На правах рукописи Куликов Алексей Михайлович ОСОБЕННОСТИ ЭВОЛЮЦИИ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ И
реклама
На правах рукописи Куликов Алексей Михайлович ОСОБЕННОСТИ ЭВОЛЮЦИИ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ ПРИЗНАКОВ НА ПРИМЕРЕ БЛИЗКОРОДСТВЕННЫХ ВИДОВ ДРОЗОФИЛ 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук МОСКВА 2012 Работа выполнена в лаборатории генетики Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН Научный консультант – доктор биологических наук, профессор Митрофанов В.Г. Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Илья Артемьевич Захаров-Гезехус (ИОГен РАН) доктор биологических наук, профессор Елена Алексеевна Ляпунова (ИБР РАН) доктор биологических наук, доцент Гриценко Вячеслав Владимирович (ТСХА) Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН Защита состоится 18 января 2012 г. на заседании диссертационного совета Д002.238.01, созданного при Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, 26. Сайт: http://idbras.comcor.ru; E-mail: idbras@bk.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, 26, и на сайте http://idbras.comcor.ru Автореферат разослан________________2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.Б.Абрамова E-mail: ele0806@yandex.ru 2 Актуальность проблемы Неравномерность темпов эволюции впервые была отмечена Дарвином и позже нашла отражение в сформулированных представителями школы эволюционной палеонтологии правилах и законах. Они предполагают связь гиперболического роста биоразнообразия и объема биоты с ростом устойчивости живых систем, зависимость периодов бурного видообразования и интенсивного вымирания видов от глобальных климатических изменений, наличие периодов быстрого и медленного накопления эволюционно-значимой изменчивости в родословных видов на длительных интервалах геологического времени. Изменения темпов эволюции прямо или косвенно связаны с действием отбора под влиянием факторов внешней среды, и заметны на масштабных отрезках геохронологической шкалы. Все больше данных свидетельствует, что неравномерность темпов накопления эволюционно-значимой изменчивости характерна даже для относительно коротких временных промежутков, сопоставимых со средним временем эволюции вида, порядка нескольких млн. лет. Предполагается, что статусные, или эволюционно-значимые видовые признаки могут эволюционировать быстрее других, но остается неясным, насколько постоянной является скорость накопления видоспецифических различий по этим признакам и что определяет темпы накопления выявляемой изменчивости на морфологическом и молекулярном уровнях. До настоящего времени остается нерешенным ряд проблем эволюционной генетики, связанных с оценкой темпов и механизмов накопления эволюционной изменчивости. Среди них: применимость концепции «прерывистого равновесия» Гулда и Элдриджа, т.е. чередования периодов стазиса и быстрой эволюции, к эволюции конкретных видов, признаков и геномов; возможность распространения концепции Сингха «эволюции по быстрому пути» («Evolution in fast lane»), рассматривающей эволюцию последовательностей генов, экспрессия которых ограничена полом, на эволюцию более широкого круга морфологических признаков (например, быстро эволюционирующих признаков копулятивного аппарата самцов); влияние отбора на эволюцию признаков, непосредственно не связанных с адаптациями; существование специфических генетических механизмов, определяющих скорость и направление эволюции признака. Известно, что нарушение темпов эволюции молекулярных признаков, или «хода молекулярных часов», характерно как для разных последовательностей одного генома, так и для гомологичных последовательностей удаленных видов, дивергировавших на протяжении десятков млн. лет. Остаются открытыми вопросы о минимально необходимом времени для формирования таких нарушений, и о том, насколько сопоставимы механизмы, нарушающие равномерную скорость эволюции молекулярных и морфологических признаков. Экспериментальное исследование этих вопросов имеет принципиальное значение для проверки множества теоретических концепций эволюционной 3 биологии. В отношении молекулярной филогенетики и биоинформатики полученные оценки предоставят возможность для более точной калибровки «молекулярных часов», и, соответственно, построения более достоверных реконструкций эволюционной истории различных групп организмов. Кроме того, ответы на поставленные вопросы могут иметь практическое значение, т.к. позволят более точно прогнозировать влияние различных факторов, в том числе антропогенного воздействия, на микроэволюционные процессы в популяциях. Цель исследования: Оценка темпов накопления генетической изменчивости, выявляемой при анализе морфологических и молекулярных признаков, на модели близнецовых видов дрозофил группы virilis, а так же определение механизмов, влияющих на темпы накопления изменчивости данных признаков. Задачи: 1. Оценить скорость и характер накопления межвидовой изменчивости морфологических признаков за время дивергенции близнецовых видов на примере эволюционно-значимых количественных признаков формы копулятивного аппарата и крыловой пластины дрозофил группы virilis, выявить роль генетической изменчивости в дивергенции видов по эволюционно-значимым признакам. 2. Оценить скорость накопления видоспецифической изменчивости молекулярных признаков по данным анализа RAPD-маркеров и SNPмаркеров у видов дрозофил группы virilis. 3. Сопоставить темпы накопления изменчивости молекулярных и морфологических признаков. 4. На основе полученных данных провести анализ и верификацию различных концепций генетического контроля темпов эволюции на геномном и организменном уровнях. Научная новизна. Впервые определены количественные характеристики межвидовой изменчивости по форме копулятивного аппарата у дрозофил группы virilis, установлена морфофункциональная взаимосвязь между структурой быстро эволюционирующего копулятивного органа и половым отбором у дрозофил. Показано, что характер дивергенции дрозофил группы virilis по форме копулятивного аппарата и форме крыла существенно различается. Представлены подтверждения концепции «эволюции по быстрому пути» признаков формы копулятивного аппарата дрозофил по сравнению с другими количественными признаками, в том числе признаками формы крыловой пластины. Эволюция признаков копулятивного аппарата самцов имеет направленный характер, т.е. вектор изменчивости по большинству количественных признаков формы органа сохраняется в ряду монофилетических видов. Эволюция признаков формы крыла не направлена и связана с адаптациями к активному полету. Получено экспериментальное подтверждение концепции Добжанского об эволюционной роли хромосомных перестроек для накопления генетической 4 изменчивости по эволюционно-значимым признакам. Впервые в эксперименте получено подтверждение концепции эволюции доминантности Фишера, как составной части эволюции генетической архитектуры, реализующейся на эволюционных отрезках в несколько млн. лет и более. Феномен эволюции доминантности объясняет направленный характер и неравномерный темп эволюции признаков формы копулятивного аппарата самцов дрозофил и в более общем виде – направленность и неравномерный темп эволюции количественных признаков. Впервые показан неравномерный темп накопления молекулярной изменчивости в родословных близкородственных видов. Подтверждена взаимосвязь двух важнейших концепций молекулярной эволюции – неравномерности хода молекулярных часов и мозаичности геномов. Для проверки этого вывода нами впервые разработан метод прямого учета индекса дисперсии как меры равномерного хода молекулярных часов, учитывающий одновременно и поправку Гилеспи на популяционно-генетические факторы, нарушающие ход молекулярных часов, и поправку, связанную с недоучетом множественных и обратных замен в сравниваемых последовательностях (индекс инфляции Балмера). Впервые экспериментально показано, что неравномерный темп эволюции морфологических и молекулярных признаков опосредован различными механизмами – действием отбора и механизмов эволюции доминантности в первом случае и действием генетико-автоматических процессов во втором. Научно-практическая значимость работы Работа носит фундаментальный характер и посвящена анализу механизмов нарушения равномерного хода эволюционной дивергенции видов, действующих на молекулярном, морфологическом и поведенческом уровнях. Представления о генетических механизмах, определяющих темп и направленность эволюционного процесса, являются необходимыми для оценки биоразнообразия и устойчивости животных и растительных сообществ, создания прогностических селекционных и эволюционных моделей. Впервые проведена работа по сравнению темпов эволюционных изменений молекулярных и морфологических признаков на комплексе близнецовых видов со сравнительно короткой эволюционной историей. Выявленные в ходе работы закономерности накопления изменчивости по количественным признакам определяют систему общих требований к сравниваемым видам, используемым в качестве модели для изучения темпов эволюции. В частности, удобной моделью являются монофилетические виды, имеющие разное время существования в качестве независимого таксона. Предложен новый метод оценки скорости накопления молекулярной изменчивости, обладающий высокой точностью и применимый для близкородственных видов. Метод может быть использован для широкого спектра молекулярно-филогенетических исследований. 5 Основные положения, выносимые на защиту 1. Форма копулятивного аппарата самцов дрозофил группы virilis эволюционирует гораздо быстрее, чем признаки крыла. Действие отбора на этот признак осуществляется через брачное поведение. Изменчивость признаков формы крыловой пластины дрозофил группы virilis отражает адаптацию дрозофил к полету и не связана с дивергенцией данной группы. 2. Накопление видоспецифической изменчивости связано в наибольшей степени с видоспецифическими инверсиями. 3. Степень доминантности не постоянна, она меняется под действием отбора, связана с эпистатическими межлокусными взаимодействиями и прямо зависит от продолжительности эволюции данного вида. 4. Темп накопления изменчивости морфологических и молекулярных признаков на относительно коротких временных отрезках неравномерен. 5. Причины неравномерности темпов накопления изменчивости для обеих групп признаков различны: в первом случае они связаны с отбором, во втором – с действием генетико-автоматических процессов. Внедрение результатов исследования в практику Работы автора представлены на сайте «Проблемы эволюции» (http://www.evolbiol.ru/) и используются студентами Государственных Университетов, а также аспирантами академических институтов, при подготовке по курсу «Теория эволюции» в качестве дополнительной литературы. Степень личного вклада автора Автор непосредственно участвовал в проведении всех экспериментов, на всех этапах: планирование и проведение эксперимента, оценка полученных результатов, статистическая обработка, создание новых оценочных алгоритмов. Апробация работы. Результаты исследований и основные положения работы доложены и обсуждены на конференциях: 16th European Drosophila Res. Conf., Sept.29 - Oct. 2, 1999, Zurich. Switzerland; III Съезд ВОГиС ″Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития″, 6-12 июня 2004, Москва, 2004; 45th Annual Drosophila Research Conference, Washington, DC. 2004; 46th Annual Drosophila Research Conference, San-Diego, California March 30 – April 3, 2005; 47th Annual Drosophila Research Conference, Houston Texas 29.03-02.04,2006; 48th Annual Drosophila Research Conference Philadelphia, Pennsylvania March 7-11, 2007; 49th Annual Drosophila Research Conference San Diego, California, April 2–6, 2008; Genetics - understanding living systems. XX International congress of genetics. Berlin, Germany, July 12-17, 2008; 50th Annual Drosophila Research Conference, Chicago, Illinois, March 4-8, 2009; V съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Москва, 21-28 июня 2009 г., 51st Annual Drosophila Research Conference, April 7-11, 2010, Washington. Публикации Опубликовано 19 работ по теме диссертации, в том числе 16 в журналах, рекомендованных Перечнем ВАК. Объем и структура диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения и 6 списка цитированной литературы. Общий объем диссертации составляет 315 страниц, основной текст изложен на 262 страницах, включая 37 таблиц и 33 рисунка. Список цитированной литературы составляет 924 работы. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Систематическое положение видов изучаемой группы. 11 видов группы virilis относятся к подроду Drosophila рода Drosophila, разделенных на две филады: virilis (D. virilis (Vi), D. lummei (Lu), D. americana (Am), D. novamexicana (No)) и montana (D. flavomontana (Fl), D. montana (Mo), D. lacicola (La), D. borealis (Bo), D. kanekoi (Ka), D. ezoana (Ez), D. littoralis (Li)). За исключением синантропного вида D. virilis, остальные виды группы обитают в зонах умеренного и субарктического климата Евразии и Северной Америки. Природные популяции D. virilis обитают в субтропических лесах Южного Китая, в зоне обитания предкового вида группы. В работе использовано 34 изосамковые линии 11 видов дрозофил группы D. virilis. Оценка внутри- и межвидовой изменчивости признаков формы копулятивного аппарата самцов была проведена на 25 линиях дрозофил группы virilis 11-ти близнецовых видов дикого типа, 15-30 образцов на линию, по 36 морфометрическим признакам (МП, рис. 1). Всего было проанализировано 278 препаратов. Морфометрический анализ проводили по фотографиям препаратов, сделанным в режиме сканирования на электронном микроскопе Jen-100C. Во избежание «эффекта шкалы» мы использовали индексы морфометрических показателей (в дальнейшем ИМП, или индексы), определяя их как отношение данного МП к МП 1. эдеагус аподема парамеры Рис. 1 Схема промеров копулятивного аппарата самца дрозофилы Для анализа изменчивости признаков формы копулятивного органа самцов у межвидовых гибридов от скрещиваний трех линий D. lummei и линии D. novamexicana, с одной стороны, и линии D. virilis с рецессивными маркерами на аутосомах, с другой, были изготовлены и проанализированы 206 препаратов, от 15-и до 28-и препаратов на линию и на каждый из вариантов межвидового скрещивания. Гибридные самцы F1 от скрещиваний D. lummei × D. virilis были использованы для получения потомства из возвратных скрещиваний от самок D. virilis 160 и оценки участия хромосом в формировании видоспецифических признаков копулятивного аппарата самцов. В ходе этой работы было проанализировано 440 препаратов: 25 от самцов F1 из прямого скрещивания 7 ♂ D. lummei x ♀D. virilis, 321 от самцов Fb – потомков F1 от прямого скрещивания, и 94 от самцов Fb – потомков F1 от обратного скрещивания. Анализ внутри- и межвидовой изменчивости по признаку наличия микрохет на эдеагусе самцов дрозофил, а также участия хромосом в формировании данного признака, был проведен на 694 препаратах половых органов, полученных от 25 линий 11 близнецовых видов группы virilis, от гибридных самцов F1 из скрещиваний D. lummei 200 × D. virilis 160 и самцов Fb из возвратных скрещиваний самцов F1 на самок D. virilis 160. Эффективность брачных ухаживаний в кон- и гетероспецифичных скрещиваниях оценивали по доле успешных копуляций из числа пар, осуществляющих стадию «садки», и по длительности копуляции. Было оценено по 30 пар в скрещиваниях видов D. virilis, D. lummei и реципрокных межвидовых скрещиваниях. Форму крыловой пластины анализировали с помощью метода геометрической морфометрии (TPS v.1.37) с использованием 14 опознавательных точек (лэндмарок), маркировавших места пересечения жилок крыла и окончания их на краю крыла. Всего для анализа было использовано 1020 правых крыльев из 17 линий 11 видов дрозофил группы virilis, по 30 крыльев на линию. Статистическая обработка результатов проведена с использованием программы “Statistica 6.1”. QTL-картирование полученных признаков проводили с помощью программы “Map manager QTX 0.30”, при выявлении значимых ассоциаций хромосом во всех случаях использовали значения χ2критерия LRS-статистики для общего эффекта ассоциации P < 10-5 и для собственно эффекта взаимодействия P < 10-2 и post-hoc сравнениями в Главной линейной модели дисперсионного анализа. Для сравнения полиномиальных распределений использовали критерий Кульбака, в том числе для сравнения разных линий одного вида. Для поиска генов-кандидатов на микрохромосоме D. virilis использовали известные по литературным данным последовательности SOP-энхансера, последовательность скаффолда 13052 D. virilis, соответствующего микрохромосоме, и программу “Vector NTI Advance 9.1”. Экстракция и амплификация ДНК. ДНК экстрагировали из гомогената самцов стандартным фенол-хлороформным методом. Для проведения ПЦРреакции использовался термоциклер PCH-3 (Techne, Великобритания). Условия амплификации были оптимизированы для каждого варианта ПЦР. Всего использовали 14 RAPD-праймеров, давших наиболее воспроизводимые видоспецифические паттерны, и одну пару праймеров, специфичных для амплификации фрагментов 1-го и 2-го экзонов и 2-го интрона гена Dras1 дрозофилы. Продукты реакции анализировались методом электрофореза в 2% агарозном геле. Секвенирование фрагмента гена Dras1 проводили дважды, с использованием прямого и обратного праймеров, набора ABI PRISM и ДНКсеквенатора 375А (Applied Biosystems, США). Полученные последовательности размещены в банке данных под номерами EF212396-EF212406. 8 Для анализа RAPD-маркеров составляли бинарные матрицы представленности маркеров в образцах и определяли генетические расстояния между видами и линиями по Нею и Ли (1979). Дальнейший анализ осуществляли методами кластерного анализа (UPGMA и NJ) и главных компонент, с использованием программ "PHYLIP" и "NTSYS". Филогенетический и молекулярный анализы по последовательности ДНК были проведены с использованием программы “MEGA version 4.1”. При анализе равномерности накопления замен в родословных изученных видов дрозофил использовали программы “PAUP 4.0” (Swofford, 1998), “MODELTEST 3.7” (Posada, Crandall, 1998), “LINTREE” Takezaki (Takezaki et al., 1995) и “MEGA 4.1”. Все расчеты индекса дисперсии и критерия значимости χ2 его отклонения от единицы проводились в электронных таблицах “MS Excel”. РЕЗУЛЬТАТЫ 1. ПРИЗНАКИ КОПУЛЯТИВНОГО АППАРАТА ДРОЗОФИЛ ГРУППЫ VIRILIS. 1.1. Межвидовая изменчивость признаков формы. Размер фаллической части структуры, без учета аподемы, колебался в среднем от 0,136 мм (D. novamexicana) до 0,194 мм (D. kanekoi). Заметна общая тенденция уменьшения размера органа у видов D. lummei, D. novamexicana, D. americana, по сравнению с D. virilis, и наоборот, увеличение у видов филады montana. Эти результаты коррелируют с данными по морфометрии торакса (Spicer, 1993; Pitnick et al., 1995), и не совпадают с изменчивостью длины сперматозоидов представителей данной группы видов (Pitnick et al., 1995). Рис.2 Направленная эволюция признаков формы копулятивного аппарата самцов в родословных видов дрозофил группы D. virilis. По результатам анализа исследованных признаков в выборках из 11 видов и 2-х подвидов дрозофил построены схематические изображения 9 проекций полового органа самцов для каждого вида. На рис. 2 приведены последовательные изменения признаков формы копулятивного аппарата в филогенетических линиях lummei, montana и kanekoi. Ширина каждого контура определяет 95%-ый доверительный интервал морфометрических показателей. Контуры предкового вида и вида-потомка на каждом этапе дивергенции наложены друг на друга. Стрелки показывают основные направления смещения морфологических структур. В каждой субфиладе происходили преимущественно однонаправленные смещения. Оценка зависимости различий по исследованным признакам от факторов “принадлежность виду” и “принадлежность линии” была проведена с помощью дисперсионного анализа (MANOVA) по всей совокупности данных. В качестве гнездового использовали фактор “принадлежность виду”. Значение RRao, многомерного аналога F-критерия (RRao=17.94; df1=385; df2=2294; p<<0.001), показывает высокую значимость влияния переменной “принадлежность виду” на устойчивость различий по совокупности исследованных признаков. При определении компонент дисперсии каждого индекса, факторы “принадлежность виду” и ”принадлежность линии” интерпретировались как случайные переменные. Компоненты дисперсии наиболее значимых ИМП (Fdf1,2 >50), определяемые переменной “принадлежность виду”, принимали на себя в среднем 60-80% общей дисперсии. Доля остальных индексов в общей дисперсии снижалась до 20%. Оценка их значимости подтвердила достоверное участие 32 ИМП из 35 в формировании видоспецифического паттерна. Индексы аподемы имеют слабую видовую специфичность. Полученные результаты свидетельствуют, что в ходе эволюции близкородственных видов дрозофил группы virilis происходит преимущественно направленное накопление видоспецифической изменчивости по признакам формы копулятивного аппарата самцов. Post-hoc сравнения в парах видов С помощью post-hoc тестов Дункана (Duncan) и Шеффе (Scheffe) была оценена значимость различий видов по исследуемым признакам, и выделены группы видов со сходными групповыми средними по каждому признаку. Выявленная картина объединения видов по разным признакам оказалась неслучайной, и обладала следующими характерными чертами: по 11-ти ИМП вид D. virilis отличается от всех остальных. При этом 10 признаков имеют крайние значения по сравнению с остальными видами; еще по восьми ИМП этот вид, обладая крайними значениями признаков, тем не менее, оказался сходен с другими; у всех остальных видов независимость по групповым средним и их крайние характеристики встречаются значительно реже. Сходство средних значений ИМП при парных сравнениях позволяет выделить наиболее близкие по признаку формы фаллоса пары видов: D. lacicola – D. borealis (нет различий по 24 ИМП), D. lacicola – D. littoralis (по 20 ИМП), D. americana americana – D. americana texana, D. lacicola – D. montana и D. borealis –D. montana (по 19 ИМП), D. lummei – D. novamexicana (по 18 10 ИМП). Эти пары в большинстве случаев представляют собой сочетание близкородственных видов дрозофил, согласно представлениям о филогенетических отношениях дрозофил группы virilis. Можно отметить также особое положение вида D. ezoana, расположенного по числу сходных ИМП между представителями филады virilis, за исключением собственно вида D. virilis, и филады montana. Эволюционно наиболее древние и наиболее молодые виды оказываются в диаметрально противоположных группах, выявляемых в ходе апостериорных сравнений, т.е. абсолютное большинство признаков эволюционируют направленно. Приведенные данные подтверждают, что степень видоспецифических различий по признакам, описывающим форму копулятивного органа самцов, в целом соответствует представлениям о филогенетических отношениях видов данной группы. Накопление эволюционно-значимой изменчивости в разных эволюционных линиях происходило преимущественно в одном направлении. 1.2. Внутривидовая изменчивость признаков формы копулятивного аппарата дрозофил группы virilis Для оценки межлинейной изменчивости признаков был проведен анализ влияния фактора “принадлежность линии” на внутривидовую изменчивость признака отдельно для каждого из видов: D. virilis, D. americana, D. lummei, D. borealis, D. montana и D. littoralis. Форма фаллоса имеет хорошо выраженную внутрилинейную специфику для каждого из исследованных видов. Количество ИМП, достоверно влияющих на фактор «Линия», менялось у разных видов от 11 до 21. Сходного для изученных видов набора признаковмаркеров межлинейной изменчивости среди ИМП парамеров и эдеагуса обнаружить не удалось. Так, у D. virilis основные межлинейные различия связаны с размерами и формой аподемы, у D. littoralis – эдеагуса, у остальных исследованных видов они распределены по всем частям органа. Значимость показателя межлинейной изменчивости λWilks определяли по наборам ИМП, включающим только достоверно различающиеся признаки. У видов D. littoralis (RRao, Form 2 =26,25; df1=13; df 2=5; p=0.001) и D. americana (RRao, Form 2 =38.96; df1=12; df 2=5; p<0.001) значения λWilks, трансформированные в показатель RRao, оказались высокими, значительно превысив общие характеристики межвидовых различий. Эти данные подтверждают, что в популяциях исследованных видов сохраняется значительная изменчивость по различным признакам формы копулятивного аппарата, у разных видов эта изменчивость может зависеть от разных морфологических структур органа. 1.3. Соотношение межвидовой и внутривидовой изменчивости в группах скоррелированных признаков. Для оценки латентной факторной структуры, определяющей сопряженную внутри- и межвидовую изменчивость индексов, мы предприняли разведочный факторный анализ данных. Критерии Каттела и Кайзера позволяют выделить от 4-х (первый) до 7 (второй) главных компонент и 6 главных факторов, полученных разными способами факторного анализа. 11 Сходство нагрузок главных компонент и главных факторов свидетельствует об объективности выделенных групп признаков, принимающих на себя основную долю изменчивости. Результаты анализа показывают сходство вторичных факторных нагрузок, независимо от метода выделения главных факторов (табл. 1) и метода вращения факторных осей. Табл. 1. Группы скоррелированных признаков формы копулятивного аппарата, выделенные с помощью ортогональных методов вращения. Способ выделения I, II, III IV Фактор 1 Фактор 2 6, 7, 8, -10, -11, 2, 10, -12, 14, 17, 22, 11, 13, 23, 24, 34 33 6, 7, -10, -11, 28, 29, 14, 17, 22, 23, 30, 31, 24, 34 32, 35 Фактор 3 28, 29, 30, 31, 32, 35 10, 11, 13, 33 Фактор 4 4, 5, 6 Фактор 5 15, 19, 21, 25 Фактор 6 7, 8, 9 8, 9 4, 5, 6 15, 21 Principial axis factoring (I), Iterated communalities (MINRES) (II), Communalities=multiple Rsquare (III) и Maximum likelihood factors (IV). В таблицу внесены ИМП, нагрузки которых на выявленные факторы превышают значения |0,5|. Жирным шрифтом выделены значения > |0,7|. ИМП, вошедшие с отрицательными нагрузками в данный фактор, занесены со знаком “минус”. Анализ итоговых нагрузок ИМП на факторные оси позволил выделить следующие группы корреляций: 1-й фактор связан с сопряженной изменчивостью показателей высоты различных участков эдеагуса, положения “вершины” эдеагуса относительно точки 1 и длины парамеров; 2-й – ИМП 2, определяющего кривизну передней части эдеагуса над шипом, показателей высоты центральной и задней части эдеагуса и ИМП 15, характеризующего кривизну нижней передней части эдеагуса; 3-й определяет скоррелированную изменчивость характеристик аподемы; 4-й – независимую изменчивость ИМП, определяющих высоту передней половины эдеагуса; 5-й фактор определяет связь показателя кривизны нижней передней части проекции эдеагуса (ИМП 15), ширины парамеров у основания (ИМП 19) и показателей высоты парамеров (ИМП 21 и ИМП 25); наконец, 6-й фактор контролирует изменчивость показателей высоты среднего участка тела эдеагуса (ИМП 7-9). В общей сложности 28 индексов проявили высокие значения корреляции с выявленными факторами, войдя со значительным весом в факторные нагрузки. ИМП 3, 16, 18, 20, 26, 27 и 36 не входят ни в одну из групп корреляций. При этом по данным дискриминантного анализа индексы 3, 18 и 36 вошли в состав хороших дискриминаторов, полученных с помощью методов последовательного отбора переменных – статистик F-включения или Fудаления. Среди признаков, вошедших в состав факторных структур, ИМП 2, 5, 11, 14, 33 и 34 выделяются как хорошие дискриминаторы. Кроме того, признаки 6, 7, 13 и 23 всегда отбираются в случае использования статистики F-удаления, и признаки 15 и 24 – в случае использования статистики F-включения. С учетом результатов post-hoc сравнений, следует отметить, что все ИМП, составляющие 1-ю факторную ось, определяют основные отличия D. virilis от остальных 12 видов, а ИМП аподемы, входящие в состав 3-го фактора, определены как сходные в подавляющем большинстве сравниваемых пар. Сходство по ИМП, входящим в состав 2-го и 4-го факторов, встречается в среднем в 4-6 раз чаще при сравнении видов внутри филад virilis и montana, чем между этими филадами. При анализе факторных структур внутривидовой изменчивости у видов D. virilis, D. lummei, D. montana и D. borealis были выделены общие для этих видов характеристики выявленных коррелирующих групп признаков. 1. Признаки объединены по принципу топологической близости и количество групп скоррелированной изменчивости больше, чем в случае анализа межвидовой изменчивости. 2. Индексы аподемы всегда входят в 1-й или 2-й факторы практически в полном составе. 3. ИМП, определяющие характеристики высоты проекции эдеагуса, могут быть организованы в 2-3 группы корреляции и часто объединены с ИМП 2, определяющим кривизну передней части эдеагуса над шипом. 4. Характеристики парамеров (ИМП 21-24) всегда представлены в факторной структуре в виде одной – двух корреляционных плеяд, не ассоциированных с ИМП эдеагуса и аподемы. Сопоставляя меж- и внутривидовые факторные структуры, можно отметить, что прослеживается «модульная» организация эволюционирующего органа – эволюционно-значимая изменчивость независимо накапливается в разных, пространственно разобщенных частях органа, по-разному в разных эволюционных линиях. С этим же связано и «укрупнение» групп корреляции при переходе к межвидовой изменчивости – отбор подхватывает лишь часть изменчивости, как правило, ограниченной тем или иным компартментом. Изменчивость, связанная с признаками эдеагуса и парамеров, определяет преимущественно межвидовые различия. Изменчивость, связанная с признаками аподемы, определяет в основном внутривидовую изменчивость. Факторы 2, 4 и 6 включают в себя как внутри - так и межвидовую дисперсию. Ряд индексов, входящих в состав факторных структур внутривидовой изменчивости (3, 16, 18, 36), не скоррелированы с другими индексами в составе факторных структур межвидовой изменчивости, что свидетельствует об их качественном изменении на видовом уровне. По признакам формы копулятивного аппарата были рассчитаны расстояния Махаланобиса, позволяющие количественно оценить расхождение между видами и линиями. Кластерный анализ был проведен по полученным расстояниям методами кластеризации UPGMA и Варда (рис. 3а). Виды группы montana кластеризуются отдельно от видов D. lummei, D. americana и D. novamexicana. Вид D. virilis кластеризуется отдельно от всех остальных видов, а D. kanekoi – близок к видам D. montana, D. flavomontana, D. lacicola, D. borealis и D. littoralis, но кластеризуется отдельно от них. D. ezoana близок к D. kanekoi по положению на дендрограмме, но в зависимости от способа кластеризации может быть равноудаленным от подгрупп montana и lummei, располагаясь при этом ближе к ним, чем к D. virilis. 13 Кластерный анализ, проведенный по всей совокупности используемых линий, в основном подтвердил отмеченную для видов степень сходства по форме копулятивного аппарата (рис. 3б). Отметим, что две линии D. littoralis имеют существенные различия, и независимо от способа кластеризации располагаются на дендрограмме на значительном удалении друг от друга. а б Рис. 3 Дендрограммы UPGMA, полученные для видов (а) и линий (б) дрозофил группы virilis по признакам формы копулятивного аппарата. Сравнение полученной для видов группы virilis дендрограммы c филогенетическим деревом, построенным на основании анализа пяти последовательностей ядерных и митохондриальных генов (см. раздел «Оценки 14 степени родства видов по молекулярным последовательностям») показывает топологическое сходство полученных деревьев. Отдельные эволюционные ветви деревьев различаются по длине от 11 до 43%, что приводит к единственному топологическому отличию: на представленной дендрограмме вид D. virilis находится за пределами своей собственной филады как внешний по отношению ко всем видам. В целом, приведенные результаты факторного, дискриминантного и кластерного анализов хорошо подтвердили выводы, сделанные по результатам дисперсионного анализа ИМП. На протяжении всего времени дивергенции видов группы virilis форма копулятивного органа самцов была эволюционно значима и менялась направленно: происходило закономерное, но независимое в эволюционных линиях видов субфилад lummei, kanekoi и montana укорочение парамеров и смещение наиболее высокой точки дорсальной части эдеагуса в латеральном направлении. 1.4. Эволюция доминирования признаков формы копулятивного органа самцов дрозофил группы virilis. Работа была проведена по 36 количественным признакам формы полового аппарата самцов: D. lummei 200, 1100 и 1109, D. novamexicana, D. virilis 160, самцов F1 из скрещивания ♂D. lummei200,1100,1109 × ♀D. virilis, самцов F1 из скрещивания ♂D. novamexicana × ♀D. virilis, самцов Fb с генотипом XVi/YVi, AVi/ALu200, самцов Fb с генотипом XVi/YLu200, AVi/ALu200. Статус признака определяли по результатам post-hoc сравнений в Главной линейной модели дисперсионного анализа. Основные результаты представлены в табл.2. Табл.2 Доля признаков с различной степенью доминирования в скрещиваниях . Статус признака DVi+sDVi DLu+sDLu N ID Ns Σ Скрещивание, дизайн половых хромосом No x Vi XViYNo Lu200 x Vi XViYLu Lu1109 x Vi XViYLu Lu1100 x Vi XViYLu Lu200 x Vi XLuYVi Lu200 x Vi XViYVi 1712+5* 51+4* 3 8 5 38 7 9 3 11 8 38 8 7 1 13 9 38 12 5 2 11 8 38 7 11 4 10 6 38 8 10 1 8 11 38 DVi+sDVi – доминирование и сверхдоминирование признаков D. virilis; DLu+sDLu – доминирование и сверхдоминирование признаков D. lummei или D. novamexicana; N – новый статус признака, ID – промежуточное доминирование; *сумма в надстрочнике – количество признаков, проявляющих доминирование по данному фенотипу, в том числе: доминировавших в скрещиваниях No × Vi и Lu × Vi, уникальных только для скрещивания No × Vi. Выявлены следующие закономерности: 15 1. Доля признаков у потомства от прямого и обратного скрещиваний D. lummei × D. virilis, доминирующих или даже сверхдоминирующих по фенотипу D. virilis, примерно соответствует доле рецессивных признаков; 2. У гибридов от скрещивания D. virilis × D. novamexicana существенно возрастает доля признаков, имеющих доминирование родительского фенотипа D. virilis, по сравнению с гибридами D. virilis/D. lummei. Гомологичные признаки, имеющие у гибридов D. lummei/D. virilis доминирование D. virilis, сохраняют этот статус и в скрещиваниях ♂D. novamexicana × ♀D. virilis. Признаки, имеющие доминирование второго родительского фенотипа, D. lummei или D. novamexicana, в основном не сохраняют преемственности своего статуса в разных скрещиваниях. То есть, признаки, потерявшие на данном этапе дивергенции доминантный статус, оставались рецессивными и на более поздних этапах дивергенции. Наоборот, доля вновь возникающих доминантных признаков у молодых видов снижалась одновременно с уменьшением времени независимой эволюции молодого вида; 3. В среднем, 35% признаков проявляют сходную степень доминирования в скрещиваниях ♂D. lummei x ♀D. virilis и ♂D .novamexicana x ♀D. virilis, тогда как при сравнении скрещиваний различных линий D.lummei в направлении ♂D. lummei x ♀D. virilis сходством обладают уже 53% признаков. При этом степень доминирования индивидуальных признаков в скрещиваниях D. virilis с линиями D. lummei, имеющими происхождение из разных частей ареала обитания, может существенно различаться; 4. Потомство F1 от скрещивания ♂D. lummei200 × ♀D. virilis имеет генотип (XViYLu АViАLu), идентичный полностью гетерозиготному по аутосомам потомству Fb от возвратного скрещивания самцов F1 с самками D. virilis. Тем не менее, 17 из 38 признаков показывают достоверную разницу по доминированию для самцов F1 и Fb, что позволяет предположить значимое влияние на экспрессию этих признаков отцовского генотипа; 5. Состав половых хромосом у гибридных самцов от скрещиваний D. lummei200 × D. virilis влияет на степень доминирования признаков. Замена Ххромосомы D. lummei на Х-хромосому D. virilis в возвратном скрещивании самцов F1 из потомства скрещивания ♂D. virilis x ♀D. lummei 200, на самку D. virilis, приводит к изменению статуса доминирования половины из всех проанализированных признаков. Тем не менее, соотношение признаков, проявляющих доминирование родительского генотипа D. virilis к признакам, проявляющим доминирование генотипа D. lummei, практически не меняется: 7/11 для самцов F1 от скрещивания ♂D. virilis x ♀D. lummei 200, и 8/10 для самцов F2 от возвратного скрещивания. Результаты анализа ИМП хорошо подтверждаются многофакторными методами анализа, учитывающими скоррелированную изменчивость, что существенно повышает надежность выводов. Для примера приведены распределения вторичных признаков гибридных и родительских форм в пространстве гомологичных факторных структур (Ф1 - большая часть 16 признаков полового аппарата, кроме аподемы; Ф2(3) – признаки аподемы), для скрещиваний Vi × No (рис.4 а) и Vi × Lu200 (рис.4 б). Хорошо видно доминирование фенотипа D. virilis в первом случае, и D. lummei во втором, в пространстве значений 1-го, наиболее весомого фактора. Полученные результаты свидетельствуют, что в филогенетической ветви D. lummei → D. novamexicana происходило накопление рецессивной изменчивости, причем преимущественно из-за потери доминирования гомологичных признаков у эволюционно более молодого вида. 3 2.0 а 1.5 б 2 1.0 1 ФАКТОР2 ФАКТОР3 0.5 0.0 -0.5 0 -1 -1.0 -1.5 -2 -2.0 -2.5 -2.5 Lu 200 Vi 160 F1 F1 Vi 160 No -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 -3 -2.5 ФАКТОР1 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 ФАКТОР1 Рис. 4 Распределение родительских и гибридных F1 генотипов в плоскости факторов 1 и 2: а – скрещивание ♂No × ♀Vi; б – скрещивание ♂Lu200 × ♀Vi. Несмотря на статусную роль признаков формы копулятивного аппарата, в популяциях D. lummei сохраняется значительный полиморфизм по степени доминирования данных признаков, что дополняет сделанное выше наблюдение о сохраняющемся полиморфизме этих признаков в географически удаленных популяциях разных видов дрозофил. Наконец, состав половых хромосом у гибридных самцов влияет на степень доминирования признаков. Факторный анализ максимизирует влияние половых хромосом: в реципрокных скрещиваниях F1 замена ХVi на ХLu и Y-хромосомы в противоположном направлении приводит к двукратному снижению доли объясненной изменчивости, проявляющей доминирование фенотипа D. virilis (с 9.6 до 4.5%), и двукратному увеличению доли изменчивости, проявляющей доминирование фенотипа D. lummei (с 27 до 48%). Наименьшей долей изменчивости, приходящейся на признаки, проявляющие доминирование фенотипа D. lummei, и наибольшей – фенотипа D. virilis, обладают самцы FbXViYVi, несущие обе половые хромосомы D. virilis. Эти результаты хорошо подтверждают гипотезу Фишера о механизмах эволюции доминирования за счет эпистатической изменчивости (подбор модификационных, т.е. регуляторных систем, повышающих степень доминирования эволюционно-значимых признаков). 1.5. Хромосомная локализация признаков формы копулятивного аппарата самцов дрозофил группы virilis Используемые для оценки формы признаки могут иметь сходную изменчивость, определяемую одним и тем же набором локусов. Поэтому для 17 выявления таких групп признаков мы провели факторный анализ изменчивости, характеризующий все используемые генотипы. По результатам анализа методом максимального правдоподобия, наиболее значимая факторная структура представлена признаками длины парамеров (ИМП 24, 25 и 26) и соотношения длины и максимальной ширины парамеров. Структура 2-го фактора определена исключительно признаками аподемы. В состав 3-го фактора входят преимущественно показатели формы дорсальной поверхности центральной и задней части фаллоса – ИМП 8-16 и индексы 13/14, 15/16. Топологически близкие показатели формы дорсальной поверхности передней части фаллоса – ИМП 4-7 и ИМП 14 и 16 образуют факторную структуру 4-го фактора. В составе структуры 5-го фактора наибольшими весами обладают ИМП 17-20, определяющие форму вентральной поверхности фаллоса. Выявленные факторные структуры хорошо соответствуют показанным выше наиболее значимым факторам, определенным для внутривидовой изменчивости видов D. virilis и D. lummei. Роль межвидовой изменчивости в составе факторных нагрузок иллюстрирует распределение генотипов Fb, представленных в анализируемой выборке, в пространстве значений факторов (рис. 5). Maximum likelihood factors, Varimax normalized 4 3 Fb 2 "virilis" Fb 1 "virilis" F1 cross 2 F1 cross 1 Другой 2 1 FACTOR4 0 -1 -2 -3 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 Самцы из возвратного скрещивания: Fb2 “virilis” – XVi/YVi, AVi/AVi; Fb2 “virilis” – XVi/YLu, AVi/ALu; Другой – частично гомозиготные по аутосомам D. virilis. Самцы F1: F1 cross 2 – XLu/YVi, AVi/ALu; F1 cross 1 – XVi/YLu, AVi/ALu FACTOR1 Рис. 5. Распределение генотипов из возвратных скрещиваний ♀Vi × ♂Lu/Vi в плоскости факторов 1, 4. Альтернативными генотипами в составе выборки являются полностью гетерозиготные самцы, обладающие в полной мере наборами аутомосом от обоих родительских видов, и гомозиготные по геному D. virilis самцы. Облака изменчивости переменных по 1-му и 4-му факторам, характеризующие полностью гетерозиготных и гомозиготных самцов, практически не 18 пересекаются. Промежуточные варианты при этом плотно занимают все пространство между двумя крайними вариантами. Применив регрессионный анализ значений признаков на гомо/гетерозиготный статус хромосом для модели возвратных скрещиваний, мы определили вклад отдельных хромосом в формирование видоспецифических признаков копулятивного аппарата. Признаки формы парамеров (фактор 1). Признак 24: хромосома 6 – 5-8% от общей изменчивости, хромосомы 2 и 5 – 5-6%. Признаки 25, 26, 27: хромосома 5 – 13-24%, хромосомы 2 и 6 – 9-18% от общей изменчивости. Признаки положения аподемы (фактор 2). Эти признаки являются слабыми дискриминаторами. Некоторый вклад аутосом в видоспецифическую изменчивость удалось получить для ИМП 28, 29 и β. Она составляет 13%, 4% и 9% соответственно. Для ИМП 28 и 29 наибольшее влияние оказывают хромосомы 5 (8-13%) и 4 (4-6%) соответственно. Признак β находится под контролем хромосом 2 – 21% и 6 – 3%, отмечено также влияние Y-хромосомы на экспрессию признака. Признаки формы дорсальной поверхности центральной и задней части фаллоса (фактор 3). Признаки 8, 9: хромосома 2 до 7%, хромосома 3 – 4%, хромосома 6 – 2-6% от общей изменчивости. Признаки 10, 11, 14: хромосома 3 – 14-20%, хромосома 2 – 2-22%, хромосома 4 – 11-16%, хромосома 6 – 5-10% от общей изменчивости. Признаки формы дорсальной поверхности передней части фаллоса (фактор 4). Влияние хромосом для всех признаков данной группы является очень сходным. Признаки 4-7, 16: хромосома 5 – 13-23% от общей изменчивости и хромосома 3 – 10-17%. Признаки формы вентральной поверхности фаллоса (фактор 5). Признак 17: ведущая роль хромосомы 5 (14%). Признак 20: ведущая роль хромосомы 3 (7-15%), второстепенная роль хромосом 6 (до 11%) и хромосомы 4 (3-8%). Для обоих признаков играет роль регуляторное влияние Y-хромосомы. Для ИМП 18 и 19 во всех вариантах анализа однозначно выявляется основная роль хромосомы 2 (21% и 14% от общей изменчивости соответственно), второстепенную роль играют хромосомы 3 (4%) и 6 (2-6%). Признаки с высокой характерностью. Для ИМП 23, признака высоты парамеров у их основания, ведущую роль в формировании генетической составляющей общей дисперсии играет хромосома 5. Признаки шипа на конце эдеагуса, ИМП 3 и α, являются сильными дискриминаторами и принципиально различаются по вкладу аутосом в выявленную генетическую составляющую дисперсии. Ведущую роль в формировании дисперсии признака ИМП 3 у самцов Fb от прямого скрещивания играют хромосомы 3 и 2 (11% каждая), а для признака α – хромосомы 4 и 6 (7% каждая). Для самцов Fb от обратного скрещивания наиболее весомый вклад в контроль признака ИМП 3 имеют хромосомы 3 и 6 (22% и 12%, соответственно), признака α – хромосомы 2 и 4 (30% и 26%, соответственно). Учитывая наблюдаемые различия, оба признака зависят от эффектов взаимодействий Y-хромосомы с аутосомами. 19 Оценка неаддитивных взаимодействий хромосом в формировании видоспецифической изменчивости показала, что 26 из 38 признаков проявляет неаддитивную изменчивость, она может составлять до 97% от наблюдаемого эффекта влияния пары хромосом. Из 13 признаков, для которых показан эффект эпистатических взаимодействий, 9 попадают в группу доминирования фенотипа D. lummei, причем это практически все признаки, доминирующие по эволюционно новому фенотипу. Очевидно, эпистатические взаимодействия межу локусами из разных групп сцепления необходимы для проявления эффекта доминирования. Этот результат подтверждает вывод о роли эпистатических взаимодействий в эволюции доминирования признаков с новым видовым статусом. Как определить ожидаемый вклад хромосом в межвидовую изменчивость признаков формы копулятивного аппарата? Используем известную гомологию хромосом D. virilis и D. melanogaster по элементам Меллера и функциональную значимость и экспрессионную активность всех аннотированных генов D. melanogaster. В соответствии с данными FlyBase, из 302 SRR (sex and reproduced related) генов на 2-й – 6-й аутосомах расположено 34%, 17%, 24%, 24% и 1% этих генов соответственно. Сходным образом, из 60 известных генов, ограниченных экспрессией в тканях самцов, на 2-й – 6-й аутосомах расположено 35%, 27%, 17%, 20% и 2% от общего их числа соответственно. Оценим распределение по хромосомам объясненной изменчивости по видоспецифическим признакам формы копулятивного аппарата. Группы признаков, обладающих скоррелированной изменчивостью, имеют различный объем, и каждый признак, обладающий высокой характерностью, представляет собой самостоятельную группу. Поэтому следует последовательно взвесить показатели участия хромосом для каждого признака на размер группы скоррелированной изменчивости, включающей данный признак, и затем получить средние значения объясненной изменчивости по признакам для каждой хромосомы. Ожидаемые показатели определяются как доли от суммарной средней объясненной изменчивости, соответствующие двум наборам приведенных выше теоретических оценок. Результаты расчетов представлены в табл. 3. Табл. 3. Нагрузка на хромосомы видоспецифической изменчивости. Хромосомы 2 3 4 5 6 ∑ % от общей изменчивости Наблюдаемая SRR* M-S** 4.8 7.5 7.8 4.9 3.8 6.0 3.2 5.3 3.8 5.7 5.3 4.4 3.6 0.2 0.4 22.2 22.2 22.2 Видоспецифические инверсии D. lummei - (Tsuno, Yamaguchi, 1991) - (Полуэктова и др., 1994) - (Полуэктова и др., 1994) + (Полуэктова и др., 1994) + (Полуэктова и др., 1994) Выделены нагрузки на хромосомы, вклад в видоспецифическую изменчивость которых выше ожидаемого. SRR* - ожидаемая по нагрузкам на хромосомы SRR-генов; M-S** - ожидаемая по нагрузкам специфичных для самцов генов. 20 Очевидно, что нагрузки на 5-ю аутосому и микрохромосому выше ожидаемых. При этом известно, что обе хромосомы несут характерные для D. lummei видоспецифические инверсии, отсутствующие у D. virilis, причем инверсия на 5-й аутосоме перекрывает незначительную часть хромосомы, тогда как микрохромосома перекрыта инверсией полностью. Этим может объясняться сравнительно слабое превышение наблюдаемого вклада 5-й хромосомы в общую изменчивость по форме копулятивного аппарата, по сравнению с ожидаемым. Таким образом, скорость накопления эволюционно-значимой изменчивости по признакам формы копулятивного аппарата самцов дрозофил выше в хромосомах, несущих видоспецифические инверсии, что соответствует модели «подавления рекомбинации» и концепции Добжанского об эволюционной роли хромосомных перестроек. 1.6. Видовая специфичность и роль микрохет на эдеагусе дрозофил Присутствие микрохет на половых органах самцов и значительное разнообразие по этому признаку у разных видов дрозофил может быть следствием сохранения функциональной значимости микрохет и их участия в формировании прекопуляционных изолирующих барьеров. Наши эксперименты по сравнению эффективности брачных ухаживаний в кон- и гетероспецифических скрещиваниях показали, что эффективность перехода от стадии “садки” к стадии “копуляции” в межвидовых скрещиваниях снижается в 1,5-2 раза. Кроме того, продолжительность времени копуляции в случае перехода на эту стадию сокращается в 2-4 раза, что сказывается на полноценности осеменения самки. Следовательно, в момент попытки оплодотворения осуществляется рецепция, определяющая эффективность как перехода на стадию копуляции, так и процесса осеменения самки. Роль сенсорных механизмов при копуляции могут играть микрохеты, обнаруженные на дорсальной поверхности копулятивного аппарата. На увеличении до 5000 видна внутренняя полость, характерная для сенсорных органов дрозофилы (рис. 6). Эволюционное происхождение внутренних половых органов насекомых связано с 8-м и 9-м тергитами брюшка, из которых у самцов образовались копулятивный аппарат и гипандрий, соответственно. Тергиты густо покрыты микро- и макрохетами, играющими механосенсорную функцию, и гомологичные структуры на внутренних половых органах могут обладать той же функцией. Рис. 6 Микрохета с вентральной поверхности эдеагуса D. montana x5000. 21 Наличие микрохет на поверхности эдеагуса у дрозофил группы virilis наблюдается в верхней, наиболее приподнятой над основанием части сагиттальной проекции органа (рис. 7). Максимальное количество микрохет характерно для всех видов филады montana (рис. 7а) – щетинки занимают до ¼ площади дорсальной части фаллоса по направлению к шипу на его конце. У видов D. americana, D. novamexicana (оба вида являются аллопатрическими) микрохеты отсутствуют полностью и у вида D. virilis появляются редко и только в случае развития личинок при пониженной температуре (рис. 7б). а б Рис. 7 Наличие микрохет у D. montana (а) и D. virilis (б). х 200 Генетический анализ данного признака был проведен с использованием гибридных самцов F1 и самцов от возвратных скрещиваний самок D. virilis с самцами F1 от скрещиваний D. virilis на D. lummei в обоих направлениях. Было показано доминирование фенотипа D. virilis при развитии потомства в нормальных условиях (25оС) и фенотипа D. lummei при содержании личинок при 17оС. В ходе анализа влияния отдельных хромосом на экспрессию признака было показано достоверное влияние 2-й (G2=2.834, d.f.=5, p<<0.001) и 6-й (G2=32.538, d.f.=5, p<<0.001) хромосом. Показано также влияние взаимодействия аутосом 3, 4 и 5 с аутосомами 2 и 6 на экспрессию признака, и взаимодействия Y-хромосомы с аутосомой 2. 4-я микрохромосома D. melanogaster имеет в своем составе всего 95 структурных генов и полностью гомологична 6-й микрохромосоме D. virilis. Поиск генов-кандидатов на формирование видовой специфичности количества микрохет на поверхности эдеагуса, расположенных на микрохромосоме, был проведен с использованием биоинформационных подходов по последовательности SOP-(sensory organ precursor) энхансера. Искомая последовательность была найдена в районе локализации генов-кандидатов shaven, CG1909 и Ephrin, экспрессирующихся в клетках нервной системы мух. Таким образом, действие отбора на быстро эволюционирующие части копулятивного аппарата самца дрозофилы может осуществляться через сенсорные структуры на поверхности эдеагуса. 22 2. ОЦЕНКА ДИВЕРГЕНЦИИ ВИДОВ ДРОЗОФИЛ ГРУППЫ VIRILIS ПО ФОРМЕ КРЫЛА Крыло дрозофилы играет существенную роль в брачном ритуале – это и реализация характерных поз самца, и сенсорика контактных феромонов, размещенных на поверхности тела самки, с помощью разнообразных рецепторов, в том числе и расположенных на крыловой пластине, и генерация своеобразной брачной песни самца и ответа на нее самки. Поскольку и сам рисунок брачного танца, и амплитуда и частота звуков брачной песни являются строго видоспецифическими характеристиками, представляется интересным оценить дивергенцию близкородственных видов дрозофил по форме крыловой пластины. Характеристики формы крыловой пластины, полученные для 17 линий 11 видов дрозофил группы virilis, были использованы для сравнения самцов и самок, представителей разных видов и разных линий дрозофил. Используя двухфакторный MANOVA, прокрустову метрику как показатель формы крыловой пластины, и принадлежность к полу и линии как факторы, нам удалось показать, что эффект линии на форму крыла высоко значим (Wilk’s λ =1.20х10-7, F(384,9670.05) =57.88, p < 0.001). Вместе с тем, прокрустовы дистанции между линиями, определенные независимо для самцов и самок, были высоко коррелированны (r = 0.927, n = 136, p <0.001) и эффект принадлежности полу был примерно в 4 раза ниже, чем эффект принадлежности линии, показанный для самок и самцов независимо. Эти результаты указали на высокую степень подобия для формы крыла самцов и самок, и в дальнейших исследованиях мы использовали только объединенные выборки двух полов. Рис. 8 Дендрограмма распределения линий дрозофил группы D. virilis по форме крыла. Дендрограмма, построенная методом UPGMA по средним прокрустовым дистанциям для линий, демонстрирует отсутствие эффекта видовой 23 принадлежности на форму крыла (рис. 8). Мы видим случайную картину распределения линий по кластерам, и отсутствие сходства полученной дендрограммы с известными филогенетическими построениями для дрозофил группы virilis. t-тест также показывает, что различия по средним прокрустовым дистанциям между линиями одного вида (31.16×10-3 ± 4.39×10-3) и линиями разных видов (39.22×10-3 ± 0.93×10-3) являются величинами одного порядка.Разбиение крыловой пластины на дистальную и проксимальную области, ограниченные лэндмарками 9-14 и 1-8 соответственно, позволяет определить различия этих компартментов по изменчивости. Средние значения MS (средняя сумма квадратов) для лэндмарок каждого компартмента составляют 4.43×10-3 ± 0.90×10-3 против 1.33×10-3 ± 0.19×10-3 для этих областей соответственно, t12 = 3.89, p < 0.01. Напротив, антериорная и постериорная зоны, различающиеся степенью костализации и граничащие между радиальной и медиальной жилками, не показывают значимых различий по изменчивости. Средние MS для лэндмарок этих зон составили 2.39×10-3 ± 0.93×10-3 против 2.92×10-3 ± 0.71×10-3. Аллометрические эффекты оказывают значимое влияние на эволюцию формы крыловой пластины. Получена достоверная регрессия средних прокрустовых дистанций между данной линией и остальными (различия по форме крыла) на соответствующую разницу по значениям центроидов (различия по величине): F(1,15) = 9.00, p < 0.01 (рис. 9), т.е. отличия по форме усиливаются с увеличением размера крыла. Эти результаты дают основание предполагать, что накопление видоспецифической изменчивости может осуществляться по-разному в различных компартментах крыла, и нарастать по мере увеличения размера крыла. По оси абсцисс – средняя абсолютная разница размеров центроидов, по оси ординат – средние прокрустовы дистанции Рис. 9. Регрессия средних прокрустовых дистанций между данной линией и остальными на соответствующую среднюю разницу по значениям центроидов. Для выявления и визуального представления наиболее характерных изменений в разных частях крыла мы использовали многомерный метод анализа относительных деформаций (relative warp analysis; Bookstein 1991). Были рассмотрены факторные нагрузки для трех наиболее значимых осей относительных деформаций (relative warps RW1, RW2 и RW3), объясняющих 64,5% всей наблюдаемой изменчивости. Проекции индивидуальных значений 24 особей с учетом нагрузок (relative warp scores) на ось RW3 (в отличие от RW1 и RW2) четко разделяли крупные виды D. kanekoi, D. ezoana и D. montana между собой и отделяли их от остальных видов группы. Для RW3, определяющей 13% изменчивости формы крыла, лэндмарки проксимального компартмента (1, 2, 3, 5, 6, 7 и 8) имели наиболее высокие нагрузки. Анализ деформаций показал, что с ростом значений вдоль оси RW3 наблюдается уменьшение проксимальной части крыла относительно дистальной части, несущей основную функциональную нагрузку при полете. Таким образом, процесс видообразования в группе virilis не связан с изменением формы крыловой пластины. Скорость накопления видоспецифической изменчивости по данному признаку значительно ниже, чем по копулятивному аппарату дрозофил. Межвидовую дивергенцию по форме крыла можно отметить только для некоторых филогенетически удаленных видов, у которых она затрагивает консервативную проксимальную область крыловой пластины, причем эта дивергенция не носит направленного характера. Межвидовые различия по форме крыловой пластины могут быть связаны с адаптациями к активному полету. 3. ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ РОДСТВА ВИДОВ ПО МОЛЕКУЛЯРНЫМ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯМ 3.1. RAPD-фингерпринтинг видов-двойников дрозофил группы virilis. Используя 14 RAPD-праймеров, мы получили 440 парсимониально значимых RAPD-маркеров для 10 видов дрозофил группы virilis. По бинарной суммарной матрице были рассчитаны оценки генетических расстояний по Нею и Ли, и методами кластерного анализа и многомерного шкалирования показана степень родства сравниваемых видов (рис. 10а и б, соответственно). 1.4 а б D. kanekoi 1.2 1.0 0.8 D. littoralis D. ezoana 0.6 D. melanogaster Ось 2 0.4 D. lummei 0.2 D. am. texana D. v irilis D. am. americana 0.0 -0.2 D. nov amexicana -0.4 D. borealis -0.6 -0.8 D.lacicola D. montana -1.0 -1.2 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Ось 1 Рис. 10. Дендрограмма отношений родства видов группы virilis (а) и распределение видов дрозофил в плоскости осей 1 и 2 многомерного шкалирования по результатам анализа RAPD-маркеров (б). Обращает на себя внимание характер первого ветвления NJ дерева, изображенного на рис. 10а и имеющего максимальную поддержку бутстрепа. 25 Один из двух кластеров объединяет всего лишь три вида филады montana (D. montana, D. lacicola и D. borealis), при этом значения индекса бутстрепа являются достаточно высокими (0.62 и 0.81), тогда как другой, больший кластер объединяет все остальные виды. При этом, если большинство видов филады virilis и образуют четко выделяющуюся группу, то положение самого вида D. virilis является крайне неустойчивым. Положение видов D. ezoana, D. kanekoi и D. littoralis в общем кластере, так же как и положение в нем D. virilis, является неопределенным, хотя выделение D. kanekoi и D. littoralis в парный кластер поддержано относительно высоким значением бутстрепа. Использование метода многомерного шкалирования (рис. 10б) позволяет сделать сходные выводы. В пространстве двух первых осей можно видеть разделение классической филады montana на независимые группы montana и kanekoi и промежуточное положение вида D. virilis между кластерами lummei, montana и kanekoi. Эти результаты в наибольшей степени сходны с филогенетическими оценками, полученными на основании анализа инверсионного полиморфизма и изменчивости по признакам формы копулятивного аппарата. 3.2. Родственные отношения дрозофил группы virilis, реконструированные на основе последовательностей гена Dras1. Использование исключительно нейтральных замен для оценки филогенетических отношений между видами позволяет исключить эффект отбора, эффективность которого в разных родословных и в разные временные периоды могла существенно различаться. Вмешательства эффектов направленного отбора можно избежать, используя нейтральную изменчивость высококонсервативных последовательностей, подверженных действию очищающего отбора. Ген Dras1 хорошо соответствует этому требованию, имея исключительный консерватизм аминокислотных последовательностей активных центров. Для дрозофил показан крайне низкий популяционный полиморфизм по любым типам замен для данного гена. Используя точный тест Фишера, мы подтвердили действие очищающего отбора на кодирующие последовательности гена Dras1. Формальный критерий на действие очищающего отбора – dS/Lsyn ≥ dN/Lnonsyn (соотношение оцененного и ожидаемого числа соответствующих замен), был справедлив для всех пар сравниваемых видов. Тест Таджимы на нейтральность подтвердил действие отбора по первым позициям кодонов в последовательности экзона 2 гена Dras1 и нейтральную эволюцию нуклеотидной последовательности по третьим позициям кодонов данного экзона и некодирующей последовательности 2-го интрона. Филогенетический анализ общих последовательностей фрагмента гена Dras1 12 линий 11 видов дрозофил группы virilis был проведен методом Neighbor-Joining, используя в качестве модели подстановки трехпараметрическую модель Тамуры. Оценка устойчивости полученной дендрограммы проведена бутстрепом (500 повторностей). В одном случае мы применяли попарное удаление сайтов с 26 пропусками (данные не приведены), полученными в ходе выравнивания последовательностей, в другом – полное удаление таких сайтов. Имеющихся замен в проанализированном участке недостаточно, чтобы получить устойчивую оценку степени родства видов филады montana, с чем связана низкая поддержка бутстрепом полученных ветвей. При этом 3 вида филады lummei и 4 вида филады montana формируют устойчивые группы, имеющие хорошую поддержку бутстрепом при полном удалении сайтов с пропусками. В зависимости от метода учета парсимониально информативных сайтов, положение видов D. virilis и D. kanekoi на дендрограмме меняется местами. Метод минимально разветвленной сети (Minimum Spanning Network) используется для оценки минимально необходимого числа точечных мутаций при происхождении данных гаплотипов. Его применение вновь демонстрирует предковую роль вида D. virilis и неустойчивое положение видов субфилады kanekoi (рис. 11). В частности, при изменении лимита образования связей между гаплотипами, состав и связи внутри субфилад lummei, montana и центральное положение D. virilis остаются неизменными, тогда как положение и связи D. ezoana, D. kanekoi и D. littoralis существенно меняются, что соответствует сделанным выше выводам об их неустойчивом положении. Таким образом, анализ выявленных нами и представленных в литературе противоречий по степени родства видов группы virilis с использованием разных последовательностей и методов их оценок указывает на неравномерность хода молекулярной эволюции в данной группе видов. Рис. 11. Минимальная сеть происхождения наблюдаемых замен. Узлами обозначены замены, отличающие последовательности родственных видов. 3.3. Оценка степени родства видов группы virilis по пяти молекулярным последовательностям, сопоставление темпов эволюции морфологических и молекулярных признаков Филогенетически-опосредованные методы имеют высокую чувствительность к правильности топологии оцениваемого дерева. При проведении филогенетической оценки необходимо подобрать модель учета 27 замен, максимально соответствующую характеру последовательности и распределению наблюдаемых замен. Для выявления наиболее вероятной топологии дерева мы использовали последовательности Adh, NonA, Fu, Ras1 ядерных генов и 16S–12S рРНК митохондриальных генов и два алгоритма оценки дистанций: Neighbor-Joining (NJ) и Maximum Parsimony (MP). В качестве внешнего вида использовали D. melanogaster. Для общей последовательности, включающей все пять используемых фрагментов, были использованы модели GTR+I+G (общая реверсионная модель (General Time Reversible) с учетом неравенства консервативных сайтов и гаммараспределением скорости замен) с параметрами I=0.7195 и G=0.3955, и TrN+I+G (модель Тамуры и Нея с учетом неравенства консервативных сайтов и гамма-распределением скорости замен) с параметрами I=0.6916 и G=0.3991, при условии полного удаления пропусков. При филогенетических построениях с использованием парсимониального метода применяли алгоритм метода ветвей и границ (branch and bound) для оценки связи ветвей с условием как полного удаления пропусков, так и учета их в качестве пятого основания. MP дерево, построенное с использованием пропусков в качестве пятого основания, хорошо соответствует классическому представлению о степени родства видов группы virilis: вид D. kanekoi оказывается связанным в один кластер с видами D. ezoana и D. littoralis, и сам кластер kanekoi входит в состав филады montana, вид D. virilis является внешним в своем кластере. Топология MP дерева, построенного с использованием пропусков в качестве пятого основания, была подтверждена анализом распределения делеций/инсерций в последовательностях. Оценка генетических дистанций между видами группы virilis по нейтральной изменчивости четырежды вырожденных сайтов кодирующих последовательностей и сайтам некодирующих последовательностей дает возможность сопоставить темп накопления нейтральной молекулярной изменчивости и видоспецифической изменчивости морфологических признаков. Регрессионный анализ был проведен по показателям генетических дистанций между парами видов, с одной стороны, и разнице по средним значениям признаков формы копулятивного аппарата, а так же по обобщенным характеристикам – Евклидовым дистанциям, полученным по значениям 35-и ИМП и по значениям 11-и канонических дискриминантных функций (dkm) , с другой. Достоверная положительная связь между генетической дистанцией для конкретной пары видов, и разницей по средним значениям признака между данной парой видов, для большинства признаков получена только для моделей нелинейной регрессии. Это подтверждает неравномерное изменение скорости накопления эволюционно-значимой изменчивости, относительно скорости накопления нейтральной молекулярной изменчивости, в родословных изучаемых видов. Обе обобщенных характеристики изменчивости количественных признаков показывают значимую положительную регрессию на генетические дистанции (для дистанций по 35 ИМП R=0.296, p=0.048; для дистанций по 11 dkm R=0.447, p=0.002). Оценки эвклидовых дистанций в парах 28 «D.virilis – все остальные виды» всегда выше оценок в парах видов, принадлежащих к разным субфиладам, в том числе – субфиладам montana и lummei. При пропорциональном вкладе изменчивости по исследованным признакам на ранних и поздних этапах дивергенции видов значения эвклидовых дистанций в парах «D.virilis – все остальные виды» должны быть ниже значений дистанций в парах видов, принадлежащих разным филадам. Можно заключить, что скорость накопления морфологических различий значительно снижалась на более поздних этапах дивергенции видов. 3.4. Применение общепринятых тестов для оценки хода молекулярных часов Результат применения двухкластерного теста Такезаки для общей последовательности изученных генов показал неравномерное накопление замен в кластере D. kanekoi, как в родословных видов D. ezoana и D. littoralis, так и D. kanekoi с субкластером видов D. ezoana и D. littoralis. Анализ независимых последовательностей подтвердил выявленные различия видов субфилады kanekoi для генов 16S–12S mtRNA, Fu, Ras1, в двух последних случаях на уровне тенденции (90<Р<95). Он также выявил дополнительные кластеры видов, имеющих значимые различия по скорости накопления замен в родословных. Подтверждения найдены для видов субфилады montana по последовательностям генов 16S–12S mtRNA, Adh, Fu, и для видов филады virilis по последовательностям генов 16S–12S mtRNA, Ras1 и NonA. Существенные различия длин ветвей в пределах одного кластера значительно увеличивают дисперсию средней длины ветви для данного кластера и не позволяют выявить достоверные различия между отдельными ветвями родословных, расположенных в различных кластерах. Эту проблему частично решает тест длин ветвей, сравнивающий суммарную длину ветви каждой родословной, от общего для всех родословных узла до конца ветви, со средней длиной ветви в дереве данной топологии. Применение теста длин ветвей подтвердило достоверное увеличение скорости замен в родословных D. ezoana и D. littoralis. Вместе с тем выявляются значимые отклонения родословных D. montana, D. lummei, D. texana и D. novamexicana от средней длины ветви, не отмеченные ранее двухкластерным тестом для суммарной последовательности. Учитывая внешнее в своем кластере положение вида D. virilis, имеющего низкие индексы поддержки бутстрепом, можно ожидать высокий показатель дисперсии для значения разницы средних длин ветвей родословных субкластеров D. virilis и D. lummei-D. texana-D. novamexicana и низкие показатели двухкластерного теста. Использованные нами тесты Такезаки (Takezaki et al., 1995) опосредованы филогенетическими оценками дистанций между видами и группами видов и имеют два существенных недостатка – чувствительность к показателям групповой дисперсии и к точности филогенетических оценок, берущихся a priori. Чтобы избежать влияния показателей групповой дисперсии, можно обратиться к филогенетически независимому тесту Таджимы, 29 оценивающему относительные скорости молекулярной эволюции только для трех последовательностей – двух тестируемых видов и одного внешнего вида. Сопоставление суммарной последовательности Adh, NonA, Fu, Ras1 ядерных генов и 16S–12S рРНК мтДНК у видов субфилад virilis и montana при использовании D. melanogaster в качестве внешнего вида подтвердило справедливость предположения о нарушении равномерности хода молекулярных часов для некоторых родословных. Для субфилады montana не показано достоверного отличия в скорости накопления замен по сравнению с D. virilis, и значимые различия по этому признаку отмечены для видов D. montana и D. flavomontana с видами субфилады lummei. Скорость накопления нуклеотидных замен в исследуемых последовательностях у всех видов-близнецов в субфиладе lummei существенно отличается от вида D. virilis. Для видов субфилады montana показано нарушение хода молекулярных часов для видов D. montana и D. lacicola. Между внутренними видами субфилады kanekoi достоверных различий тест не выявил. Использование в качестве внешнего вида представителей собственной группы видов, являющихся внешними по отношению к сравниваемой паре, позволяет дополнительно подтвердить неравномерность скорости молекулярной эволюции у видов субфилады kanekoi. Тем не менее, этот тест также не лишен недостатков. Он не учитывает характера сравниваемых последовательностей, внешний вид должен быть удален от сравниваемых. Представленные результаты свидетельствуют о неравномерной скорости накопления замен в разных родословных изученной группы видов и о неодинаковом характере накопления замен в пределах каждого генотипа по разным последовательностям. Тем не менее, получить четкую взаимоподтверждаемую разными тестами картину не удается, в силу различных недостатков каждого из тестов. 3.4. Использование методов прямой оценки равномерности хода молекулярных часов, с поправками на различия между родословными и последовательностями Модель нейтральной эволюции предполагает, что число мутаций (нуклеотидных или аминокислотных замен), фиксирующихся в популяции за T поколений, должно соответствовать Пуассоновскому распределению со средним значением uT, где u – число мутаций, фиксирующихся за одно поколение. Следовательно, в рамках этой модели дисперсия числа замен должна быть равна их среднему числу uT (поскольку в Пуассоновском распределении дисперсия равна среднему). Тогда и индекс дисперсии R(T), соответствующий частному дисперсии числа замен на их среднее число, как мера нарушения хода молекулярных часов, не отличается достоверно от единицы. Существуют формальные факторы, приводящие к смещению оценок R(T). Это число узлов филогенетического древа (или степень отличия конкретной филогении от филогении «звезды»), скорость смены поколений в разных родословных, недоучет параллельных и множественных замен в 30 сравниваемых последовательностях и др. Методы оценки величины взвешенного индекса дисперсии были разработаны Гилеспи и Балмером. Эти методы приложимы к разным исходным данным и учитывают разные факторы. Суть метода Гилеспи заключается в использовании весовых коэффициентов (w) при оценке параметров M (среднее число замен) и S2 (дисперсия числа замен) для замен в выборке последовательностей трех сравниваемых видов. Гилеспи определил весовые коэффициенты как "эффекты происхождения", общие для разных последовательностей (локусов) одного генома. Эффекты происхождения нормируют дистанции между последовательностями с учетом следующих «формальных» причин нарушения нуль-гипотезы нейтральной эволюции: 1) отклонения филогении сравниваемых видов от филогении «звезды», 2) неравная продолжительность поколений в разных родословных и 3) различия по общим молекулярным, биохимическим и физиологическим параметрам, определяющим скорость эволюции, в отдельных родословных. Балмер предложил метод для сравнения скорости накопления замен у любого числа видов по одной последовательности и ввел поправку (коэффициент инфляции) на неоправданное увеличение R(T), возникающее при использовании сложных моделей, учитывающих множественные замены. Коэффициент инфляции оценивает возможные множественные, параллельные и обратные мутации в независимых родословных по ковариациям скоростей замен. Коэффициент инфляции имеет удобное χ2-распределение, позволяющее оценивать полученные отклонения в скорости накопления замен от пуассоновского распределения. Нами был разработан и применен новый метод учета скорости накопления замен, принимающий во внимание обе поправки. Невзвешенный R(T), с поправкой на коэффициент инфляции. Оценивается отдельно для каждого из k локусов и каждой пары видов i-j, R(T )i j inf lat. ( s 2) Sa /( ( s 4)c)( s 1) , где v и c – значения обобщенных оценочных показателей для каждой i-ой родословной (по Балмеру) Var (dij) и Cov (dij, dik) соответственно, d – дистанции между соответствующими родословными, s – число сравниваемых видов, i _ S a (ai a ) 2 , где ai – число замен на один нуклеотид в данной родословной, ā– i 1 среднее число замен на один нуклеотид во всех рассматриваемых эволюционных линиях. Вариационно-ковариационную матрицу этих показателей, как показал Балмер, можно определить с высокой точностью по стандартным формулам сложения дисперсий и ковариаций независимых линейных функций: i Var (dij ) Var ( wi dij ) wi Var (dij ) wi w j Cov(dij , dik ) 2 i 1 i j Cov(( dij , d ik ) Cov( wi d ij , ui d ij ) wiuiVar (d ij ) wiu j Cov(d ij , d ik ) i 1 i j 31 где wi, wj и ui, uj – веса вхождения дистанций dij, dik в родословную i. Стандартные значения весов (wi, wj и ui, uj) входят в формулы дисперсии и ковариации дистанций для данной эволюционной линии «i» с положительным знаком и значением +wi=1/(s-1), для всех дистанций между видом «i» и остальными видами, и с отрицательным знаком и значением wi=1/(s-1)(s-2), для всех остальных дистанций. Статистика χ2 = (s - 2)Sa/(v + (s - 4)c) определяется для искомого показателя R(T)i-j inflat по индивидуальным значениям дисперсии и ковариации каждой родословной каждого анализируемого локуса. Пользуясь свойством аддитивности независимых распределений χ2, мы можем получить оценку для средних по всем локусам значений R(T)i-j inflat., для всех пар данного вида и внешних по отношению к нему, используя суммы соответствующих статистик χ2 и суммы их степеней свободы, вместо аргумента функции x используется аргумент nx. Показатель индекса дисперсии для данной эволюционной линии R(T)i inflat определяется как среднее по всем парам, образуемым данным видом. Данный метод оценки был использован Балмером для одного локуса. Однако на основе этой методики мы можем также получить среднее значение для каждой пары и для каждой родословной по всем локусам. Оценка среднего показателя R(T)i inflat по всем парным дистанциям в пределах одной родословной (между данным видом и каждым из оставшихся) и средних показателей по всем родословным затруднена, так как соответствующие распределения не являются независимыми. Взвешенный R(T), с поправкой на коэффициент инфляции. Оценивается отдельно для каждого из k локусов и каждой пары видов i-j. Веса ωi определяются по средним ai для всех k локусов: k i k i s ai / ai , так, что Σ ωi = s. k 1 i 1 k 1 В соответствии со свойствами дисперсии и ковариации, для произвольных случайных величин ξ1, ξ2 верны равенства: Var (ωi2 ξ) = ωi2 Var (ξ) и Cov (ωi ξ1, ωj ξ2) = ωi ωj Cov (ξ1, ξ2). Учитывая уже определенную вариационно-ковариационную матрицу, полученную для невзвешенных значений среднего числа замен на один нуклеотид ai, воспользуемся свойствами дисперсии и ковариации и разделим значения матрицы на соответствующие им весовые коэффициенты. R(T )i j inf lat,. weight. (s 2)Sa weight. /( / i (s 4)(c / i j ))( s 1) 2 χ2 = (s - 2) Sa weight./((v/ ωi2) + (s - 4)(c/ ωi ωj)). Индекс дисперсии для родословной i R(T)i inflat., weight также определяется как среднее по всем парам, образуемым данным видом. Итог применения всех 4-х алгоритмов для оценки индекса дисперсии по 5 последовательностям в родословных видов группы virilis получился неожиданным. Применение индекса инфляции как для наивных значений, так и для значений, взвешенных по эффектам происхождения, приводит к увеличению индекса дисперсии (табл. 4). 32 Табл. 4. Средние значения индекса дисперсии для изученных последовательностей видов дрозофил группы virilis. Гены Наивные формулы С учетом индекса инфляции R(T) R(T)Гилеспи R(T)unw R(T)Гилеспи Ras1 1.42 0.80 3.53 1.93 NonA 1.55 0.83 2.97 1.53 12S-16S 3.65 3.22 5.14 4.58 Adh 1.46 0.60 1.66 0.68 Fus 1.12 0.80 2.52 1.85 среднее 1.84 1.25 3.16 2.12 Выделены максимальные значения R(t), полученные с учетом индекса инфляции. Объяснить это можно следующим образом. Индекс инфляции Балмера включает поправку на дисперсии и ковариации дистанций между ними (Equation 19a, Bulmer, 1989): p(Sa) = n(v+(s-4)c)/ā(s-2). Нетрудно показать, что при v+(s-4)c<(s-2)ā/n фактор инфляции будет принимать значения меньше единицы, что при применении поправки приведет к эффекту, противоположному ожидаемому – росту индекса дисперсии. Отмеченный феномен может существовать в ограниченных рамках – границы изменчивости показателя ковариации (c) должны иметь значения от ā/n, при условии соблюдения пуассоновского распределения, когда R(T)=1, до (ā(s-2)-vn)/n(s-4). Если показатель ковариации находится в указанных пределах, индекс дисперсии оказывается занижен, и применение поправки Балмера ведет к его увеличению. Дальнейший рост ковариации приведет к раздуванию индекса дисперсии, и применение поправки дает обратный эффект. Рост ковариации дистанций может быть вызван независимым (конвергентным) накоплением одинаковых замен у рассматриваемых видов. Действительно, в использованных последовательностях присутствует 31 сайт, обладающий статусом, на основании которого все виды субфилады kanekoi (или два вида из трех) можно отнести к кластеру lummei, и 40 сайтов, свидетельствующих в пользу их локализации совместно с кластером montana. Важно отметить, что во всех последовательностях эти сайты расположены стохастически, не образуя общих кластеров. Высоко полиморфный локус Adh имеет наименьший показатель индекса дисперсии. Консервативная митохондриальная последовательность 12S-16S mt rRNA имеет наибольший индекс дисперсии. Среди ядерных генов наибольшее значение (с учетом индекса инфляции Балмера) получено для высококонсервативного гена Ras1. Регрессия средних значений R(T) на средние значения дистанций, определенных по объединенной редуцированной последовательности всех 5-и генов, показала хорошую линейную зависимость только для взвешенных значений R(T) (рис. 12). Результаты анализа дистанций в парах индивидуальных родословных представлены на графиках 13a, б и в, отдельно для каждой из 3-х субфилад. Можно отметить несколько общих закономерностей характера изменений R(T). 33 Ось Х - Среднее количество замен на нуклеотид Ось Y – значения R(T) Рис. 12. Соотношение среднего количества замен на один нуклеотид в данной родословной и полученного для этой родословной среднего индекса дисперсии. а б в Рис.13 Изменения R(T)i-j inflat.,weight (ось Y) в рядах видов, относящихся к одной субфиладе. a – субфилада virilis (D. virilis, D. lummei, D. novamexicana); б –субфилада montana (D. montana, D. flavomontana, D. lacicola, D. borealis); в –субфилада kanekoi (D. kanekoi, D. ezoana, D. littoralis). 1. Виды субфилады montana (рис. 13б) имеют наиболее низкие и наиболее сходные между собой показатели R(T). Это свидетельствует о сходной равномерной скорости молекулярной эволюции в соответствующих родословных. При этом D. flavomontana, имеет самые низкие значения R(T). 2. Значения R(T) в парах, включающих вид D. virilis (рис. 13а), являются максимальными, что предполагает наиболее существенные нарушения равномерности хода молекулярных часов в эволюционной линии D. virilis. 34 Остальные виды данной субфилады (D. lummei, D. novamexicana) также имеют более высокие индексы дисперсии по сравнению с представителями других субфилад. Возможно, что на всех этапах расхождения видов данной субфилады были периоды значительных изменений скорости молекулярной эволюции. 3. При сравнении представителей филады virilis и субфилады montana получены минимальные значения R(T). Это означает, что на ранних этапах дивергенции от общего предка молекулярные часы шли более равномерно, чем на поздних этапах у видов – представителей филады virilis. 4. Виды – представители субфилады kanekoi (рис. 13в) (D. kanekoi, D. ezoana, D. littoralis) имеют более сложную картину распределения показателей R(T). Минимальные значения показателя наблюдаются у вида D. ezoana, а виды D. kanekoi и D. littoralis при сравнении между собой показывают промежуточные значения R(T)≈2.5, а при сравнении с представителями других субфилад – противоположные значения. Как было показано выше, наиболее вероятная топология филогенетического древа включает филаду virilis с видом D. virilis в качестве внешнего по отношению к остальным видам филады, и филаду montana, состоящую из субфилад montana и kanekoi. Это не исключает возможности сохранения видом D. virilis наибольшей близости к предковому виду. Тогда наиболее ранним актом дивергенции явилось отделение общего предка для видов филады montana, далее разделившихся на две субфилады, тогда как выделение субфилады lummei происходило позже. Следует ожидать, что значения R(T) для пар видов, включающих D. virilis и представителя субфилады montana, будут выше, чем для пар, включающих D. virilis и представителя субфилады lummei, предполагая показанную Катлером прямую зависимость R(T) от времени дивергенции. Это ожидание не подтверждается полученными результатами. Тем не менее, топология приведенного дерева может соблюдаться при условии равномерного хода молекулярных часов в эволюционной линии D. virilis на отрезке, включающем дивергенцию с предковыми видами филады montana, и существования более позднего периода ускорения хода молекулярной эволюции в родословной D. virilis. При формировании предкового вида субфилады lummei происходило изменение скорости молекулярных часов, так как значение R(T) для пары видов D. virilis-D. lummei значительно выше 3. Внутри субфилады lummei также наблюдается значительное нарушение равномерности хода молекулярных часов. Низкие индексы дисперсии, характеризующие виды субфилады montana, свидетельствуют в пользу того, что при происхождении общего предка этих видов, соблюдалось правило равномерного хода молекулярных часов. Тем не менее, оценка среднего индекса дисперсии для каждого из этих видов позволяет предположить существование возможных периодов нарушения хода молекулярных часов на поздних этапах дивергенции, при расхождении вида D. montana и видов D. borealis и D. lacicola. В субфиладе kanekoi основные события, приводящие к формированию больших значений индекса дисперсии, должны были случиться независимо в 35 ходе формирования видов D. kanekoi и D. littoralis, тогда как дивергенция D. ezoana от предкового вида субфилады в наибольшей степени соответствовала равномерному ходу молекулярных часов. ОБСУЖДЕНИЕ Нами было установлено, что неравномерная скорость дивергенции близкородственных видов характерна как для морфологических, так и для молекулярных признаков. Однако причины изменений скорости эволюции морфологических и молекулярных признаков оказываются различными. Адаптивно значимые признаки в ходе эволюции подвергаются давлению направленного отбора. Но собственно направление отбора и его интенсивность могут существенно меняться даже для представителей одного вида, одновременно обитающих в разных географических изолятах и в разных климатических условиях. Как мы убедились на примере анализа формы крыловой пластины, в этом случае признак может обладать значительной внутривидовой изменчивостью, превышающей межвидовую для близкородственных видов. Важным результатом, полученным при исследовании формы крыловой пластины, является отсутствие направленных изменений по данному признаку в родословных видов данной группы. Даже те отличия, которые были показаны для нескольких видов по латеральной, наиболее консервативной области крыла, связаны с адаптивной дивергенцией видов по характеристикам двигательной активности и формировались, очевидно, независимо в разных родословных. Признаки формы копулятивного аппарата имеют иной характер изменчивости. Находясь под давлением полового отбора, данные признаки эволюционируют быстро и направленно. Значительная доля изменчивости видоспецифических признаков у эволюционно молодых видов принадлежит рецессивным признакам. В соответствии с концепцией «сита Холдейна», в аутбредных популяциях вероятность фиксации вновь возникающих рецессивных мутаций крайне мала (Haldane, 1927), и основной вклад в эволюционно-значимую изменчивость должен принадлежать доминантным мутациям. Вклад рецессивной изменчивости в формирование новых адаптаций за счет отбора по сохраняющейся в популяциях генетической изменчивости, был объяснен в теоретической работе Орра и Бетанкура (Orr, Betancourt, 2001). Наши результаты, свидетельствующие о сохранении значительной популяционной изменчивости по эволюционно-значимым признакам и преимущественном вкладе рецессивной изменчивости в эволюцию этих признаков, поддерживают концепцию Орра и Бетанкура. Мы показали, что скорость накопления генетической изменчивости не является постоянной величиной в каждой независимой эволюционной линии и различается между ними. Тем не менее, общая скорость накопления межвидовых различий по форме копулятивного аппарата является наиболее высокой среди прочих морфологических признаков, что соответствует концепции Сингха эволюции генов, ограниченных полом, по «быстрому пути», т.е. со скоростью, многократно превышающей среднюю скорость эволюции 36 генов данного генома (Civetta, Singh, 1998, Singh, Kulathinal, 2000, Haerty et. al., 2007). Вместе с тем, наличие значимого внутривидового полиморфизма по признакам формы копулятивного аппарата, являющихся статусными видовыми признаками, и данные регрессионного анализа показателей изменчивости данных признаков на генетические дистанции между видами предполагают, что эффективность полового отбора по этим признакам существенно снизилась после выделения вида как независимо эволюционирующей совокупности популяций. Следовательно, концепция Сингха приобретает звучание как «эволюция генов, ограниченных полом, по быстрому и прерывистому пути». Как известно, интенсивное формирование презиготических изоляционных барьеров опосредовано отбором при реализации симпатрических сценариев видообразования. Дрозофилы группы virilis проявляют межвидовые различия по частотным характеристикам брачной песни, за исключением видов субфилады lummei, для которых эти различия носят количественный характер и паттерны сигналов в значительной степени перекрываются (Hoikkala et al., 1982; Hoikkala, Lumme, 1987; Hoikkala, 1988; Routtu et al, 2007). Эти данные согласуются с нашим наблюдениям за эволюцией формы копулятивного аппарата, согласно которым наименьшими различиями обладают виды D. americana и D. novamexicana. Учитывая время дивергенции и направления миграции вновь возникающих видов, можно предположить, что формирование видов D. americana и D. novamexicana осуществлялось по аллопатрическому сценарию. Эволюция всех остальных видов происходила на сопредельной или общей территории и могла осуществляться по симпатрическому сценарию, что и привело к быстрому накоплению видоспецифической изменчивости по признакам, связанным с брачным поведением и оплодотворением. Интересно, что наибольшую нагрузку по накоплению видоспецифической изменчивости взяли на себя 5-я аутосома и микрохромосома, несущие видоспецифические инверсии у D. lummei. Этот результат подтверждает концепцию Добжанского об эволюционной роли хромосомных перестроек (Dobzhansky, 1971) и соответствует модели «подавления рекомбинации» при накоплении в перестройках видоспецифической изменчивости (Ayala, Coluzzi, 2008). Важно, что здесь впервые получено подтверждение концепции Добжанского на эволюционнозначимых признаках. Ранее такие подтверждения были сделаны на основании анализа замен в коллинеарных последовательностях, попадающих в районы перестроек или свободные от них области хромосом (Ranz et al., 2001, 2007). При анализе доминирования новых видоспецифических признаков удалось показать, что степень доминирования новых статусных признаков находится в прямой зависимости от времени существования вида с момента его дивергенции от предкового, и связана с эпистатической изменчивостью. Этот результат подтвердил концепцию Фишера об эволюции доминантности (Fisher 1928а,б, 1930), неразрывно связанную с эпистатическими, или модификационными межгенными отношениями. Концепция Фишера представлялась спорной, исходя из упрощенных представлений о регуляции 37 активности экспрессии генов, и была подвергнута жесткой критике со стороны Райта и последователей (Wright, 1934; Crosby, 1963; Kacser and Burns, 1981). Интерес к этой концепции возродился в связи с формированием принципиально новых парадигм молекулярной биологии, и основанных на них математических моделях эволюции генетической архитектуры (Bűrger 2005, 2008; Bagheri 2006; Kopp, Hermisson 2006; Johnson, Barton, 2007). Экспериментальные подтверждения этой концепции в последнее время были найдены в области экологической генетики, что ограничивало реализацию механизмов эволюции доминирования только для адаптивно-ценных признаков и на очень коротких эволюционных промежутках. Полученные нами подтверждения распространяются на отрезки времени, сопоставимые с продолжительностью существования вида. Они могут также объяснить показанный выше феномен направленной изменчивости в родословных данных видов. Отбор по признаку в популяции, дивергирующей от предкового вида, будет приводить к фиксации уклоняющейся формы, на основе сохраняющейся рецессивной изменчивости. На ранних этапах дивергенции этот отбор приведет к формированию асимметричного распределения селектируемого признака. Равная вероятность направления отбора в обоих направлениях на очередных этапах дивергенции будет восстановлена только после накопления новой изменчивости и восстановления симметричной формы распределения количественного признака, по которому идет отбор. Однако такое восстановление изменчивости будет затруднено на ранних этапах дивергенции, так как статус новых признаков является рецессивным, и стабилизирующий отбор по видоспецифическим признакам будет выметать из популяции уклоняющиеся формы, и, соответственно, новые аллели. Только по прошествии определенного времени, необходимого для формирования доминантного статуса нового признака, в популяции начнет накапливаться рецессивная изменчивость. Соответственно, чем короче эволюционные промежутки между последовательными актами дивергенции монофилетических видов, тем выше вероятность однонаправленной эволюции количественных признаков, подверженных действию отбора. Обращаясь к эффекту нарушения равномерного хода “молекулярных часов”, отметим прежде всего, что этот эффект показан нами для нейтральных или близких к нейтральности замен. Следовательно, влияние отбора на полученные оценки можно исключить, и сопутствующий отбору эффект hitchhicking также, учитывая применение поправки Гилеспи при определении средней оценки R(T) на данную эволюционную линию по всем используемым последовательностям. Тем не менее, влияние эффекта hitch-hicking возможно для независимых оценок R(T) по каждой последовательности. Катлер предпринял анализ численных моделей, учитывающих различные эволюционные факторы, которые могут влиять на темп накопления замен (Cutler, 2000). В соответствии с результатами этого анализа, интенсивный отбор, действующий на локус, должен способствовать снижению R(T), т.е., более равномерным темпам молекулярной эволюции. Полученные нами 38 результаты хорошо согласуются с выводами Катлера. Высоко полиморфный локус Adh, связанный с пищевыми адаптациями к бродящим субстратам и находящийся под действием положительного отбора (Merçot et al., 1994; Vieira, Charlesworth 2000; Sheeley, McAllister, 2008), имеет наименьший показатель индекса дисперсии. Консервативная митохондриальная последовательность 12S-16S mt rRNA имеет наибольший индекс дисперсии. Среди ядерных генов наибольшее значение (с учетом индекса инфляции Балмера) получено для гена Ras1, также высококонсервативного и обладающего исключительно низким популяционным полиморфизмом (Gasperini, Gibson, 1999). Эти факты подтверждают идею о том, что позитивный отбор (в отличие от очищающего отбора) способствует более равномерным темпам молекулярной эволюции. В 2008 г. Хартл и Бедфорд на примере видов дрозофил с проаннотированными геномами показали, что зависимость R(T) от количества накопленных замен носит положительный линейный характер. Тем не менее, методологически авторы сравнивали именно последовательности, скорость эволюции которых в геноме существенно варьирует, и использовали виды, время дивергенции которых различается от нескольких миллионов до нескольких десятков миллионов лет. Большие выборки последовательностей и качественные различия между эволюционными скоростями отдельных генов позволяют в этом случае игнорировать поправку Балмера. Однако оценка средних для генома показателей чувствительна к этой поправке. На графике, построенном для средних показателей изученных нами видов, хорошую линейную зависимость удается получить только с учетом поправки Балмера. Высокие значения R(T), полученные нами как для большинства парных сравнений родословных близкородственных видов дрозофил, так и средних значений для эволюционных линий видов филады virilis и субфилады kanekoi, свидетельствуют о влиянии популяционных механизмов на скорость накопления замен. Араки и Тачида, используя модель карточного домика (НОС) для описания замен, показали, что при условии как стохастического, так и периодического формирования бутылочных горлышек, уже после небольшого числа таких колебаний наблюдается значительный рост R(T). Авторы предположили, что возможным механизмом для генерации требуемой моделью периодичности «бутылочных горлышек» могут быть 100тысячелетние ледниково-межледниковые циклы. При сходном влиянии такого фактора на группу родственных видов, рост R(T) будет пропорционален времени дивергенции между видами, а следовательно, и генетическим дистанциям между ними. Мы не получили такого результата. Скорее, наоборот, наиболее поздно дивергировавшая субфилада lummei имеет максимальные значения R(T). Можно предполагать, что различные виды испытывали разное давление окружающей среды и в разной степени подвергались эффекту прохождения через «бутылочные горлышки». В целом полученные результаты соответствуют концепции мозаичности генома, в разных последовательностях которого процессы накопления изменчивости идут с разной скоростью. Предположение о неравномерном 39 темпе эволюционного процесса, в отношении времени дивергенции и времени независимого существования видов, прозвучало еще у Дарвина. Эта идея представлена и в теории Гулда и Элдриджа «прерывистого равновесия» (Eldredge, Gould, 1972). Хотя в виде правила, исполняемого в равной степени всеми последовательностями эволюционирующего генома, данная теория вряд ли найдет подтверждение, тем не менее, она справедлива для большого числа индивидуальных последовательностей в пределах одного генома. Изменение темпов эволюционного процесса является, очевидно, широко распространенным явлением, реализация которого на разных уровнях организации обеспечена действием различных эволюционных факторов. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. ВЫВОДЫ Показано, что на протяжении всего времени дивергенции видов группы virilis форма копулятивного органа самцов находилась под действием направленного полового отбора. Максимальному давлению отбора подвержены признаки вентральной поверхности эдеагуса, шипа на его конце и формы парамеров. Скорость накопления видоспецифической изменчивости по признакам формы копулятивного аппарата различается как между разными эволюционными линиями дрозофил группы virilis, так и в пределах каждой родословной. Связь эволюционно-значимых частей копулятивного аппарата дрозофилы с половым поведением опосредована сенсорными микрохетами на вентральной поверхности эдеагуса. Эволюция формы крыла у близнецовых видов virilis не имеет направленного характера, связана преимущественно с аллометрическими эффектами и указывает на участие данного признака в формировании частных адаптаций. Дивергенция по форме крыловой пластины осуществляется значительно медленнее, чем по признакам формы полового аппарата. Оценки дивергенции видов группы virilis методом RAPDфингерпринтинга и по последовательности гена Ras1 указывают на неравномерность хода молекулярной эволюции различных участков генома. Точные оценки равномерности хода молекулярных часов по последовательностям митохондриальных и ядерных генов у видов дрозофил группы virilis свидетельствуют о нарушениях хода молекулярных часов в большинстве эволюционных линий данной группы видов. Нарушение хода молекулярных часов характерно для поздних стадий дивергенции исследуемых видов. Показано, что неравномерная скорость накопления эволюционнозначимой и нейтральной изменчивости опосредована действием различных эволюционных факторов. Нарушения скорости накопления изменчивости по статусным видовым признакам связаны с действием полового отбора, выступающего в роли дизруптивного в момент 40 расхождения видов. Нарушения скорости накопления нейтральной изменчивости вызваны действием генетико-автоматических процессов. 8. Эволюция статусных признаков формы копулятивного аппарата у дрозофил осуществляется на основе сохраняющейся генетической изменчивости, в соответствии с концепцией Орра «Сито Холдейна и адаптации на основе поддерживающейся в популяции генетической изменчивости». 9. Степень доминирования нового фенотипа усиливается с течением времени, определяя темп и направленность накопления изменчивости; эволюция доминантности осуществляется за счет эпистатической изменчивости, в соответствии с концепцией Фишера «эволюции доминантности». 10.В накоплении видоспецифической изменчивости статусных признаков формы копулятивного аппарата принимают участие все хромосомы, но мажорная роль принадлежит 5-й и 6-й аутосомам, несущим видоспецифические инверсии, что соответствует модели «подавления рекомбинации». Список публикаций по теме диссертации 1. Горностаев Н.Г., Куликов А.М., Митрофанов В.Г. Морфологическая диагностика самцов видовой группы Drosophila virilis s.l. (Diptera, Drosophilidae) // Энтомологическое обозрение. 1998. Т. 77. Вып. 3. С. 700703. 2. Куликов А.М., Мельников А.И., Горностаев Н.Г., Митрофанов В.Г. Дивергенция видов дрозофил группы virilis по форме фаллуса // Докл. Акад. Наук. 2001. Т. 376. N 6. С. 841-843. 3. Куликов А.М., Мельников А.И., Горностаев Н.Г., Лазебный О.Е., Митрофанов В.Г. Морфометрический анализ половых органов самцов видов-двойников Drosophila virilis Sturt.// Генетика, 2004, Т.40. №2. С. 180-194. 4. Kulikov A.M., Melnikov A.I., Gornostaev N.G., Lazebny O. E. and Mitrofanov V. G. Morphological analysis of male mating organ in the Drosophila virilis species group: a multivariate approach // J. Zool. Syst. Evol. Research. 2004. V. 42. № 2. P. 135-144. 5. Темкина Л.М., Куликов А.М., Лазебный О.Е., Митрофанов В.Г. Некоторые проблемы исследования генетических основ видообразования на примере дрозофил группы virilis // Онтогенез. 2005. Т. 36. № 5. C. 1-7. 6. Кузнецов А., Куликов А.М. Рекуррентная модель зависимости динамики вытеснения рецессивной мутации от компонент приспособленности и способ ее решения // Генетика. 2005. Т. 41. № 3. C. 411-421. 7. Куликов А.М., Кузнецов А., Марец Ф., Митрофанов В.Г. Определение компонент приспособленности особей, несущих рецессивную летальную мутацию l(2)М167DTS с теплочувcтвительным доминантным эффектом, в популяционных экспериментах на D. melanogaster // Генетика. 2005. Т. 41. № 6. C. 767-777. 41 8. Марков А.В., Куликов А.М. Системы различения «своего» и «чужого» и формирование репродуктивной изоляции (гипотеза иммунологического тестирования брачных партнеров) // Успехи современной биологии. 2006. Т. 126, № 1. C. 10-26. 9. Марков А.В., Куликов А.М. Историческое развитие систем распознавания «своего» и «чужого» и их роль в эволюции биоразнообразия // Успехи современной биологии. 2006. Т. 126. № 2. C. 132-148. 10.Марков А.В., Куликов А.М. Гипотеза «иммунологического тестирования» партнеров – согласованность адаптаций и смены половых предпочтений // Известия РАН. Сер. биол. 2006. Т. 33. № 3. C. 205-216. 11.Марков А.В., Куликов А.М. Гипотеза «иммунологического тестирования» партнеров – системы распознания «свой-чужой» в исторической перспективе // Известия РАН. Сер. биол. 2006. Т. 33. № 4. C. 311-322. 12.Михайловский С.С., Куликов А.М., Потапов С.Г., Лазебный О.Е., Митрофанов В.Г. RAPD-фингерпринтинг видов-двойников дрозофил группы virilis // Генетика. 2007. Т. 43. № 1. C. 105-109. 13.Bubliy O.A., Tcheslavskaya K.S., Kulikov A.M., Lazebny O.E., Mitrofanov V.G. Variation of wing shape in the Drosophila virilis species group (Diptera: Drosophilidae) // J. Zool. Syst. Evol. Research. 2008. V. 46. № 1. P. 38-47. 14.Куликов А.М., Лазебный О.Е., Горностаев Н.Г., Чекунова А.И., Митрофанов В.Г. Неравномерность скорости эволюции у дрозофил группы virilis. I. Применение филогенетически опосредованных тестов Такезаки // Известия РАН. Сер. биол. 2010. № 1. C. 1-9. 15.Куликов А.М., Лазебный О.Е., Горностаев Н.Г., Чекунова А.И., Митрофанов В.Г. . Неравномерность скорости эволюции у дрозофил группы virilis. II. Применение теста Таджимы // Известия РАН. Сер. биол. 2010. № 2. C. 1-6. 16.Куликов А.М., Лазебный О.Е., Рыбакова Е.Ю. Оценка равномерности хода молекулярных часов в родословных видов дрозофил группы virilis // Вестник Московского Университета. Серия 16. 2010. Биология. Т. 65. № 4. С. 100-103. 42