Экспрессия векторов в эукариотических клетках

Экспрессия векторов в эукариотических клетках
Многие генетические заболевания у млекопитающих связаны с отсутствием или
дефектами внутриклеточных белков, вызванные дефектами генов, кодирующих эти белки.
Лечение таких заболеваний возможно с использованием рекомбинантных технологий, с
применением специально сконструированных кольцевых ДНК (векторов), содержащих
НОРМАЛЬНЫЕ гены, отсутствующие в организме. К настоящему моменту времени
созданы многочисленные векторы для этих целей, способные экспрессировать в клетках
млекопитающих in vitro. Однако, подобные векторы, применяемые in vivo, должны быть
селективны по отношению к тканям с дефектными клетками. Непосредственное
генетическое модифицирование в организме насчитывает слишком мало примеров
успешного применения.
Определенные
типы
разработанных
векторов
позволяют
репликацию,
транскрипцию и трансляцию чужеродных генов, осуществляемую на клеточных
культурах, выращиваемых in vitro, включая ДНК- и РНК- вирусные векторы, содержащие
вставки целевой ДНК. Эти вирусные векторы способны инфицировать и реплицировать в
клетке-хозяине. Экспериментально сконструированные векторы позволяют экспрессию
чужеродных генов только, если содержат существенные элементы ДНК. Обычно эти
элементы привносятся непосредственно с вирусной ДНК.
Так называемые челночные векторы, содержат сигналы репликации, необходимые
в бактериальных системах и системах млекопитающих, поэтому могут применяться для
производства белков в обоих типах клеток. Челночные векторы могут быть клонированы
и очищены из бактериальных клеток в больших количествах, а затем перенесены для
экспрессии в клетки млекопитающих. Некоторые из них способны внедряться в геном
клетки-хозяина, другие- остаются внехромосомальными (эписомальными), сохраняя,
однако стабильную возможность экспрессии заложенного в них интересуемого гена,
Некоторые из последних- кочуя в дочерние клетки при их делении, другие- работая
только в период жизни клетки.
Процесс переноса информации чужеродной ДНК в эукариоту в виде вектора
называется трансфекцией. Подобный процесс переноса информации в клетки прокариот
называют трансформацией. Наиболее часто используемый метод трансфекции включает
образование комплекса ДНК с фосфатом кальция или DEAE-декстраном, которые затем
захватываются клеткой в результате эндоцитоза. ДНК затем переносится из цитоплазмы в
ядро, где и происходит ее репликация и экспрессия. Детали механизма трансфекции
неизвестны. Обычно трансфекции подвергаются 10-20 % клеток культуры.
Экспрессия рекомбинантных генов в клетках млекопитающих требует присутствия
в векторе ДНК-контролирующих элементов, которые необязательны в бактериальных
системах. Для экспрессии в эукариотической клетке, ген должен быть вставлен в вектор в
нужном направлении относительно контролирующих элементов, включающих промотер,
сигналы полиаденилирования, в некоторых случаях- интроны. Некоторые или все из этих
элементов могут оказаться в векторе, если использовалась цельная геномная ДНК при
клонировании. Если же клонировали только часть ДНК, они могут отсутствовать,
поскольку были удалены при обработке рестриктазами. В таких случаях они должны
присутствовать в самом векторе.
Популяция эукариотических клеток, подвергшихся трансфекции, должна быть
обнаруживаема с целью их направленного выращивания, ведь их относительное число не
превышает 10-20 %. Конструирование векторов, содержащих экспрессируемый ген и
маркер одновременно, чрезвычайно сложно, поэтому прибегают к котрансфекции, когда
в клетку вносят одновременно два вектора, с геном и маркером. В большинстве случаев,
не менее 90 % преобразованных клеток содержат оба вектора.
Два из наиболее широко применяемых маркера- гены тимидинкиназы (тк) и
дигидрофолат-редуктазы
(дгфр).
Продукт тк-гена – тимидинкиназа
образуется
в
большинстве клеток млекопитающих и участвует в путях метаболизма тимидина.
Некоторые мутантные линии клеток не содержат функционального гена тимидинкиназы
(тк-) и такие клетки не выживают в средах, содержащих гипоксантин, аминоптерин и
тимидин. Только те из (тк-)-мутантных клеток, которые в результате котрансфекции
получат вектор, несущий нормальный ген, способны к росту. Они и подвергаются
процедуре внедрения интересуемого генома.
Ген дегидрофолат-редуктазы (дгфр) необходим для поддержания в клетке
нормального уровня активности дегидрофолат-редуктазы, необходимой в биосинтезе
нуклеотидов. Клетки, не содержащие этого фермента, выживают только в средах,
содержащих тимидин, глицин и пуриновые азотистые основания. Если провести
трансфекцию мутантных клеток одновременно двумя векторами (с интересуемым геном и
геном дгфр), то становится возможным их определение от нетрансфектированных клеток
при выращивании на средах, не содержащих перечисленные выше компоненты.
Другой подход для определения немутировавших клеток – использование для
котрансфекции бактериального гена, кодирующего аминогликозид-3’-фосфотрансферазу
(АФТ).
Клетки,
экспрессирующие
ген
АФТ,
устойчивы
к
аминогликозидным
антибиотикам типа неомицина и канамицина, ингибирующих синтез протеинов как у
прокариот, так и у эукариот. Поэтому векторы, несущие ген АФТ, могут применяться как
на бактериальных клетках, так и на клетках млекопитающих.
“Чужие”
гены
можно
экспрессировать
применяя
трансформированные
эукариотические
вирусом
клетки.
Например,
клетки линии COS-1 есть симиановые
клетки CV-1, трансформированные oriдефектным вирусом SV-40.Дефектный
вирусный геном внедряется в геном
клетки
и
способен
только
продуцировать вирусные белки, в то
время
как
сами
вирусы
не
продуцируются, вследствие нарушенной
репликативной функции. Однако, если в
трансформированную
таким
образом
клетку внести рекомбинантную ДНК
вируса
с
SV-40
ненарушенной
репликативной системой, содержащую к
тому же вставку из интересуемой ДНК,
то
начнется
репликация
рекомбинантных вирусных плазмид в
больших количествах. Они, оставаясь
внехромосомальными, накапливаются в
количествах до 100 тысяч на клетку,
одновременно происходит транскрипция
интересуемой
ДНК-овой
вставки
с
образованием мРНК и синтез целевого
белка в результате трансляции. Клетки
COS-1
погибают
через
3-4
дня,
возможно, из-за токсического действия
эписомальной
векторной
ДНК,
целевой белок может быть выделен.
и