Вестник СПбГУ, серия биология, №3, с. 108-116, 2007 г. РАЗВИТИЕ ВИСОЧНОЙ ОБЛАСТИ КОРЫ МОЗГА ЧЕЛОВЕКА В СРЕДНИЙ И ПОЗДНИЙ ПЕРИОДЫ ПРЕНАТАЛЬНОГО ОНТОГЕНЕЗА. Краснощекова Е.И., Самарина А.С., Федосеева К.Н., Смолина Т.Ю. Решение одной из фундаментальных проблем нейробиологии, связанной с изучением структурно-функциональных предпосылок ранней предуготовленности мозга человека к биосоциальным воздействиям, предполагает выработку критериев и методов определения динамики развития неокортекса человека в пренатальный период. Постнатальный онтогенез неокортекса человека изучен сравнительно полно и результаты этих исследований указывают на гетерохронное созревание корковых территорий различной функциональной направленности (Цехмистренко, 1990). В то же время данные о развитии коры мозга человека в пренатальном онтогенезе, особенно в среднем и позднем его периоде, крайне скупы, хотя именно этот период определяет видовую специфику пренатального опыта плода и новорожденного (Батуев, Соколова, 1994). В последние годы при изучении онтогенеза неокортекса млекопитающих пристальное внимание обращают на развитие и функцию субпластинки в его составе (Kostovic, Rakic, 1990; Rakic, 2006). Обнаруженная в эмбриональной коре всех млекопитающих, субпластинка, в зависимости от длительности периода гестации и видовой специфичности, претерпевают более или менее полную, генетически запрограммированную, редукцию (Luskin, Shatz, 1985; Shatz et all 1988, Reep, 2000). Нейроны этой структуры устанавливают первую систему связей с таламусом, которая отличается от зрелой отсутствием модальной специфичности, и откуда таламокортикальные волокна не поднимаются выше до полной элиминации субпластинки (Allendoerfer, Shatz, 1994; Lopez-Bendito, Molnar, 2003). В последние годы повышенный интерес к изучению субпластинки обусловлен следующим: у плодов и новорожденных, перенесших гипоксию, генетически запрограммированный процесс гибели нейронов субпластинки не происходит, следствием чего являются последующая аномалия развития коры и в результате дефицит моторных, когнитивных функций, врожденные неврологические заболевания (Sbarbati et al., 2004; Andres et al., 2005; Eastwood et al., 2005; Cepeda et al.,2006). Несмотря на широкий интерес к данной проблеме, этапы дифференцировки субпластинки в коре мозга человека практически не изучены, что во многом объясняется тем, что ее нейроны лишены нейрохимической специфичности (Innocenti, Price, 2005; Rakic et al., 2006). В то же время, с учетом того, что присутствие 1 субпластинки в составе коры определяет важнейший критический период ее становления, когда кора повышенно уязвима для экзогенных факторов, а плод рождается жизнеспособным, необходимость четких критериев выделения этого образования очевидна. В связи со всем вышесказанным, задача данного исследования заключалась в выработке критериев структурной зрелости функционально различающихся территорий неокортекса по присутствию субпластинки в составе коры, на примере верхней височной подобласти мозга человека, в течение среднего и позднего периодов гестации, с целью выявления последовательности и закономерности онтогенетического созревания корковых территорий, обеспечивающих адаптивное поведение плода и младенца. Материал и методы исследования. Материалом исследования явились фронтальные срезы левой и правой верхней височной подобласти мозга пятнадцати плодов человека обоих полов в возрасте от 16 до 40 недель гестации, всего 25 полушарий. При идентификации области исследования руководствовались цитоархитектоническими картами Полякова (1937) и Блинкова (1949) для мозга плодов человека разных сроков гестации. Исследовался мозг плодов, которые, по предварительному заключению патологоанатома, не имели неврологической патологии. Материал обрабатывали по методу Ниссля и Гольджи. Иммуноцитохимическое выявление нейронов проводилось с использованием соответствующих антител к кальций-связывающим белкам. Гистологические срезы оцифровывали на установке, включающей микроскоп Биолам И и цифровую камеру Canon EOS 350 D. Полученные изображения обрабатывали с помощью свободно доступной программы ImageJ и дополнений Dynamic Profile, Excel Writer, Jimmi File Opener. Были изучены следующие морфометрические характеристики развивающейся коры: оптическая расположения плотность, нейронов, относительная объемная фракция оптическая нейронов плотность, и глии плотность отдельных цитоархитектонических слоев, общая ширина поперечника коры и отдельных слоев, коэффициент вертикальной упорядоченности нейронов коры Org. По результатам измерения оптической плотности слоев строили графики. Относительную оптическую плотность измеряли для двух уровней коры – слоя eII (наружной каймы корковой пластинки) и верхней зоны субпластинки, как разницу оптической плотности между этими слоями и соседствующими с ними маргинальной зоной (слой eI), в первом 2 случае, и нижней зоной субпластинки, во втором. Статистическая обработка результатов измерений проводилась с использованием критерия Стьюдента. Оценка значимости достоверных различий определялась при р< 0,05. Результаты исследования и их обсуждение. У плодов в возрасте 16-18 недель исследованная кора верхней височной подобласти цитоархитектонически подразделяется на маргинальную зону (слой eI), корковую пластинку (ср) и субпластинку (sp). Корковая пластинка в этом возрасте не разделяется на слои, что, по мнению Г.И. Полякова, характерно для стадии консолидации (Поляков, 1937). В составе субпластинки отчетливо выделяется верхняя зона (spu), которая выглядит как самостоятельный слой благодаря высокой плотности составляющих ее клеток. В период с 20 по 26 недели толщина коры возрастает от 1300 мкм до 1500 мкм, при этом происходит первоначальная стратификация корковой пластинки. Ее расслоение в это время характеризуется чередованием очень плотноклеточных и более разреженных слоев. Плотноклеточными и, следовательно, обладающими высокой оптической плотностью являются: наружная кайма корковой пластинки – слой eII, слой eIV и верхняя зона субпластинки - spu. Слои сравнительно редкоклеточные и с низкой оптической плотностью это – слой eIII и недифференцированный комплекс слоев eV+eVI (рис. 1а). В этом возрасте слои еII и еIII состоят из незрелых нейронов, которым присущи типичные структурные особенности нейробластов - веретеновидное тело и длинные отростки, которые отходят от апикального и базального полюсов клетки. Слой eIV состоит из крупных, хорошо дифференцированных пирамидных нейронов, комплекс слоев eV+eVI содержит полиморфные клетки. В составе субпластинки превалируют нейроны, которые характеризуют как интерстициальные – они имеют горизонтально вытянутое тело и обильно ветвящиеся дендритами (рис.1б). Увеличение толщины коры в этот период происходит, главным образом, за счет расширения и одновременного снижения клеточной плотности слоев eIV – eVI, которые к концу 26 недели в сумме образуют больше 60% поперечника. Начиная с 27-й недели гестации в височной коре, помимо продолжающегося ее расширения, наблюдается постепенное снижение показателей клеточной плотности слоя eII и субпластинки (spu). Последняя к 33-й недели развития мало отличается по плотности клеток от вышележащего слоя eVI. К этому сроку цитоархитектоника и нейронный состав эмбрионального слоя еIV претерпевают значительные изменения, в 3 его составе появляются типичные гранулярные элементы, а крупные пирамидные нейроны, которые были характерны для этого уровня на более ранних сроках гестации, входят в состав слоя V и подслоя IIIб, которые в это время очень крупноклеточны (рис.2). Рис. 1. Цитоархитектоника и график оптической плотности (а), нейронный состав (б) коры верхней височной подобласти мозга 24 недельного плода человека. a – метод Ниссля; б- метод Гольджи. Mасштабная линейка – 100 мкм. Обозначения:, eI-eVI слои коры; spu- верхняя область субпластинки. Рис.2. Схема преобразования цитоархитектонических слоев коры верхней височной подобласти мозга человека при переходе эмбрионального к от дефинитивному строению. - нейробласты, S Обозначения: - пирамидные нейроны, зернистые - - клетки, полиморфные клетки, - µ интерстициальные нейроны субпластинки, – eI—eVI слои эмбриональной коры, spu- верхняя зона субпластинки, I-VI слои дефинитивной коры. Одновременно толщина коры достигает образом, за счет расширения слоев 1700 мкм, что происходит, главным eII и eIII, при этом происходит изменение 4 соотношения верхнего «ассоциативного» и нижнего «эфферентного» этажей коры, первый составляет больше 50% поперечника коры. У плодов, начиная с 36 недели гестации, височная область становится структурно неоднородной. На planum temporale удается определить границы полей 41 и 22, которые по цитоархитектонике сходны с корой взрослого мозга. Каудальная височно- затылочная подобласть, представленная полем 37, отличается от зрелой коры и характеризуется присутствием субпластинки, на что указывает высокая плотность клеток в ее верхней зоне и в наружной кайме корковой пластинки. Таким образом, исследование становления верхней височной подобласти неокортекса в мозге плодов человека с 16 по 36 недели гестации позволило установить следующее: по мере развития организма происходит утолщение коры, при чем в период с 16 по 26 недели преимущественно за счет нижних ее слоев, то есть «эфферентного» комплекса, а с 27 по 36 недели – за счет верхних – «ассоциативного» комплекса. В течение исследованного периода наблюдается переход эмбрионального типа расслоения коры височной области к дефинитивному, характерному для зрелого мозга, и дифференцировка верхней височной подобласти на первичное (41), вторичное (22) и третичное (37) цитоархитектонические поля. Для объективной оценки онтогенетических преобразований коры был разработан количественный критерий дифференцировки субпластинки в ее составе, а именно положительно коррелирующие показатели изменения клеточной плотности слоя eII – наружной каймы корковой пластинки и spu - верхней зоны субпластинки (рис3). Использование этого критерия позволило установить первоначально опережающую дифференцировку «эфферентного» комплекса коры, и сменяющее ее более позднее становление «ассоциативного» комплекса. Созревание «эфферентного» комплекса происходит в присутствии субпластинки и, по-видимому, незначительно зависит от ее состояния. С другой стороны очевидна взаимообусловленность темпов созревания нейронов слоев II и IV, основной составляющей «ассоциативного» комплекса коры, и процессов элиминации субпластинки. Эти слои начинают дифференцироваться усиленным темпом только после начала элиминации нейронов субпластинки и опережают становление «эфферентного» комплекса начиная с 27 недели гестации (рис. 4). Полученные результаты подтверждаются недавними литературными данными, согласно которым, как показано в модельных экспериментах на животных, созревание тормозных интернейронов в слое IV зависит от клеток субпластинки, несостоявшаяся 5 Рис.3. Графики объемной фракции нейронов и глии, плотности клеток, относительной оптической плотности в слоях eII и верхней области субпластинки spu . 1- плотность клеток; 2-объемная фракция слоя eII; 3объемная фракция субпластинки spu; 4 – относительная оптическая плотность. Обозначения: eII – наружная кайма корковой пластинки, spu- верхняя область субпластинки Рис. 4. Ширина формаций препластинки (слои eI, I, spu) и корковой пластинки (CP) в составе височной коры мозга плодов человека на разных сроках гестации. 6 их элиминация изменяет нормальное становление тормозных процессов, оказывая влияние на модульную организацию коры (Kanold, Shatz, 2006). В пределах верхней височной подобласти, с помощью разработанного критерия, удалось также установить более позднее созревание поля 37. Развитие цитоархитектонических полей верхней височной подобласти на сроках 37-40 недель гестации оценивали, используя следующие показатели: процентное соотношение нейронов, позитивных к двум кальций-связывающим белкам (кальбиндину и парвальбумину) и вертикальную упорядоченность нейронов коры, определяемую по величине коэффициента Org. На этом отрезке развития в границах верхней височной подобласти можно дифференцировать: поле 41 – первичное слуховое, поле 22 – вторичное слуховое, поле 37 – третичное ассоциативное, входящее в состав зоны Вернике. Иммуноцитохимические методы исследования, широко применяемые в нейроморфологами в последние годы, могут продемонстрировать новые параметры структурно-функциональной организации коры. В частности показано, что так называемые «ядерные», по фило- и онтогенезу более зрелые, таламокортикальные отношения формируются нейронами иммунопозитивными к парвальбумину, а «поддерживающие», менее зрелые, кальбиндинпозитивными клетками (Jones, 1998; Jones, 2001). Нами обнаружено, что исследованные поля гетероморфны по распределению нейронов, иммунопозитивных к этим двум кальцийсвязывающим белкам. Кальбиндинпозитивные нейроны наиболее массово представлены в поле 22, клетки, экспрессирующие парвальбумин – в поле 41, в поле 37 удалось идентифицировать оба типа нейронов (рис. 5). Таким образом, полученные данные указывают на продолжающееся гетерохронное развитие 41, 22, 37 полей верхней височной подобласти. О зрелости первичного проекционного поля 41 можно судить по максимальному содержанию парвальбумин-позитивных нейронов, что является косвенным свидетельством в пользу того, что к концу плодного периода таламо-кортикальные проекции этого поля организованы тонотопически и опосредуются принципальной частью медиального коленчатого типа. Превалирование кальбиндинпозитивных клеток во вторичном слуховом поле подтверждает характерную особенность его связей с таламусом, которые классифицируются как «поддерживающие». Присутствие в поле 37 двух типов нейронов можно расценить как свидетельство незрелости его основных таламо7 кортикальных проекций, которые в зрелом мозге относятся к «ядерному» типу (Альтман, 1990; Вартанян, 2003; Moore, Linthicum, 2006). О гетерохронном становлении полей верхней височной подобласти на последних неделях гестации свидетельствует еще один показатель – вертикальная упорядоченность нейронных комплексов коры. Согласно полученным данным величина коэффициента Org для полей 41, 22 и 37 плодов человека в возрасте 38-40 недель гестации, различается (рис. 6). В этот период максимальное значение коэффициента Org характеризует поле 22, что является еще одним фактом, свидетельствующем об опережающем развитии этой вторичной слуховой зоны. В то же время для поля 37 Рис. 5 Процентное соотношение кальбиндинпозитивных и парвальбуминпозитивных нейронов в полях 22, 37 и 41 височной области коры мозга 37-40 недельных плодов человека. 8 Рис.6 Коэффициент вертикальной исчерченности Org для полей 22, 41 и 37 височной областей коры мозга 38-40 недельных плодов человека. Обозначения: ЛП – левое полушарие поля 37, ПП-правое полушарие поля 37, *- обозначение достоверности различия показателя Org (p ‹ 0,05) величина коэффициента Org минимальна, хотя во взрослом мозге самые высокие значения этого показателя характерны для полей (в том числе и поля 37) речевой зоны Вернике (Кесарев и др., 1977; Адрианов, 1999). Межполушарная асимметрия – хорошо известный факт. Количественный показатель асимметрии коры мозга человека, полученный при сравнительной оценке вертикальной упорядоченности нейронных комплексов, достигает максимальных значений для речевых зон (Кесарев, Соколовская, 1976; Адрианов, 1999). В нашем исследовании межполушарная асимметрия, оцениваемая по этому же показателю, выявлена только для поля 37, что свидетельствует о том, что, несмотря на незрелость, ассоциативные поля еще до рождения приобретают характерные структурно-функциональные особенности. На основании результатов проведенного исследования можно сделать следующее заключение: комплексное морфологическое, иммуноцитохимическое с применением компьютерных технологий, исследование особенностей онтогенетических преобразований коры конечного мозга, как основного структурного образования, обеспечивающего реализацию интегративных процессов в центральной нервной 9 системе, позволило выработать четкие количественные и качественные критерии поступательного развития коры. В период с 16 по 26 недели гестации структурнофункциональная организация височной области коры определяется доминированием «эфферентного» комплекса коры и присутствием субпластинки, нейроны которой опосредуют таламо-кортикальные влияния. В период с 27 по 36 недели гестации происходит постепенная элиминация нейронов субпластинки и нарастающая дифференцировка «ассоциативного» комплекса, который к концу периода доминирует над «эфферентным», одновременно происходит выделение полей разной функциональной направленности – первичного (поле 41), вторичного (поле 22) и третичного (поле 37). Начиная с 37 недели гестации и до окончания плодного периода эти поля коры развиваются гетерохронно – структурно-функциональные признаки опережающего развития характеризует вторичное поле 22, поле 41 в этот период еще не достигает структурной зрелости, поле 37 обладает структурно-функциональными особенностями эмбриональной коры, хотя оно единственное из полей височной области демонстрирует признаки межполушарной асимметрии. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. 1. Адрианов О.С. О принципах структурно-функциональной организации мозга. / Избранные научные труды. М., 1999, 250 с. 2. Альтман Я.А. Нарушения слуха при поражениях различных отделов слуховой системы животных и человека. / В кн. «Слуховая система». Л., «Наука», 1990. C.120155. 3. (Батуев А.С., Соколова Л.В.) Batuev A.S., Sokolova L.V. A.A.Ukhtomskii’s Idees on the Nature of Man. // Neuroscience and Behaviorsl Physiology. 1994. Vol. 24, N 2.P. 173–185. 4. Блинков С.M. Височная область./ В кн. «Цитоархитектоника коры большого мозга человека». М., Медгиз, 1949. С. 344-380. 5. Вартанян И.А. Речевая система. / В кн. «Физиология сенсорных систем», СПб «Паритет», 2003. С.297-315. 6. Кесарев В.С., Малофеева Л.И., Трыкова О.В. Структурная организация новой коры мозга китообразных.// Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. 1977. Т.56. №12. С.23-30. 7. Кесарев В.С., Соколовская Н.Ю. Информационная оценка некоторых морфологических структур коры полушарий большого мозга человекa // Архив анат., 10 гистол., эмбриол. 1976. Т. 55. №12. С.13-16. 8. Поляков Г.И. Ранний и средний онтогенез коры большого мозга человека. М.,1937. 67с. 9. Цехмистренко Т.А. Структурные преобразования коры большого мозга человека в постнатальном онтогенезе //В сб. «Структурно-функциональная организация развивающегося мозга» Л., «Наука». 1990. С.8-44 10. Allendoerfer, K.L., and Shatz, C.J. The subplate, a transient neocortical structure: its role in the development of connections between thalamus and cortex// Annu. Rev. Neurosci. 1994. №17. P. 185–218. 11. Andres M., Veronique M. Andre V.M., Nguyen S. Human cortical dysplasia and epilepsy: an ontogenetic hypothesis based on volumetric MRI and NeuN neuronal density and size measurements// Cerebral Cortex. 2005. V. 15. № 2. P.194-210. 12. Cepeda C., Andreґ V.M., Levine M.S., Salamon N., Miyata H., Vinters H.V., Mathern G.W. Epileptogenesis in pediatric cortical dysplasia: The dysmature cerebral developmental hypothesis.// Epilepsy & Behavior. 2006. № 9. P. 219–235. 13. Eastwood S.L., Harrison P.J. Interstitial white matter neuron density in the dorsolateral prefrontal cortex and parahippocampal gyrus in schizophrenia// Schizophrenia Research. 2005. V. 79. P.181– 188. 14. Innocenti G.M., Price D.J. Exuberance in the development of cortical networks.// Neurosci. 2005. V.6. P.955-965. 15. Jones E. G. Viewpoint: the core and matrix of thalamic organization// Neurosci. 1998. V.85. P.238-261. 16. Jones E.G. The thalamic matrix and thalamocortical synchrony// TINS. 2001. V.24, P.595601. 17. Rakic P. A century of progress in corticoneurogenesis: from silver Impregnation to genetic engineering. // Cerebral Cortex. 2006. V.16. P. 3-17. 18. Kanold P.O., Shatz C.J. Subplate neurons regulate maturation of cortical inhibition and outcome of ocular dominance plasticity// Neuron. 2006. V.51.№7. P. 627–638. 19. Kostovic I., Rakic P. Developmental history of the transient subplate zone in the visual and somatosensory cortex of the macaque monkey and human brain // J.Comp.Neurol. 1990. V. 297. №3. P.441-470. 20. Lopez-Bendito G., Molnar Z. Thalamocortical development: how we are going to get there //Neurosci.2003.V.4. P.276-289. 11 21. Luskin M.L., Shatz C.J. Studies of the earliest generated cells of the cat’s visual cortex: Cogeneration of subplate and marginal zones. //J. Neurosci. 1985. V. 5. P. 1062-1075. 22. Moore J.K., Linthicum F.H. Auditory system/ In “The human nervous system”. Els.Acad.Press. 2006. P.1241-1279. 23. Rakic S., Davis C., Molnar Z., Nikolic M., ParnavelasJ. Role of p35/Cdk5 in preplate splitting in the developing cerebral cortex // Cerebral Cortex. 2006. V.16. P.35-45. 24. Reep R.L. Cortical layer VII and persistent subplate cells in mammalian brains.//Brain Behav. Evol. 2000. V.56. №4. P.212-34. 25. Sbarbati A., Pizzini F.,Fabene P., Nicolato E., Marzola P., Calderan L., Simonati A., Longo L., Osculati A., Beltramello A. Cerebral cortex three-dimensional profiling in human fetuses by magnetic resonance imaging // J. Anat. 2004. V.204. P. 465–474. 26. Shatz C.J., Chun J. J. M., Luskin M.B The role of the subplate in the development of the mammalian telencephalon. // Cerebral cortex, 1988, V.7, p. 35-58. 12