Выявление полиморфизма гена рецептора

Проект
Клинические рекомендации
ВЫЯВЛЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА РЕЦЕПТОРА
ВИТАМИНА D ДЛЯ ПРОГНОЗА РАЗВИТИЯ
АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Москва 2015
2
Содержание
Стр.
Разработчики……………………………………………………………………..
3
1. Введение……………………………………………………………………….
4
2. Методология…………………………………………………………………..
5
3. Описание медицинской разработки.………………………………………..
7
3.1 Выделение ДНК……………………………………………………………
7
3.2 Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени…………
8
3.3 Общая схема проведения ПЦР……………………………………………
9
3.4 Схема расчета компонентов ПЦР-смеси ………………………………...
10
3.5 Результаты научно-исследовательской работы………………………
10
3.6 Сведения о патентовании………………………………………………
12
3.7 Степень готовности медицинской технологии к внедрению……….
13
3.8 Область применения медицинской технологии…………………….
13
3.9 Реализация в практике………………………………………………..
13
4. Заключение……………………………………………………………………
14
Список литературы………………………………………………………………
15
3
Разработчики: д.м.н., проф. Т.Б. Сенцова, д.м.н., проф. В.А.Ревякина, к.м.н. И.В. Ворожко,
к.м.н. В.И. Соломатина, О.О. Черняк, Н.Э. Фукс, А.Г.Тимофеева
Организация-разработчик:
Федеральное
государственное
учреждение «Научно-исследовательский институт питания»
бюджетное
научное
4
1. Введение.
В настоящее время общепризнан мультифакториальный характер развития аллергических
болезней, при которых генетическая составляющая играет не только важную, но и иногда и
определяющую роль в реализации иммунных изменений (1,2).
Выявление генетических маркёров предрасположенности к атопии, так называемых
«генов-кандидатов», в основном, сводилось к исследованию генов иммунной системы,
прежде всего генов главного комплекса гистосовместимости, цитокинов, IgE, лейкотриенов,
ростовых факторов и др. (3,4). Однако, в настоящее время в опубликованной литературе
обсуждается гипотеза об участии синтропных генов в развитии аллергических болезней(5).
Согласно мнению авторов, синтропные гены ответственны за общие звенья патогенеза ,
хотя не исключается возможность одновременной инициации и регуляции иммунного
ответа
специфическими для аллергии генами. По сути, подтверждается полигенный
характер предрасположенности к развитию аллергических заболеваний (6,7). В этой связи,
большой интерес исследователей вызывает ген рецептора витамина Д (VDR), который
кодирует внутриклеточный рецептор, способный, в частности, связывать активные формы
витамина Д, опосредованно осуществляя иммунорегуляторные эффекты (8). Поскольку
рецептор витамина Д широко представлен во многих клетках и тканях организма, то в
последние годы были предприняты многочисленные попытки изучения ассоциации
полиморфизма гена
VDR с развитием артериальной гипертонии, ХОБЛ, туберкулёза
лёгких, псориаза, раковых опухолей, сахарного диабета 2 типа, болезни Паркинсона,
остеопороза и др. (9,10,11).
Кроме того, в работах последних лет было продемонстрировано, что VDR
экспрессируется на клетках иммунной системы: моноцитах, макрофагах, активированных
лимфоцитах, клетках тимуса и др.(12,13). Поэтому становится очевидным, что выявление
особенностей функционирования иммунорегуляторных субстанций при различных аллелях
гена VDR имеет не только большое теоретическое, но и практическое значение для
прогноза выраженности аллергического воспаления.
Ген VDR расположен на коротком плече 12 хромосомы имеет размер 75 Кб и содержит 11
экзонов. В гене выделяют некодирующую и кодирующую области. Некодирующая облать
находится на 5-конце гена и включает экзоны 1А, 1В и 1С. Последующие 8 экзонов
кодируют структурную часть белкового продукта гена VDR. В гене VDR описано
5
значительное
количество
аллельных
вариантов,
однако
наиболее
функционально
значимыми являются 4 полиморфных сайта в позиции соответствующих точкам узнавания
эндонуклеаз: BsmL, TaqI, FokI.
Задачей предлагаемой технологии является разработка диагностического способа
выявления гентических полиморфизмов рецептора витамина D ассоциированных с риском
развития аллергических заболеваний, позволяющие выявить группу риска, оптимизировать
профилактические мероприятия и персонифицировать диетотерапию.
2. Методология.
Методы, использованные для сбора/селекции доказательств:

поиск в электронных базах данных.
Методы, использованные для оценки качества и силы доказательств:

оценка значимости в соответствии с уровнями доказательности и классами рекомендаций
(табл.1, 2).
Таблица 1. Уровни доказательности
Уровень
1
2
3
Источник доказательств
Проспективные рандомизированные контролируемые исследования.
Достаточное количество исследований с достаточной мощностью, с участием
большого количества пациентов и получением большого количества данных.
Крупные мета-анализы.
Как минимум одно хорошо организованное рандомизированное контролируемое
исследование.
Репрезентативная выборка пациентов
Проспективные с рандомизацией или без исследования с ограниченным количеством
данных.
Несколько исследований с небольшим количеством пациентов.
Хорошо организованное проспективное исследование когорты.
Мета-анализы ограничены, но проведены на хорошем уровне.
Результаты непрезентативны в отношении целевой популяции.
Хорошо организованные исследования «случай-контроль»
Нерандомизированные контролируемые исследования.
Исследования с недостаточным контролем.
Рандомизированные клинические исследования с как минимум 1 значительной или
как минимум 3 незначительными методологическими ошибками.
Ретроспективные или наблюдательные исследования.
Серия клинических наблюдений.
Противоречивые данные, не позволяющие сформировать окончательную
6
рекомендацию
Мнение эксперта/данные из отчета экспертной комиссии, экспериментально
подтвержденные и теоретически обоснованные
4
Таблица 2. Уровни рекомендаций.
Уровень
A
B
Описание
Рекомендация основана на высоком уровне
доказательности (как минимум 1 убедительная
публикация 1 уровня доказательности,
показывающая значительное превосходство
пользы над риском)
Рекомендация основана на среднем уровне
доказательности (как минимум 1 убедительная
публикация 2 уровня доказательности,
показывающая значительное превосходство
пользы над риском)
C
Рекомендация основана на слабом уровне
доказательности (но как минимум 1
убедительная публикация 3 уровня
доказательности, показывающая значительное
превосходство пользы над риском) или
нет убедительных данных ни о пользе, ни о
риске)
D
Отсутствие убедительных публикаций 1, 2 или 3
уровня доказательности, показывающих
значительное превосходство пользы над риском,
либо убедительные публикации 1, 2 или 3
уровня доказательности, показывающие
значительное превосходство риска над пользой
Расшифровка
Метод/терапия первой линии;
либо в сочетании со
стандартной
методикой/терапией
Метод/терапия второй линии;
либо при отказе,
противопоказании, или
неэффективности стандартной
методики/терапии.
Рекомендуется
мониторирование побочных
явлений
Нет возражений против
данного метода/терапии
или нет возражений против
продолжения данного
метода/терапии.
Рекомендовано при отказе,
противопоказании или
неэффективности стандартной
методики/терапии, при
условии отсутствия побочных
эффектов
Рекомендация основана на
мнении экспертов, нуждается
в проведении исследований
Методы, использованные для анализа доказательств:

Обзоры опубликованных мета-анализов;

Систематические обзоры с таблицами доказательств.
Описание методов, использованных для анализа доказательств:
7
Были использованы: Zhao CN, Fan Y, Huang JJ, Gao T, Wang C, Hou LH. The Association of
GSDMB and ORMDL3 Gene Polimorphisms With Asthma: A Meta-Analisis. Allergy Asthma
Immunol Res. 2015 7 (2) 175-85.; Liu Z. Liu L. Chen X, He W, Yu X. Associations study of
vitamin D receptor gene polymorphisms with diabetic microvascular complication: a metaanalysis. Gene, 2014, 546 (1),6-10.
Основные рекомендации:
 Сила рекомендаций (A-D) приводятся при изложении текста технологии.
3. Описание медицинской разработки
Выявление генетических полиморфизмов витамина D может служить критерием,
ассоциированным с развитием пищевой аллергии, с последующим обоснованием
формирования группы риска (уровень В).
Данный диагностический способ может служить основой для рекомендаций по лечебнопрофилактическому питанию этих пациентов. В результате данная методика позволяет
подбирать оптимальную схему диетологического ведения групп пациентов и отдельных
больных,
одновременно
предупреждая
развитие
возможных
осложнений
несбалансированной диетотерапии (уровень В).
Выявление генетических полиморфизмов рецептора витамина D проводили методом
ПЦР.
С целью проведения молекулярно-генетического анализа у больных натощак собирали
2-3 мл венозной крови в вакуумные пробирки с 0,05М раствором ЭДТА.
3.1. Выделение ДНК
Выделение геномной ДНК проводили из цельной крови с использованием реактива
«Проба-Рапид-Генетика» фирмы «ДНК-технология» (Россия).
Последовательность действий при проведении процедуры выделения ДНК из цельной
крови:
1. Маркируют необходимое количество пластиковых пробирок фирмы «Scientific
Specialties Inc.» (США) объёмом 1,5 мл с защёлкой в соответствии с
количеством анализируемых проб и одну пробирку для отрицательного
контрольного образца «К–».
2. Вносят 600 мкл лизирующего раствора в каждую промаркированную пробирку.
8
3. Добавляют 100 мкл периферической крови, перемешанной переворачиванием
пробирки, в соответствующую пробирку с лизирующим раствором. В пробирку,
промаркированную «К–», вносят 100 мкл стерильного физиологического
раствора. Закрывают крышки пробирок. Встряхивают пробирки на вортексе
«Microspin FV-2400»фирмы «Biosan» (Латвия) в течение 3–5 сек.
Биологический
образец
обрабатывают
лизирующим
раствором.
В
результате
происходит деструкция клеточных мембран, других биополимерных комплексов и
высвобождение ДНК.
4. Центрифугируют пробирки с использованием центрифуги «Sigma 1-14» фирмы
«Sigma Laborzentrifugen» (Германия) при 13000 об/мин в течение 1 мин.
Растворенная ДНК в комплексе с белками выпадает в осадок.
5. Удаляют надосадочную жидкость.
Компоненты лизированного клинического материала остаются в растворе и удаляются.
6. Добавляют к осадку 300 мкл реактива «Проба-Рапид» фирмы «ДНКтехнология» (Россия), закрывают крышки пробирок и встряхивают пробирки на
вортексе в течение 5–10 сек.
7. Термостатируют пробирки при 98°С в течение 10 мин в термостате «Гном»
фирмы «ДНК-технология» (Россия).
При добавлении буферного раствора и термостатировании происходит диссоциация
белков от ДНК и высвобождение ее в раствор. В результате указанной процедуры
получается высокоочищенный препарат ДНК, свободный от ингибиторов реакции
амплификации.
8. Центрифугируют пробирки при 13000 об/мин в течение 3 мин.
9. Надосадочная жидкость, содержащая выделенную ДНК, готова к внесению в
реакционную смесь для амплификации.
3.2. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени
Принципиальной особенностью режима Real-Time PCR является мониторинг и
количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции, а также
автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов.
В реакционную смесь введены два ДНК-зонда (к двум аллелям исследуемого
полиморфизма), каждый из которых содержит флуоресцентный краситель на 5`-конце и
9
тушитель флуоресценции на 3`-конце. В исходном растворе фоновая флуоресценция
минимальна, но в результате проведения амплификации флуоресцентные красители
высвобождаются, что позволяет детектировать наличие в амплифицированной смеси того
или иного аллеля образца ДНК.
Генотипирование образцов проводили с использованием наборов фирмы «ДНКтехнология» (Россия), микропробирок фирмы «Greinerbio-one»(США) и детектирующего
амплификатора «ДТ-96» фирмы ДНК-технология» (Россия).
Состав реакционной смеси для ПЦР:
1. Taq-полимераза с 5`-нуклеазной активностью (растворена в буфере: 10 мМ HEPES;
pH 8,0; 100мМ KCl; 1% Tween-20; 5 мМ DTT; 50% глицерин)
2. Смесь для ПЦР (670мМ Tris-HCl (pH 8,8 при 25оС)
0,1% Tween-20, 2мМ dNTPs, 10мМ праймеров, 5мМ зондов)
3. Деионизованная вода
4. Образец ДНК
3.3 Общая схема проведения ПЦР
1. Денатурация
На первом этапе двойная спираль ДНК под действием высоких температур
расплетается, с образованием одноцепочечных молекул. Для этого реакционную смесь
нагревают до 92-95°С. Продолжительность этапа 1-2 минуты.
2. Отжиг
На втором этапе праймеры присоединяются к одноцепочечной ДНК-мишени. Отжиг
происходит в соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа, согласно которому в
любой молекуле ДНК количество аденина всегда равно содержанию тимина, а количество
гуанина — количеству цитозина. После отжига праймеровTaq-полимераза начинает
достраивание второй цепи ДНК с 3 '-конца праймера.
Помимо пары праймеров, комплементарных участку, содержащему исследуемый ген, в
реакционной смеси присутствуют дополнительные зонды, комплементарные внутреннему
участку гена (мутантному аллелю и аллелю дикого типа). На 5’- конце зонда располагается
флуоресцентная метка, испускающая флуоресценцию, на 3’- конце присоединен гаситель
флуоресценции. Специфические зонды связываются с исследуемыми областями ДНК по
принципу комлементарности.
10
3. Элонгация
На этапе элонгации температуру в реакционной смеси доводят до оптимума работы
Taq-полимеразы, что обеспечивает синтез второй цени ДНК.
Когда Taq-ДНК-полимераза, продвигаясь
по одноцепочечной матрице, достигнет
зонда, то произойдет его расщепление благодаря эндонуклеазной активности ДНКполимеразы.
После
расщепления
зонда
краситель
высвобождается,
и
сигнал
флуоресценции, соответствующий этому аллелю, растет. Дуплекс с зондом с одним
неспаренным нуклеотидом (второй аллель) имеет меньшую температуру плавления и не
разрушается, а отщепляется полимеразой целиком. По отношению уровней флуоресценции
от обоих зондов судят о наличии в пробе одного или другого аллеля.
Температурный цикл амплификации многократно повторяется, обеспечивая на каждом
цикле двукратное увеличение числа копий ДНК.
Результатом циклического процесса является экспоненциальное увеличение количества
специфического фрагмента ДНК, которое можно описать формулой:
А = М*(2n-n-1)~2n,где
А - количество специфических продуктов реакции амплификации;
М - начальное количество ДНК-мишеней;
n - число циклов амплификации.
4.Выход на «плато»
Процесс накопления специфических продуктов амплификации ограничен по времени,
затем его эффективность критически падает. "Эффектом плато" описывают процесс
накопления продуктов ПЦР на последних циклах амплификации, когда количество
ампликонов достигает 0,3-1 пмолей. Проведение дальнейшего анализа нецелесообразно.
3.4 Схема расчета компонентов ПЦР-смеси
Расчет компонентов ПЦР-смеси для VDR (на 1 образец)
Реагент
Количество (V1)
Деионизованная вода
6,9 мкл
Смесь для ПЦР для VDR
2,0 мкл
Taq-полимераза
0,1 мкл
Исследуемый образец (~30 нг ДНК /мкл)
1,0 мкл
Суммарный объем
10 мкл
11
При постановке реакции для N образцов количество Vсмеси=V1*( N+2)
3.5. Результаты научно-исследовательской работы:
Разработана диагностическая технология определения риска развития аллергических
заболеваний.
При изучении частоты встречаемости генотипов FokI, BsmI, TagI VDR у больных детей и в
контрольной группе были получены следующие результаты (табл. № 1).У больных детей
достоверно повышена частота встречаемости аллеля А в сайте BsmI гена VDR ( OR=1,81,
Р=0,04) и носительство гомозиготного А/А, гетерозиготного G/А генотипа (OR=2,03, Р=0,05
и OR=1,8, P=0,05 соответственно)
прогностического
маркёра
что даёт возможность рассматривать его в качестве
ассоциированного
с
риском
развития
аллергического
заболевания (уровень В). Как свидетельствуют клинические наблюдения,
эту группу
составили, в основном, дети с пищевой аллергией. При анализе частоты встречаемости
полиморфного варианта FokI гена VDR у детей с аллергическими заболеваниями и у
здоровых детей не выявлено различий как в отношении распределения аллелей, так и в
отношении распределения генотипов ( Р=0,22, Р=0,29). Аналогичные результаты были
получены и в отношении полиморфного сайта Tag1 гена VDR ( Р=0,08, Р=0,06). Результаты
статистического анализа продемонстрировали, что наиболее информативным маркёром
наследования у детей с аллергическими заболеваниями является аллель А против аллеля G
в сайте BsmI гена VDR. Обращает на себя внимание тот факт, что у здоровых детей чаще
обнаруживалось носительство мутантного гомозиготного генотипа G/G
полиморфного
сайта BsmI гена VDR, чем у больных детей (OR=0,39, Р=0,05). Можно предположить, что
носительство
данного
генотипа
аллергических заболеваний.
является
протективным
в
отношении
развития
12
Таблица 1.
Распределение частот аллелей и генотипов гена VDR у детей с аллергическими
заболеваниями и в контрольной группе
Частота аллелей
и генотипов
Аллели,
генотипы
Дети с аллергическими
заболеваниями (n=130)
Контрольная
группа (n=41)
OR [95% CI]
P
FokI (rs2228570)
A>G
Аллель A
0.460
0.378
1.40 [0.82-2.39]
0.22
Аллель G
0.540
0.622
0.71 [0.42-1.22]
0.22
Генотип A/A
0.241
0.122
2.29 [0.8-6.59]
0.29
Генотип G/A
0.437
0.512
0.74 [0.35-1.56]
0.29
Генотип G/G
0.322
0.366
0.82 [0.38-1.78]
0.29
BsmI (rs1544410)
A>G
Аллель A
0.443
0.305
1.81 [1.04-3.16]
0.04
Аллель G
0.557
0.695
0.55 [0.32-0.96]
0.04
Генотип A/A
0.138
0.073
2.03 [0.54-7.62]
0.05
Генотип G/A
0.609
0.463
1.80 [0.85-3.82]
0.05
Генотип G/G
0.253
0.463
0.39 [0.18-0.86]
0.05
TaqI (rs731236)
T>C
Аллель Т
0.569
0.451
1.61 [0.95-2.72]
0.08
Аллель С
0.431
0.549
0.62 [0.37-1.06]
0.08
Генотип Т/Т
0.276
0.220
1.35 [0.56-3.25]
0.06
13
Генотип С/Т
0.576
0.463
1.64 [0.78 -3.46]
0.06
Генотип С/С
0.138
0.317
0.34 [0.14- 0.84]
0.06
3.6 Сведения о патентовании: нет
3.7 Степень готовности разработки к внедрению: научно-исследовательская разработка
может быть внедрена в практику лечебно-профилактических учреждений, центров
здоровья, диетологических кабинетов лечебно-профилактических учреждений в Российской
Федерации в виде методических указанний по выявлению генетических полиморфизмов
рецептора витамина D.
3.8 Область применения разработки:
- здравоохранение: внутренние болезни, диетология, гастроэнтерология, аллергические
болезни, терапия, обучение студентов высших медицинских учебных заведений, курсантов
сертификационных и тематических циклов усовершенствования и специализации врачей по
диетологии, нутрициологии, аллергологии.
3.9.
Реализация в практике: клиника ФГБНУ «НИИ питания», кафедра диетологии
ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава
России, кафедра диетологии и нутрициологии ГБОУ ВПО «Российский национальный
исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России.
14
4. Заключение
Описанный способ опробован при обследовании и лечении 134 пациентов с
аллергическими заболеваниями в возрасте от 1 мес. до 14 лет ( 78 мальчиков и 56 девочек),
что позволило разработать индивидуальные ротационные диеты для каждого больно и
рекомендации по проведению диетотерапии у этого контингента пациентов.
Исследование проводилось на базе лаборатории клинической биохимии, иммунологии и
аллергологии и отделения гастроэнтерологии и гепатологии ФГБУ «НИИ питания» с
использованием спектрофотометра «Sunrise» Tecan (Австрия), хемилюминесцентного
анализатора CLA-1 Hitachi (США) и ПЦР-амплификатора ДТ-96 (Россия).
На основе предложенного способа выявления полиморфизма рецептора витамина D
сформированы
группы
риска
по
развитию
пищевой
аллергии,
разработаны
профилактические рекомендации по диетотерапии, что позволило добиться значительного
уменьшения
клинических
проявлений
заболевания,
снижению
лекарственных препаратов, повышению качества жизни больных.
эффективных
доз
15
Список литературы
1.Zhao CN, Fan Y, Huang JJ, Gao T, Wang C, Hou LH. The Association of GSDMB and
ORMDL3 Gene Polimorphisms With Asthma: A Meta-Analisis. Allergy Asthma Immunol Res.
2015 7 (2) 175-85.
2. Ortiz RA, Barnes KC. Genetics of allergic diseases. Immunol Allergy Clin North Am. 2015, 35
(1), 19-44.
3. Yucesoy B, Kashon VL.Johnson VJ. Lummus ZL. Fluharty K. Gautrin D. Carter A. Boulet
L.P. Genetic variants in TNFα, TGFB1, PTGS1 and PTGS2 genes are associated with
disocyanate-induced asthma. J Immunotoxicol.2015, 27, 1-8.
4.Tizaoui K. Kaabachi W. Hamzaoui A.Association of Single Nucleotide Polimorphisms in Tolllike Receptors Genes With Asthma Risk:A Systematic Review and Meta-analysis. Allergy Asthma
Immunol Res 2015, 7 ( 2 ), 130-40.
5.Фрейдин МБ, Пузырёв ВП. Синтропные гены аллергических заболеваний. Генетика,
2010,том 46, №2,с.255-261.
6.Bunyavanich S,Schadt EE. Systems biology of asthma and allergic diseases: a multiscale
approach. J Allergy Clin Immunol .2015, 135 (1), 31-42.
7. Saccone D, Asani F, Bornman L. Regulation of the vitamin D receptor gene by environment,
genetics and epigenetics. Gene, 2015, 13 pii S0378-1119 (15) 00159-6.
8.Barry EL, Rees JR, Peacock JL, Mott LA, Amos CI, Bostick RM, Burke CA. Baron JA. Genetic
variants in CYP2R1, CYP24A1, and VDR modify the efficacy of vitamin D3 supplementation for
increasing serum 25- hydroxyvitamin D levels in a randomized controlled trial. J Clin Endocrinol
Metab.2014, 99 (10), 133-7.
9.Gnagnarella P, Pasquali E, Serrano D, Raimondi S, Disalvatore D, Gandini S. Vitamin D
polimorphism and cancer risk: a comprehensive meta-analysis. Carcinogenesis, 2014, 35 (9),
1913-9.
10.Taiouri L, Ovcaric M, Curtain R, Johnson MP, Griffiths LR, Csurhes P, Pender MP, Lea RA.
Vaariation in the vitamin D receptor gene is associated with multiple sclerosis in Australian
population. J Neurogenet. 2005, 19 (1), 25-38.
11. Liu Z. Liu L. Chen X, He W, Yu X. Associations study of vitamin D receptor gene
polymorphisms with diabetic microvascular complication: a meta-analysis. Gene, 2014, 546 (1),610.
16
12.Wobke TK, Sorg BL, Steinhiber D. Vitamin D in inflammatory diseases. Front Physiol. 2014,
5, 244-256/
13. Gruber BM. The phenomen of vitamin D. Postery Hig Med Dosw. 2015, 69 (0), 127-39.