Занятие 1. - Биологический факультет

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ
Кафедра микробиологии
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ
Методические указания к лабораторным занятиям
для студентов биологического факультета
специальности 1-31 01 03 «Микробиология»
Минск
2015
1
А в т о р: Е.В. Литвинова
Рекомендовано
Советом биологического факультета
28 января 2015 г., протокол № 7
Рецензент:
кандидат биологических наук, доцент В.В. Лысак
2
ВВЕДЕНИЕ
Фармацевтическая микробиология – прикладная, профессионально ориентированная дисциплина, интегрирующая сведения общей микробиологии и ее
прикладных направлений (медицинской, санитарной, промышленной микробиологии) для применения в сфере разработки, исследования, производства и
контроля качества фармацевтических препаратов.
Основные задачи фармацевтической микробиологии:
1. Разработка методов и проведение микробиологического контроля качества фармацевтической продукции (стерильности, микробной контаминация
сырья и нестерильных лекарственных средств, количественное определение
действующих веществ);
2. Выявление микроорганизмов-контаминантов производственных условий и разработка эффективных методов предотвращения попадания посторонней микробиоты в производственные условия. Мониторинг производственной
среды;
3. Овладение принципами безопасной работы с микроорганизмами;
4. Участие в технологическом процессе получения фармацевтических субстанций с использованием процессов микробного синтеза (поддержание и селекция микроорганизмов-продуцентов биологически активных веществ, подготовка посевного материала, контроль процесса ферментации);
5. Контроль за соблюдением правил производственной гигиены.
Фармацевтическая микробиология изучает:
- микробиоту лекарственных средств (ЛС);
- пути загрязнения ЛС;
- средства деконтаминации ЛС;
- микробиологический мониторинг производства;
- заболевания лекарственных растений, вызываемые микроорганизмами;
-процессы порчи лекарственных растений и сырья под действием микроорганизмов;
- методы асептики и антисептики;
- методы дезинфекции при производстве лекарственных препаратов;
-технологии получения микробиологических, иммунологических, диагностических, профилактических, лечебных средств и т.п.
3
Тема 1. СИСТЕМА ОБЕСПЕЧЕНИЯ КАЧЕСТВА НА
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОМ ПРОИЗВОДСТВЕ
Обеспечение качества – это совокупность организационных мероприятий,
предпринимаемых в целях гарантии соответствия качества ЛС их назначению.
Система обеспечения качества в производстве ЛС гарантирует:
1. Четкое определение обязанностей руководства.
2. Создание ЛС путем планирования, разработки, исследования и внедрения с учетом требований правил надлежащего производства и надлежащей лабораторной практики.
3. Составление четкой документации на все производственные и контрольные операции.
4. Производство, поставку и использование надлежащих исходных и упаковочных материалов, выбор и мониторинг поставщиков.
5. Изготовление, проверку и хранение готовой продукции в надлежащих
условиях, исключающих риск получения некачественной продукции.
6. Качество продукции на протяжении всего срока годности при хранении,
реализации и последующем обращении.
7. Выпуск ЛС в обращение только после того, как Уполномоченное лицо
удостоверит, что каждая серия продукции была произведена и проконтролирована в соответствии с требованиями регистрационного досье и другими требованиями в отношении производства, контроля и реализации ЛС.
8. Проведение самоинспекции и/или аудита (контроля сторонней организации) качества, которые повышают эффективность системы обеспечения качества.
Фармацевтическая система качества должна быть определена и документально оформлена, а ее эффективность проконтролирована.
Предприятие должно разработать руководство по качеству, содержащее
описание системы управления качеством, включая обязательства ключевого
персонала.
Качество, безопасность и эффективность ЛС должны быть подтверждены
на всех этапах его разработки, производства, испытания и реализации.
Надлежащая производственная практика (GMP) – часть системы обеспечения качества, которая направлена на обеспечение высокого уровня качества, безопасности и эффективности лекарственных средств и гарантирование того, что лекарственное средство изготовлено в соответствии со своей формулой (составом), не содержит посторонних включений, маркировано надлежащим образом, упаковано и сохраняет свои свойства в течение всего срока годности.
Надлежащая производственная практика устанавливает требования к системе
управления качеством, контролю качества, персоналу, помещениям и оборудованию,
документации, производству продукции и проведению испытаний, порядку отзыва
продукции и организации самоинспекций.
Надлежащая производственная практика – совокупность правил по организации промышленного производства и контролю за качеством лекарственных
средств.
4
Этапы обращения
нового ЛС
Доклинические испытания
Клинические испытания
Промышленное
производство
Хранение
Оптовая продажа
Поступление к потребителю
через аптечную сеть
Система требований
GLP – Good Laboratory Practice – надлежащая
лабораторная практика
GCP – Good Clinical Practice – надлежащая
клиническая практика
GMP – Good Manufacturing Practice – надлежащая
производственная практика
GSP – Good Storage Practice – надлежащая
практика хранения лекарственных средств.
GDP – Good Distribution Practice – надлежащая
практика оптовой реализации
GPP – Good Pharmacy Practice – надлежащая
аптечная практика
Правила GMP направлены на решение двуединой задачи:
1. Гарантия качества производимой продукции
2. Уменьшение риска, свойственного любой фармацевтической продукции, который не может быть полностью исключен при проверке на соответствие стандартам качества.
Основные положения GMP:
1. Все производственные процессы должны быть четко определены и описаны, систематически проверяться и пересматриваться с учетом накопленного
опыта.
2. Все критические производственные этапы и существенные изменения
процесса должны быть обоснованы и валидированы.
3. Все инструкции и процедуры должны быть даны в письменной форме
ясно и однозначно, относиться к конкретным предметам и обеспечивать возможность выполнения операций.
4. Во время процесса производства необходимо вести записи (вручную
и/или с использованием записывающих устройств), которые подтверждают выполнение всех стадий процесса в соответствии с установленными процедурами
и инструкциями, а также что количество и качество продукции на каждом этапе
соответствуют запланированным.
5. Любые отклонения должны быть запротоколированы и исследованы,
должны быть приняты соответствующие корректирующие и предупреждающие
действия.
6. Предприятие должно иметь в наличии:
- обученный персонал, имеющий необходимую квалификацию;
- подходящие площади и помещения;
- необходимое оборудование и вести правильную его эксплуатацию;
5
- соответствующие исходные материалы, упаковочные материалы, этикетки;
- соответствующие условия хранения и транспортирования продукции.
7. На каждую производственную серию продукции должны вестись протоколы, позволяющие проследить историю серии.
8. При оптовой реализации продукции должен быть сведен к минимуму
риск снижения ее качества.
9. Должна быть организована система отзыва любой серии реализованной
продукции, а также система расследования рекламаций на качество продукции,
выявления несоответствий и принятия мер к предотвращению случаев несоответствия.
Задание 1. Ознакомление с организацией системы обеспечения качества на
предприятии фармацевтической отрасли.
Ход работы
Занятие 1. Экскурсия на фармацевтическое предприятие РУП
«Белмедпрепараты».
В ходе экскурсии студенты посещают один из производственных цехов по
производству готовой
фармацевтической продукции
или опытнопромышленный участок. Студентам демонстрируются следующие обучающие
фильмы:
1. Об основных направлениях деятельности и перспективах развития РУП
«Белмедпрепараты»;
2. Об организации системы обеспечения качества на предприятии.
Вопросы для подготовки:
1. Что такое обеспечение качества?
2. Назначение системы обеспечения качества.
3. Надлежащая производственная практика и ее место в системе обеспечения качества.
4. Основные положения надлежащей производственной практики.
5. Микробиологический мониторинг как неотъемлемая часть надлежащей
производственной практики, объекты микробиологического мониторинга.
Тема 2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖИВЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ
КЛЕТОК В ПРОБИОТИКАХ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
Пробиотики – биотехнологические препараты из живых микроорганизмов
– нормальных «обитателей» кишечного тракта здорового человека – и веществ
микробного происхождения, оказывающие при естественном пути введения
положительный эффект через регуляцию микробиоты кишечника.
6
Термин «пробиотик», от латинского pro bio — «для жизни», был предложен Lilly D.M. и Stilwell R.H. в 1965 г. как альтернатива термину «антибиотики», означающему «против жизни».
Современное определение пробиотиков было дано Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) в 2002 г: «Пробиотики – это живые микроорганизмы, которые при применении в адекватных количествах вызывают улучшение
здоровья организма-хозяина»
Роль пробиотиков:
1. Антагонистически (несовместимо с жизнью) действуют в отношении патогенных, условно патогенных бактерий, дрожжей, грибов, вирусов.
2. Улучшают нарушенный баланс микроорганизмов в желудочнокишечном тракте, устраняют дисбиоз (количественные и качественные изменения состава кишечной микробиоты) и дисбактериоз (качественное изменение
бактериальной микробиоты организма, преимущественно кишечника).
3. Выполняют защитную и детоксикационную (помогают очищать организм) роль по отношению к радиационному воздействию, химическим загрязнителям пищи, канцерогенным и токсическим веществам, экзотической и непривычной пище.
4. Продуцируют витамины (K, фолиевую кислоту, пиридоксин), расщепляют желчные кислоты, холестерин и координирует его уровень, принимает
участие в рециркуляции женских половых гормонов.
5. Оптимизирует процесс пищеварения, моторную функцию кишечника.
6. Способствуют активизации иммунной системы.
К микроорганизмам, используемым в качестве пробиотиков, относят:
- лактобактерии (Lactobacillus acidophilus, L. plantarum, L. casei, L. lactis, L.
reuteri, L. rhamnosus, L. fermentum,, L. gassed);
- бифидобактерии (Bifidobacterium bifidum, B. infantis, B. longum, B. breve,
B. adolescents);
- непатогенные разновидности бактерий E. сoli;
- непатогенные спорообразующие бактерии вида Bacillus subtilis;
- непатогенные разновидности бактерий Enterococcus faecium, и Е. salivarius;
- бактерии, родов Bifidobacrerium, Lactobacillus, Enterococcus, Streptococcus, синтезирующие в процессе метаболизма молочную кислоту;
- дрожжевые грибки вида Saccharomyces boulardii.
В зависимости от состава различают следующие виды пробиотиков:
1. Монокомпонентные – содержат только один вид бактерий: Лактобактерин, Бифидумбактерин, Бактолакт, Бактисубтил.
2. Поликомпонентные – включают несколько видов живых микроорганизмов: Линекс, Ацилакт, Лактобациллин, Энтерожермина.
3. Комбинированные (симбиотики) – содержат как живые бактерии, так и
пребиотики (химические вещества, которые содержатся в довольно широком
спектре продуктов питания: олигофруктоза, инулин, пантотенат кальция, лактулоза, пектины, декстрин, каротиноиды и др.): Бифилиз, Полибактерин.
7
Фармакологическая активность препаратов-пробиотиков зависит от количества и состояния входящих в их состав бактериальных клеток. Поэтому количество жизнеспособных клеток в одной терапевтической дозе таких лекарственных средств является одним из основных показателей качества.
Как правило, одна доза лекарственного средства-пробиотика должна содержать не менее 107 живых бактериальных клеток.
Задание 1. Определение количественного содержания живых бактериальных клеток в поликомпонентном пробиотике на основе бактерий.
Определение количественного содержания жизнеспособных клеток, как
правило, проводят следующим способом:
1. Приготовление серии десятикратных разведений с учетом предполагаемого титра в готовой лекарственной форме;
2. Посев на соответствующую питательную среду, культивирование, подсчет выросших колоний микроорганизмов и определение тира клеток.
Ход работы
Занятие 1. Определение количества живых клеток бактерий Bacillus
subtilis и Lаctobacillus acidophilus в сухом (лиофилизированном) лекарственном средстве Лактобациллин методом посева на (в) питательные среды.
Испытуемое лекарственное средство:
Лактобациллин, порошок лиофилизированный для приготовления суспензии для приема внутрь 5 доз, во флаконах.
1 доза препарата содержит:
- живых клеток бактерий Lаctobacillus acidophilus – не менее 107;
- живых клеток бактерий Bacillus subtilis – не менее 107.
Питательные среды и растворы:
Для количественного определения клеток бактерий Lаctobacillus acidophilus используют стерильное восстановленное молоко.
Для количественного определения клеток бактерий Bacillus subtilis используют агаризованную среду № 1 (Государственная фармакопея Республики
Беларусь – ГФ РБ).
Стерильность и ростовые свойства питательных сред должны быть подтверждены предварительно.
Для приготовления суспензии лекарственного средства и приготовления
разведений используют 0,9% изотонический раствор натрия хлорида или стерильную очищенную воду, которые прибавляют из расчета 1 мл на одну дозу
препарата (т.е. 5 мл).
Количественное определение живых клеток бактерий Lаctobacillus acidophilus:
8
Из полученной суспензии лекарственного средства готовят серию десятикратных разведений (до 10-9) в пробирках со стерильным восстановленным молоком.
Пробирки с инокулятом инкубируют в термостате при температуре
(37±1) °С в течение 72 ч.
Количественное определение живых клеток бактерий Bacillus subtilis:
Из полученной суспензии лекарственного средства готовят серию десятикратных разведений (до 10-6) в пробирках с 0,9% изотоническим раствором
натрия хлорида или стерильной очищенной водой.
Из двух последних разведений (10-5 и 10-6) делают высевы на среду № 1
(ГФ РБ) по две чашки на каждое разведение. Для этого на поверхность подсушенной агаризованной среды № 1 в чашках Петри стерильной пипеткой наносят 0,1 мл соответствующего разведения суспензии лекарственного средства и
распределяют стерильным шпателем по всей поверхности среды. Для каждого
посева используют новую стерильную пипетку и шпатель.
Чашки переворачивают крышками вниз и инкубируют в термостате при
температуре (37±1) °С в течение 24 – 48ч.
Занятие 2. Учет результатов. Анализ соответствия качества испытуемого лекарственного средства по показателю «Количественное определение живых бактериальных клеток».
По окончании инкубирования проводят учет результатов по макроскопическим признакам роста микроорганизмов.
Для бактерий Lаctobacillus acidophilus отмечают наличие или отсутствие
роста микроорганизмов по свертыванию молока в пробирке с определенным
разведением.
Количество живых клеток бактерий Lаctobacillus acidophilus в 1 мл (1 дозе)
суспензии лекарственного средства определяют по последнему разведению, в
котором обнаружен рост.
Для бактерий Bacillus subtilis подсчитывают количество выросших колоний
на чашках с обоими разведениями. Суммируют результаты параллельных высевов из одного и того же разведения и определяют среднее количество колоний.
При этом учитывают, что оптимальное разведение – разведение, при высеве из
которого выросло от 50 до 150 колоний.
Количество живых клеток бактерий Bacillus subtilis в 1 мл (1 дозе) суспензии лекарственного средства вычисляют по формуле:
a x 10n
,
M =
V
где:
М – количество клеток в 1 мл;
а – среднее количество колоний при высеве из данного разведения;
10 – коэффициент разведения;
9
n – степень разведения;
V – объем суспензии, взятый для посева на чашку Петри (мл).
Результаты заносят в таблицу 1
Таблица 1
Определение количества живых клеток бактерий Bacillus subtilis и
Lаctobacillus acidophilus в лекарственном средстве Лактобациллин
Наименование
микроорганизма
Количество
живых клеток в 1 мл
препарата
Критерий
приемлемости
Соответствие
критерию приемлемости
≥ 107
Lаctobacillus
acidophilus
Bacillus subtilis
≥ 107
В заключение делают вывод о соответствии качества испытуемого лекарственного средства по показателю «Количественное определение живых бактериальных клеток».
Вопросы для подготовки:
1. Что такое антибиотики и пробиотики?
2. Фармакологические свойства пробиотиков.
3. Требования к микроорганизмам, входящим в состав пробиотиков.
4. Виды пробиотиков.
5. От чего зависит фармакологическая активность пробиотиков?
6. Принцип определения количественного содержания действующих компонентов пробиотиков.
Тема 3. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ
НЕСТЕРИЛЬНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
Уровень микробной чистоты – один из основных показателей качества лекарственных средств и фармацевтических субстанций (активных фармацевтических ингредиентов).
Важность микробиологического контроля в фармацевтическом производстве обусловлена последствиями присутствия микроорганизмов как в стерильных, так и в нестерильных ЛС, создающими опасность для здоровья и жизни человека.
Микробиологические требования к качеству нестерильных ЛС вырабатывались в связи с выявлением случаев заболевания людей в результате применения загрязненных микроорганизмами препаратов.
Нестерильные препараты – препараты, в которых допускается содержание
живых микроорганизмов, требования к количеству и качественному составу которых зависит от вида и назначения продукции. Нестерильные лекарственные
средства составляют ~ 80 % от общего количества лекарственных средств.
Требования к качеству нестерильной продукции:
10
- должна содержать ограниченное количество микроорганизмов;
- не должна содержать определенные виды микроорганизмов;
-допустимое количество и виды микроорганизмов зависят от пути введения препарата.
Методы определения микробиологической чистоты нестерильных лекарственных средств и фармацевтических субстанций:
1. Метод высева на чашки Петри с питательной средой
- метод глубинного посева;
- метод поверхностного посева.
2. Метод мембранной фильтрации
3. Метод наиболее вероятного числа (наименее точный метод, используется для продуктов с очень низкой бионагрузкой).
Возможность обнаружения микроорганизмов-контаминантов в нестерильном лекарственном средстве должна быть доказана, для чего необходимо провести проверку пригодности используемых питательных сред (стерильность,
ростовые, ингибирующие, индикаторные свойства), а также проверку наличия
либо отсутствия антимикробного действия лекарственного средства (фармацевтической субстанции). При наличии антимикробного действия оно должно
быть надлежащим образом устранено.
Задание 1. Определение микробиологической чистоты нестерильного лекарственного cредства (таблеток, капсул) или фармацевтической субстанции /
вспомогательного вещества.
Лекарственные средства в форме таблеток и капсул по способу применения относятся к неводным лекарственным средствам для внутреннего применения. В соответствии с ГФ РБ (т.1, изд-е 2 раздел 5.1.4.) критерии приемлемости
для микробиологической чистоты по содержанию колониеобразующих единиц
(КОЕ) в 1 г данной группы препаратов следующие:
- общее количество аэробов (ОКА) – 103 КОЕ/г;
- общее количество грибов (ОКГ) – 102 КОЕ/г;
- отсутствие бактерий Escherichia coli в 1г.
Критерии приемлемости для микробиологической чистоты нестерильных
субстанций для производства нестерильных лекарственных средств, а также
для вспомогательных веществ следующие:
- ОКА и ОКГ – 102 КОЕ/г суммарно;
- Отсутствие Escherichia coli в 1г.
Если в нормативной документации не указано иное, используют 10 г или
10 мл испытуемого продукта, растворяя или суспендируя данное количество в
соответствующем растворителе в отношении 1:10.
Метод определения микробиологической чистоты – метод глубинного или
поверхностного посева на чашки Петри с питательной средой.
Для определения микробиологической чистоты нестерильных лекарственных средств используют следующие питательные среды:
11
- для выявления ОКА – агаризованную среду на основе гидролизата казеина и соевых бобов или агаризованную среду №1;
- для выявления ОКГ – декстрозный агар Сабуро или агаризованную среду
№2;
- для выявления бактерий Escherichia coli – бульон на основе гидролизата
казеина и соевых бобов, бульон Макконки, агар Макконки.
Ход работы
Занятие 1. Определение микробиологической чистоты (содержания
ОКА и ОКГ) нестерильного лекарственного cредства (таблеток, капсул)
или фармацевтической субстанции / вспомогательного вещества методом
глубинного посева на чашки Петри с питательной средой.
Питательные среды и буферные растворы:
Для приготовления испытуемого образца (лекарственного средства, субстанции / вспомогательного вещества) используют забуференный раствор
натрия хлорида и пептона (рН 7,0), или фосфатный буферный раствор (рН 7,2)
или бульон на основе гидролизата казеина и соевых бобов.
Приготовление испытуемого образца:
10 г испытуемого продукта растворяют или суспендируют в 100 мл забуференного раствора натрия хлорида и пептона (рН 7,0) или фосфатного буферного раствора (рН 7,2), или бульоне на основе гидролизата казеина и соевых
бобов (разведение 1:10).
Приготовленный образец разводят в 10 раз в пробирках, используя тот же
растворитель (разведение 1:100).
Если испытуемый продукт обладает антимикробным действием, его
нейтрализуют подходящим способом.
Инокулирование приготовленного образца:
Для определения содержания ОКА и ОКГ используют по 2 чашки Петри
для каждого разведения.
Для выявления ОКА: по 1 мл разведения испытуемого продукта 1:10 и
1:100 вносят в 2 чашки Петри для каждого разведения. Добавляют ~ 15 мл
предварительно расплавленной и охлажденной ~ до 40 – 45°С агаризованной
среды №1 или агаризованной среды на основе гидролизата казеина и соевых
бобов. Тщательно перемешивают для равномерного распределения образца
препарата.
Для выявления ОКГ: по 1 мл разведения испытуемого продукта 1:10 и
1:100 вносят в 2 чашки Петри для каждого разведения. Добавляют ~ 15 мл
предварительно расплавленной и охлажденной ~ до 40 – 45°С агаризованной
среды №2 или декстрозного агара Сабуро. Тщательно перемешивают для равномерного распределения образца препарата.
Отрицательный контроль (проверка на стерильность растворителя и сред).
1 мл растворителя, используемого для приготовления раствора/суспезий
испытуемого продукта, вносят в чашку Петри и добаваляют ~ 15 мл предварительно расплавленной и охлажденной ~ до 40 – 45°С соответствующей агаризо12
ванной. Тщательно перемешивают для равномерного распределения растворителя.
Чашки Петри предварительно должны быть промаркированы с указанием
наименования испытуемого продукта, выявляемых микроорганизмов (ОКА или
ОКГ), степени разведения, имени исследователя, даты испытания.
Инкубирование:
После застывания агаризованной среды чашки инкубируют:
• в течение 3 – 5 суток при температуре 30 – 35°С для выявления ОКА;
• в течение 5 – 7 суток при температуре 20 – 25°С для выявления ОКГ
Занятие 2. Учет и интерпретация результатов. Анализ соответствия
качества испытуемого образца по показателю «Микробиологическая чистота».
По истечении периода инкубирования подсчитывают количество выросших колоний бактерий и грибов. Результаты заносят в таблицы 2 и 3; рассчитывают число КОЕ (ОКА и ОКГ) в 1г испытуемого продукта и делают вывод о
соответствии их содержания установленным критериям приемлемости.
Таблица 2
Определение содержания общего количества аэробов (ОКА)
Разведение
ч.№1
число
коло
ний
ч.№2
число
коло
ний
Среднее
*Содерж
арифмеание
тическое
ОКА,
числа ко- КОЕ/г
лоний
(Х)
(а)
Среднее
арифметическое
ОКА,
КОЕ/г
Критерий
приемлемо
сти
Соответствие
крите
рию
приемлемости
Отрицательный
контроль
1:10
103
КОЕ/г
1:100
Таблица 3
Определение содержания общего количества грибов (ОКГ)
Разведение
ч.№1
число
коло
ний
ч.№2
число
колоний
Среднее
*Содерж
арифмеание
тическое
ОКГ,
числа ко- КОЕ/г
лоний
(Х)
(а)
Среднее
арифметическое
ОКГ,
КОЕ/г
Критерий
приемлемо
сти
1:10
102
КОЕ/г
1:100
13
Соответствие
крите
рию
приемлемости
Отрицательный
контроль
*Содержание ОКА и ОКГ (Х) рассчитывается следующим образом:
Х = а · 10n ,
где:
а – среднее арифметическое числа колоний для данного разведения;
n – степень разведения испытуемого образца.
Если на агаризованной питательной среде для выявления бактерий обнаруживаются колонии грибов, они рассчитываются как часть общего количества
аэробов (ОКА).
Если на агаризованной питательной среде для выявления грибов обнаруживается рост колоний бактерий, они рассчитываются как общее количество
грибов (ОКГ).
В чашках с отрицательным контролем рост должен отсутствовать.
В заключение делают общий вывод о соответствии качества испытуемого
образца по показателю «Микробиологическая чистота» в отношении общего
числа аэробов и общего числа грибов.
Вопросы для подготовки:
1. Чем обусловлена важность микробиологического контроля в фармацевтическом производстве?
2. Какие препараты относятся к нестерильным?
3. Требования к качеству нестерильной фармацевтической продукции.
4. Основные задачи микробиологического контроля нестерильной продукции.
5. Методы определения микробиологической чистоты нестерильных лекарственных средств и фармацевтических субстанций.
6. Критерии приемлемости для микробиологической чистоты неводных
нестерильных лекарственных средств для внутреннего применения и средств
для кожного и назального использования.
Тема 4. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ
СТЕРИЛЬНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
Цель испытания на стерильность – подтверждение полного отсутствия
жизнеспособных бактерий и грибов в испытуемом объекте (лекарственном
средстве, фармацевтической субстанции).
Испытание применяется для препаратов, которые должны быть стерильны:
- лекарственные средства для парентерального применения (растворы,
лиофильно высушенные порошки, стерильно расфасованные порошки для
инъекций и инфузий);
- офтальмологические препараты;
- растворы антисептиков для наружного применения;
- фармацевтические субстанции, предназначенные для производства
лекарственных средств в форме стерильно расфасованных поршков.
Условия для проведения испытания по определению стерильности:
14
 Испытания на стерильность должны проводиться в тех же условиях, что
и асептическое производство: при использовании камеры с ламинарным
потоком воздуха класса А, расположенной в чистом помещении класса В, или с
помощью изолятора.
 Подготовка воздуха, подаваемого в чистое помещение, с помощью
высокоэффективных фильтров, которые служат для практически полной
очистки воздуха даже от самых мельчайших частиц, вплоть до 0.1 мкм.
 Доступ к помещению должен быть организован через воздушные
шлюзы – конструкции с однонаправленными односторонними путями
прохождения. Воздушный шлюз предотвращает перемещение воздуха между
помещениями. Когда все двери воздушного шлюза закрыты, подаваемый в него
воздух разбавляет загрязнения, поступившие из наружного коридора через
дверь, либо выделяемые присутствующим персоналом.
 Испытуемая продукция должна подаваться через передаточные окна.
 Исполнители должны быть переодеты в стерильную одежду.
 Исполнители должны пройти соответствующую подготовку.
 Меры предосторожности, принимаемые против контаминации, не
должны влиять ни на один из микроорганизмов, которые могут быть
обнаружены входе испытания.
 Условия, в которых проводятся испытания, должны регулярно
контролироваться путем отбора проб воздуха и поверхностей рабочей зоны.
Методы определения стерильности:
1. Метод прямого посева (инокуляции).
2. Мембранная фильтрация – наиболее предпочтительный метод, если
испытуемый препарат фильтруется;
Прямой посев
 Преимущества:
- быстрый, простой, экономичный;
- можно испытывать нефильтруемые образцы.
 Ограничения:
- ограниченный объем образца: низкая чувствительность;
- проблемы с антимикробным действием.
Мембранная фильтрация
 Преимущества:
- возможность удаления антимикробных веществ;
- высокая надежность выявления нестерильности антимикробных препаратов из-за отсутствия разбавления, что имеет место при устранении антимикробного действия;
- возможность фильтрования большого объема;
- статистически более достоверен;
- более чувствителен: высокая эффективность выявления микробной контаминации при низкой концентрации клеток в единице образца благодаря воз15
можности концентрирования или удержания на мембране даже единичных клеток (1 КОЕ на образец).
 Ограничения:
- нельзя испытывать нефильтруемые образцы;
- закупоривание мембраны.
Возможность обнаружения микроорганизмов-контаминантов в лекарственных средствах должна быть доказана, для чего необходимо провести проверку пригодности используемых питательных сред (стерильность, ростовые
свойства), а также проверку наличия либо отсутствия антимикробного действия
лекарственного средства (фармацевтической субстанции). При наличии антимикробного действия оно должно быть надлежащим образом устранено.
Задание 1. Определение стерильности лекарственных средств.
Для определения стерильности лекарственных средств (субстанций) используют следующие питательные среды:
1. Жидкая
тиогликолевая
среда:
снижает
окислительновосстановительный
потенциал
и
способствует
росту
анаэробных
микроорганизмов. Используется для выявления анаэробных и аэробных
бактерий.
2. Жидкая среда на основе гидролизата казеина и соевых бобов (жидкая
среда Сабуро). Используется для выявления грибов и аэробных бактерий.
Таблица 4
Минимальные количества испытуемого продукта,
используемые для каждой питательной среды
Количество препарата в контейнере
Жидкости:
- менее 1 мл
- 1-40 мл
- более 40 мл, но не более 100 мл
- более 100 мл
Жидкости, содержащие антибиотики
Нерастворимые ЛС, кремы и мази, подлежащие суспендированию или эмульгированию
Твердые вещества
Менее 50 мг
50 мг – 300 мг
от 300 мг до 5 г
Более 5 г
Минимальное количество, которое следует использовать для посева на каждую среду (если не обосновано
или не разрешено использование других количеств)
Все содержимое контейнера
½ содержимого каждого контейнера, но не менее 1 мл
20 мл
10% содержимого контейнера, но не менее 20 мл
1 мл
Все содержимое каждого контейнера, составляющее не
менее 200 мг
Все содержимое каждого контейнера
½ содержимого каждого контейнера, но не менее 50 мг
150 мг
500 мг
При определении стерильности водных растворов методом прямого посева:
16
- определенное количество испытуемого продукта помещают непосредственно в питательную среду. При этом объем образца должен составлять не
более 10% объема питательной среды;
- если испытуемый продукт обладает антимикробной активностью, испытания выполняют после нейтрализации подходящим нейтрализующим агентом или путем разведения в достаточном количестве питательной среды;
- при необходимости использования большого объема испытуемого продукта предпочтительно использовать концентрированную питательную среду,
приготовленную с учетом последующего разбавления.
Инокулированные питательные среды инкубируют в течение не менее 14
дней при 30 – 35°С (тиогликолевую среду для выявления бактерий) и при
20 – 25°С (среду на основе гидролизата казеина и соевых бобов или жидкую
среду Сабуро для выявления грибов).
Ход работы
Занятие 1. Определение стерильности водного лекарственного
cредства методом прямого посева в емкости с жидкими питательными
средами.
Питательные среды:
Для определения стерильности лекарственных средств используют следующие питательные среды, ростовые свойства и стерильность которых подтверждены предварительно:
- жидкая тиогликолевая среда: для выявления анаэробных и аэробных
бактерий;
- жидкая среда на основе гидролизата казеина и соевых бобов или
жидкая среда Сабуро : для выявления грибов и аэробных бактерий.
Инокуляция питательных сред испытуемым лекарственным средством:
Необходимое количество образца испытуемого лекарственного средства (в
соответствии с таблицей 4) асептически переносят в жидкую тиогликолевую
среду и жидкую среду на основе гидролизата казеина и соевых бобов (или
жидкую среду Сабуро). Объем образца должен составлять не более 10% объема
питательной среды.
Если испытуемый продукт обладает антимикробным действием, его
нейтрализуют подходящим способом.
Отрицательный контроль:
Интактные порции питательных сред из той же партии.
Инкубирование:
Инкубирование инокулированных питательных сред проводят в течение 14
суток при температуре:
- 30 – 35°С – тиогликолевую среду для выявления бактерий;
- 20 – 25°С – среду на основе гидролизата казеина и соевых бобов (или
жидкую среду Сабуро) для выявления грибов.
17
Занятие 2. Учет результатов. Анализ соответствия качества испытуемого лекарственного средства по показателю «Стерильность».
На протяжении периода инкубации, а также по его завершении (через 14
суток) визуально оценивают наличие макроскопических признаков микробного
роста в питательных средах.
Если признаков микробного роста не обнаруживается, то испытуемое лекарственное средство признают выдерживающим испытание на стерильность.
При наличии признаков микробного роста испытуемое лекарственное
средство не выдерживает испытание на стерильность.
Результаты заносят в таблицу 5.
Таблица 5
Определение стерильности лекарственного средства
методом прямого посева
Наименование
питательной среды
Тиогликолевая
среду
V ЛС в
контейнере
V образца
ЛС, взятого
в испытание
Критерий приемлемости
Результат
испытания
Отрицательный
контроль
Отсутствие
макроскопических признаков микробного роста в питательных средах при визуальной оценке
Среда на основе
гидролизата
казеина и соевых
бобов (или
жидкая среда
Сабуро)
В заключение делают вывод о соответствии качества испытуемого лекарственного средства по показателю «Стерильность».
Вопросы для подготовки:
1. Что такое стерильность фармацевтической продукции и какова цель испытания на стерильность?
2. Какие группы лекарственных средств подлежат контролю стерильности?
3. Условия для проведения испытания по определению стерильности.
4. Методы определения стерильности фармацевтической продукции.
5. Что такое система гарантирования стерильности?
Тема 5. ВАЛИДАЦИЯ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
ПРОИЗВОДСТВА СТЕРИЛЬНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
Валидация технологического процесса – документированное подтверждение того, что процесс, проводимый в пределах установленных параметров, может осуществляться эффективно, с воспроизводимыми результатами и приво18
дит к получению лекарственного средства, соответствующего заранее установленным характеристикам качества.
Требования к производству стерильных лекарственных средств:
- минимальный риск загрязнения микроорганизмами, механическими частицами, пирогенными веществами;
- производство в классифицированных чистых помещениях и зонах с постоянным контролем степени их загрязненности.
Различают два типа технологических операций при производстве стерильных лекарственных средств:
- производство с заключительной стерилизацией;
- производство в асептических условиях.
К валидации процессов по изготовлению стерильных лекарственных
средств применяются принципиально разные подходы:
• для лекарственных средств, подвергающихся заключительной стерилизации, – валидация процесса стерилизации;
• для лекарственных средств, производимых в асептических условиях, валидация процесса стерилизующей фильтрации и асептических операций в
целом.
Для достижения уровня гарантированной стерильности лекарственных
средств в асептическом производстве применяют системы фильтрации, включающие фильтры стерилизующего уровня для удаления микроорганизмов, а
также чистые помещения и локальные зоны со своей инфраструктурой, обеспечивающие асептическую среду вокруг этих систем фильтрации.
Стерилизующий фильтр – фильтр, способный в процессе фильтрации удалять из среды микроорганизмы, присутствующие в ней в определенной концентрации.
Требования, предъявляемые к характеристикам и свойствам стерилизующих фильтров:
- способность удерживать микроорганизмы;
- отсутствие способности к сорбции компонентов лекарственных средств;
- широкая химическая совместимость с различными средами (растворами
лекарственных средств);
- способность выдерживать множественные циклы регенерирующих и стерилизационных воздействий;
- стойкость к механическим воздействиям;
- высокая производительность и др.
Часть требуемых характеристик предоставляется в составе документов
производителя фильтров.
Свойства, которые определяются спецификой применения в конкретных
производственных условиях и с конкретными лекарственными средствами,
должны быть подтверждены пользователем фильтров самостоятельно (в частности, удерживающая способность фильтра).
Для проверки удерживающей способности стерилизующего фильтра используют клетки одной из самых мелких «классических» бактерий – Bre19
vundimonas (ранее Pseudomonas) diminuta. Суспензия таких клеток считается
международным промышленным стандартом микробиологических модельных
загрязнений для определения эффективности удерживающей способности на
мембранах с диаметром пор 0,2 мкм.
Проверка удерживающей способности стерилизующего фильтра проводится с учетом реальных условий производства лекарственного средства:
1. Путем инокуляции суспензии микроорганизма в раствор конкретного
лекарственного средства, т.к его компоненты могут оказывать воздействие как
на материал фильтра, так и на микроорганизм;
2. В течение времени фильтрации стандартного объема ЛС;
3. При давлении и скорости потока, соответствующих таковым в условиях
реального производства лекарственного средства;
4. С учетом температуры фильтрации (если температура раствора лекарственного средства не оказывает влияния на жизнеспособность тестмикроорганизма).
Фильтр классифицируется как стерилизующий, если он выдерживает
бионагрузку в виде клеток бактерий Brevundimonas diminuta в количестве не
менее 107 КОЕ/см2 эффективной площади фильтра и обеспечивает стерильный
поток на выходе.
Бионагрузка (биологическая нагрузка) – популяция жизнеспособных микроорганизмов в жидкости до стадии стерилизующей фильтрации.
Для расчета объема суспензии бактерий Brevundimonas diminuta, обеспечивающего необходимую биологическую нагрузку (микробный вызов), используют формулу:
10 7 ( КОЕ / см 2 )  S (см 2 )
V
,
K ( КОЕ / мл)
где:
107 (КОЕ/см2) – минимальная нагрузка на 1 см2 активной площади фильтра;
S (см2) – активная площадь фильтра;
107 · S – бионагрузка на фильтр площадью S;
К (КОЕ/мл) – концентрация клеток бактерий Brevundimonas diminuta в 1 мл
приготовленной суспензии.
Приготовленной суспензией микроорганизма инокулируют раствор конкретного лекарственного средства. Для подтверждения требуемой биологической нагрузки на фильтр проводят расчет бактериальной предстерилизационной нагрузки раствора лекарственного средства, т.е. титр клеток бактерий Brevundimonas diminuta в растворе препарата после внесения в него микробной
суспензии. Для этого используют формулу:
C
V ( мл)  К ( КОЕ / мл)
,
v( мл)
20
где:
V (мл) – объем приготовленной суспензии бактерий Brevundimonas
diminuta;
К (КОЕ/мл) – концентрация клеток бактерий Brevundimonas diminuta в 1 мл
суспензии;
v (мл) – объем лекарственного средства.
Занятие 1. Расчет объема суспензии бактерий Brevundimonas diminuta,
необходимого для проверки удерживающей способности стерилизующего
фильтра, и бактериальной предстерилизационной нагрузки.
1. Рассчитать объём суспензии бактерий Brevundimonas diminuta, обеспечивающий биологическую нагрузку не менее 107 КОЕ на 1 см2 площади фильтра, если площадь фильтра – 0,32 м2. Концентрация клеток в суспензии культуры составляет 6·109 КОЕ/мл.
2. Рассчитать предстерилизационную микробную нагрузку для стерилизующего фильтра площадью 0,65 м2, если объем лекарственного средства, используемого для проверки удерживающей способности фильтра составляет 150
л, а концентрация клеток в приготовленной суспензии бактерий Brevundimonas
diminuta составляет 4·109 КОЕ/мл.
Вопросы для подготовки:
1. Что такое валидация технологического процесса?
2. Основные типы технологических операций при производстве стерильных лекарственных средств.
3. Подходы, применяемые к валидации процессов производства стерильных лекарственных средств с заключительной стерилизацией и в асептических
условиях.
4. Какие фильтры относятся к стерилизующим? Требования, предъявляемые к стерилизующим фильтрам.
5. Что такое биологическая нагрузка?
6. Принцип проверки удерживающей способности стерилизующих фильтров.
21
ЛИТЕРАТУРА
Основная:
1. Галынкин В.А. Основы фармацевтической микробиологии: Учебное пособие/
В.А.Галынкин,
Н.А.Заикина,
В.И.Кочеровец,
Т.С.Потехина,
Н.Д.Бунатян. – СПб: «Проспект Науки», 2008. – 304с.
2. Галынкин В.А Методы исследования в фармацевтической микробиологии/ В.А.Галынкин, Н.А.Заикина, В.И.Кочеровец, Т.С.Потехина. – М.: Арнебия.
2007. – 260с.
3. Поздеев О.К. Медицинская микробиология: Учебное пособие/
О.К.Поздеев, В.И.Покровский. – М.:ГЭОТАР-МЕД, 2001. – 765с.
4. Медицинская и санитарная микробиология: Учебное пособие/
А.А.Воробьев, Ю.С.Кривошеин, В.П.Широбоков. – М.: издательский центр
«Академия», 2008. – 464с.
5. Государственная фармакопея Республики Беларусь. (ГФ РБ ): Разработана на основе Европейской фармакопеи. Т.1 Общие методы контроля лекарственных средств/ М-во здравоохр. Республики Беларусь, УП «Центр экспертиз
и испытаний в здравоохранении»/ под общ. Ред. А.А. Шерякова. – Молодечно:
Тип. «Победа», 2012. – 1220 с.
6. Технический кодекс установившейся практики «Надлежащая производственная практика» (ТКП 030-2013 (02040))/ М-во здравоохр. Республики Беларусь. – Минск, 2013. – 144 с.
7. Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и
гельминтами. Санитарные правила (СП 17-129 РБ 2000). – М-во здравоохр.
Республики Беларусь, 2000. – 51 с.
8. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology/ Editor: Joseph B.
Schwarts/ - Vol.52:Technical Report No.26 Sterilizing Filtration of Liquids. – 1998. –
31 p.
Дополнительная:
1. Технический кодекс установивщейся практики «Производство
лекарственных средств. Порядок разработки и постановки лекарственных
средств на производство» (ТКП 022-2012 (02041))/ М-во здравоохр. Республики
Беларусь. – Минск, 2012. – 52 с.
2. Технический кодекс установивщейся практики
«Производство
лекарственных средств. Микробиологический мониторинг производственной
среды» (ТКП 441-2012 (02041))/ М-во здравоохр. Республики Беларусь. –
Минск, 2012. – 52 с.
3. Технический кодекс установивщейся практики
«Производство
лекарственных средств. Контроль качества» (428-2012 (02041))/ М-во здравоохр. Республики Беларусь. – Минск, 2012. – 33 с.
4. Марейко А.М. Методы определения чувствительности микроорганизмов
к антибактериальным препаратам: Инструкция по применению/ А.М.Марейко,
Т.И.Мероокая, Л.П.Титов, Т.С.Ермакова, О.В.Тонко. – Минск, ГУ «Республи22
канский центр гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья Министерства здравоохранения Республики Беларусь», 2009. – 83с.
5. McBurnie L. Validation of Sterile Filtration/ L. McBurnie, B.Bardo. – Pharmaceutical Technology. Filtration, 2004. – P. 13 – 23.
23
СОДЕРЖАНИЕ
стр.
ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………………..3
Тема 1. СИСТЕМА ОБЕСПЕЧЕНИЯ КАЧЕСТВА НА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОМ ПРОИЗВОДСТВЕ………………………………………….……………..…4
Ознакомление с организацией системы обеспечения качества на предприятии фармацевтической отрасли………………………..…………………………..6
Занятие 1. Экскурсия на фармацевтическое предприятие РУП «Белмедпрепараты»………………………………………………………….....................................6
Тема 2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖИВЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ
КЛЕТОК В ПРОБИОТИКАХ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМ МЕТОДОМ…......6
Определение количественного содержания живых бактериальных клеток
в поликомпонентном пробиотике…………………………………………………..8
Занятие 1. Определение методом посева на (в) питательные среды количества
живых клеток бактерий Bacillus subtilis и Lаctobacillus acidophilus в сухом
(лиофилизированном) лекарственном средстве Лактобациллин…………………8
Занятие 2. Учет результатов. Анализ соответствия качества испытуемого лекарственного средства по показателю «Количественное определение живых
бактериальных клеток».……………………………………………………………..9
Тема 3. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ НЕСТЕРИЛЬНЫХ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ…………………………………………………...10
Определение микробиологической чистоты нестерильного лекарственного cредства или фармацевтической субстанции или вспомогательного вещества……………………………………………………………………………………..
11
Занятие 1. Определение микробиологической чистоты (содержания ОКА и
ОКГ) нестерильного лекарственного cредства (таблеток, капсул) или фармацевтической субстанции или вспомогательного вещества методом глубинного посева на чашки Петри с питательной средой……………………….……………...12
Занятие 2. Учет и интерпретация результатов. Анализ соответствия качества
испытуемого образца по показателю «Микробиологическая чистота»………...13
Тема 4. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ СТЕРИЛЬНОСТИ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ…………………………………………………...14
Определение стерильности лекарственных средств……………………...16
Занятие 1. Определение стерильности водного лекарственного cредства методом прямого посева в емкости с жидкими питательными средами…………….17
Занятие 2. Учет результатов. Анализ соответствия качества испытуемого лекарственного средства по показателю «Стерильность»…………………………18
Тема 5. ВАЛИДАЦИЯ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
ПРОИЗВОДСТВА СТЕРИЛЬНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ………......18
24
Занятие 1. Расчет объема суспензии Brevundimonas diminuta, необходимого для
проверки удерживающей способности стерилизующего фильтра, и бактериальной предстерилизационной нагрузки……………………...………………….…..21
ЛИТЕРАТУРА….…………………………………………………………………..22
25