. Калибровка установки Калибровку установки проводили по бензойной кислоте. Бензойная кислота рекомендована в качестве основного стандарта для исследований энтальпии сублимации органических соединений [51,124]. Температурная зависимость ионных токов ln(IT)=f(T-1) для бензойной кислоты носит линейный характер (рис. 2.1.5.1). 14 13 ln(IT) 12 11 10 9 8 3.0 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 1000/ (T/K) Рисунок 2.1.5.1 – График зависимости ионного тока (ln (IT)) от температуры (T-1) для бензойной кислоты (молекулярный ион C6H5COOH, Uioniz=30 эВ) В исследуемом диапазоне температур 286.3 - 330.12 K нами определена молярная энтальпия сублимации (subHmo(T)) бензойной кислоты, равная 90.81.9 кДж·моль-1. Данная величина subHmo(T) согласуется с имеющимися литературными значениями (по методу Кнудсена) [28,51]: 91.0±0.8 кДжмоль-1 (при 310 K), 89.2±0.5 кДжмоль-1 (при 310 K), 95.1±1.8 кДжмоль-1 (при 298 K), 90.5±0.1 кДжмоль-1 (при 303 K), 89.1±0.3 кДжмоль-1 (при 361 K) и 92.8±0.2 53 кДжмоль-1 (при 296 K). Для оценки результатов, получаемых при сублимации аминокислот и пептидов на данной установке, в качестве тестового образца использован глицин (Gly). Получено значение молярной энтальпии сублимации Gly [13]: subHmo(T) = 1313 кДжмоль-1 в интервале температур 473.15 - 533.15 K. Доступные из литературы значения молярной энтальпии сублимации глицина: 136.5±2 кДжмоль-1 (при 419 K) [32], 130.45±2.1 кДжмоль-1 (при 298 K) [125], 131.4±1 кДжмоль-1 (при 298 K) [126] и 136.4±0.4 кДжмоль-1 (при 462 K) [37]. Таким образом, полученные результаты находятся в хорошем согласии с литературными данными. 2.2. ГАЗОВАЯ ЭЛЕКТРОНОГРАФИЯ 2.2.1. Теоретические основы газовой электронографии Метод газовой электронографии – дифракционный метод исследования, основанный на упругом рассеянии электронов молекулами в газовой фазе. Он позволяет с высокой точностью получить наиболее полную информацию о геометрическом строении молекул в газовой фазе. Как и в других экспериментальных методах исследования, в газовой электронографии сформулированы прямая и обратная задачи. Прямая задача газовой электронографии - это построение дифракционной картины по известным данным (геометрическое строение, ядерная динамика) о строении молекул, а обратная задача - определение строения молекул на основе экспериментальной дифракционной картины. В обоих случаях считается, что параметры ансамбля (в частности, температура) известны. Прямая задача в общем случае является сложной квантово-механической (и статистической) задачей и обычно решается с помощью ряда приближений. Обратная задача в большинстве случаев является некорректно поставленной, а потому решается с помощью прямой задачи 54 методом проб и ошибок: параметры модели, заложенной в решении прямой задачи, оптимизируются для наилучшего согласования с экспериментом. При решении прямой задачи делается ряд допущений. Основным является предположение, что молекула рассеивает электроны так же, как система химически не связанных (свободных, сферически симметричных) атомов, расположенных друг относительно друга в соответствии с ядерной конфигурацией молекулы. Это приближение является достаточно точным, поскольку основной вклад в интенсивность рассеяния вносят ядра, а искажение распределения электронной плотности атомов в составе молекулы при образовании химической связи заметно проявляется лишь в области малых углов рассеяния, которые обычно не охватываются в традиционном электронографическом эксперименте [112,127]. Данный подход позволяет представить полную интенсивность рассеяния как сумму неосциллирующей и осциллирующей составляющих, называемых атомным и молекулярным рассеяниями соответственно. Интенсивность атомного рассеяния не являются периодической функцией и не несёт информации о геометрическом строении молекулы [127]. Полная интенсивность рассеяния электронов записывается следующим образом [128] (2.2.1.1) 55 где – полная интенсивность молекулярного рассеяния, – интенсивность атомного рассеяния, – интенсивность молекулярного рассеяния, – параметр угла рассеяния: – длина волны электронов, – угол рассеяния, – интенсивность падающего пучка электронов, – расстояние от точки рассеяния до точки регистрации, - комплексный фактор упругого рассеяния атомом сорта i: - амплитуда упругого рассеяния, – фаза упругого рассеяния, – радиус Бора, – атомный фактор неупругого рассеяния, – число атомов в молекуле, - средняя амплитуда колебаний для пары атомов ij, – параметр фазового сдвига, - константа асимметрии. Комплексные факторы упругого рассеяния электронов атомами (атомные форм-факторы) рассчитываются с помощью метода парциальных волн в первом приближении Борна для рассеяния [129], а их табулированные значения используются программами, осуществляющими теоретическое построение молекулярного рассеяния, кривых интенсивности рассеяния [130]. Кроме интенсивностей атомного и экспериментальные кривые интенсивности содержат вклад, определяемый 56 особенностями экспериментальной аппаратуры и известный как функция постороннего рассеяния , которая не является периодической. При выделении молекулярной составляющей интенсивности рассеяния интенсивность атомного рассеяния включают в функцию фона, так как интенсивность атомного рассеяния не содержит информации о строении молекулы. (2.2.1.2) , где (2.2.1.3) Поскольку является быстро затухающей функцией, то при обработке электронографических данных традиционно используют приведённую молекулярную составляющую интенсивности рассеяния [112,128]: (2.2.1.4) , где – функция фона (включающая атомное рассеяние). Обычно эксперимент проводят так, чтобы вклад постороннего рассеяния был пренебрежимо мал. В этом случае функция фона представляет собой функцию атомного рассеяния, модифицированную секторной функцией, как и функция полной интенсивности рассеяния. С помощью Фурье-преобразования функции функцию радиального распределения можно получить : (2.2.1.5) , где - коэффициент затухания (искусственный температурный фактор). Положение пиков на кривой радиального распределения соответствуют межъядерным расстояниям , их полуширина определяется среднеквадратичными амплитудами колебаний и коэффициентом затухания , а их высота прямо пропорционально зависит от количества эквивалентных расстояний и зарядов ядер и обратно пропорционально – от межъядерного 57 расстояния. Таким образом, функция радиального распределения является наглядным представлением результатов дифракционного эксперимента. По своему физическому смыслу близка к плотности вероятности распределения межъядерных расстояний в молекуле . 2.2.2. Температурные эффекты в газовой электронографии Основная цель газовой электронографии - определение структурных параметров молекул в газовой фазе. Поскольку изучение отдельной молекулы или невозможно, или физически и технически затруднено, то все величины, непосредственно наблюдаемые экспериментальных данных, и получаемые являются в средними результате по ансамблю. обработки Условия эксперимента, как правило, соответствуют приближению идеального газа, в котором наблюдаемый ансамбль близок к каноническому, а межмолекулярными взаимодействиями можно пренебречь. В литературе используют различные виды геометрических параметров, одни из которых можно условно считать наблюдаемыми (поскольку непосредственно наблюдаемой величиной является полная интенсивность рассеяния электронов), а другие получают в результате обработки экспериментальных данных, вводя при этом различные приближения о строении молекул. Обычно считается, что приближение Борна-Оппенгеймера справедливо, молекулы находятся в основном электронном состоянии, на поверхности потенциальной энергии имеется единственный разделённых выраженный значительными минимум (или барьерами), а несколько эквивалентных, колебательно-вращательным взаимодействием можно пренебречь. В этом случае говорят о колебательных эффектах, а определяемые эффективные параметры зависят от силового поля молекулы и от температуры. Наиболее часто используется приближение малых гармонических колебаний. 58 Максимумам пиков на распределения соответствуют экспериментальной кривой радиального -параметры. Следовательно, они не зависят от приближений, вводимых при обработке экспериментальных данных, и являются наблюдаемыми. Усреднённые по ансамблю и зависящие от температуры связаны с -параметры, - следующим образом: (2.2.2.1) , Кроме того, -структура не является геометрически согласованной из-за эффекта сокращения [112,128]. Вследствие этого эффекта в линейном трёхатомном фрагменте сумма длин связей ( ) между крайними и центральным атомом будет больше расстояния между крайними атомами. Для малых колебаний атомов в молекуле выражается следующим образом: (2.2.2.2) , где содержит вклад ангармонических членов, и – среднеквадратичные амплитуды перпендикулярных колебаний, при этом ось выбрана параллельно вектору, соединяющему ядра и . Величины усреднены по всем колебаниям и по ансамблю. В отличие от -параметров, -параметры являются геометрически согласованными, если ангармонизмом колебаний можно пренебречь [128,131]. Их соотношения с другими видами параметров выглядят следующим образом: , где - колебательные поправки. Как видно, из уравнения 2.2.2.3 отличаются от (2.2.2.3) –параметры только вкладом ангармонических членов, т.е. являются хорошим приближением к равновесным геометрическим параметрам. В отличие от , 59 параметр зависит от температуры (поскольку средней по ансамблю является величина ), однако эта зависимость слабее, чем температурная зависимость . Если колебательные поправки рассчитываются в предположении нелинейной связи внутренних и декартовых координат, то вместо говорят об -структуре [132]. Колебательные поправки (и соответственно, ) длительное время рассчитывались на основе гармонического силового поля в предположении линейной зависимости внутренних координат от декартовых. В работах [132,133] предложен и реализован в программе SHRINK другой способ оценки колебательных поправок к межъядерным расстояниям. Также коллективом авторов [134] успешно используется метод молекулярной динамики как альтернатива методу расчёта термически средних межъядерных расстояний, амплитуд колебаний и колебательных поправок на основе силовых полей и нормальных координат. Таким образом, использование всё более высоких приближений при интерпретации данных электронографического эксперимента позволяет приблизить определяемые параметры к равновесным. 2.2.3. Структурный электронографический анализ Поскольку обратная электронографическая задача решается с помощью прямой путём достижения максимального согласия теоретической и экспериментальной интенсивностей рассеяния методом наименьших квадратов, то для этого минимизируют следующий функционал: , где - весовая функция, а (2.2.3.1) – масштабирующий коэффициент. На практике в качестве более удобной характеристики для минимизации является фактор согласования, или R-фактор [112]: 60 (2.2.3.2) , где - теоретический аналог приведённой функции молекулярной составляющей интенсивности рассеяния, обычно определяемый следующим образом [112]: (2.2.3.3) , где - число атомов в молекуле, а . В уравнении 2.2.3.3 суммирование ведётся по всем неэквивалентным парам атомов, вносящим вклад в интенсивность молекулярного рассеяния. Каждый член в разложении определяется тремя параметрами: , и . Параметр представляет собой термически среднее расстояние между ядрами i и j, соответствующее функции распределения P(r)/r, ( ); параллельную амплитуду колебаний, а – – среднеквадратичную колебательный параметр, учитывающий асимметрию пика на f(r). В геометрическом смысле эти величины являются, соответственно, первым, вторым и третьим моментами функции распределения межъядерного расстояния в пространстве межъядерных расстояний. В общем случае вариационная задача сводится к минимизации R-фактора относительно набора межъядерных расстояний, среднеквадратичных амплитуд колебаний и колебательных поправок (всего 3M параметров, где M – число неэквивалентных пар атомов). Однако надёжное вариационное уточнение такого количества параметров часто невозможно, поэтому их число на практике сокращают, поскольку: 1) для описания геометрического строения молекулы используют неизбыточный набор внутренних координат, с помощью которых можно рассчитать величины всех остальных. Использование только независимых 61 координат не является приближением, однако от их выбора зависит стабильность вариационной процедуры. 2) амплитуды колебаний для термов, характеризующихся близкими величинами межъядерных расстояний и относящимися к одному пику на кривой радиального распределения, варьируют «в группах», т.е. вариации группы амплитуд соответствует всего один независимый параметр. Кроме того, иногда не варьируются значения некоторых межъядерных расстояний и амплитуд, если не представляется возможным их надёжное уточнение в рамках структурного анализа. Алгоритмы для решения структурной электронографической задачи (2.2.3.1) реализованы в программах, например KCED [62]. Для надёжного и эффективного решения вариационной задачи (2.2.3.1) необходимо задать разумное начальное приближение для вариационных параметров, а также значения (окончательные) тех параметров, которые не будут варьироваться в ходе её решения. Обычно в современной газовой электронографии для этого используются данные вычислительной химии – квантово-химические расчёты или расчёты на основе эмпирических силовых полей. 2.2.4. Комплекс аппаратуры «электронограф/масс-спектрометр» и методика эксперимента Экспериментальный молекулярных параметров технологического аминокислоты материал был получен Ивановского университета. использован Для на Лаборатории государственного съемки комплекс аппаратуре электронограмм аппаратуры химикопаров ЭМР-100/АПДМ-1 [135,136], объединяющий электронограф и масс-спектрометр. Аппаратура позволяет проводить как автономные масс-спектрометрические исследования, так и синхронный электронографический и масс-спектрометрический эксперимент. 62 Схема электронографической части представлена на рис. 2.2.4.1. Для формирования электронного луча 1 заданной формы служит набор диафрагм 2. Диаметр луча в области дифракции равен приблизительно 0.6 мм при верхнем положении испарителя 3 (как показано на рис. 2.2.4.1) и 0.3 мм при нижнем положении. Для улавливания электронов, не испытавших рассеяния, и измерения их тока применяется ловушка 4. При юстировке луча в центр сектора 5 используется цилиндр Фарадея 6 с нанесенным на внутреннюю поверхность люминофором. Для прерывания электронного луча и простановки центра дифракционной картины без изменения тока луча ниже анода 7 помещен алюминиевый цилиндр 8 с двумя взаимно перпендикулярными каналами, один из которых закрыт Рассеянные несколькими струей пара слоями электроны медной электролитической регистрируются сетки. фотопластинкой 9, подаваемой из фотомагазина. Дифракционную картину можно наблюдать при помощи подвижного люминесцентного экрана 10. В ходе эксперимента на каждой фотопластинке помечается центр дифракционной картины. 63 Рисунок 2.2.4.1 – Схема колонны электронографа ЭМР-100: 1 – электронный луч; 2 – диафрагмы; 3 – испаритель; 4 – ловушка нерассеянных электронов; 5 – сектор; 6 – цилиндр Фарадея; 7 – анод; 8 – затвор для электронного луча; 9 – фотопластинка; 10 – люминесцентный экран; 11 – катод. Для контроля состояния исследуемого образца осуществлено совместное проведение электронографического и масс-спектрометрического экспериментов путем комбинирования электронографа ЭМР-100 и монополярного анализатора парциальных давлений АПДМ-1 [135-137]. Схема комплекса ЭМР-100/АПДМ-1 представлена на рис. 2.2.4.2. Массспектрометрический блок 1, основным узлом которого является монополярный масс-анализатор 2, соединяется с колонной 3 электронографа ЭМР-100 через технологическое окно, расположенное напротив испарителя 4. Молекулярный пучок 5 исследуемого вещества, которое эффундирует из ампулы 6 испарителя, 64 пересекается с пучком быстрых электронов 7, которые после рассеяния регистрируются в виде дифракционной картины. Затем молекулы попадают в ионизационную камеру 8 датчика 2. Масс-спектрометрический блок снабжен собственной системой обеспечения высокого вакуума. Насос 9 создает рабочий вакуум в блоке порядка (1-6) 10-7 Тор. Смотровое окно 15 позволяет измерять положение сопла эффузионной ячейки и кристаллического стандарта. Комплекс ЭМР-100—АПДМ-1 предназначен для съемок электронограмм и записи массспектров паров при температурах 270–1500 К и давлениях исследуемых веществ 10-2 – 10 Тор. Рис. 2.2.4.2 – Схема комплекса электронограф-масс-спектрометр: 1 – масс-спектральный блок, 2 – монополярный датчик ММС-2А массспектрометра АПДМ-1, 3 – дифракционная камера электронографа ЭМР-100, 4испаритель-реактор, 5 – молекулярный пучок, 6 – ампула, 7 – пучок быстрых электронов, 8 – ионизационная камера, 9 – орбитронный ионно-геттерный насос, 10 – отверстие 9 мм, 11 – штуцер форвакуумной откачки, 12 – шибер, 13 – ловушка, 14 – датчик ПМИ-12, 15 – стекло. Проведение синхронного ЭГ-МС эксперимента позволяет осуществить контроль качественного и количественного состава газовой фазы над исследуемым веществом для обеспечения оптимальных условий съемки 65 электронограмм. Это включает в себя возможность контролировать появление в рассеивающем объеме различного рода примесей, наблюдать за интенсивностью ионных токов и судить о стабильности концентрации частиц, сопоставлять каждой снятой электронограмме записанный во время ее экспонирования массспектр и оперативно реагировать на изменение состава пара в ходе эксперимента. 2.3. КВАНТОВО-ХИМИЧЕСКИЕ РАСЧЕТЫ 2.3.1. Теоретические методы расчета структуры и энергетики молекул Выбор подходящего уровня расчета К процедуре оптимального выбора базисного набора предъявляются три основных требования [138]: 1) число базисных функций, удовлетворительно аппроксимирующих волновую функцию ψi , должно быть невелико; 2) интегралы должны вычисляться, по возможности, просто и быстро, желательно аналитически; 3) базисные функции должны правильно моделировать поведение самого ядра и окружения вдали от него, т.е. давать в целом хорошее приближение к точной волновой функции, и, как следствие, молекула должна «чувствовать» любое возмущение в валентной области и вблизи молекулы. Улучшение результата расчета обычно достигается расширением базисного набора функций. Наиболее распространены базисы, в которых используются атомные функции гауссова типа, способствующие достаточно быстрому расчету интегралов. Одним из недостатков таких функций можно назвать плохое приближение поведения хартри-фоковских орбиталей, вследствие чего для аппроксимации атомных орбиталей в модели Хартри-Фока с достаточной точностью приходится брать большее число гауссовых функций по сравнению со слейтеровскими [138]. 66 Теория функционала плотности (англ. density functional theory, DFT) – метод расчёта электронной структуры систем многих частиц в квантовой физике и квантовой химии термодинамических, [139]. Он структурных успешно и применяется колебательных для получения параметров, при исследовании структуры переходных состояний, энергий активации, дипольных моментов и других свойств, является одним из наиболее широко используемых и универсальных методов. В традиционных методах определения электронной структуры (метод Хартри-Фока и производные от него) описание системы проводится с помощью многоэлектронной волновой функции. Основной целью теории функционала плотности является замена многоэлектронной волновой функции при описании электронной подсистемы – на электронную плотность. Данные изменения ведут к существенному упрощению задачи, так как многоэлектронная волновая функция зависит от 3N переменных (по 3 пространственных координаты на каждый из N электронов), тогда как плотность – функция лишь трех пространственных координат. Одним из распространенных в квантовой химии является обменный функционал BLYP (Becke, Lee, Yang, Parr). Но наиболее широко распространено приближение B3LYP, основанное на гибридном функционале, в котором обменная энергия рассчитывается с привлечением точного результата, полученного методом Хартри-Фока. Расчеты, основанные на теории функционала электронной плотности, обеспечивают наиболее доступный из всех известных способ учета электронной корреляции. Говоря о точности вычислений, следует отметить, что невозможно оценить погрешность расчета, проведенного методом теории функционала плотности, не сравнивая его результаты с другими подходами или с результатами экспериментов. 67 Поляризационные и диффузные функции Поляризационные функции улучшают описание химической связи, учитывая смещение центра тяжести электронного заряда. Их включение необходимо для расчетов с учетом корреляции электронов, чтобы можно было описать возбужденные состояния. В этих функциях заложены более высокие значения орбитального квантового числа l по сравнению с орбиталью соответствующего атома, занятой электронами в основном состоянии. Для молекул, включающих атомы от Li до F, в качестве поляризационных функций обычно используют шесть d-ОГТ (орбиталей гауссового типа), для атома водорода – три p-ОГТ [138]. Диффузные функции требуются для корректного описания анионов и слабых связей (ван-дер-ваальсовых, водородных), вычислений дипольного момента, поляризуемости и т.д. Обычно они представляют собой гауссовы функции s- и pтипа с малыми экспоненциальными множителями, медленно спадающие при увеличении расстояния от ядра [138]. В данной работе использованы базисные наборы 6-31G** (или 6-31G(d,p)) и 6-31++G** (или 6-31++G(d,p)). В первом случае к базисному набору добавляются 6 поляризационных d-функций для тяжелых (неводородных) атомов и 3 поляризационные p-функции для атомов водорода. Во втором случае, кроме уже описанных поляризационных, появляются: для неводородных атомов – 1 диффузная гауссова функция s-типа и 3 гауссовы функции p-типа (с одинаковыми экспонентами), для водородных атомов – 3 диффузных гауссиана p-типа. Это наиболее часто используемый базис для массовых расчетов. Кроме того, для получения результатов более высокой точности расчеты проводились в корреляционно-согласованном валентном базисном наборе cc-pVTZ. Этот базис построен так, чтобы последовательно учесть все поляризационные функции, понижающие энергию на величину одного порядка, с целью достигнуть наилучшей точности расчета. 68 Точность неэмпирических расчетов ограничена приближениями. С точки зрения химии, интерес представляет расчет, позволяющий надежно интерпретировать результаты эксперимента, для чего достаточно ограничиться следующими пределами точности [138]: - для геометрии молекул: длины связей – до 0.002 А, углы – до 0.2 град. - для силовых постоянных – до 2% (в основном оценивается точность воспроизведения частот колебательного спектра). 2.3.2. Метод анализа электронной плотности в терминах натуральных орбиталей связи (NBO) Квантово-химические расчеты позволяют проанализировать распределение электронной плотности в молекуле. Для этого удобно использовать так называемый анализ натуральных орбиталей связи (NBO), основанный на методе, который позволяет оптимально преобразовать многоэлектронную волновую функцию в локализованную форму, соответствующую одноцентровым (орбитали неподеленных пар LP) и двухцентровым (валентные связывающие орбитали связей BD) элементам в электронных структурах Льюиса [140]. Для большинства молекул волновые функции не могут быть полностью описаны единственной структурой Льюиса, поэтому их представляют в виде заселенности нельюисовых орбиталей (валентные разрыхляющие орбитали связей BD* или ридберговы орбитали RY*). Последовательность натуральных локализованных орбитальных наборов имеет вид [140]: AO NAO NHO NBO NLMO MO, где AO – базисные атомные орбитали; NAO – натуральные (естественные) атомные орбитали, то есть локализованные одноцентровые орбитали, которые можно определить как эффективные естественные орбитали атома в молекуле; 69 NHO – натуральные гибридные орбитали, представляющие линейную комбинацию NAO; NLMO – натуральные локализованные молекулярные орбитали, в значительной степени отражающие локализованную льюисову структуру химических связей; MO – канонические молекулярные орбитали. Данные натуральные локализованные наборы являются полными и ортонормированными, пригодными для описания любых свойств молекулы. В соответствии с простейшими представлениями о химической связи, каждая связывающая NBO – σAB – может быть записана в терминах двух линейных комбинаций гибридных орбиталей (NHO) – hA, hB на атомах A и B, с соответствующими поляризационными коэффициентами cA, cB [140]: σAB = cAhA + hBcB, (2.3.2.1) Поляризационные коэффициенты при натуральных гибридных орбиталях позволяют определить тип связи. Если cA>>cB, то данная связь относится к полярной, и больший вклад в образование связи дает натуральная гибридная орбиталь hA, а атом А – донор электронной плотности. Для полного охвата валентного пространства каждая валентная связывающая NBO образует пару с соответствующей валентной разрыхляющей NBO [140]: σAB* = cBhA – hAcB, (2.3.2.2) Таким образом, «заполненные» (донор) NBO льюисового типа дополняются «пустыми» (акцептор) NBO нельюисового типа. Данные взаимодействия приводят к частичному перетеканию электронной плотности с локализованных NBO на «пустые» (формально незаполненные в идеализированной структуре) нельюисовы орбитали и называются «делокализационными» поправками к нулевому приближению структуры Льюиса [140]. Величины донорно-акцепторных взаимодействий Е могут быть оценены посредством теории возмущений второго порядка [141,142]: 70 E = -n0Fij/ΔE (2.3.2.3) где, n0 – заселеннось орбитали неподеленной электронной пары; ΔE – разница орбитальных энергий и Fij – недиагональный элемент матрицы Фока, характеризующий взаимодействие орбиталей. В рамках NBO – анализа образование водородных связей происходит за счет переноса небольшого количества электронной плотности (переноса заряда), – «гиперсопряженного» взаимодействия – с орбиталей неподеленной электронной пары атома кислорода или азота донора на антисвязывающую орбиталь ОН- или NH-связи акцептора. Величина перенесенного заряда (qCT) при образовании водородной связи должна превышать 0,01е [141,143] и рассчитывается по следующей формуле [141]: qст 2FIJ E . . 2 где FIJ – недиагональный элемент матрицы (2.3.2.4) Фока, характеризующий взаимодействие (перекрывание) данных орбиталей; ΔЕ – разница орбитальных энергий. С помощью NBO-анализа также можно определить энергию донорноакцепторного взаимодействия, гибридизацию на атомах, натуральные заряды на атомах, порядки связей и многое другое. В диссертационной работе все расчеты проводились с помощью пакета программ Gaussian_03 [144] с использованием теории функционала плотности на уровне теории B3LYP с базисными наборами 6-31G (d,p), 6-31++(d,p) и cc-pVTZ. Как показал анализ литературных источников, это достаточный уровень квантовохимических расчетов для достижения поставленных целей. 71 2.4. ПОДГОТОВКА И ХАРАКТЕРИСТИКИ ИССЛЕДУЕМЫХ ВЕЩЕСТВ Исследуемые вещества (аминокислоты, дипептиды) осушали под вакуумом при температуре 323 К в течение 48 часов непосредственно перед использованием, хранили в эксикаторе над P2O5 (табл 2.5.). Бензойная кислота [CAS No. 65-85-0] (ACS reagent, 0.995; Aldrich Chemical Co.) использована без дальнейшей очистки. Таблица 2.5 – Характеристика аминокислот и дипептидов Аминокислоты Боковая цепь /- R CASRN Символ M/ (г·моль-1) Источник (фирма) Массовая доля, w L-Фенилаланин -CH2C6H5 - CH2C6H4OH 63-91-2 L-Phe 165.19 Sigma, France 60-18-4 L-Tyr 181.19 Sigma-Aldrich, USA BioUltra, 0.99 BioUltra, 0.99 L-Триптофан -C9H8N 73-22-3 L-Trp 204.23 Sigma-Aldrich, USA BioUltra, 0.99 L-Серин -CH2 OH 56-45-1 L-Ser 105.09 Sigma-Aldrich, Germany 0.99 L-Треонин -CH(OH) CH3 72-19-5 L-Thr 119.12 Sigma-Aldrich, Germany 0.98 L-Метионин -(CH2)2 SCH3 63-68-3 L-Met 149.67 Sigma-Aldrich, USA 0.98 L-Пролин -(CH2)3- 147-85-3 L-Pro 115.13 Sigma-Aldrich, Germany 0.99 Дипептиды Формула дипептида CASRN Символ M/ (г·моль-1) Источник (фирма) Массовая доля, w Глицил-Lаланин C5H10N2O3 07981 Gly-L-Ala 146.19 Reanal, Hungary 0.98 L-Аланил-Lаланин C6H12N2O3 01084 L-Ala-L-Ala 160.17 Reanal, Hungary 0.98 DL-Аланил-DLвалин C8H16N2O3 01080 DL-Ala-DLVal 188.23 Reanal, Hungary 0.98 DL-Аланил-DLнорвалин C8H16N2O3 2325-18-0 DL-Ala-DLNvl 188.23 Acros USA L-Аланил-Lтриптофан C14H17N3O3 16305-75-2 L-Ala-L-Trp 275.30 Fluka, Swetzerland L-Тирозин Organics, >0.99 >0.99 72 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ И ЭНЕРГЕТИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК АМИНОКИСЛОТ И ДИПЕПТИДОВ 3.1.1. Особенности масс-спектров и состава паров аминокислот и дипептидов Масс-спектры электронной ионизации дипептидов Gly-L-Ala, L-Ala-L-Ala, DL-Ala-DL-Val, DL-Ala-DL-Nvl, L-Ala-L-Trp, и аминокислот L-Ser, L-Thr, L-Met, L-Phe, L-Tyr, L-Trp, L-Pro представлены в таблице 3.1.1.1. полученных масс-спектров с имеющимися Сопоставление литературными данными [21,36,75,145] показывает, что фрагментация дипептидов и аминокислот носит, во многом, сходный характер. Как видно, в условиях электронной ионизации в массспектрах исследуемых соединений пики молекулярных ионов имеют слабую интенсивность, поскольку карбоксильная группа легко элиминируется [77]. Введение боковых алкильных или ароматических групп к одному из атомов углерода главной цепи ослабляет прилежащие связи, облегчая их разрыв под действием электронной ионизации [21]. Этим объясняется появление в массспектрах исследуемых соединений пика иона [COOH]+ с массой 45 а.е.м. с довольно высокой интенсивностью[75]. Масс-спектры аминокислот Результаты расшифровки масс-спектров электронной ионизации аминокислот представлены в таблицах 3.1.1.1-3.1.1.4. Известны наиболее характерные для них направления фрагментации: элиминирование боковой цепи R, карбоксильной группы [113,145]. Практически во всех масс-спектрах аминокислот регистрируются ионы со стехиометрией СООН+, NH2CHCO+, NH2CH+. В перегруппировка случае гидроксилсодержащих МакЛафферти (m/z = внутримолекулярный перенос протона от 75 аминокислот а.е.м.), когда наблюдается происходит OH-группы боковой цепи на карбонильный кислород с последующим элиминированием боковой цепи [113]. Следует отметить, что в масс-спектре метионина также содержится ион с m/z = 75 73 а.е.м., но он имеет вид CH3SCH2CH2+, а не NH2CHCO2H2+ [73]. Еще одной особенностью масс-спектра этой аминокислоты является довольно высокая интенсивность молекулярного иона по сравнению с другими аминокислотами. Это объясняется способностью атома серы, входящего в состав боковой цепи, локализовывать положительный заряд. Как было отмечено в п.1.4., сохранение заряда на R (ионы R+) характерно для ароматических аминокислот [113]. Так, в спектре фенилаланина пик иона PhCH2+ имеет интенсивность, сопоставимую с интенсивностью основного иона. Данный факт свидетельствует о преимущественном направлении фрагментации этой молекулы по связи CH-CH2. В ароматических аминокислотах отмечен бензильный разрыв с образованием резонансно стабилизированного иона, который в дальнейшем превращается в полностью рандомизованный тропилийкатион, который в свою очередь последовательно теряет две молекулы ацетилена [113]. Также в литературе [74] отмечается возрастание π-электронной плотности в кольце для ряда: L-Phe, L-Tyr, L-Trp, что отражается на интенсивностях молекулярного иона в масс-спектрах этих аминокислот, которые возрастают в той же последовательности. Гетероциклическая аминокислота пролин отличается от остальных тем, что у нее α-аминокислотный фрагмент включен в пирролидиновый цикл. Тем самым отчасти фрагментация пролина протекает по направлениям, характерным для циклических углеводородов. Одним из таких путей является раскрытие цикла с последующим элиминированием алкена [C2H4]+, в результате чего образуется ион с m/z = 87 а.е.м. Масс-спектры дипептидов Фрагментация молекул дипептидов преимущественно происходит по пептидной связи. Таким образом, молекулярный ион пептида распадается, прежде всего, в результате разрыва связей C(H)-C(O), C(O)-N(H), N(H)-C(H) и C(H)-R с образованием осколочных ионов. Основным направлением распада при 74 электронной ионизации исследуемых веществ является разрыв пептидных связей с образованием аминокислотных и альдиминных фрагментов: NH2-CH(R1)-CO+, + NH-CH(R2)-COOH и + NH2=CH(R1), + CO-NH-CH(R2)-COOH [75,146,147]. Полученные масс-спектры паров исследуемых дипептидов представлены в Таблице 3.1.1.1. Алифатические остатки, как правило, не вносят существенных осложнений в масс-спектр [22]. Для масс-спектра Gly-L-Ala характерно наличие пика c координатой m/z = 30 а.е.м., относящегося к иону [NH2CH2]+, появление которого можно связать с наличием заместителя R=H в боковой цепи при атоме Cα. В то же время присутствие радикала R=CH3 при атоме Cα в молекулах L-Ala-L-Ala, DLAla-DL-Val, DL-Ala-DL-Nvl, L-Ala-L-Trp ведет к тому, что при диссоциативной ионизации образуется ион [NH2CH]+ с m/z = 29 а.е.м. Для Gly-L-Ala интенсивность иона N-концевого фрагмента [NH2CH2CO]+ с m/z = 58 а.е.м. несколько выше, чем подобного иона [NH2CHCO]+ с m/z = 57 а.е.м. для остальных дипептидов, что, по-видимому, можно объяснить меньшими затратами энергии на разрыв одной связи в первом случае, чем двух связей в последних молекулах. Однако существенное различие в интенсивностях иона [NH2CH(CH3)CO]+ с m/z = 72 а.е.м. в представленных масс-спектрах, образование которого сопровождается формально разрывом лишь одной связи, указывает на то, что кинетический фактор играет, по-видимому, не меньшую роль, чем энергетический. Впервые получены масс-спектры электронной ионизации для DL-Ala-DL-Nvl и L-Ala-L-Trp, для которых в целом характерны те же направления фрагментации, что и для Gly-L-Ala, L-Ala-L-Ala и DL-Ala-DL-Val. Образование четырех интенсивных токов ионов (m/z = 45, 72, 99, 128 а.е.м.) наблюдается в масс-спектре DL-Ala-DL-Nvl. Два из них подобны доминантным пикам в масс-спектрах соответствующих аминокислот: Ala (m/z = 45 а.е.м.) and Nvl (m/z = 72 а.е.м.) [145]. Для L-Ala-L-Trp ионный фрагмент с m/z = 130 а.е.м., образованный при 75 отрыве боковой цепи аминокислоты [C9H8N]+, является наиболее интенсивным ионом как в масс-спектре исследуемого дипептида, так и при фрагментации молекулярного иона аминокислоты L-Trp. Таблица 3.1.2.1 – Масс-спектры ЭИ исследуемых дипептидов (Uioniz=30 эВ) Gly-L-Ala Т=428 К m/z Ионы 30 45 58 72 85 100 116 128 146 [NH2CH2]+ [COOH]+ [NH2CH2CO]+ [NHC(CH3)CO] + [MC-[CONH]]+ [MC-[CO]]+ [CONHCH(CH3)COOH]+ MC + M+ L-Ala-L-Ala Т=428 К Iотн., % 37 67 49 4 99 14 4 100 7 DL-Ala-DL-Val Т=428 К m/z Ионы 29 45 57 72 99 114 142 160 [NH2CH]+ [COOH]+ [NH2CHCO]+ [NH2CH(CH3)CO]+ [MC-[CONH]]+ [MC-[CO]]+ MC + M+ Iотн., % 20 100 25 39 44 3 46 6 m/z Ионы 29 45 57 72 87 98 116 127 142 170 188 [NH2CH]+ [COOH]+ [NH2CHCO]+ [NH2CH(CH3)CO]+ [NH2CH(CH3)CONH]+ [NHC(CH(CH3)2)CO] + [NHCH(CH(CH3)2)COOH]+ [MC-[CONH]]+ [MC-[CO]]+ MC + M+ Iотн., % 10 100 35 86 74 93 86 94 6 30 1 Таблица 3.1.2.2 – Масс-спектры ЭИ исследуемых аминокислот и дипептидов (Uioniz=30 эВ) DL-Ala-DL-Nvl T=477 K L-Ala-L-Trp T=465 K L-Pro T=419 K m/z Ионы Iотн., % m/z Ионы Iотн., % m/z Ионы 29 [NH2CH]+ 4 29 [NH2CH]+ 3 29 [NH2CH]+ 45 57 72 87 99 116 128 144 170 188 + [COOH] [NH2CHCO]+ [NH2CH(CH3)CO]+ [NH2CH(CH3)CONH]+ [NHCH(CH2CH2CH3)CO]+ [M-[NH2CH(CH3)CO]]+ [NH2CH(CH3)CONHCHCO]+ [M-[NH2CH(CH3)]]+ M c+ M+ 59 29 100 6 35 5 52 9 <1 7 45 57 72 77 87 105 130 188 259 275 + [COOH] [NH2CHCO]+ [NH2CH(CH3)CO]+ [C6H5]+ [NH2CH(CH3)CONH]+ [C7H7N]+ [C9H8N]+ [C9H8NCHCOOH]+ [M-[NH2]]+ M+ 4 2 1 1 1 2 100 4 10 3 43 45 57 71 75 87 115 Iотн., % 21 + [NHCH2CH2] [COOH]+ [NH(CH2)3]+ [NH(CH2)4]+ [NH2CH2COOH]+ [M-[C2H4]]+ M+ 13 23 1 100 1 1 2 76 Таблица 3.1.2.3 – Масс-спектры ЭИ исследуемых аминокислот (Uioniz=30 эВ) L-Ser Т=403 К L-Thr Т=433 К m/z Ионы 29 45 57 60 75 88 105 [NH2CH]+ [COOH]+ [NH2CHCO]+ [M-[COOH]]+ [NH2CHCO2H2]+ [M-[OH]]+ M+ Iотн., % 31 51 44 100 95 15 6 m/z Ионы 29 45 57 75 104 120 [NH2CH]+ [COOH]+ [NH2CHCO]+ [NH2CHCO2H2]+ [M-[CH3]]+ M+ L-Met Т=428 К Iотн., % 60 32 100 88 7 3 m/z Ионы 29 45 57 61 75 88 102 104 116 133 149 [NH2CH]+ [COOH]+ [NH2CHCO]+ [CH2SCH3]+ [CH3SCH2CH2]+ [M-[CH2SCH3]]+ [M-[SCH3]]+ [M-[COOH]]+ [M-[NH2]-[OH]]+ [M-[NH2]]+ M+ Iотн., % 48 22 63 100 61 52 39 42 28 52 72 Таблица 3.1.2.4 – Масс-спектры ЭИ исследуемых аминокислот (Uioniz=30 эВ) L-Phe Т=439 К L-Tyr Т=507 К m/z Ионы 29 39 45 51 65 74 77 91 103 121 165 [NH2CH]+ [C3H3]+ [COOH]+ [C4H3] + [C5H5]+ [M-[C7H7]]+ [C6H5]+ [PhCH2]+ [PhC2H2]+ [M-[COOH]]+ M+ Iотн., % 36 16 38 14 41 100 27 98 31 33 8 m/z Ионы 29 39 45 51 65 74 77 91 108 119 136 181 [NH2CH]+ [C3H3]+ [COOH]+ [C4H3] + [C5H5]+ [M-[C7H7]-[OH]]+ [C6H5]+ [PhCH2]+ [HOPhCH2]+ [M-[COOH]-[OH]]+ [M-[COOH]]+ M+ L-Trp Т=465 К Iотн., % 3 1 4 3 1 5 12 5 100 1 3 10 m/z Ионы 29 39 45 51 65 74 77 89 104 115 117 130 160 204 [NH2CH]+ [C3H3]+ [COOH]+ [C4H3] + [C5H5]+ [M-[C9H8N]]+ [C6H5]+ [M-[C8H6N]]+ [C7H7N]+ [C8H5N]+ [C8H7N]+ [C9H8N]+ [M-[COOH]]+ M+ Iотн., % 13 2 15 3 1 2 14 2 16 3 7 100 6 26 Необходимо отметить, что некоторые пептиды проявляют склонность к циклизации при нагревании (в процессе испарения). Анализ полученных данных показал, что в масс-спектрах исследуемых соединений регистрируется молекулярный ион, соответствующий циклической форме дипептида с массой [M-[H2O]]+. Согласно [75], при нагревании до 393-433 К возможно образование циклических форм дипептидов, что и было нами установлено для алифатических 77 дипептидов (за исключением L-Ala-L-Trp), определен вид и фрагментация этих форм (см. табл. 3.1.1.1). Рисунок 3.1.1.1 – Ациклическая и циклическая формы дипептида на примере L-Ala-L-Ala. Циклическая форма дипептида может образоваться в результате реакции (на примере L-Ala-L-Ala): Ala-Ala → (Ala-Ala)c + Н2О, (3.1.1.1) Для оценки вероятности протекания такой реакции проведены квантовохимические расчеты DFT-методом B3LYP (Gaussian 03) [144] с базисным набором 6-31G(d,p). Исходная геометрия молекул взята аналогично геометрии соответствующих цвиттер-ионов, которые существуют в кристаллах. Рассчитаны энергии для молекулы воды и линейных и циклических структур всех дипептидов. Проведена оптимизация геометрических параметров, расчет частот колебаний, активных в ИК-спектре. Отсутствие мнимых частот подтверждает то, что полученные структуры действительно являются минимумами на поверхности потенциальной энергии. На основании полученных данных найдено изменение свободной энергии Гиббса ΔG в реакции (3.1.1.1), что доказывает возможность образования циклических дипептидов из ациклических молекул в газовой фазе (табл. 3.1.1.5). 78 Таблица 3.1.1.5 – Изменение энергии Гиббса в реакции (3.1.1.1) и энтальпия сублимации циклических дипептидов ΔG, кДж/моль ΔsH(Т=428К), кДж/моль Gly-L-Ala L-Ala-L-Ala DL-Ala-DL-Val DL-Ala-DL-Nvl L-Ala-L-Trp - 22 - 19 - 23 - 15 - 12 1035 1027 1514 --- --- Выявлено, что для DL-Ala-DL-Nvl и L-Ala-L-Trp изменение энергии Гиббса в реакции циклизации менее отрицательно, чем для других алифатических дипептидов. Данный факт может служить объяснением незначительного содержания циклической формы в насыщенном паре DL-Ala-DL-Nvl и ее отсутствия у L-Ala-L-Trp. Для ионных токов циклических форм алифатических дипептидов были построены температурные зависимости ln(IT)=f(T-1), на основе которых методом линейной регрессии найдены энтальпии сублимации данных циклических форм. Вследствие того, что содержание циклической формы дипептида в масс-спектре DL-Ala-DL-Nvl мало, ее энтальпию сублимации получить не удалось. 3.1.2. Энтальпии сублимации аминокислот и дипептидов Термодинамическое исследование сублимации аминокислот и дипептидов проведено эффузионным методом Кнудсена с масс-спектрометрическим контролем состава пара в рамках второго закона термодинамики в интервалах температур: 440-501 К для Tyr, 425-475 К для Trp, 396-440 К для Phe, 374-418 К для Pro, 415-460 К для Met, 442-479 К для Ser, 441-477 К для Thr, 424-497 К для Gly-Ala, 430-497 К для Ala-Ala, 412-480 К для Ala-Val, 446-491 К для Ala-Nvl, 453-482 К для Ala-Trp. На основе анализа данных, полученных в масс-спектрометрическом эксперименте, для токов наиболее интенсивных ионов в масс-спектрах каждого из изученных соединений были построены температурные зависимости ln(IT)=f(1000/T), представленные на 79 рисунках (рис. 3.1.2.1-3.1.2.12). Можно констатировать, что точки на данных зависимостях отвечают состояниям, очень близким к равновесным, поскольку гистерезисные явления при увеличении/уменьшении температуры практически отсутствуют. Во всех случаях эти функции хорошо аппроксимируются линейными зависимостями. температура паров не Поскольку превышала во всех температуры случаях максимальная плавления (разложения) соединений, можно заключить, что изучаемым процессом парообразования является сублимация. Установлено, что наклоны температурных зависимостей для токов различных ионов в случае каждого соединения имеют близкие значения, что свидетельствует о происхождении ионов из одной молекулярной формы. Расчет молярных энтальпий сублимации аминокислот и дипептидов проводили в рамках второго закона термодинамики на основе уравнения Клаузиуса-Клапейрона (2.1.3.2) методом линейной регрессии. В таблице 3.1.2.1 представлены полученные значения молярных энтальпий сублимации subHmo(Tav) при средней температуре эксперимента (Tav=T). Указанные погрешности этих значений включают утроенное стандартное отклонение линейной аппроксимации экспериментального набора точек для каждого образца. 80 + [NH2CH2] + [COOH] + [NH2CH2CO] 11 ln(IT) + [Mc-(CONH)] + [Mc-(CO)] + [Mc] 10 9 8 7 6 2.30 2.35 2.40 2.45 2.50 2.55 1000/T Рисунок 3.1.2.1 – Температурная зависимость ионных токов наиболее интенсивных ионов в масс-спектре Gly-L-Ala + [COOH] + [NH2CHCO] 13 + [NH2CH(CH3)CO] 12 [Mc-(CONH)] + [Mc-(CO)] + [Mc] ln(IT) 11 + 10 9 8 7 2.18 2.20 2.22 2.24 2.26 2.28 1000/Т Рисунок 3.1.2.2 – Температурная зависимость ионных токов наиболее интенсивных ионов в масс-спектре L-Ala-L-Ala 81 + [COOH] + [NH2CH(CH3)CO] [NHC(CH(CH3)2)CO] 16 + [NHCH(CH(CH3)2)COOH] ln(IT) [Mc-(CONH)] + [M] 14 + + 12 10 8 6 2.20 2.25 2.30 2.35 2.40 2.45 1000/T Рисунок 3.1.2.3 – Температурная зависимость ионных токов наиболее интенсивных ионов в масс-спектре DL-Ala-DL-Val + [NH2CH(CH3)CO] + [NHCH(CH2CH2CH3)CO] 13 ln (IT) + [NH2CH(CH3)CONHCHCO] 12 11 10 9 2.05 2.10 2.15 2.20 1000/T 2.25 Рисунок 3.1.2.4 – Температурная зависимость ионных токов наиболее интенсивных ионов в масс-спектре DL-Ala-DL-Nvl 82 14 [C9H8N] + + [M] 13 ln (IT) 12 11 10 9 8 7 2.05 2.10 2.15 2.20 2.25 2.30 1000/T Рисунок 3.1.2.5 – Температурная зависимость ионных токов наиболее интенсивных ионов в масс-спектре L-Ala-L-Trp 8.5 + [M-COOH] ln(IT) + [H2NCHCO2H2] 8.0 7.5 + [COOH] 7.0 + [H2NCHCO] 6.5 2.16 2.18 2.20 2.22 1000/T 2.24 Рисунок 3.1.2.6 – Температурная зависимость ионных токов наиболее интенсивных ионов в масс-спектре L-Ser 83 + [NH2CH] + [COOH] + [NH2CHCO] 12 + [NH2CHCO2H2] + [M-CH3] ln(IT) + [M] 10 8 6 2.10 2.15 2.20 2.25 1000/T Рисунок 3.1.2.7 – Температурная зависимость ионных токов наиболее интенсивных ионов в масс-спектре L-Thr 14 + [NH2CHCO] + [CH2SCH3] + [CH3SCH2CH2] ln(IT) + [M-[CH2SCH3]] M 12 + 10 8 2.24 2.32 2.40 2.48 1000/T 2.56 Рисунок 3.1.2.8 – Температурная зависимость ионных токов наиболее интенсивных ионов в масс-спектре L-Met (усредненная интенсивность) 84 15 + [M-(C7H7)] ln(IT) 14 13 12 11 10 9 2.20 2.25 2.30 2.35 2.40 2.45 2.50 2.55 1000/Т Рисунок 3.1.2.9 – Температурная зависимость ионного тока наиболее интенсивного иона в масс-спектре L-Phe 14 + [HOPhCH2] ln(IT) 12 10 8 6 1.90 1.95 2.00 2.05 2.10 2.15 2.20 2.25 1000/T Рисунок 3.1.2.10 – Температурная зависимость ионного тока наиболее интенсивного иона в масс-спектре L-Tyr 85 + 14 [C9H8N] ln (IT) 12 10 8 2.08 2.16 2.24 2.32 1000/T Рисунок 3.1.2.11 – Температурная зависимость ионного тока наиболее интенсивного иона в масс-спектре L-Trp + 14 [NH(CH2)4] ln (IT) 13 12 11 10 9 2.35 2.40 2.45 2.50 2.55 2.60 2.65 2.70 1000/T Рисунок 3.1.2.12 – Температурная зависимость ионного тока наиболее интенсивного иона в масс-спектре L-Pro 86 Таблица 3.1.2.1 – Энтальпии сублимации исследуемых дипептидов и аминокислот Вещество subHmo(Тav) (exp.), кДж/моль Tav, (exp), К Gly-L-Ala L-Ala-L-Ala DL-Ala-DL-Val DL-Ala-DL-Nvl L-Ala-L-Trp Gly L-Ala L-Ser L-Thr L-Met L-Phe L-Tyr L-Trp L-Pro 1075 1135 1564 1773 1733 131±3[13] 1326[28] 1418 1585 1352 1582 2003 1843 1312 432 451 436 477 466 421 433 453 442 438 418 471 450 396 Для экстраполяции энтальпий Cp,mo(cr) 298.15К, Дж/(моль.К) [29, 59] 168 195 240 277 340 99 122 136 166 290 203 217 238 151 сублимации Cp,mo(g) 298.15 К, Дж/(моль.К) subHmo (298.15K), кДж/моль 172 195 239 237 303 86 109 124 147 172 184 203 219 121 1076 1136 1565 1844 1794 133±4 1348 1439 1616 1523 1603 2024 1874 1344 за пределы изученного температурного интервала и получения стандартных значений (po = 0.1 MPa; T=298.15 K) молярной энтальпии сублимации, subHmo(298.15 K), необходимо учитывать зависимость subHmo(Tav) от температуры. Происхождение данной зависимости можно наглядно объяснить с помощью термодинамического цикла, схема которого представлена на рис.3.1.2.1. Рисунок 3.1.2.1 – Термодинамический цикл для приведения энтальпии сублимации к Т=298.15 К 87 Если известны теплоемкости твердой и газовой фаз (Cp,mo(cr) и Cp,mo(g)), то стандартную молярную энтальпию сублимации subHmo(298.15 K) можно соотнести с экспериментально измеренным значением subHmo(T) при температуре T с помощью уравнения Кирхгоффа: Т subHmo(298.15K)= subHmo(T)+∫298 (Cp,mo(cr)-Cp,mo(g))dT, (3.1.2.1) где Cp,mo(cr) и Cp,mo(g) – стандартные молярные теплоемкости соединений в твердом и газообразном состояниях, соответственно. Данное уравнение можно использовать для отнесения измеренной энтальпии сублимации к любой температуре. Величина Т может обозначать как дискретную температуру измерения (Т), так и среднюю температуру эксперимента (Tav), проводимого в узком температурном интервале. Принимая разность между теплоемкостями обеих фаз не зависящими от температуры, поскольку ΔT экстраполяции невелика, и интегрируя уравнение (3.1.2.1), получим subHmo(298.15K)=subHmo(Tav)+[(Cp,mo(cr)-Cp,mo(g))·(Tav-298.15K)]/1000 (3.1.2.2) Для приведения молярной энтальпии сублимации к стандартным условиям (T=298.15 K, po =0.1 MПа) необходимо знание разности молярных теплоемкостей соединений в твердом и газообразном состояниях. В таблице 3.1.2.1 приведены значения Cp,mo(cr) для аминокислот и дипетпидов при температуре 298.15 К, взятые из литературных источников [29,59]. Экспериментальные значения молярной теплоемкости кристаллических дипептидов DL-Ala-DL-Nvl и L-Ala-LTrp вычислены из удельных теплоемкостей, которые были измерены в Центре коллективного пользования ИХР РАН (табл. 3.1.2.1). Экспериментальные значения теплоемкостей для газового состояния Cp,mo(g) исследуемых веществ отсутствуют и могут быть оценены в рамках теоретических приближений. В данной работе стандартные молярные теплоемкости аминокислот и дипептидов в газовой фазе Cp,mo(g) получены из квантово-химических расчетов методом B3LYP/6-31G(d,p) с использованием пакета программ Gaussian 03 [144]. Их 88 значения также представлены в таблице 3.1.2.1. Значения стандартной молярной энтальпии сублимации subHmo(298.15K), рассчитанные по уравнению (3.1.2.2), приведены в таблице 3.1.2.1. Как видно из таблицы 3.1.2.1, разность между величинами subHmo(Tav) при средней температуре экспериментов (Tav) и subHmo(298.15K) сопоставима с погрешностью эксперимента. Поэтому многие авторы [28,44,115] принимают энтальпию сублимации не зависящей от температуры в сравнительно нешироком темпратурном интрвале (ΔТ=200-500 К). В таблице 3.1.2.2 приведены имеющиеся литературные значения энтальпий сублимации для исследуемых аминокислот, полученные различными экспериментальными методами. Существующий разброс в величинах sublHmо может быть объяснен особенностями термического поведения соединений этого класса (в частности, невысокой термической устойчивостью), чистотой образцов (особенно для ранних исследований) и погрешностью используемых методов исследования. Таким образом, значения молярной энтальпии сублимации для исследуемых дипептидов и аминокислот получены нами впервые эффузионным методом Кнудсена с масс-спектрометрическим контролем состава пара. Анализ всех данных таблицы 3.1.2.1 подтверждает вывод о сложности установления однозначных закономерностей в энтальпиях сублимации аминокислот и дипептидов, имеющих в структуре молекул столь различные по природе боковые радикалы. Значения энтальпии сублимации повышаются с понижением температуры. Можно отметить тенденцию к повышению энтальпии сублимации дипептидов с ростом длины их боковых углеводородных радикалов. Повидимому, это обусловлено взаимодействий в кристалле. увеличением вклада ван-дер-ваальсовых 89 Таблица 3.1.2.2 – Энтальпии сублимации исследуемых аминокислот из обзора [28] №п/п Формула 1. C2H5NO2 2. 3. 4. 5. sublHmо, кДж/моль Tav, K method 136.5±2 138.1±4.6 136.4±4.0 U1 96.2±4 130.5±2 419 298 462 375 414 TE2, ME3 C4 ME LE5 ME 407-426 132.8 ±1 132.4±1.3 144.8±4.2 414 433 298 TE,ME C L-пролин 396-416 380-420 323-423 L-метионин 127.4±1 149±4 U 50±8 406 400 373 TE,ME C LE 164±4 125 298 474 C A6 U 90±6.3 154±8 392 455 LE ME 101±8 462 LE U 87.9±8 390 LE Соединение. Интервал Т, K Глицин 408-431 413-450 453-471 325-425 412-417 C3H7NO2 C5H9NO2 C5H11NO2S C9H11NO2 6. C9H11NO3 7. C11H12N2O2 L-аланин 463-485 L-фенилаланин 342-442 L-тирозин 412-512 L-триптофан 340-440 1 U – ненадежные данные 2 TE – тензиметрический метод 3 ME – эффузионный метод Кнудсена, перенос массы 4 C - калориметрия 5 LE – метод Лэнгмюра 6 A – вычислено из данных по давлению паров Интересно отметить, что аминокислоты и пептиды имеют высокие температуры сублимации. Показано, что в отличие от молекулярных органических соединений, для которых характерны, прежде всего, ван-дерваальсовы взаимодействия и невысокие значения энтальпий сублимации (менее 100 кДж/моль) [28], довольно высокие величины subHmo для исследуемых аминокислот и дипептидов могут быть обусловлены дополнительным 90 электростатическим вкладом при взаимодействии цвиттер-ионов друг с другом и наличием водородных связей. 3.1.3. Взаимосвязь молекулярных дескрипторов аминокислот и дипептидов с их энергетическими характеристиками Методы расчета ΔsubHmo сравнительно немногочисленны и ориентированы в основном на органические соединения, не содержащие атомов N и O, поэтому теоретическая оценка ΔsubHmo аминокислот и пептидов не потеряла своей актуальности до сих пор [34,35]. Для решения поставленной задачи среди разных подходов следует выделить наиболее широко применяемые аддитивный подход групповых вкладов, метод корреляций «структура-свойство» и метод атоматомных потенциальных функций [28,32,34,35,44]. Все они позволяют получать энтальпии сублимации с близкими по величине коэффициентами корреляций и стандартными отклонениями. При поиске корреляционных соотношений важным моментом является выбор дескрипторов, характеризующих молекулярную структуру вещества. Большинство опубликованных QSPR-моделей базируется на традиционных параметрах (коэффициент распределения (logP), липофильность (π), молекулярная рефракция (MR) и др.). Существует множество примеров использования топологических дескрипторов и групповых вкладов для описания физико-химических свойств соединений [148,149]. Однако эти подходы ограничены их применением в узких пределах родственных углеводородных соединений, различающихся, например, длиной цепи алкильного заместителя. Кроме того, они не учитывают вклады отдельных функциональных групп, особенно содержащих гетероатомы, в межмолекулярные взаимодействия, которые влияют на свойства соединения [150]. В последние годы наблюдается заметный интерес к расчетным (в том числе, квантово-химическим) структурным характеристикам для исследования связи 91 структура-свойство [151-153]. В квантово-химических расчетах сложных молекул используются атомные и молекулярные квантово-химические дескрипторы, такие как дипольный момент (μ), индекс поляризуемости, заряды на атомах, энергии высшей занятой (EHOMO) и низшей незанятой (ELUMO) молекулярных орбиталей и др. [149,154]. На основе обобщения термодинамическим собственных (энтальпии и литературных ΔsubHmo, сублимации данных теплоемкости по Cp,s) свойствам дипептидов (+NH3-CH(-R)-CO-NH-CH(-R')-COO-) и аминокислот (+NH3CH(-R)-COO-) (где -R, -R' боковые цепи) проведен поиск корреляций с различными молекулярными ответственными за диссертационной представленные вклады работе в параметрами, в нами Таблице энергию в или иной кристаллической выбраны 3.1.3.1, той молекулярные которые используются степени решетки. В дескрипторы, в качестве независимых, но взаимодополняющих параметров, описывающих различные типы межмолекулярного взаимодействия. В качестве стерических дескрипторов использован молекулярный объем Ван-дер-Ваальса (VW), учитывающий трехмерную структуру молекул и отражающий в определенной степени ван-дер-ваальсовы взаимодействия. Расчет ван-дер-ваальсовых объемов молекул исследуемых аминокислот и дипептидов проводился на основе использования инкрементов объемов δVi атомов, полученных методом численного интегрирования в [155]. Этот метод позволяет учитывать пространственные пересечения трех и более ван-дер-ваальсовых сфер валентно несвязанных атомов в одной точке, что имеет принципиальное значение для получения более точных объемов стерически сложных молекул и молекул, содержащих внутримолекулярные водородные связи. 92 Таблица 3.1.3.1 Физико-химические параметры аминокислот и дипептидов № п/п 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Вещества Gly L-Ala L-Val L-Leu L-Ser L-Thr L-Pro L-Phe L-Arg L-Cys L-Met L-Tyr L-Trp L-His L-Asn L-Gln L-Lys Gly-L-Ala L-Ala-L-Ala DL-Ala-DL-Val DL-Ala-DL-Nvl L-Ala-L-Trp Vw, Ǻ3 60.63 76.81 109.45 125.48 80.62 99.37 98.82 146.96 151.31 90.83 128.61 154.85 174.68 127.21 104.43 120.45 132.03 120.56 137.33 165.41 168.73 233.47 ISA [156] 19.93 62.9 120.91 154.35 19.75 59.44 122.35 189.42 52.98 78.51 132.22 132.16 179.16 87.38 17.87 19.53 102.78 82.83 125.80 183.81 245.40 242.06 Ind 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 μ [158] 0 0 0 0 1.62 1.52 1.49 0.25 3.52 1.93 1.77 1.33 2.18 3.93 3.51 3.75 1.51 2.19 3.22 3.62 3.43 3.22 NHB [158] 0 0 0 0 3 3 2 0 7 3 2 3 2 3 5 5 3 4 8 8 4 6 Молекулярная поверхность Sa (ISA) характеризует гидрофобные свойства исследуемых веществ. В работе [156] предложен индекс площади поверхности боковых цепей молекулы (ISA), доступной для неспецифических взаимодействий с растворителем. Его значения могут служить количественной характеристикой гидрофобности молекулы, исходя из ее структуры. Параметры ISA различных аминокислот определены авторами [156] с использованием версии программы Pearlman [157], модифицированной для расчета площади поверхности молекул. Для учета возможности образования водородных связей в исследуемых веществах введен параметр NHB, который представляет сумму максимально возможного числа Н-связей для различных функциональных групп, содержащих соответствующие донорные и акцепторные атомы [158]. Электростатические 93 свойства аминокислот и дипептидов в определенной степени могут быть выражены через дипольные моменты боковых цепей их молекул (μ), величины которых были рассчитаны квантово-химически в работе [158]. Молярная теплоемкость Cp,mo(cr) может быть использована как термодинамический дескриптор аминокислот и дипептидов. Анализ данных по молярной теплоемкости исследуемых кристаллических дипептидов показывает, что значения Cp,mo(cr) возрастают с ростом объема Ван-дер-Ваальса (Vw) (рис.3.1.3.1) 360 5 4 280 240 3 o -1 Cp,m (cr) / J mol K -1 320 200 2 1 160 120 140 160 180 Vw / A 200 220 240 3 Рисунок 3.1.3.1 Зависимость стандартных молярных теплоемкостей кристаллических дипептидов от объемов Ван-дер-Ваальса для Gly-L-Ala (1), L-Ala-L-Ala (2), DL-Ala-Dl-Val (3), DL-Ala-DL-Nvl (4), and L-Ala-L-Trp (5) Сопоставление полученных значений стандартных энтальпий сублимации с величинами молярных теплоемкостей кристаллических аминокислот позволило дифференцировать их поведение в зависимости от структуры бокового радикала (рис. 3.1.3.2). 94 210 tyr 200 -1 190 trp subHm , кДж моль 180 170 leu thr o 160 val 150 cys ser 140 130 gly 100 ala phe gln met his agr asn pro 150 200 250 300 -1 -1 o Cp,m (cr), Дж моль К Рисунок 3.1.3.2 Зависимость стандартных молярных энтальпий сублимации от молярных теплоемкостей кристаллических аминокислот Как видно из рисунка 3.1.3.2, можно выделить три основные группы молекул L--аминокислот, для которых наблюдается повышение значений ΔsubHmo при увеличении Cp,mo(cr): - молекулы, имеющие преимущественно гидрофобные (алкильные, ароматические) боковые цепи: Gly, Ala, Val, Leu, Phe, Trp; - молекулы с ОН-группой в боковой цепи: Ser, Thr, Tyr; - молекулы, содержащие атомы азота и серы (NH, NH2, S, SH) в боковой цепи: Asn, Cys, Gln, Arg, His, Met. Предполагая, что теплоемкость изученного ряда аминокислот в кристаллическом состоянии определяется, прежде всего, первичной структурой молекул, наличие различных функциональных групп в боковой цепи изменяет энергетические затраты на увеличение степеней свободы молекул (колебательных, вращательных, трансляционных) при нагревании вещества в разной степени. Это может быть связано с фактором упаковки молекул и плотностью кристаллов, что требует проведения отдельных исследований. Анализ собственных и имеющихся значений энтальпий сублимации [28,32,34,44] позволил выявить зависимости ΔsubHmo от индекса ISA. Показано, 95 что величины ISA и энтальпии сублимации изменяются симбатно в следующих рядах: - алифатические аминокислоты: Gly<Ala<Val<Leu; - аминокислоты с ОН-группами в боковой цепи: Tyr>Thr>Ser; - аминокислоты с амидной группой в боковой цепи: Asn<Gln<Lys; - аминокислоты, содержащие в боковой цепи атомы азота и серы (NH, NH2, S, SH): Arg<Cys<His<Met. Ароматические аминокислоты Phe, Trp, Tyr имеют ISA и ΔsubHmo бóльшие, чем Gly (без боковой цепи) и Ala (с боковой CH3-группой), вследствие наличия бензольного, фенольного и индольного кольца, соответственно, в структуре их молекул. Что касается алифатических дипептидов, то повышение ISA сопровождается ростом ΔsubHmo в ряду Gly-Ala<Ala-Ala<Ala-Val<Ala-Trp<Ala-Nvl. Таким образом, выявлена тенденция к повышению энтальпии сублимации исследуемых соединений с удлинением углеводородной боковой цепи, что обусловлено увеличением вклада ван-дер-ваальсовых взаимодействий. Наличие ароматического кольца в боковой цепи исследуемых аминокислот и введение ОНгруппы в структуру молекул приводит к увеличению энтальпий сублимации: Ala<Phe<Trp<Tyr; Ala<Ser<Thr<Tyr. Изменение ΔsubHmo при переходе от Ala к Met также обусловлено увеличением размера боковой цепи: Ala<Met. Довольно высокие значения subHmo для исследуемых аминокислот и дипептидов связаны с дополнительными вкладами от водородных связей и электростатических взаимодействий между цвиттер-ионами. При проведении сравнительного термодинамического анализа разных соединений, содержащих в боковой цепи различные по структуре функциональные группы, предпочтительнее использовать объемно-удельные параметры [13,159], получаемые путем деления молярного свойства (ΔsubHmo) на объем молекулы, в качестве которого может быть использован ван-дер-ваальсов 96 объем. Отношение ΔsubHmo/VW характеризует величину объемно-удельной энтальпии сублимации вещества, учитывающую размеры исследуемой многоатомной молекулы. На основе обобщения собственных и литературных данных предложен подход для оценки регрессионные взаимодействий коэффициенты в исследуемых четырех-параметрического веществах через корреляционного соотношения (3.1.3.1), связывающего объемно-удельные энтальпии сублимации subHmo /Vw и структурные дескрипторы молекул, в той или иной степени ответственные за вклады в ван-дер-ваальсовы взаимодействия (Vw), образование водородных связей (NHB) и электростатические эффекты (μ): subHmo/Vw=a+b1Vw+b2NHB+b3+b4(Ind), (3.1.3.1) где Vw – ван-дер-ваальсов объем молекул, NHB - сумма максимально возможного числа Н-связей для различных функциональных групп, содержащих соответствующие донорные и акцепторные атомы, μ - дипольный момент, Ind – показатель вариантности (Ind=1 для аминокислот, содержащих в боковой цепи активные группы OH-, NH2-, NH; Ind=0 для остальных аминокислот и дипептидов). Следует отметить, что данные дескрипторы весьма чувствительны к изменению структуры молекулы в зависимости от природы и размеров боковой цепи. В таблице 3.1.3.2 представлены коэффициенты регрессии a, b1, b2, b3, b4 уравнения 3.1.3.1 для аминокислот и дипептидов соответственно. Таблица 3.1.3.2 Коэффициенты корреляционного уравнения (3.1.3.1) Вещество a0 102 b1 102 b2 102 b3 b4 rcorr SD Аминокислоты 4.18 -2.43 -2.36 -18.09 0.42 0.9422 0.203 (n=13) ±0.20 ±0.23 ±1.15 ±6.60 ±0.16 Дипептиды (n=5) 1.35 -0.61 -10.55 44.35 0 0.9563 0.095 ±0.16 ±0.20 ±2.01 ±10.70 97 Оценка степени соответствия корреляционной зависимости экспериментальным данным (для малых выборок n<20) проводилась по коэффициенту корреляции rcorr и по минимальной дисперсии распределения (S), которую называют выборочным стандартным отклонением [160,161]. Принимая во внимание, что коэффициент rcorr является случайной величиной, проводилась оценка его средней квадратичной ошибки по формуле: σr=(1-rcorr2)/√n [161]. Для представленной корреляционной зависимости величина │rcorr│>3σr, что подтверждает наличие связи между параметрами. Проведенный статистический анализ показал удовлетворительную степень надежности вычисленных коэффициентов bi в уравнении (3.1.3.1) для указанных рядов соединений. Как видно из таблицы 3.1.3.2, все коэффициенты статистически значимы (при доверительной вероятности 0,95). Таблица 3.1.3.3 Корреляционная матрица параметров уравнения 3.1.3.1 Vw NHB Ind Vw 1.00 0.316 0.351 0.377 NHB 1.00 0.787 0.633 1.00 0.661 Ind 1.00 Таблица 3.1.3.3 представляет корреляционную матрицу для используемых дескрипторов уравнения (3.1.3.1). Существует некоторое взаимовлияние между и NHB (0.747), а также между и Ind. Параметр Ind был введен нами для учета наличия в боковой цепи активных групп. Остальные параметры слабо зависят друг от друга. Наибольшие значения коэффициентов регрессии b3 при параметре μ свидетельствуют об усилении вклада электростатических эффектов в величину энтальпии сублимации дипептидов по сравнению с аминокислотами, что может быть связано с изменением молекулярной поляризации и величины дипольного момента молекулы дипептида при возрастании длины его основной цепи. 98 Чувствительность объемно-удельной энтальпии сублимации к специфическим (водородным связям) и ван-дер-ваальсовым взаимодействиям проявляется через коэффициенты регрессии b2 и b1 в уравнении (3.1.3.1). Представленные результаты указывают, что специфические взаимодействия имеют большее значение, чем ван-дер-ваальсовы взаимодействия в случае дипептидов, имеющих в структуре пептидную группу (-CO-NH-), склонную к образованию Н-связей, в отличие от аминокислот, для которых эти вклады сопоставимы. Рассчитанные по уравнению (3.1.3.1) значения энтальпий сублимации для исследуемых веществ представлены в таблице 3.1.3.4. Там же приведена абсолютная погрешность расчета, оцененная как (±δ)=subHmo(эксп)-subHmo(расч). Следует отметить, что средняя относительная погрешность такой оценки составила 5.5% для аминокислот и 2.3% - для дипептидов, что сопоставимо с уровнем оценки различных физико-химических свойств веществ из корреляционных соотношений (от 6 до 12% [35,44,161] ). Таблица 3.1.3.4 Экспериментальные и рассчитанные значения энтальпий сублимации аминокислот и дипептидов Вещества Gly L-Ala L-Val L-Leu L-Ser L-Thr L-Pro Phe Arg Cys Met Tyr Trp His R- боковой радикал -H -CH3 -CH(CH3)2 -CH2-CH-(CH3)2 -(CH2CH2CH2)-CH2-(C6H5) -(CH2)3-NHC(=NH)-NH2 -CH2-SH -CH2-CH2-S-CH3 -CH2(C6H4OH) -CH2(3-indolyl) -CH2(4imidazolyl) sH298(эксп), кДж/моль 1332 [159] 1344 [159] 1608 [159] 1436 1615 1344 1603 142 [159] sH298(расч.), кДж/моль 129 140 171 159 149 167 143 170 144 (±δ) кДж/моль 4 6 11 6 6 9 10 2 146.48 [159] 1523 2024 1864 147.48 [9] 135 149 192 198 150 11 3 10 12 3 99 Продолжение Таблицы 3.1.3.4. Asn Gln Lys Gly-L-Ala L-Ala-L-Ala DL-Ala-DL-Val DL-Ala-DL-Nvl L-Ala-L-Trp -CH2-C(=O)-NH2 -CH2-CH2C(=O)-NH2 -CH2-CH2-CH2CH2-NH2 - 146 148 - - 185 - 1074 1134 1565 1844 1794 105 117 149 185 180 2 4 7 1 1 100 3.2. ИССЛЕДОВАНИЕ СТРОЕНИЯ МОЛЕКУЛЫ L-ТРИПТОФАНА В ГАЗОВОЙ ФАЗЕ 3.2.1. Конформационные свойства L-триптофана по данным квантовохимических расчетов Молекулы аминокислот обладают низкой симметрией и множеством торсионных колебательных координат, вследствие чего существует большое количество различных низкоэнергетических конформеров. Этот факт серьезно затрудняет проведение структурных исследований молекул данного класса соединений в газовой фазе. Поэтому для исследования конформационного многообразия аминокислот широкое применение нашли теоретические методы. Тем не менее, имеются примеры применения газовой электронографии к определению структурных параметров алифатических аминокислот – L-глицина (Gly) [17] и L-аланина (Ala) [18]. Авторами установлено наличие одного основного конформера для Gly и двух – для Ala. Как отмечалось в литературном обзоре, в работе [89] исследовано конформационное многообразие триптофана на уровне теории B3LYP/6311++G(d,p). Однако для структурного электронографического анализа кроме стартовой геометрии молекулы требуется знание силового поля, амплитуд колебаний и колебательных поправок к межъядерным расстояниям. Поэтому нами был заново проведена оптимизация геометрии и расчет частот колебаний конформеров Trp методом B3LYP/cc-pVTZ. Отсутствие мнимых частот подтверждает, что все найденные структуры являются минимумами на поверхности потенциальной энергии. Конформеры отличаются различной взаимной ориентацией карбоксильных и аминогрупп, а также основной цепи и индольного фрагмента друг относительно друга. В результате конформационного анализа обнаружены 40 различных форм молекулы Trp с разными ориентациями фрагментов молекулы друг относительно друга, являющихся минимумами на поверхности потенциальной энергии. Анализ полученных данных позволил 101 выделить 6 групп конформеров (Рис. 3.2.1.1), связанных с взаимной ориентацией основной аминокислотной цепи и индольного фрагмента. Как видно из рисунка 3.2.1.1, в группах G1, G2, G3 индольное кольцо расположено слева относительно связи Сα-Сβ, при этом основная аминокислотная цепь поворачивается на 120о. В группах G4, G5, G6 имеет место такое же вращение аминокислотной цепи, только при правостороннем расположении кольца. Дальнейшая систематизация позволила обнаружить 8 форм в каждой группе, различающихся ориентацией карбоксильной и аминогруппы. В качестве примера на рис. 3.2.1.2 изображены подобные конформеры, принадлежащие к группе G2. Следует отметить, что в группах G1, G3, G4 и G6 возможен переход некоторых форм в более устойчивые, что влечет за собой сокращение общего числа конформеров с 48 до 40. G1 G2 G3 G4 G5 G6 Рисунок 3.2.1.1 – Группы конформеров триптофана 102 G2F1 G2F2 G2F3 G2F4 G2F5 G2F6 G2F7 G2F8 Рисунок 3.2.1.2 – Конформеры триптофана в группе G2 В таблице 3.2.1.1 представлены значения энергии для найденных конформеров, рассчитанные относительно самого низкоэнергетического из них. Анализ данных показывает, что максимальная относительная энергия не превышает 10 ккал/моль. 103 Таблица 3.2.1.1 – Значения относительной энергии для конформеров триптофана конформер G1F1 G1F2 G1F3 G1F4 G1F5 (C1) G1F7 G1F8 G2F1 G2F2 G2F3 G2F4 G2F5 (C3) G2F6 (C2) G2F7 G2F8 G3F1 G3F2 G3F6 G3F8 G4F1 1 Erel, конформер ккал/моль1 4.13 G4F2 2.06 G4F3 4.52 G4F4 2.56 G4F5 (C6) 0.00 G4F7 8.93 G4F8 7.13 G5F1 2.12 G5F2 2.23 G5F3 3.30 G5F4 3.71 G5F5 (C5) 0.96 G5F6 (C4) 0.43 G5F7 7.21 G5F8 7.14 G6F1 3.89 G6F2 2.91 G6F5 4.98 G6F6 6.32 G6F7 4.13 G6F8 Erel, ккал/моль 2.15 4.54 2.81 1.17 9.71 7.72 2.84 3.19 3.85 4.59 1.48 1.15 8.06 8.18 3.50 2.35 2.95 3.38 4.94 4.94 1 ккал/моль = 4.184 кДж/моль На диаграмме (Рис. 3.2.1.3) показаны относительные энергии всех конформеров триптофана, которые сравниваются с тепловой энергией RT, соответствующей температуре эксперимента. Видно, что шесть конформеров из 40 имеют энергию ниже RT. Именно эти конформеры с внутримолекулярной водородной связью дают основной вклад в интенсивность рассеяния электронов в электронографическом эксперименте при Т = 495 К, а остальные – будут присутствовать в насыщенном паре триптофана в пренебрежимо малых концентрациях. Как следует из рисунка, основные конформеры могут быть разделены на две группы: различимые (с различной ориентацией карбоксильной и 104 амидной групп относительно индольного фрагмента, т.е. с различными торсионными углами C(ООН)-C(HNH2)-С(Н2)-C(инд)) и неотличимые (которые отличаются только положениями атомов водорода в карбоксильной и амидной группах, т.е. с различными торсионными углами HNCC и HOCC) в рамках электронографического метода. Рисунок 3.2.1.3 – Основные конформеры Trp (ΔE<RTexp) Установлено, что наиболее стабильные конформеры Trp имеют внутримолекулярную водородную связь между карбоксильными и амидными группами (Рис. 3.2.1.3). Проведен NВO-анализ (Gaussian 03//B3LYP/6-31++G(d,p)) для 6 основных конформеров триптофана. По уравнению (2.3.2.4) рассчитаны энергия перекрывания орбиталей и величина перенесенного заряда qст с орбитали неподеленной электронной пары атома азота аминогрупы LP(N) на 105 разрыхляющую орбиталь *(О-Н) карбоксильной группы. Как видно из таблицы 3.2.1.2, значения перенесенного заряда между донором и акцептором удовлетворяет критерию 0.01e [141], поэтому можно говорить о наличии внутримолекулярных водородных связей средней силы (см. табл. 1.3.1) в исследуемых конформерах (табл. 3.2.1.2). Таблица 3.2.1.2 – Энергии взаимодействия орбиталей LP(N) c *(О-Н) и величины перенесенного заряда для основных конформеров триптофана молекула C1 C2 C3 C4 C5 C6 Перед выполнением E(LP(N)*(О-Н)), ккал/моль 15.27 13.67 14.80 13.52 14.40 15.86 структурного анализа qст 0.033 0.029 0.031 0.029 0.031 0.035 проведена работа по определению чувствительности электронографических данных к изменениям в структуре конформеров: сравнивались функции радиального распределения f(r) для конформеров, различающихся положением индольного кольца и аминокислотной части. Установлено, что электронографические данные более чувствительны к повороту аминокислотной группы, чем индольного кольца (рис. 3.2.1.4). Обнаружены конформационно-чувствительные области на функции радиального распределения, что несколько облегчает структурную задачу. Таким образом, доказано, что попарно конформеры триптофана будут различимы, поскольку фактор рассогласования между теоретическими функциями f(r) для конформеров превышает уровень, определяемый экспериментальным шумом фотопленки (3-4%). 106 f(r) f(r) f(r) 0 4 8 r, Å f(r) 12 0 4 8 r, Å 12 C1 и C6 – различная ориентация C1 и C2 – вращение аминокислотной индольного кольца Rf = 5,3% цепи Rf = 7,7% Рисунок 3.2.1.4 – Теоретические функции радиального распределения f(r) для конформеров триптофана 3.2.2. Электронографическое исследование L-триптофана Исследование насыщенного пара триптофана проводилось на комплексе аппаратуры ЭМР-100/АПДМ-1 в лаборатории молекулярных параметров ИГХТУ. Подробное описание прибора приведено в главе 2.2. Препарат испарялся из эффузионной ячейки, выполненной из нержавеющей стали Х18Н10Т, при T=495(5) K. Температура ячейки измерялась вольфрам-рениевой термопарой ВР5/20. Ускоряющее напряжение составляло около 50 кВ. Основные условия эксперимента представлены в таблице 3.2.2.1. Электронограммы снимались с двух расстояний «сопло ячейки – фотопластинка». С каждого низ них, кроме электронограмм исследуемого вещества, получено по 2 электронограммы кристаллического стандарта ZnO. Электронограммы ZnO снимались до и после 107 эксперимента с триптофаном для определения и контроля изменения длины волны электронов. Электронограммы исследуемого вещества и кристаллического стандарта просканированы на микроденситометре MD100 [148]. Таблица 3.2.2.1 – Условия съемки электронограмм L-триптофана Короткое расстояние Расстояние «сопло – фотопластинка», мм 338 Интенсивность электронного пучка, мкА 1,50 Ионизирующее напряжение, В 50 Ускоряющее напряжение, кВ 94.0 Температура «холодных концов» 20,4 термопары, оС Температура эффузионной ячейки, оС 222 Длина волны быстрых электронов, Å 0,039032 Среднее время экспозиции, с 90 Остаточное давление в дифракционной 2·10-6 камере, мм рт. ст. Остаточное давление в масс-спектральном 6·10-7 блоке, мм рт. ст. Диапазон углов рассеяния (smin÷smax), Å-1 3.7-31.0 Количество электронограмм 6 Длинное расстояние 598 0,70 50 90.8 21,1 222 0,038306 80 3·10-6 5·10-7 1.2-17.2 5 Структурный анализ При обработке экспериментальных данных за основу взяты два конформера из конформационного анализа с наименьшими значениями относительной энергии – С1 и С2 (рис. 3.2.1.2). Различие между этими конформерами состояло в повороте аминокислотной группы на 120о по часовой стрелке. Конформеры С2 и С3 отличаются ориентацией атомов водорода в аминогруппе и могут быть условно приняты за одну структуру вследствие невозможности точного определения положения атомов водорода методом электронографии из-за их малой рассеивающей способности и малой кратности термов О-Н (1) и N-H (2). Относительное содержание шести основных конформеров триптофана (рис. 3.2.1.2), соответствующее температуре электронографического эксперимента, 108 определено по величинам GoT, рассчитанным методом B3LYP/cc-pVTZ (табл. 3.2.2.2). Как видно из таблицы 3.2.2.2, в насыщенном паре триптофана суммарная мольная доля трех конформеров С1, С2 и С3 составляет приблизительно 70 % вклада от всех конформеров. Структуры аминокислотной цепи в оставшихся формах С4, С5 и С6 во многом аналогичны структурам С2, С3 и С1, соответственно, а основное отличие заключается в ориентации индольного кольца: правостороннее (в С4, С5, С6) против левостороннего (в С1, С2, С3). Как было показано ранее, различное положение кольца оказывает слабое влияние на основные пики функции радиального распределения (рис. 3.2.1.3). Таблица 3.2.2.2 – Изменение энергии Гиббса и мольные доли конформеров триптофана при Т = 495 К конформер C1 C3 C2 C5 C4 C6 ∆GoT, ккал/моль 0 0,12 0,17 0,67 0,84 1,32 χ, моль % 0,255 0,226 0,215 0,129 0,108 0,066 Поэтому при анализе электронографических данных использовалось предположение, что насыщенный пар триптофана состоит из трех конформеров С1, С2, С3, причем два из них С2 и С3 являются неразличимыми в рамках использованного метода (рис.3.2.2.1). В результате структурный анализ сводился к поиску геометрических параметров двух конформеров триптофана с разной ориентацией аминокислотной группы относительно индольного фрагмента, а также к поиску их относительных концентраций. 109 С1 С2 С3 Рисунок 3.2.2.1 – Конформеры L-триптофана, используемые в структурном анализе Геометрическая модель каждого конформера описывалась с помощью 75 независимых параметров: 28 межъядерных расстояний; 25 валентных углов и 22 торсионных углов. Одновременное и независимое определение 75 структурных параметров из электронографических данных не представляется возможным вследствие их корреляции. Для ее уменьшения в процессе МНК-анализа независимо варьируемыми были выбраны: — 4 типа межъядерных расстояний: N1-H16, C2-C3, C10-C3, C12-O13 (между неэквивалентными расстояниями одного типа удерживалась разница, полученная в квантово-химических расчетах); — 9 валентных углов: N3-C2-C1, C4-N1-C2, C6-C5-C4, C10-C3-C2, C11C10-C3, O13-C12-C11, O14-C12-C11, N15-C11-C10, N15-C11-C12 (разница между углами фиксировались на квантово-химических величинах); — 3 торсионных угла C1-C10-C3-C2, C12-C11-C10-C3, O13-C12-C11-C10. В результате наложенных ограничений число варьируемых параметров сократилось до 16. Уточнение амплитуд колебаний пар атомов с близкими межъядерными расстояниями осуществлялось посредством их варьирования в группах. Разбиение амплитуд колебаний на группы проводилось в соответствии с принадлежностью термов к определенным пикам на кривой радиального распределения f(r). Стартовые величины для межъядерных расстояний, валентных 110 и торсионных углов были взяты из результатов расчета структуры методом B3LYP/cc-pVTZ. Стартовые значения амплитуд колебаний и колебательные поправки к межъядерным расстояниям рассчитаны по программе SHRINK [132,133] с использованием нелинейных соотношений между декартовыми и внутренними координатами на основе силового поля и геометрии молекулы, полученных в тех же расчетах B3LYP/cc-pVTZ. Следует отметить, что в МНКпроцедуре поправки не Δr варьировались. Экспериментальные функции молекулярной составляющей интенсивности рассеяния sM(s) и функция радиального распределения f(r) приведены на рисунках 3.2.2.2 и 3.2.2.3. sM(s) sM(s) 0 4 8 12 16 20 24 28 32 s, Å-1 Рисунок 3.2.2.2 – Функции молекулярной составляющей интенсивности рассеяния sM(s) молекулы L-триптофана (экспериментальная – точки, теоретическая – сплошная линия, рассчитанная для оптимального состава пара) и кривые разности ΔsM(s) = sMэксп(s) – k·sMтеор(s) 111 Результаты МНК-анализа функций sM(s) представлены в таблице 3.2.2.3. Там же сопоставлены результаты электронографического эксперимента с результатами квантово-химических расчетов. Таблица 3.2.2.3 – Экспериментальные (конформер С1) и теоретические структурные параметры (конформеры С1, С2 и С3), ангстремы и градусы конформер С1 C1 C2 C3 Параметры: GED, B3LYP/ B3LYP/ B3LYP/ rh1 cc-pVTZ, re cc-pVTZ, re cc-pVTZ, re r, Å; , º N1-H16 1.014(4) a p1 c 1.003 1.003 1.003 d C2-H17 1.087(4)(p1) 1.077 1.078 1.077 C10-H22 1.099(4)(p1) 1.089 1.093 1.094 O14-H25 0.994(4)(p1) 0.984 0.982 0.983 C2-C3 1.374(3) p2 1.370 1.370 1.368 N1-C2 1.380(3)(p2) 1.376 1.378 1.379 C10-C3 1.498(5) p3 1.500 1.495 1.495 C12-O13 1.195(6) p4 1.203 1.202 1.202 b N3-C2-C1 110.1 (10) p5 110.0 110.1 110.2 C4-N1-C2 110.6(10) p6 109.4 109.2 109.1 C6-C5-C4 118.7(2) p7 118.6 118.8 118.8 C10-C3-C2 125.9(20) p8 126.4 126.6 126.9 C11-C10-C3 112.5(13) p9 113.9 113.6 113.5 O13-C12-C11 123.9(25) p10 123.3 122.9 123.2 O14-C12-C11 110.0 (25) p11 113.7 113.9 113.8 N15-C11-C10 118.2(50) p12 115.9 110.7 115.3 N15-C11-C12 111.3 (18) p13 109.3 109.9 109.7 b C1-C10-C3-C2 82(6) p14 84.5 108.2 107.1 C12-C11-C10-C3 -71 (5) p15 -69.9 176.4 171.1 O13-C12-C11-C10 -35 (12) p16 -37.7 -73.1 -40.3 мол.% 50 50 25 25 Rf, % 4.017 ------a 2 2 1/2 погрешность в rh1– параметрах =(sc +(2,5 LS) ) (sc =0,002r, LS –стандартное отклонение в МНК-анализе); b погрешность в величинах валентных и торсионных углов принята равной 2.5МНК; c pi – уточняемый параметр; d (pi) – параметр, связанный с независимым параметром pi через разность = pi-(pi), полученную в квантово-химических расчетах; Семь коэффициентов корреляции имели величину, большую 0,7: p6/p5 = -0,87, p11/p10 = - 0,88, p11/p16 = 0,80. 112 f(r) f(r) 0 4 8 50:50 100:0 0:100 75:25 25:75 r, Å Рисунок 3.2.2.3 – Экспериментальная функция радиального распределения f(r) и кривые разности для разного процентного соотношения конформеров триптофана в насыщенном паре Экспериментальные значения межъядерных расстояний, экспериментальные и рассчитанные амплитуды колебаний, а также поправки к межъядерным расстояниям Δr = rh1 – ra , показаны в таблице 3.2.2.4. При МНК-анализе экспериментальных данных в рамках сделанных предположений установлено, что при Т=495 К в насыщенном паре L-триптофана присутствуют как минимум три конформера аминокислоты в соотношениях С1:(С2+С3) = 50:50. Как уже было сказано, конформеры С2 и С3 отличаются только положением атомов водорода, которое неразличимо в рамках электронографического метода. Такая модель насыщенного пара хорошо описывает наблюдаемую функцию интенсивности рассеяния (рис. 3.2.2.3). 113 Таблица 3.2.2.4 – Межъядерные расстояния, экспериментальные и теоретические амплитуды колебаний и колебательные поправки (за исключением термов для несвязанных атомов, включающих атомы водорода) (все величины даны в Å). Параметр O14- H25 N 1- H16 C 2- H17 C 8- H20 C 6- H18 C10- H22 O14- C12 C 3- C 2 C 4- N 1 C 2- N 1 C 6- C 7 C 9- C 8 C 4- C 9 C 5- C 4 C 3- C 5 C11- N15 C10- C 3 C11- C10 C11- C12 O14…O13 C 2…C 4 C 5…N 1 C11…H25 C 3…C 4 C 5…C 7 O13…C11 C 4…C 6 C12…N15 O14…N15 C 4…C 7 C 6…C 9 O13…C10 C 3…N15 C10…C 6 O13…C 2 C 5…N15 C 2…C 9 C 3…C 9 C10…N 1 C 8…N 1 C 6…N15 C10…C 4 ra 0.9935 1.0116 1.0854 1.0903 1.0915 1.0984 1.3282 1.3730 1.3819 1.3843 1.3864 1.3876 1.3974 1.4212 1.4390 1.4743 1.4973 1.5394 1.5411 2.2496 2.2620 2.2283 2.1611 2.3307 2.4074 2.4144 2.4278 2.4852 2.5531 2.7602 2.8329 2.8552 3.0789 3.3218 3.2611 3.5843 3.6329 3.6569 3.7005 3.7228 3.8193 3.7852 lexp 0.074(2) 0.071 0.076 0.077 0.077 0.078 0.046(1) 0.044 0.046 0.046 0.045 0.045 0.046 0.047 0.049 0.052 0.051 0.055 0.056 0.057(3) 0.054 0.055 0.145 0.056 0.058 0.069 0.060 0.072 0.108 0.065(4) 0.065 0.126 0.156 0.114(7) 0.352 0.256(6) 0.056 0.055 0.060 0.059 0.415 0.062 lcalc 0.072 0.069 0.074 0.075 0.075 0.076 0.046 0.044 0.046 0.046 0.045 0.045 0.046 0.047 0.049 0.052 0.051 0.056 0.056 0.055 0.053 0.053 0.144 0.055 0.057 0.068 0.059 0.070 0.107 0.066 0.066 0.127 0.157 0.119 0.357 0.263 0.063 0.062 0.067 0.066 0.423 0.069 Δr= rh1 – ra Группа 0.0007 1 0.0020 1 0.0015 1 0.0014 1 0.0014 1 0.0011 1 0.0005 2 0.0012 2 -0.0037 2 -0.0039 2 0.0009 2 0.0006 2 -0.0000 2 0.0019 2 0.0051 2 -0.0001 2 0.0002 2 0.0005 2 -0.0004 2 0.0008 3 0.0054 3 -0.0038 3 0.0052 3 0.0067 3 0.0032 3 0.0052 3 0.0062 3 0.0044 3 -0.0071 3 0.0072 4 0.0067 4 -0.0009 4 0.0125 4 0.0136 5 0.0077 5 0.0189 6 0.0117 6 0.0121 6 0.0051 6 0.0076 6 0.0430 6 0.0153 6 114 Продолжение Таблицы 3.2.2.4 O14…C 3 C11…C 6 C 7…N 1 C12…N 1 C 4…N15 C 2…C 8 O13…N 1 N15…N 1 O13…C 5 C12…C 4 O14…N 1 C12…C 6 O13…C 4 C 9…N15 O13…C 9 O14…C 7 3.8775 4.0970 4.1090 4.4686 4.6176 4.5780 4.5343 4.7524 4.7228 5.0018 4.8924 5.1567 5.3020 5.6223 6.6539 6.7211 0.265 0.248(5) 0.068 0.279(4) 0.281 0.070 0.388 0.300 0.273 0.252(10) 0.467 0.292(14) 0.338 0.330 0.371(32) 0.551 0.272 0.249 0.069 0.275 0.278 0.066 0.385 0.296 0.270 0.259 0.474 0.296 0.342 0.334 0.362 0.542 0.0456 0.0357 0.0079 0.0203 0.0285 0.0166 0.0274 0.0368 0.0575 0.0445 0.0704 0.0719 0.0573 0.0332 0.0775 0.1267 6 7 7 8 8 8 8 8 8 9 9 10 10 10 11 11 Особенности геометрического строения В отличие от алифатических аминокислот, низкоэнергетические конформеры Trp имеют внутримолекулярную водородную связь. Прослеживается влияние этой Н-связи на структурные параметры основной цепи аминокислот (Табл. 3.2.2.5): в Trp (Cm-C-N) увеличивается и (C-C-N) уменьшается, а r(C-N) длиннее и r(C-O) короче, чем в Gly и Ala. Таблица 3.2.2.5 – Геометрические параметры аминокислот по данным газовой электронографии r, Å; , º C-Cm C-N C-C C=O C-O C-C-Cm C-C-N Cm-C-N C-C=O C-C-O Gly [1] Ala [2] Trp [наши данные] --1,467(5) 1,526(3) 1,205(1) 1,355(2) --112,1(5) --125,1(5) 111,6(5) 1,536(11) 1,453(2) 1,527(11) 1,197(1) 1,341(2) 111,9(2) 112,9(3) 110,0(2) 125,7(3) 110,3(2) 1,540(5) 1,474(3) 1,541(5) 1,195(6) 1,329(6) 109.6(13) 111.3 (18) 118.2(50) 123,9(25) 110,0(25) 115 ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ 1. Эффузионным методом Кнудсена с масс-спектрометрическим контролем состава пара исследованы процессы сублимации 5 дипептидов (глицил-L-аланин, L-аланил-L-аланин, DL-аланил-DL-валин, DL-аланил-DL-норвалин, L-аланил-Lтриптофан) и 7 -аминокислот (L-серин, L-треонин, L-метионин, L-фенилаланин, L-тирозин, L-триптофан, L-пролин). Получены температурные зависимости ионных токов наиболее интенсивных ионов в масс-спектрах исследуемых соединений. Впервые определены молярные энтальпии сублимации аминокислот и дипептидов в рамках II закона термодинамики. Осуществлено их приведение к значениям стандартной молярной энтальпии сублимации subHmo(298.15K) с использованием уравнения Кирхгоффа. 2. Впервые получены масс-спектры электронной ионизации для дипептидов DLаланил-DL-норвалина и L-аланил-L-триптофана. 3. Методами масс-спектрометрии электронной ионизации и квантовой химии выявлено существование циклических форм алифатических дипептидов (GlyAla)с, (Ala-Ala)с и (Ala-Val)с в газовой фазе. В рамках II закона термодинамики впервые оценены энтальпии их сублимации. 4. Проведен конформационный анализ L-триптофана квантово-химическим методом B3LYP/cc-pVTZ. Получены структуры 40 конформеров L-Trp, предложена их систематизация на основе различной ориентации индольного фрагмента и основной аминокислотной цепи относительно друг друга. 5. Впервые электронографическим методом определена структура свободной молекулы L-триптофана. Полученные структурные параметры согласуются с данными квантово-химических расчетов. Установлено внутримолекулярной водородной связи в изолированной молекуле помощью NBO-анализа (B3LYP/6-31++G(d,p)). наличие Trp с 116 6. Величины энтальпий сублимации дипептидов возрастают с ростом длины их боковых углеводородных радикалов: Gly-L-Ala<L-Ala-L-Ala<DL-Ala-DL-Val<LAla-L-Trp<DL-Ala-DL-Nvl, ваальсовых что взаимодействий. обусловлено Установлена увеличением вклада последовательность ван-деризменения значений subHmo(298.15K) в ряду аминокислот: Gly<Pro<Ala<Ser<Met<Phe <Thr<Trp<Tyr, что связано с влиянием различной структуры боковых радикалов на межмолекулярные взаимодействия. Предложена корреляционная зависимость стандартных величин молярной энтальпии сублимации от ван-дер-ваальсова объема, суммы доноров/акцепторов Н-связи и дипольного момента для ряда аминокислот и дипептидов. 117 ЛИТЕРАТУРА 1. Кобаяси, Н. Введение в нанотехнологию / Н. Кобаяси. – М.: изд-во БИНОМ. Лаб. знаний, – 2008. – 134 с. 2. Li, L. Positively Charged Nanosheets Derived via Total Delamination of Layered Double Hydroxides / L. Li, R. Ma, Y. Ebina, N. Iyi, T. Sasaki // Chem. Mater. – 2005. –17(17). – P.4386-4391. 3. Ding, L. Molecular Characterization of the Cytotoxic Mechanism of Multiwall Carbon Nanotubes and Nano-Onions on Human Skin Fibroblast / L. Ding, J. Stilwell, T. Zhang, O. Elboudwarej, H. Jiang, J.P. Selegue, P.A. Cooke, J.W. Gray, F.F. Chen // Nano Letters. – 2005. –5(12). – P.2448-2464. 4. Евдокимов, Ю.М. Принципы создания наноконструкций с использованием молекул нуклеиновых кислот в качестве строительных блоков / Ю.М. Евдокимов, В.В. Сычев // Успехи химии. – 2008. – 77(2). – С.194-206. 5. De Santis, P. Peptides with regular enantiomeric sequences: a wide class of modular self-assembling architectures / P. De Santis, S. Morosetti, A.J. Scipioni // Nanosci. Nanotechnol. - 2007. – 7(7) - Р. 2230-2238. 6. Сагадеев, Е.В. Энтальпии образования и сублимации аминокислот и пептидов / Е.В. Сагадеев, А.А. Гимадеев, В.П. Барабанов // Журн. физ. химии. – 2010. – 84(2). – С.260-265. 7. Barone, G. Enthalpies and entropies of fusion of some substituted dipeptides. Comparison with crystal data / G. Barone, C. Giancola, T.H. Lilley, C.A. Mattia, R. Puliti // J. Therm. Analys. – 1992. – 38. – P.2771-2778. 8. Куваева, З.И. Получение и применение N-ацетил--аминокислот / З.И. Куваева, Д.В. Лопатик, Т.А. Николаева, А.Н. Книжникова, В.Э. Найденов, М.М. Маркович // Хим.-фарм. журн. – 2010. – 44(6). – С.22-23. 9. Wilce, M.C.J. Physicochemical Basis of Amino Acid Hydrophobicity Scales: Evaluation of Four New Scales of Amino Acid Hydrophobicity Coefficients Derived 118 from RP-HPLC of Peptides / M.C.J. Wilce, M.-I. Aguilar, M.T.W. Heam // Anal. Chem. – 1995. – 67(7). – P.1210-1219. 10. Katritzky, A.R. Interpretation of Quantitative Structure−Property and −Activity Relationships / A.R. Katritzky, R. Petrukhin, D. Tatham, S. Basak, E. Benfenati, M. Karelson, U. Maran // J. Chem. Inf. Comput. Sci. – 2001. –41. – P.679-685. 11. Givand, J. Distribution of Isomorphic Amino Acids between a Crystal Phase and an Aqueous Solution / J. Givand, B.-K. Chang, A.S. Teja, R.W. Rousseau // Ind. Eng. Chem. Res. – 2002. – 41. – P.1873-1876. 12. Barone, G. Correlation between phase transition thermodynamics and crystal features of solid small peptides / G. Barone, R. Puliti // J. Thermal Analys. Calorimetry. – 1999. – 57. – P.119-132. 13. Баделин, В.Г. Взаимосвязь между строением молекул аминокислот и дипептидов и тепловым эффектом их сублимации / В.Г. Баделин, Е.Ю. Тюнина, Г.В. Гиричев, Н.И. Гиричева, О.В. Пелипец // Журн. структурной химии. – 2007. – 48(4). – С.698-704. 14. Якубке, Х.-Д. Аминокислоты, пептиды, белки / Х.-Д. Якубке, Х. Ешкайт. – М.: Мир, – 1985. – 456 с. 15. Березов, Т.Т. Биологическая химия: учебник / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. – М.: Медицина, – 1998. – 704 с. 16. Овчинников, Ю.А. Биоорганическая химия / Ю.А. Овчинников. – М.: Просвещение, – 1987. – 815 с. 17. Iijima, K. Main conformer of gaseous glycine: molecular structure and rotational barrier from electron diffraction data and rotational constants / K. Iijima, K. Tanaka, S. Onuma // J. Mol. Struc. – 1991. –246. – P.257-266. 18. Iijima, K. Reinvestigation of molecular structure and conformation of gaseous lalanine by joint analysis using electron diffraction data and rotational constants / K. Iijima, M. Nakano // J. Mol. Struc. – 1999. – 485-486. – P.255-260. 119 19. Молекулярные взаимодействия / под ред. Г. Ратайчак, У. Орвилл-Томаса. – М.: Мир, – 1984. – 600 с. 20. Молекулярные структуры. Прецизионные методы исследования / под ред. А. Доменикано, И. Харгиттаи. – М.: Мир, – 1997. – 671 с. 21. Вульфсон, Н.С. Масс-спектрометрия органических соединений / Н.С. Вульфсон, В.Г. Заикин, А.И. Микая. – М.: Химия, – 1986. – 312 с. 22. Розынов, Б.В. / Масс-спектрометрия и химическая кинетика / Б.В. Розынов; под общ. ред. В.Л. Тальрозе. – М.: Наука, – 1985. – 344 с. 23. Кемпбел, Дж. Современная общая химия: в 3 т. / Дж. Кемпбел. – М.: Мир, – 1975. – 447 с. – 3 т. 24. Биологически активные вещества в растворах : структура, термодинамика, реакционная способность / под ред. А.М. Кутепова. – М.: Наука, – 2001. – 403 с. 25. Osborn, J.C. A comparison of sublimation enthalpies with lattice energies calculated using force fields / J.C. Osborn, P. York // J.Mol.Struct. – 1999. – 474. – P.43-47. 26. Kvick, A. Deformation electron density of α-glycylglycine at 82 K. I. The neutron diffraction study / A. Kvick, A. R. Al-Karaghouli, T. F. Koetzle // Acta Crystallogr. – 1977. – B33. – P. 3796–3801. 27 Destro, R. Electrostatic properties of L-alanine from x-ray diffraction at 23 K and ab initio calculations / R. Destro, R. Bianchi, G. Morosi // J. Phys. Chem. – 1989. – 93. – P. 4447-4457. 28. Acree, Jr, W. Phase transition enthalpy measurements of organic and organometallic compounds. Sublimation, vaporization and fusion enthalpies from 1880 to 2010 / W.Acree, Jr., J.S. Chickos // J. Phys. Chem. Ref. Data. – 2010. – 39. – P.1-942. 29. Мревлишвили, Г.М. Низкотемпературная калориметрия биологических макромолекул / Г.М. Мревлишвили // Успехи физ. наук. – 1979. –128(2). – С.273312. 30. Rodante, F. Thermal analysis of different series of dipeptides / F. Rodante, G. Marrosu, G. Catalani // Thermochimica Acta. – 1992. – 197. – P.147-160. 120 31. Калоус, В. Биофизическая химия / В. Калоус, З. Павличек. – М.: Мир, – 1985. – 446 с. 32 De Kruif, C.G. Enthalpies of sublimation and vapour pressures of 14 amino acids and peptides / C.G. De Kruif, J. Voogd, J.C.A. Offringa // J. Chem. Thermodyn. – 1979. –11. – P. 651–656. 33. Коттерел, Т. Прочность химической связи / Т. Коттерел. – М.: Иностр. Лит-ра, – 1956. – 282 с. 34. Арнаутова, Е.А. Методы расчета энтальпии сублимации органических молекулярных кристаллов / Е.А. Арнаутова, М.В. Захарова, Т.С. Пивина, Е.А. Смоленский, Д.В. Сухачев, В.В. Щербухин // Изв. РАН. Сер. хим. – 1996. – (12). – С. 2872–2881. 35. Бредшнайдер, С. Свойства газов и жидкостей / С. Бредшнайдер. – М.-Л.: Химия, – 1966. – 536 с. 36. Gross, D. On the Sublimation of Amino Acids and Peptides / D. Gross, G. Grodsky // J. Am. Chem. Soc. – 1955. – 77(6). – P.1678-1680. 37. Svec, H.J. Vapor Pressures of Some α-Amino Acids / H.J. Svec, D.D. Clyde // J. Chem. Eng. Data. – 1965. –10(2). – P.151-152. 38. Sabbah, R. Thermodynamique de composes azotes. IV. Etude thermochimique de la sarcosine et de la L-proline / R. Sabbah, M. Laffitte // Bull. Soc. Chim. France. – 1978. – 1(1-2). – P. 50-52. 39. Sabbah, R. Thermodynamique de substances soufrees. II. Etude thermochimique de la L-cysteine et de la L-methionine / R. Sabbah, C. Minadakis // Thermochimica Acta. – 1981. – 43. – P.269-277. 40. Методы практической биохимии / под ред. Б. Уильямса, К. Уилсона. – М.: Мир, – 1978. – 273с. 41. Piacente, V. Vaporization study of o-, m-, and p-chloroaniline by torsion-weighing effusion vapor pressure measurements / V. Piacente, P. Scardala, D. Ferro, R. Gigli // J. Chem. Eng. Data. – 1985. –30. – P 372-376. 121 42. Della Gatta, G. Enthalpies of solvation for N-alkylamides in water and in carbon tetrachloride at 25°C / G. Della Gatta, G. Barone, V. Elia // J. Solution Chem. – 1986. – 15. – P. 157-167. 43. Ferro D. Enthalpies of sublimation and fusion for N-acetyl substituted glycine, Lalanine, and D-leucine amides / D. Ferro, G. Della Gatta, G. Barone // J. Thermal Analysis. – 1988. – 34. – P.835-841. 44. Лебедев, Ю.А. Термохимия парообразования органических веществ. Теплоты испарения, сублимации и давление насыщенного пара / Ю.А. Лебедев, Е.А. Мирошниченко. – М.: Наука, – 1981. – 216 с. 45. Delle Site, A. The vapor pressure of environmentally significant organic chemicals: A review of methods and data at ambient temperature / A. Delle Site // J. Phys. Chem. Ref. Data. – 1997. – 26. – P. 157-194. 46. Goldfarb, J.L. Vapor pressures and enthalpies of sublimation of ten polycyclic aromatic hydrocarbons determined via the Knudsen effusion method / J.L. Goldfarb, E.M. Suuberg // J. Chem. Eng. Data. – 2008. – 53. – P. 670-676. 47. Uddin, K.M. Comparisons of computational and experimental thermochemical properties of α-amino acids / K.M. Uddin, P.L. Warburton, R.A. Poirier // J. Phys. Chem. – 2012. – B116. – P.3220-3234. 48. Goodman, B.T. Use of the DIPPR database for the development of QSPR correlations: solid vapor pressure and heat of sublimation of organic compounds / B.T. Goodman, W.V. Wilding, J.L. Oscarson, R.L. Rowley // Int. J. Thermophys. – 2004. – 25. – P. 337-342. 49. Taulelle, P. Measuring enthalpy of sublimation for active pharmaceutical ingredients: validate crystal energy and predict crystal habit / P. Taulelle, G. Sitja, G. Pépe, E. Garcia, Ch. Hoff, S. Veesler // Cryst. Growth Des. – 2009. – 9. – P. 4706-4709. 50. Booth, A.M. Design and construction of a simple Knudsen effusion mass spectrometer (KEMS) system for vapour pressure measurements of low volatility 122 organics / A.M. Booth, T. Markus, G. McFiggans, C.J. Percival, M.R. Mcgillen, D.O. Topping // Atmos. Meas. Tech. – 2009. – 2. P. 355-361. 51. Ribeiro da Silva, M.A.V. The design, construction, and testing of a new Knudsen effusion apparatus / M.A.V. Ribeiro da Silva, M.J.S. Monte, L.M.N.B.F. Santos // J. Chem. Thermodynamics. – 2006. – 38. – P.778-787. 52. Roux, M.V. Experimental and Computational Thermochemical Study of SulfurContaining Amino Acids: L-Cysteine, L-Cystine, and L-Cysteine-Derived Radicals. S−S, S−H, and C−S Bond Dissociation Enthalpies / M.V. Roux, C. Foces-Foces, R. Notario, M.A.V. Ribeiro da Silva, M.D.M.C. Ribeiro da Silva, A.F.L.O.M. Santos, E. Juaristi // J.Phys.Chem. – 2010. – B114. – P.10530-10540. 53. Amaral, L.M.P.F. Thermochemistry of sarcosine and sarcosine anhydride: Theoretical and experimental studies / L.M.P.F. Amaral, A.F.L.O.M. Santos, M.D.M.C. Ribeiro da Silva, R. Notario // J. Chem. Thermodynamic. – 2013. – 58. – P.315-321. 54. Ribeiro da Silva, M.A.V. Experimental and computational thermochemical study of -alanine (DL) and -alanine / M.A.V. Ribeiro da Silva, M.D.M.C. Ribeiro da Silva, A.F.L.O.M. Santos, M.V. Roux, C. Foces-Foces, R. Notario, R. Guzmán-Mejía, E. Juaristi // J. Phys. Chem. – 2010. – B114. – P.16471-16480. 55. Калинин, Ф.Л. Справочник по биохимии / Ф.Л. Калинин, В.П. Лобов, В.А. Жидков. – Киев: Наукова Думка, – 1971. – 1013 с. 56. Дэвени, Т. Аминокислоты, пептиды и белки / Т. Дэвени, Я.М. Гергей. – 1976. – 268c. 57. Терней, А. Современная органическая химия / А. Терней. – М.: Мир, – 1981. – 651 с. 58. Пептиды. Основные методы образования пептидных связей / под ред. Э. Гросса, И.М. Майнховера. – М.: Мир, – 1983. – 422 с. 123 59. Badelin, V.G. Physico-chemical properties of peptides and their solutions / V.G. Badelin, O.V. Kulikov, V.S. Vatagin, E. Utzig, A. Zielekiewicz, W. Zielekiewicz, G.A. Krestov // Thermochim. Acta. – 1990. –169. – P.81-93. 60. Domalski, E.S. Heat capacities and entropies of organic compounds in the condensed phase. Volume III / E.S. Domalski, E.D. Hearing // J. Phys. Chem. Ref. Data. – 1996. – 25(1). –P.1-523. 61. Rodriguez-Mendez, M.L. DTG and DTA studies on amino acids / M.L. RodriguezMendez, F.J. Rey, J. Martin-Gil, F.J. Martin-Gil // Thermochimica Acta. – 1988. – 134. – P.73-78. 62. Rodante, F. Thermal analysis of some α-amino acids using simultaneous TG-DSC apparatus. The use of dynamic thermogravimetry to study the chemical kinetics of solid state decomposition / F. Rodante, G. Marrosu // Thermochimica Acta. – 1990. – 171. – P.15-29. 63. Rak, J. Thermal properties, crystal lattice energy, mechanism and energetics of the thermal decomposition of hydrochlorides of 2-amino acid esters / J. Rak, J. Lubkowski, I. Nikel, J. Przybylski, J. Blazejowski // Thermochimica Acta. – 1990. – 171. – P.253277. 64. Ватагин, В.С. Дериватографическое исследование глицилсодержащих пептидов / В.С. Ватагин, В.Г. Баделин // Ж.хим.термодин. термохиии. – 1993. – 2(1). – С.101-105. 65. Козлов, В.А. Термодинамические характеристики плавления-разложения βаланил-β-аланина и β-аланил-глицина / В.А. Козлов, В.С. Ватагин, В.Г. Баделин // Изв.вузов. Химия и хим. Технол. – 1985. – 28(12). – С. 121-123. 66. Селифонова, Е.И.Термогравиметрическое изучение L--аминокислот / Е.И. Селифонова, Р.К. Чернова, О.Е. Коблова // Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия: химия, биология, экология. – 2008. – 8(2). – С.23-28. 124 67. Mohajeri, A. Detection and Evaluation of Hydrogen Bond Strength in Nucleic Acid Base Pairs / A. Mohajeri, F.F. Nobandegani // J. Phys. Chem. – A112. – 2008. – P.281295. 68. Цирельсон, В.Г. Квантовая химия. Молекулы, молекулярные системы и твердые тела : учеб. пособие д/вузов / В.Г. Цирельсон. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, – 2010. – 496 с. 69. Mayo, S.L. DREIDING: a generic force field for molecular simulations / S.L. Mayo, B.D. Olafson, W.A. Goddard // J. Phys. Chem. – 1990. – 94. – P.8897-8909. 70. Vinogradov S.N. Hydrogen bonds in crystal structures of amino acids, peptides and related molecules / S.N. Vinogradov // Int. J. Peptide Prot. Res. – 1979. – 14(4). – P.281-289. 71. Рамендик, Г.И. Масс-спектрометрия / Г.И.Рамендик // Горная энциклопедия в 3 т. – 1987. – с.266-267. – 3 т. 72. Biemann, K. Application of mass spectrometry to structure probltms. I. Amino acid sequence in peptides / K. Biemann, F. Gapp, J. Seibl // J. Am. Chem. Soc. – 1959. – 81(9). – P.2274-2275. 73. Biemann, K. Mass Spectra of Organic Molecules. II Amino Acids / K. Biemann, J. McCloskey // J. Am. Chem. Soc. – 1962. –84(16). – P.3192-3193. 74. Junk, G. The Mass Spectra of the α-Amino Acids / G. Junk, H. Svek // J. Am. Chem. Soc. – 1963. – 85(7). – P.839-845. 75. Svek, H. The Mass Spectra of Dipeptides / H. Svek, G. Junk // J. Am. Chem. Soc. – 1964. – 86(11). – P.2278-2282. 76. Gaffney, J.S. Mass spectrometer study of evaporation of alpha-amino acids / J.S. Gaffney, R.C. Pierce, L. Friedman // J. Am. Chem. Soc. – 1977. – 99(13). – P.42934298. 77. Fales, H.M. Comparison of mass spectra of some biologically important compounds as obtained by various ionization techniques / H.M. Fales, G.W.A. Milne, H.U. 125 Winkler, H.D. Beckey, J.N. Damico, R. Barron // Analytical Chemistry. – 1975. – 47(2). – P.207-219. 78. Trauger, S.A. Peptide and protein analysis with mass spectrometry / S.A. Trauger, W. Webb, G. Siuzdak // J. Spectroscopy. – 2002. –16(1). – P.15-28. 79. Ryzhov, V. Measuring Gas-Phase Basicities of Amino Acids Using an Ion Trap Mass Spectrometer. A Physical Chemistry Laboratory Experiment / V. Ryzhov, L.S. Sunderlin, L.M. M. Keller, E.R. Gaillard // Journal of Chemical Education. – 2005. – 82(7). – P.1071-1073. 80. Принципы масс-спектрометрии в приложении к биомолекулам / под ред. Дж. Ласкин, Х. Лифшиц. – М.: Техносфера, – 2012. – 608 с. 81. Dixon, D.A. Electronic structure and bonding of the amino acids containing first row atoms / D.A. Dixon, W.N. Lipscomb // J. Biol.Chem. – 1976. –251(19). – P.59926000. 82. Wright, L.R. Ab initio self-consistent field calculations on some small amino acids / L.R. Wright, R.F. Borkman // J. Am. Chem. Soc. – 1980. – 102. – P.6207-6210. 83. Wu, J. Studies of nearest-neighbor interactions between amino acids in gas-phase protonated peptides / J. Wu, E. Gard, J. Bregar, M.K. Green, C.B. Lebrilla // J. Am. Chem. Soc. – 1995. – 117. – P.9900-9905. 84. Gronert, S. Ab Initio Studies of Amino Acid Conformations. 1. The Conformers of Alanine, Serine, and Cysteine / S. Gronert, R.A.J. O’Hair // J. Am. Chem. Soc. – 1995. – 117. – P.2071-2081. 85. Cao, X. Infrared Spectral, Structural, and Conformational Studies of Zwitterionic LTryptophan / X. Cao, G. Fischer // J. Phys. Chem. – 1999. – A103. – P.9995-10003. 86. Jacob, R. Infrared Spectra and Structures of the Valyl-Alanine and Alanyl-Valine Zwitterions Isolated in a KBr Matrix / R. Jacob, G. Fischer // J. Phys. Chem. – 2003. – A107. – P.6136-6143. 126 87. Lambie, B. Conformational Behavior of Serine: An Experimental MatrixIsolation FT-IR and Theoretical DFT(B3LYP)/6-31++G** Study / B. Lambie, R. Ramaekers, G. Maes // J.Phys.Chem. – 2004. – A108. – P.10426-10433. 88. Kaczor, A. Importance of Entropy in the Conformational Equilibrium of Phenylalanine: A Matrix-Isolation Infrared Spectroscopy and Density Functional Theory Study / A. Kaczor, I.D. Reva, L.M. Proniewicz, R.Fausto // J.Phys.Chem. – 2006. – A110. – P.2360-2370. 89. Kaczor, A. Matrix-Isolated Monomeric Tryptophan: Electrostatic Interactions as Nontrivial Factors Stabilizing Conformers / A. Kaczor, I.D. Reva, L.M. Proniewicz, R. Fausto // J.Phys.Chem. – 2007. – A111. – P.2957-2965. 90. Guthmuller, J. Linear and Nonlinear Optical Response of Aromatic Amino Acids: A Time-Dependent Density Functional Investigation / J. Guthmuller, D. Simon // J.Phys.Chem. – 2006. A110. – P.9967-9973. 91. Gil, A. Influence of the Side Chain in the Structure and Fragmentation of Amino Acids Radical Cations / A. Gil, S. Simon, L. Rodriguez-Santiago, J. Bertran, M. Sodupe // J. Chem. Theory Comput. – 2007. – 3. – P.2210-2220. 92. Sousa, S.F. Gas-Phase Geometry Optimization of Biological Molecules as a Reasonable Alternative to a Continuum Environment Description: Fact, Myth, or Fiction? / S.F. Sousa, P.A. Fernandes, M.J. Ramos // J. Phys. Chem. – 2009. – A113. – P.14231-14236. 93. Baek, K.Y. Investigation of Conformation-Dependent Properties of l-Phenylalanine in Neutral and Radical Cations by Using a Density Functional Taking into Account Noncovalent Interactions / Baek K.Y., Hayashi M., Y. Fujimura, S.H. Lin, S.K. Kim // J.Phys.Chem. – 2010. – A114. – P.7583-7589. 94. Baek, K.Y. Density Functional Theory Study of Conformation-Dependent Properties of Neutral and Radical Cationic l-Tyrosine and l-Tryptophan / K.Y. Baek, Y. Fujimura, M. Hayashi, S.H. Lin, S.K. Kim // J.Phys.Chem. – 2011. – A115. – P.96589668. 127 95. Kimura, H. Structural study of α-amino-acid crystals by 1H CRAMPS NMR spectroscopy / H. Kimura, K. Nakamura, A. Eguchi, H. Sugisawa, K. Deguchi, K. Ebisawa, E. Suzuki, A. Shoji // J. Mol. Struct. – 1998. – 447. – P. 247-255. 96. Mukkamala, D. A Solid State 13C NMR, Crystallographic, and Quantum Chemical Investigation of Phenylalanine and Tyrosine Residues in Dipeptides and Proteins / D. Mukkamala, Y. Zhang, E. Oldfield // J. Am. Chem. Soc. –2007– 129. – P.7385-7392. 97. Liu, Y. Structural Studies of L-Seryl-L-Histidine Dipeptide by Means of Molecular Modeling, DFT and 1H NMR Spectroscopy / Y. Liu, J.-B. Hou, X.-X. Liu, F.-M. Miao, Y.-F. Zhao // Журн. структ. химии. – 2009. – 50(5). – С.873-877. 98. Császár, A.G. Conformers of gaseous glycine / A.G. Császár // J. Am. Chem. Soc. – 1992. – 114. – P.9568-9575. 99. Iijima, K. An electron diffraction study of gaseous α-alanine, NH2CHCH3CO2H / K. Iijima, B. Beagley // J. Mol. Struc. – 1991. – 248. – P.133-142. 100. Császár, A.G. Conformers of gaseous α-Alanine / Császár A.G. // J. Phys.Chem. – 1996. – 100. – P.3541-3551. 101. Ewbank, J.D. Conformational analysis of the methyl ester of alanine by gas electron diffraction and Ab initio geometry optimization / J.D. Ewbank, V.J. Klimkowski, K. Siam, L. Schäfer // J. Mol. Struc. – 1987. – 160. – P.275-285. 102. Takeuchi, H. Inductive and Steric Effects on the Gas-Phase Structure of tert-Butyl Acetate. Electron Diffraction and ab Initio MO Investigations / H. Takeuchi, J. Enmi, M. Onozaki, T. Egawa, Sh. Konaka // J. Phys.Chem. – 1994. – 98. – P.8632-8635. 103. Kiyono, H. Structure Determination of Methyl Nicotinate and Methyl Picolinate by Gas Electron Diffraction Combined with ab Initio Calculations / H. Kiyono, R. Tatsunami, T. Kurai, H. Takeuchi, T. Egawa, Sh. Konaka // J.Phys.Chem. – 1998. – A102. – P.1405-1411. 104. Takeshima, T. Molecular Structure of Nicotine As Studied by Gas Electron Diffraction Combined with Theoretical Calculations / T. Takeshima, R. Fukumoto, T. Egawa, Sh. Konaka. // J.Phys.Chem. – 2002. – A106. – P.8734-8740. 128 105. Новиков, В.П. Молекулярная структура и конформация N,N- диметиланилина по данным газовой электронографии и квантово-химическим расчетам / В.П. Новиков, С. Самдал, Л.В. Вилков // Журнал общей химии. – 2004. – 74(8). – С.1348-1354. 106. Ksenafontov, D.N. Molecular structure of carphedon as studied by gas electron diffraction and quantum chemical calculations / D.N. Ksenafontov, N.F. Moiseeva, A.N. Rykov, I.F. Shishkov, H. Oberhammer // Struct. Chem. – 2013. – 24. – Р.171-179. 107. Petrov, V.M. Gas electron diffraction and quantum chemical studies of the molecular structure of 2-nitrobenzenesulfonic acid / V.M. Petrov, N.I. Giricheva, G.V. Girichev, V.N. Petrova, S.N. Ivanov, A.V. Bardina // J. Struct. Chem. – 2011. – 52(1). – P.60-68. 108. Lesarri, A. The Structure of Neutral Proline / A. Lesarri, S. Mata, E.J. Cocinero, S. Blanco, J.C. Lopez, J.L. Alonso // Angew. Chem. Int. Ed. – 2002. –41(24). – P.46734676. 109. Lesarri, A. Shape of 4(S)- and 4(R)-Hydroxyproline in Gas Phase / A. Lesarri, E.J. Cocinero, J.C. Lopez, J.L. Alonso // J. Am. Chem. Soc. – 2005. – 127. – P.2572-2579. 110. Lesarri, A. The shape of neutral valine / A. Lesarri, E.J. Cocinero, J.C. Lopez, J.L. Alonso // Angew. Chem. Int. Ed. – 2004. – 43. – P.605-610. 111. Blanco, S. The Gas-Phase Structure of Alanine / S. Blanco, A. Lesarri, J.C. Lopez, J.L. Alonso // J. Am. Chem. Soc. – 2004. – 126. – P.11675-11683. 112. Пентин, Ю.А. Физические методы исследования в химии / Ю.А. Пентин, Л.В. Вилков. – М.: Мир, – 2006. – 683 с. 113. Лебедев, А.Т. Масс-спектрометрия в органической химии / А.Т. Лебедев. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, – 2003. – 493 с. 114. Заикин, В.Г. Масс-спектрометрия синтетических полимеров / В.Г. Заикин. – М.: ВМСО, – 2009. – 332с. 115. Бажин, Н.М. Термодинамика для химиков / Н.М. Бажин, В.А. Иванченко, В.Н. Пармон. – М.: Химия, – 2001. – 408 с. 129 116. Otvos, J.W. Cross-sections of molecules for ionization by electrons / J.W. Otvos, D.P. Stevenson // J. Am. Chem. Soc. – 1956. – 78. – P.546-551. 117. Stuzhina, O.V. The thermodynamic characteristics of sublimation of aluminum and indium complexes with tetraphenylporphin according to the high-temperature mass spectrometry data. / O.V. Stuzhina, T.N. Lomova, O.V. Pelipets, G.V. Girichev // Russ. J. Phys. Chem. 2008. – A82. – P.154-158. 118. Пелипец, О.В. Исследование термодинамики испарения ErCl3, EuBr2 и EuCl2 и строения молекулярных форм по данным высокотемпературной массспектрометрии и газовой электронографии : дисс. … канд. хим. наук : 02.00.04 / Пелипец Олег Владимирович. – Иваново, 2000. – 145с. 119. Шлыков, С.А. Развитие методики совместного электронографического и масс-спектрометрического эксперимента и её применение для изучения структуры ряда молекул неорганических соединений : дисс. … д-ра хим. наук : 02.00.04 / Шлыков Сергей Александрович. – Иваново, 2008. – 320с. 120. Погонин, А.Е. Масс-спектрометрическое изучение сублимации этиопорфиринатов – II кобальта, никеля, меди и цинка. / А.Е. Погонин, А.В. Краснов, Ю.А. Жабанов, А.А. Перов, В.Д. Румянцева, А.А. Ищенко, Г.В. Гиричев. // Макрогетероциклы. Изд-во: ИГХТУ, Иваново – 2012. – Т.5.- №4-5 - P. 315-320. 121. Badelin, V.G. Mass spectrometry study of the sublimation of aliphatic dipeptides / V.G. Badelin, E.Yu. Tyunina, A.V. Krasnov, V.V. Tyunina, N.I. Giricheva, G.V. Girichev // Russ. J. Phys. Chem. – 2012. – A86. – P.457-462. 122. Girichev, G.V. Ytterbium tris(hexafluoroacetylacetonate) Yb(C5O2HF6)3: The composition of overheated vapor and sublimation thermodynamics / G.V. Girichev, V.V. Rybkin, V.V. Tyunina, A.V. Krasnov, N.V. Tverdova, N.P. Kuz’mina, I.G. Zaitseva // Russ. J. Inorg. Chem. – 2011. – 56 – P.99-103. 123. Girichev, G.V. A mass spectrometric study of the vaporization of erbium hexafluoroacetylacetonate / G.V. Girichev, S.A. Shlykov, A.V. Krasnov, I.O. Zyabko, 130 N.I. Giricheva, N.P. Kuz’mina, I.G. Zaitseva // Russ. J. Phys. Chem. – 2007. – A81. – P.524-527. 124. Sabban, R. Reference materials for calorimetry and differential thermal analysis / R. Sabban, A. Xu-wu, J.S. Chickos, M.L. Planas Leitão, M.V. Roux, L.A. Torres // Thermochim. Acta. – 1999. – 331. – P.93-204. 125. Tagaki, S. Vapor pressure of molecular crystals. XIII. Vapor pressure of α-glycine crystal. The energy of proton transfer / S. Tagaki, H. Chihara, S. Seki // Bull. Chem. Soc. Jpn. – 1959. – 32. – P.84-88. 126. Nguon Ngauv, S. Thermodynamique de composes azotes. III. Etude thermochimique de la glycine et de la L-α-alanine / S. Nguon Ngauv, R. Sabbah, M. Laffitte // Thermochim. Acta. – 1977. – 20. – P.371-380. 127. Месси, Г. Электронные и ионные столконовения / Г. Месси, Е. Бархоп. – М.: Издательство иностранной литературы, 1958. – 604 с. 128. Вилков, Л. В. Теоретические основы газовой электронографии / Л. В. Вилков, В. П. Спиридонов, Е. З. Засорин. – М.: Изд-во Моск. ун-та, – 1974. – 228 с. 129. Schlegel, H.B. Geometry Optimization 1. In Encyclopedia of Computational Chemistry, eds. P v R. Schleyer et al. / H.B. Schlegel. – John Wiley & Sons Ltd., – 1998 – P. 1136-1142. 130. Andersen, B. Procedure and Computer Programs for the Structure Determination of Gaseous Molecules from Electron Diffraction Data / B. Andersen, H.M. Seip, T.G. Strand, R. Stølevik // Acta Chem,Scand. – 1969. – 23(9). – P. 3224-3234. 131. Kuchitsu, K. Comparison of molecular structures determined by electron diffraction and spectroscopy. Ethane and diborane / K. Kuchitsu // J. Chem. Phys. – 1968. – 49(10). – P. 4456 – 4462. 132. Sipachev, V. A. Calculation of shrinkage corrections in harmonic approximation / V.A. Sipachev // J. Mol. Struct. (Theochem). – 1985. – 121(1-2). – P. 143-151. 131 133. Sipachev, V. A. Local centrifugal distortions caused by internal motions of molecules / V. A. Sipachev // J. Mol. Struct. – 2001. – 567-568. – P. 67-72. 134. Wann, D.A. Experimental equilibrium structures: application of molecular dynamics simulations to gas electron diffraction / D.A. Wann, A.V. Zakharov, A.M. Reilly, P.D. McCaffrey, D.W.H. Rankin // J. Phys. Chem. A – 2009. –113(34). – P. 9511-9520. 135. Гиричев, Г.В. Модернизация электронографа ЭМР-100 для исследования газов / Г. В. Гиричев, А. Н. Уткин, Ю. Ф. Ревичев // Приборы и техника эксперимента.– 1984. – 2. – С.187-190. 136. Гиричев, Г.В. Аппаратура для исследования структуры валентно-ненасыщенных соединений / Г. В. Гиричев, С. А. Шлыков, молекул Ю. Ф. Ревичев // Приборы и техника эксперимента. – 1986. – 4. – С.167-169. 137. Шлыков, С.А. Радиочастотный масс-спектрометр на базе АПДМ-1 с диапазоном масс 1-1600 а.е.м. / С. А. Шлыков, Г. В. Гиричев // Приборы и техника эксперимента. – 1988. – 2. – С.141-142. 138. Пентин, Ю.А. Основы молекулярной спектроскопии / Ю.А. Пентин, Г.М. Курамшина. – М.: Мир; БИНОМ. Лаборатория знаний, – 2008. – 398с. 139. Ziegler, T. Approximate density functional theory as a practical tool in molecular energetics and dynamics / T. Ziegler // Chem. Rev. – 1991. – 91. – P.651-667. 140. Weinhold, F. Natural bond orbitals and extensions of localized bonding concepts / F. Weinhold, C.R. Landis // Chem. Educ. Res. Pract. Eur. – 2001. – 2. – P.91-104. 141. Weinhold, F. Nature of H-bonding in cluster, liquids and enzymes: an ab initio, natural bond orbital perspective / F. Weinhold // J. Mol. Struct. (Theochem). – 1997. – 398-399. – P.181-197. 142. Glendening, E. D. NBO 3.0 Program manual / E. D. Glendening, A.E. Reed, F. Weinhold // University of Wisconsin. Madison, – 1998. 143. Hobza, P. Improper, blue-shifting hydrogen bond / P. Hobza, Z. Havlas // Teor Chem. Acc. – 2002. – 108. – P.325-334. 132 144. Frisch M. J., Trucks G. W., Schlegel H. B., Scuseria G. E., Robb M. A., Cheeseman J. R., Montgomery J. A., Vreven Jr., T., Kudin K. N., Burant J. C., Millam J. M., Iyengar S. S., Tomasi J., Barone V., Mennucci B., Cossi M., Scalmani G., Rega N., Petersson G. A., Nakatsuji H., Hada M., Ehara M., Toyota K., Fukuda R., Hasegawa J., Ishida M., Nakajima T., Honda Y., Kitao O., Nakai H., Klene M., Knox X. Li, J. E., Hratchian H. P., Cross J. B., Adamo C., Jaramillo J., Gomperts R., Stratmann R. E., Yazyev O., Austin A. J., Cammi R., Pomelli C., Ochterski J. W., Ayala P. Y., Morokuma K., Voth G. A., Salvador P., Dannenberg J. J., Zakrzewski V. G., Dapprich S., Daniels A. D., Strain M. C., Farkas O., Malick D. K., Rabuck A. D., Raghavachari K., Foresman J. B., Ortiz J. V., Cui Q., Baboul A. G., Clifford S., Cioslowski J., Stefanov B. B., Liu G., Liashenko A., Piskorz P., Komaromi I., Martin R. L., Fox D. J., Keith T., Al-Laham M. A., Peng C. Y., Nanayakkara A., Challacombe M., Gill P. M. W., Johnson B., Chen W., Wong M. W., Gonzalez C., and Pople J. A., Gaussian, Inc., Pittsburgh PA, 2003.15.SDD, Gaussian 03, Revision B.03 145. NIST Chemistry WebBook (http://webbook.nist.gov/chemistry) 146. Wipf, H.K. Mass spectrometric studies of peptides. V. Determination of amino acid sequences in peptide mixtures by mass spectrometry / H.K. Wipf, Ph. Irving, M. McCamish, R. Venkataraghavan, F.W. McLafferty // J. Am. Chem. Soc. – 1973. – 95(10). – P.3369-3375 147. Практическая химия белка / под ред. А. Дарбре. – М.: Мир, 1989. – С.515-529. 148. Huuskonen, J. QSAR modeling with the electrotopological state indices: predicting the toxicity of organic chemicals / J. Huuskonen // Chemosphere. – 2003. – 50. – P.949953. 149. Раевский, О.А. Дескрипторы молекулярной структуры в компьютерном дизайне биологически активных веществ / О.А. Раевский // Успехи химии. – 1999. – 68. – С.555-575. 150. Ren, B. Application of novel atom-type Al topological indices in the structureproperty correlations / B. Ren // J. Mol. Struct.(Theochem). – 2002. – 586. – P.137-148. 133 151. Diaz, H.G. Symmetry considerations in Markovian chemical “in silico” design (march-inside) I: central chirality codification, classification of ace inhibitors and prediction of ∑-receptor antagonist activities / H.G. Diaz, I.H. Sanchez, E. Uriarte, L. Santana // Comput. Biol. Chem. – 2003. – 27. – P.217-227. 152. Soffers, A.E.M.F. Computer-modeling-based QSARs for analyzing experimental data on biotransformation and toxicity / A.E.M.F. Soffers, M.G. Boersma, W.H.J. Vaes, J. Vervoort, B. Tyrakowska, J.L.M. Hermens, I.M.C.M. Rietjens // Toxicol. Vitro. – 2001. – 15. – P.539-551. 153. Берсукер, И.Б. Электронно-топологический подход в исследовании связи структура-активность. Ингибирование тимидинфосфорилазы производными урацила / И.Б. Берсукер, А.С. Димогло, М.Ю. Горбачев // Биоорган. химия. – 1987. – 13. – С.38-44. 154. Karelson, M. Quantum-chemical descriptors in QSAR/QSPR studies / M. Karelson, V.S. Lobanov, A.R. Katritzsky // Chem. Rev. – 1996. – 96. – P.1027-1043. 155. Кузьмин, В.С. Расчет ван-дер-ваальсовых объемов органических молекул / В.С. Кузьмин, С.Б. Кацер // Изв. АН. Сер. химическая. – 1992. – (4). – С. 922-931 156. Collantes, E.R. Amino acid side chain descriptors for quantitative structure-activity relationship studies of peptide analogues / E.R. Collantes, W.J. Dunn III // J. Med. Chem. – 1995. – 38. – P. 2705-2713. 157. Pearlman, R. Program No. 432, SAREA Bloomington, IN, Quantum Chemistry Program Exchange, 1981. 158. Palekar, D. Correlation of physicochemical parameters to the hydrophobic contribution constants of amino acid residues in small peptides / D. Palekar, M. Shiue, E.J. Lien // Pharmaceut. Res. – 1996. –13. – P.1191-1195. 159. Reis, J.C.R. The concepts of non-Gibbsian and non-Lewisian properties in chemical thermodynamics / J.C.R. Reis, M.J. Blandamer, M.I. Davis, G. Douhéret // Phys. Chem. Chem. Phys. – 2001. – 3. – P. 1465- 1470. 134 160. Львовский, Е.Н. Статистические методы построения эмпирических формул / Е.Н. Львовский. – М.: Высш. шк., – 1988. – 239 с. 161. Лесникович, А.И. Корреляции в современной химии / А.И. Лесникович, С.В. Левчик. – Минск: изд-во университетское, – 1989. –118 с. 162. Гиричев, Е. Г. Автоматизация физикохимического эксперимента: фотометрия и вольтамперометрия / Е. Г. Гиричев, А. В. Захаров, Г. В. Гиричев, М. И. Базанов // Известия ВУЗов. Технология Текстильной Промышленности. – 2000. – 2. – С.142-146.
