Научно-техническое обоснование космического эксперимента «Мембрана-2»

Научно-техническое обоснование
космического эксперимента «Мембрана-2»
1. Сущность исследуемой проблемы. Краткая история и состояние вопроса
Биологические мембраны являются неотъемлемым компонентом всех без исключения
клеток и большинства внутриклеточных органелл, играют исключительную роль в
регуляции клеточного метаболизма. Согласно данным литературы, первичные
перестройки в структурно-функциональной организации растительных клеток при
экстремальном действии факторов внешней среды происходят на мембранном уровне,
в особенности, на уровне цитоплазматической мембраны (ЦМ). Известно, что ЦМ участвует
в обмене веществ между клеткой и окружающей средой, координирует синтез и
сборку целлюлозных микрофибрилл клеточной оболочки, передает гормональные и
внешние сигналы, которые контролируют рост и дифференциацию клеток. Эти функции в
значительной степени определяются специфическими молекулами, такими как рецепторы,
ферментные белки. Функционирование рецепторов и ферментов регулируется
физическими свойствами среды, в которой они находятся - липидного окружения.
Липидный бислой ЦМ выполняет функцию структурной основы, матрицы для белковых
молекул-ферментов, ионных каналов и рецепторов, барьерную функцию для ионов и
гидрофильных молекул. Отмеченные функции нарушаются при действии стрессовых
факторов и, предполагается, что реакции клеток растений на условия микрогравитации
ассоциированы с изменениями физико-химических свойств биологических мембран и, в
особенности, ЦМ. Идентификация последних является важной для понимания
адаптационных механизмов растительных клеток
Одной из первичных неспецифических реакций клеток на воздействие неблагоприятных
факторов является активация перекисного окисления липидов (ПОЛ). Активация ПОЛ
сопровождается перестройками физико-химических характеристик мембран, в частности
изменениями их жирнокислотного состава, вязкости липидного бислоя, активности
мембраносвязанных ферментов, что, в конечном итоге, сказывается на функциональной
активности клеток. Интенсификация ПОЛ и связанные с ней физико-химические
перестройки мембран в значительной степени определяются состоянием клеточных систем
защиты от окислительной деструкции. Последние включают низкомолекулярные и
ферментативные компоненты, в частности супероксиддисмутазу, каталазу, пероксидазу. В
связи с этим, изучение интенсивности ПОЛ, особенно в связи с предполагаемым его
участием в перестройках физико-химического состояния мембран, является также
перспективным
для
идентификации
адаптационных
механизмов к
условиям
микрогравитации.
Среди многочисленной литературы посвященной исследованию физико-химических
свойств мембран при действии разнообразных биотических и абиотических факторов
имеются единичные сведения, касающиеся структурно-функциональной организации ЦМ
в условиях космического полета. В определенной степени это обусловлено трудностью
адаптации экспериментальных методов исследования биологических мембран к требованиям
1
проведения экспериментов в условиях космического полета. Вместе с тем, данные,
полученные в эксперименте с модельными мембранами, показали существенное снижение
(менее 10 % наземного контроля (Наnke, 1996)) активности аламетоциновых каналов
полетных образцов, подтверждают актуальность исследования роли мембран в ответе
клеток на условия измененной силы тяжести.
О структурно-функциональных изменениях биологических мембран в условиях
измененной силы тяжести свидетельствуют данные, полученные в модельных
экспериментах, проведенных в Институте ботаники НАН Украины. Объектом
исследований служили микросомальные и ЦМ фракции, выделенные из корней проростков
гороха. ЦМ клеток корней проростков гороха, выращенных в условиях
клиностатирования при сравнении с контрольными, характеризовались изменениями
жирнокислотного состава, повышением индекса ненасыщенности (Polulyakh, 1988;
Polulyakh et al., 1989; Климчук та ін., 2006), активности Н+-АТФазы (Klymchuk et al., 2004),
микровязкости липидного бислоя (Klymchuk et al., 2006). В модельных экспериментах
других авторов было показано влияние липидного состава на активность протеин киназы С,
ключевого фермента, участвующего в передаче трансмембранных сигналов, и
функционирование мембраносвязанных ферментов (Liscovitch, 1992; Nishizuka et al., 1983;
1992).
Интенсивность ПОЛ в условиях измененной силы тяжести изучалась в клетках
хлореллы, культуры ткани гаплопаппуса и препаратах ЦМ, полученных из корней
проростков гороха (Zhadko et al., 1992; Baranenko, 2003). Выявленное повышение уровня
ПОЛ связывают с его возможным участием в перестройках физико-химического состояния
мембран. Обнаружено также активацию антиоксидантной системы клеточной защиты на
основании измерения активности супероксиддисмутазы. Исследование активности
каталазы, пероксидазы не проводились. В связи с этим, целесообразно комплексное
изучение уровня ПОЛ и состояния антиоксидантной клеточной защиты и их возможным
участием в мембранных перестройках в условиях измененной силы тяжести.
2. Необходимость проведения КЭ в условиях космического пространства в составе РС
МКС
Отсутствие экспериментальных данных о влиянии микрогравитации на физико-химические
свойства биологических мембран, важнейшего регулятора клеточного гомеостаза и их роли
в гравичувствительности растительной клетки, что необходимо для получения новых знаний
в области фундаментальных основ организации и жизнедеятельности биологических
объектов.
3. Описание КЭ
3.1 Порядок проведения КЭ
- предполетная подготовка объектов;
- доставка материала в термостате «доставки» к месту старта транспортного корабля, с
последующей доставкой на МКС;
- размещение биологического материала (биоконтейнеры) в отдельных блоках НА
«Биолаборатории-М»;
2
- выращивание материала в бортовом термостате и центрифуге «Биолаборатории-М»;
- фиксация выращенного материала по окончании эксперимента;
- размещение фиксированных образцов в термостате «доставки»;
- транспортировка материалов эксперимента на Землю;
- обработка и анализ биологического материала и видеоматериала в лабораторных условиях;
- составление экспресс и заключительного отчетов.
3.2 Принципиальные требования к условиям выполнения КЭ:
- поддерживать необходимую температуру (+250±10С);
- центрифугирование биологических объектов в режиме 1g;
- фиксация материала;
- хранение материала при температуре минус 150С или +40С.
3.3 Технические особенности НА
НА «Биолаборатория-М» является многоцелевой, не имеющей зарубежных аналогов,
аппаратурой для проведения биологических космических экспериментов широкого профиля.
Она состоит из блоков, включающих следующие конструктивные модули:
- бортовой термостат;
- холодильно-морозильный блок;
- центрифугу;
- биоконтейнеры различной конфигурации;
- устройство для фиксации биологического материала;
- автономный блок питания;
- цифровую камеру;
- кабели питания и кабели для подключения к ИУС;
- комплект ЗИП.
3.4. Методическое особенности проведения эксперимента
Для изучения структуры и функций биологических мембран необходимо получение
достаточно чистых мембранных фракций. Получение фракции цитоплазматической
мембраны планируется с помощью водно-полимерной системы, метода, который
основывается на избирательном концентрировании мембранных везикул в одной из фаз и
происходит благодаря незначительным отличиям в энергиях взаимодействия их
поверхности с полимерными компонентами фаз. Распределение между фазами
обусловлено как природой и свойствами полимеров, которые образовывают фазы, так и
свойствами мембранных везикул: площадью поверхности, ее структурой, электрическим
зарядом, поверхностными реакционными центрами. Особое внимание будет направлено на
определение чистоты мембранных фракций при помощи маркерных ферментов и
электронной микроскопии. Также будут проводиться тесты на ориентацию везикул ЦМ
3
с помощью детергентов. Для получения фракций ЦМ планируется использовать клетки
каллусных культур арабидопсиса (сои). Выращенный на орбите материал будет
подвергаться замораживанию и в таком виде доставляться в лаборатории постановщиков КЭ
или подвергаться предварительной химической фиксации.
4 Новизна, оценка качественного уровня по
отечественными и зарубежными исследованиями
сравнению
с
аналогичными
Впервые будет проведен комплекс физико-химических исследований структурнофункциональной организации биологических мембран клеток высших растений, в
частности, будут получены сведения, касающиеся содержания и состава липидов,
активности Н+-АТФазы ЦМ, микровязкости липидного бислоя, интенсивности
перекисного окисления липидов и активности ферментов антиоксидантной клеточной
защиты в условиях микрогравитации. Предполагается, что планируемое исследование
комплекса структурно-функциональных характеристик биологических мембран, в первую
очередь ЦМ, позволит оценить их роль в ответе растительных клеток на условия
микрогравитации.
5. Ожидаемые результаты и
областей применения)
их предполагаемое использование (с указанием
5.1 Основными результатами КЭ будут следующие:
5.1.1 Оценка физико-химических свойств биологических мембран непосредственно в
условиях космического полета.
5.1.2 Полученные в данном эксперименте результаты позволят сформулировать гипотезу о
роли мембран, главным образом цитоплазматической мембраны, о гравитационной
чувствительности растительной клетки.
5.2 Результаты предполагается использовать:
Ожидаемые результаты необходимы для оценки роли мембранно-связанных процессов в
адаптации растительных клеток к условиям измененной силы тяжести Они будут служить
основой при планировании дальнейших исследований и могут представлять интерес для
таких организаций как космические агентства России, Украины и США.
6. Обоснование технической возможности создания НА с заданными характеристиками
Соисполнители со стороны Украины, имея 35-летний опыт конструирования НА, которая
успешно работала на станциях «Мир» и «Салют», опираясь на опыт и оригинальные идеи
украинских ученых в области биологических космических исследований, имеет всю
техническую, технологическую и кадровую инфраструктуру для создания аппаратуры с
заданными характеристиками.
7. Характеристики рисков и дискомфорта для экипажа, связанных с КЭ
Создаваемая научная аппаратура, материалы и технологии проведения эксперимента сводит
риск и дискомфорт экипажа практически к нулю.
4
Список цитируемой литературы
1. Бараненко, В.В. (2003) Пероксидне окиснення ліпідів та активність супероксиддисмутази в
рослинах гороху за умов кліностатування. Автореф. дис. на здобуття наук. ступ. канд. біол.
наук. Київ,Україна, 24 с (Укр.).
2. Жадько, С.И., Климчук, Д.А., Кордюм, Е.Л., Сытник, К.М., Сидоренко, П.Г., Барабой, В.А.
(1992) Перекисное окисление липидов и ультраструктурная организация клеток культуры
ткани Haplopappus.” Результаты исследований на биоспутниках» (Под ред.О.Г. Газенко)
Москва, Наука..с. 321-323.
3. Климчук, Д.О., Куриленко І.М., Воробйова Т.В., Дубовой В.Д. (2006) Отримання
препаратів цитоплазматичної мембрани з коренів гороху методом двофазової воднополімерної системи. Наук. вісник Ужг. ун-ту. Сер.: Біологія, Вип.. 19, с. 126-131 (Укр).
4. Кордюм, Е.Л., Сытник, К.М., Белявская, Н.А., Жадько, С.И., Климчук, Д.А., Полулях,
Ю.А. (1994) Современные проблемы космической клеточной фитобиологии. - М.: Наука, 293 с.
5. Полулях, Ю.А. (1988) Фосфолипидный и жирнокислотный состав плазматических
мембран клеток корней гороха в условиях клиностатирования. Докл. АН УССР. Сер. Б. 10:
67-69.
6. Румянцева В.Б., Мерзляк М.Н., Машинский А.Л., Нечитайло Г.С. (1990) Влияние факторов
космического полета на пигментный и липидный состав растений пшеницы. Космич. Биол.
Авиакосмич. Медицина. 2: 53-55.
7. Таирбеков, М.Г., Кабицкий, Е.Н., Маилян, Э.С. (1980) АТФ-азная активность в клетках
корней кукурузы, выращенных в условиях измененной силы тяжести.Физиол. Раст. 27 (4):
883-885.
8. Hanke, W. (1996). Planar lipid bilayer as model system to study the interaction of gravity with
biological membranes. In: 30th Plenary Meeting COSPAR, 1994, 283.
9. Klymchuk, D.O., V.V. Baranenko, T.V. Vorobyova, I.M. Kurylenko, O.A. Chyzhykova, V.D.
Dubovoy (2004) Characterization of H+-ATPase activity in plasma membrane from pea seedlings
under altered gravity. J. Gravit. Physiology. 11 (2): 205-206.
10. Klymchuk, D.O., Vorobyova T.V., Dubovoy V.D.,Bezruk L.I., Baranenko V.V. (2006) Fluidity
of Pea Root Plasma Membranes under Altered Gravity. J. Gravit. Physiology. 13(1): 123-124.
11. Klymchuk, D.O., V.V. Baranenko, T.V. Vorobyova, I.M. Kurylenko, O.A. Chyzhykova, V.D.
Dubovoy, Palladina T.O. (2009) Properties of the Plasma Membrane from Pea Seedling Roots
under Altered Gravity Вісник ХНАУ, 2009, серія Біологія, вип. 2, с. 47-55.
12. Kordyum, E.L. (1997) Biology of plant cells in microgravity and under clinostating. Intern.
Review of Cytology 171:1-78.
13. Larsson, C., Sommarin, M., Widell, S. (1994) Isolation of highly purified plant plasma
membranes and separation of inside-out and right-side-out vesicles. Methods Enzymology 228:
451-469.
14. Liscovitch, M. (1992) Crosstalk among multiple signal-activated phospholipases. Trends
5
Biochem. Sci. 17: 393-399.
15. Nishizuka, Y. (1983) Phospholipid degradation and signal translation for protein
phosphorylation. Trends Biochem. Sci. 17: 713-716.
16 Nishizuka, Y. (1992) Intracellular signaling by hydrolysis of phospholipids and activation of
protein kinase C. Science 258: 607-613.
17. Polulyakh, Yu. A., Zhadko, S. I., Klymchuk, D. A., Baraboy, V. A., Alpatov, A. N., Sytnik, K.
M. (1989) Plant cell plasma membrane structure and properties under clinostating. Adv. Space Res.
9(11): 71-74.
18. Schatz, A., Reitstetter, R., Briegleb, W., Linke-Hommes A. (1992) Gravity effects on biological
systems. Adv.Spase Res. 12(1): 51-53.
19. Schatz, A., Reitstetter, R., Linke-Hommes, A., Briegleb, W., Slenzka, K. and
Rahmann, H. (1994) Gravity effects on membrane processes. Adv. Space Res. 14 (8): 835-843.
6