Системное ингибирование миостатина передачей генов у нормальных и
реклама
Системное ингибирование миостатина передачей генов у нормальных и дистрофических мышей Введение Миостатин или фактор 8 (GDF-8) дифференциации является членом семьи трансформирующих ростовых факторов β и является мощным негативным регулятором мышечной массы. Миостатин высоко сохраняется у разных видов и функционально инактивированный приводит к увеличениию мышечной массы у коров, собак, овец, мышей и человека. Наоборот, внематочная избыточная экспрессия миостатина вызывает атрофию скелетных мышц. Множество экспериментов показали, что отсутствие миостатина из-за генетических нарушений или торможение приводит к увеличению мышечной массы. В то время как эффект ингибирования миостатина на скелетные мышцы зависит от сроков и механизма блокады, всегда есть увеличение мышечной массы за счет роста мышечных волокон (гипертрофии) и / или увеличение количества волокон (гиперплазия). Постнатальное ингибирование миостатина достигается путем нейтрализирующих антител, направленных против миостатина, вводимых нормальных C57 Bl / 6 мышей и MDX мышам, что приводит к росту мышц за счет гипертрофии и гиперплазии. Общей чертой мышиных моделей является компенсаторная регенерация мышечных волокон за счет активации спутниковых клеток, пролиферации и слияния с существующими мышечными волокнами или формирования мышечных волокон De Novo. Поэтому данная терапия весьма перспективна для лечения мышечной дистрофии из-за ее способности увеличивать размер волокна, повысить регенерацию мышц и регулировать фиброз. Торможение миостатина привело к значительному улучшению дистрофической патологии у модели MDX, смешанные результаты у тяжелых дистрофических моделей (DSG) или никакого улучшения у тяжелых дистрофических моделей (GSG, ду). Это торможение миостатина не улучшает тяжелой мышечной дистрофии, что не удивительно, поскольку миостатин не приводит к устранению генетического дефекта. Для мышечной дистрофии торможение миостатина может быть использовано для увеличения коррекции первичного дефекта путем краткосрочной прибыли мышечной массы. Увеличение мышечной массы может защитить от повреждения, вызванного сокращением при уменьшении количества мышечных волокон, чтобы произвести определенное количество силы. Модуляция миостатина также имеет терапевтический потенциал для болезненных состояний, которые связаны с потерей нормальной мышечной массы, таких как кахексия, атрофия, саркопения. Тем не менее, существует возможность того, что торможение миостатина в сердце может помешать сердечной адаптации к основной сердечной болезни, которые могут возникнуть при старении, и мышечной дистрофии. Предыдущие доклинические исследования у MDX мышеймодели мышечной дистрофии Дюшенна, ориентированные на миостатин, использовали нейтрализующие антитела, инъекции миостатина пропептида и рекомбинантный адено-связанный вирус (ААВ) для опосредованной экспрессии ингибитора миостатина из нескольких тканей. Эти исследования показали, что все скелетные мышцы имели улучшение, хотя животные были исследованы в течение 3-4 месяцев после начала лечения. При мышечной дистрофии в результате прогрессивного патологии скелетных мышц, долгосрочные исследования имеют решающее значение для определения того, как предлагаемое лечение будет исправить патологию с течением времени и оценить эффект ингибирования миостатина на функцию сердца. В возрасте девяти месяцев MDX мыши сначала имеют признаки прогрессивной дилатационной кардиомиопатии, которые не были проанализированы в этих исследованиях. Цяо и соавт. недавно сообщалось, что экспрессия AAV опосредованного пропептида миостатина увеличивает размер мышц и улучшает патологию у животных MDX. В то время как они предположили, что это было связано с секрецией печенью, иммуноблоттинг не показывают экспрессии пропептида в печени и ОТ-ПЦР показал экспрессию трансгена в печени. Не исключено, что пропептид не экспрессируется в печени, но и в сердце, а также других неэкранированных скелетных мышцах. Haidet и соавт. использовали внутримышечные инъекции AAV для сверхэкспрессии эндогенных белков. Ограничением данного исследования является то, что ни один из ингибиторов не является специфичным для миостатина. Например, фолистатин как родственный ген (FLRG) связываются с активином в дополнение к миостатину и GDF связанному белку сыворотки 1 (GASP1). Наблюдаемое благотворное влияние на рост мышц может зависеть от сигнальных путей, кроме миостатина, которые не являются специфическим для мышц, и модуляция без особенностей физиологии мышечной ткани может ограничить клиническое применение. В то время появился значительный интерес к использованию торможения миостатина для улучшения мышечной дистрофии и других заболеваний, хотя всеобъемлющие долгосрочные исследования постнатального ингибирования миостатина еще не проводились. Оценки, включая оценку функционирования медленных и быстрых типов мышц, а также диафрагмы и сердца не достаточно. Диафрагма наиболее сильно имеет дистрофические изменения у мышей MDX. Прямое введение во все эти ткани не представляется возможным и дистрофические мышцы не поддерживает долгосрочные трансдукции AAV без стабилизации мембран. Потеря трансдукции AAV с течением времени, скорее всего, за счет оборота мышечных волокон, о чем свидетельствует потеря AAV опосредованной экспрессии IGF после четырех месяцев в мышцах MDX (неопубликованные наблюдения ER Бартон и HL Sweeney) и аналогичные потери AAV опосредованного пропептида миостатина. Для решения этих вопросов мы разработали метод, который позволяет достичь стойкого ингибирования миостатина одной дозой AAV при сверхэкспрессии новых ингибиторов миостатина из печени у C57 Bl / 6 и MDX мышей. C57 Bl / 6 мыши рассматриваться как новорожденные или молодые люди и исследуются через три месяца после инъекции, чтобы определить эффект ингибирования миостатина на мышечную массу у нормальных животных. Mdx мышам, новорожденным или в возрасте одного месяца, вводили препарат, их исследовали в четыре и одиннадцать месяцев, чтобы оценить эффект торможения миостатина на ранних и поздних стадиях мышечной патологии. Функциональная и гистологическая оценка камбаловидной мышцы, длинного разгибателя пальцев (EDL), диафрагмы и сердца проводилась чтобы определить системный эффект ингибирования миостатина. Эти выводы имеют важное значение для будущей терапии, которые используют пути и регулирующую роль миостатина в скелетных и сердечной мышцах. Результаты Чтобы экспрессировать стабильные циркулирующие ингибиторо миостатина, доминантный негативный пропептид миостатина был спроектирован (dnMstat), в паре с промотором ( LSP) и AAV псевдотипом 2/8 LSP.dnMstat . AAV псевдотип 2/8 имеет тропизм к печени и после внутривенной инъекции демонстрирует превосходную трансдукции в печени по сравнению с другими серотипами AAV. Экспериментальный дизайн исследования показан на рисунке 1а. C57 Bl / 6 мыши взяты в периоде новорожденности (п = 6 контроль, п = 6 основная C57 новорожденные), либо в три месяца (п = 6 контроль, п = 6 основная C57 взрослые) и проанализированы через три месяца после вирусной инъекции. MDX мыши были использованы для изучения влияния торможения миостатина на прогрессирование мышечной дистрофии. Уровни dnMstat были оценены в сыворотке крови всех групп MDX (рис. 1E). В возрасте четырех месяцев было ~ 3 кратное увеличение циркулирующих ингибиторов. Разница в циркуляции ингибитора поддерживается на протяжении всего исследования. Вирусная инъекция неонатальным животным эффективно привела к снижению дозы dnMstat, в то время как вирусные инъекции у мышей одного месяца требуют высоких доз dnMstat. В целях упрощения обсуждения, мы назвали экспериментальные группы с учетом возраста животного и дозы ингибитора. Небольшой группе новорожденных мышей MDX вводили препарат, а затем их исследовали в возрасте четырех месяцев, чтобы определить влияние возраста на вирусную экспрессию (п = 4 лечиться, MDX обозначается 4L). За одиннадцать месяцев мыши рассматриваться как новорожденные (п = 6, обозначается MDX 11L) или в возрасте одного месяца (п = 4, обозначается MDX 11H) с общим набором элементов лечения (п = 6, обозначается MDX 11C). Специфика LSP была подтверждена внутривенной доставкой 1E12 копий генома AAV2 / 8 LSP.GFP. Экспрессия GFP была обнаружена исключительно в печени, и флуоресценция не наблюдается в сердце или скелетных мышцах (рис. 1б).Распределение в тканях экспрессии трансгена в дальнейшем оценивается ОТ-ПЦР в шести различных тканях. Экспрессия трансгенов была обнаружена только в печени (рис. 1в). AAV2 / 8 LSP.dnMstat вводили взрослым C57 Bl / 6 мышам и высокий уровень ингибиторов был обнаружен в крови, а также в печени после одной недели (рис. 1D). C57 Bl / 6 животных умерщвляли через неделю после вирусной инъекции для оценки острых изменениий в деятельности ключевых внутриклеточных регуляторов роста мышц. В рассматримой четырехглавой мышце произошло снижение фосфорилированной Smad 2/3, снижение фосфорилированных JNK и увеличение фосфорилированных Akt (п = 4) (рис. 2). Эти результаты показывают, что печень была жизнеспособной мишенью для AAV опосредованной сверхэкспрессии циркулирующих ингибиторов миостатина. Эффективность ингибирования миостатина dnMstat была оценена путем анализа размера мышц и их функции. Экспрессия dnMstat привела к 14-22% увеличению мышечной массы четырехглавой мышцы, передней большеберцовой мышцы и длинных разгибателей пальцев (EDL) в C57 группе взрослых, в то время как 32-43% прироста в этих мышцах наблюдалось в группе C57 новорожденных (табл. 1). Таким образом, более выраженное увеличение мышечной массы наблюдалось у не-дистрофических животных, когда торможение было начато в начале жизни. Вес камбаловидной мышци и сердца не изменился в обеих C57 Bl / 6 группах. В C57 группе взрослых EDL прошли гипертрофию без гиперплазии, как показано сдвиг вправо без изменения числа волокон (рис. 3а, б).EDL стала примерно на 15% больше по площади поперечного сечения (CSA) и силы (рис. 3, D). Взятые вместе эти данные свидетельствуют о экспрессии dnMstat, которая привела к увеличению мышечной массы, силы и гипертрофии без гиперплазии нормальных скелетных мышц. Чтобы выяснить влияние торможения миостатина в камбаловидной мышце, было оценено распределение волокон в C57 Bl / 6 группах. Не существовало никакого влияния dnMstat в камбаловидной мышце на тип волокон в C57 группе взрослых (рис. 3F). Однако произошел сдвиг в сторону быстрых типов волокон в C57 группе новорожденных, до 10% обработанных волокон мышц были MHC IIB типа, в то время как нет волокон типа IIB обнаруженных в контрольных группах .MDX группы демонстрируют гиперэкспрессию dnMstat , повышенную массу тела по сравнению с контрольной группой (рис. 4, C, D).Увеличение размера скелетных мышц конечности было сопоставимо с результатами ранее описанных подходов к торможению миостатина. В MDX 4H группе масса передней большеберцовой, икроножной и четырехглавой мышцы бедра у обработанных животных была на 38%, 34% и 46% больше, чем в контрольной, соответственно (рис. 4в).Увеличение мышечной массы, наблюдаемое в этих мышцах, сохраняется до одиннадцати месяцев в MDX группе 11H. В то время как различия веса 11L и 11H MDX мышц не были статистически различны, но были больше, чем вес контроля и была заметная тенденция к большей величине роста мышц, когда торможение миостатина было начато в возрасте одного месяца (MDX 11H) по сравнению с неонатальным периодом (MDX 11L) (рис. 4).Вес сердца мышей MDX увеличился на 25% в группе MDX 4H и 22-42% в MDX 11L и 11H группах (рис. 4, D).Отношение веса сердце / тело (мг / г) не изменится в MDX 4H группах (4 ± 0,1 против 4 ± 0,3). Группа MDX 11L имела соотношение 4,2 ± 0,1, что меньше, чем в контрольной. Это, скорее всего, потому, что увеличение массы тела в этой группе немного опережало увеличение веса сердца. Сывороточная креатинкиназа (CK) является мерой состояния скелетных мышц в организме в целом. У MDX мышей и людей страдающих от мышечной дистрофии Дюшенна отсутствие дистрофина приводит к повреждению сарколеммы и повышению проницаемости мембран, и тем самым подъем сывороточной КФК. Торможение миостатина привело к значительному снижению в сыворотке крови уровня КФК в группе MDX 4H по сравнению с контрольной MDX группой (рис. 4В), однако сывороточная КФК у MDX 11L и 11H групп не отличалась от одиннадцати месячных MDX мышей, получавших лечение. Иммуногистохимия была использована для измерения площади поперечного сечения (CSA) и оценки тяжелой цепи миозина (МНС)в составе мышечных волокон из EDL, камбаловидной мышцы и диафрагмы MDX групп. Эти скелетные мышцы были выбраны для анализа, чтобы определить, есть ли группы мышц с различными типами волокон и прогрессирование заболевания дифференциально реагирует на торможение миостатина. EDL представляет собой прототип "быстрых" мышц, состоящих в основном из быстрых гликолитических MHC IIB волокон, а камбаловидная мышца представляет собой прототип "медленных" мышц и заполняется медленными окислительными MHC I волоконами. Диафрагма содержит смешанный тип распределения волокон. В мышцах конечностей наблюдалось увеличение мышечной массы волокон без изменения числа волокон, за исключением EDL в группе MDX 11H, которые не подверглись гипертрофии (рис. 5, 6). Размеры волокна были дополнительно классифицированы в соответствии с типом MHC чтобы определить, какой тип волокна приходится на общую гипертрофию. В соответствии с результатами предшествующих исследований, которые обнаружили, что миостатин преимущественно действует на быстрый тип волокон, средний CSA тип IIA и IIB волокон увеличился в EDL в то время как средняя CSA только из волокон типа IIA была увеличена в камбаловидной мышце(рис. 5А, B и 6А, Б). EDL была на 11% больше волокон типа IIB в группе MDX 4H и на 19% больше типа IIB волокон в MDX 11H группе (рис. 5). Кроме того, в камбаловидной мышце было на 13% больше волокон типа IIB в группе MDX 4H и на 20% больше типа IIA волокон в MDX 11H группе (рис. 6). В обоих мышцах конечностей не было существенных различий между MDX 11L и 11H группами. На обоих концах не было никаких различий в размерах, распределении волокон или количестве сагиттальной клетчатки в диафрагме (рис. 7A, B, C). В диафрагме наблюдалось увеличение IIx типа волокон и снижение волокон типа IIA у MDX 4H групп (рис. 7). Диафрагма MDX 11H была также проанализирована трехцветным окрашиванием Masson, чтобы оценить степень инфильтрации соединительной ткани. Как показано на рис. 7E, доля фиброза в диафрагме была неизменной на длительный срок сверхэкспрессии dnMstat. Функции EDL, камбаловидной мышцы и диафрагмы были оценены, чтобы определить, избыточную экспрессию dnMstat, повышенную прочность мышц. MDX 4H в EDL увеличилось абсолютное производство тетанической силы, сравнимое с увеличением CSA в результате изменений силы (табл. 2). В отличие от MDX 4H в камбаловидной мышцы генерируется 55% больше тетанической силы и на 66% более высокую удельную силу, а сила в диафрагме не изменилась (табл. 3, рис. 7E). Эти данные указывают на короткий срок блокады миостатина. В одиннадцать месяцев камбаловидная мышца продолжала демонстрировать повышенную абсолютную и удельную силу, и эффект был более выражен в MDX 11H группе (табл. 3). В то время как CSA был увеличен в MDX 11L, тетаническое сила не изменились (табл. 2). Абсолютная сила EDL был слегка увеличена в группе MDX 11H, но удельная сила снизилась на 21%. Диафрагма MDX 11H не продемонстрировала никакой разницы в силе (рис. 7E). Таким образом, долгосрочное ингибирование миостатина привело к значительному улучшению производительности силы только в камбаловидной мышце. Для изучения взаимодействия между миостатином и инсулиноподобным фактором роста-I (IGF-I) гомогенизаты четырехглавой мышцы из MDX 4H группы были проанализированы с помощью иммуноблоттинга на наличие миостатина, и ИФА -на содержание IGF-I. Существовало примерно на 60% больше миостатина C-димера в обработанных мышцах (рис. 4E), несмотря на отсутствие разницы в IGF-I содержании. Функциональное действие торможение миостатина на дистрофическое сердце было определено с помощью эхокардиографии. Лечение MDX сердца и четырехглавой мышцы в течение одинадцати месяцев были исследованы на уровне рецепторов активина IIB.Белок и активин IIB рецепторы в этих тканях были одинаковыми (рис. 8а).Дозы ингибиторов миостатина зависимых от увеличения сырой массы сердца (рис. 4C, 4D, 8Б). В группе MDX 11H фракция выброса была сокращена на 11%, а толщина стенки левого желудочка составляет на 43% толще (рис. 8в). Стойкое ингибирование миостатина через AAV опосредованную экспрессию нового ингибитора миостатина в печени приводит к увеличению массы скелетных мышц в норме и у MDX мышей. Важно отметить, что не только секреция в печени в результате широкого ингибирования миостатина, но она также дает стабильность в течение длительного периода времени, который не может быть возможен при доставке в скелетные мышцы. Доза ингибитора сокращенно "L" для низких доз и "H" для высокой дозы. В зависимости от дозы, масса скелетных мышц была увеличена в MDX 11L и 11H группах. Прибыль скелетной мышечной массы в нашем исследовании сопоставимы с введением нейтрализующих антител против миостатина или пропептида, и превосходит результаты предварительного исследования AAV опосредовано системного ингибирования миостатина.Поскольку данные свидетельствуют о том, что миостатин действует на клетки-сателлиты, так и взрослые волокна, увеличение мышечной массы может произойти через гипертрофию существующих мышечных волокон, или через образование новых волокон (гиперплазия). В предыдущих исследованиях, удаление миостатина генной терапией способствует как гипертрофии и гиперплазии скелетных мышц, в то время как послеродовое ингибирование миостатина индуцирует только гипертрофию. Двойной механизм повышения мышечной массы был также очевиден у MDX мышей на протяжении всей жизни. В текущем исследовании, во всех мышцах мышечный рост был обусловлен гипертрофией, а не гиперплазией. Этот вывод подтверждает мнение, что пренатальное отсутствие миостатина приводит как к гипертрофии, так и гиперплазии в скелетных мышцах, в то время как послеродовое торможение миостатина способствует росту мышц, прежде всего гипертрофии. Однако, когда анти-миостатиновые антитела вводились два месяца мышам тяжелым комбинированным иммунодефицитом или миостатин был постнатально инактивирован использованием Cre-LoxP системы, у четырех месячных мышей не было никаких изменений в MHC профиле камбаловидной и EDL мышц. Таким образом, это первый доклад о торможении миостатина, которое приводит к изменению MHC содержания в послеродовых скелетных мышцах. Причины расхождений между нашими выводами у C57 Bl / 6 животных и предыдущих докладов могут быть связаны с эффективностью метода ингибирования или возраста животных, когда торможение миостатина было начато. Примечательно, что произошел сдвиг в сторону быстрых MHC изоформ в камбаловидной мышце в C57 группе новорожденных, но не в C57 группе взрослых. Эти результаты предполагают, что существует критический период развития мышц до трехмесячного возраста в течение которого миостатин можно регулировать после рождения. Типирование волокон у мышей MDX 1 месяца в камбаловидной мышце показали 30% волокон типа 1 и 70% волокна типа IIA, что согласуется с предыдущими докладами. Отсутствие типа IIB волокон на начало торможения миостатина в возрасте одного месяца предлагает новую роль миостатина в спецификации типа волокна. Преимущество селективного выживания быстрых типов волокон, как представляется, может активно переключаться на быстрые MHC изоформы, которые, вероятно, опосредовано регулируются механизмом, действующим на существующие волокна, потому что число волокон не изменилось. Потенциальным посредником в данном процессе является наличие большой активной популяции спутников. Быстрый постнатальный роста мышц у C57 Bl / 6 животных частично обусловлен слиянием клеток-сателлитов существующих мышечных волокон, а у MDX животных есть в большом масштабе фазы дегенерации- регенерации в возрасте 4-6 недель. Наблюдение типа переключения волокон у новорожденных мышей C57 и у всех MDX животных при активации однородного бассейна спутниковых клеток может внести вклад в процесс спецификации волокон под влиянием миостатина. Другой возможностью является то, что могут быть отдельные "медленные" и "быстрые" субпопуляции клеток, и спутниковая селективная активация «быстрой» субпопуляции при торможении миостатина может быть заполнение скелетных мышц быстрым типов волокон. Кроме того, наблюдаемые изменения в экспрессии MHC изоформ может быть связана с прямым действием на мышечные волокна, а не включать спутниковые клетки. Дальнейшие эксперименты необходимы, чтобы очертить механизмы и точные сроки типа переключения волокон нормальных скелетных мышц, индуцированных торможением миостатина. Иммуноблоттинг C57 Bl / 6 мышц через неделю после вирусной инъекции показал изменения в соответствии с торможением миостатина. Когда биологически активная формой миостатина воздействует на активин рецепторы IIB внутриклеточного сигнального каскада приводит к фосфорилированию Smad 2/3. Фосфорилированные Smad 2/3 перемещаются к ядру для подавления экспрессии миогенных факторов клеточного цикла в клетках-сателлитах. Другие ключевые регуляторы размера мышц были вовлечены в сигнальные пути миостатина , такие как серин / треонин киназа Akt и MAP киназа ERK, JNK и p38. У C57 Bl / 6 мышей с гиперэкспрессией dnMstat было снижение уровня фосфорилированного Smad 2/3, как было замечено в C2C12 клетках инкубированых с анти-миостатиновыми антителами. В нашем исследовании было также отмечено снижение фосфорилирования JNK и увеличение фосфорилирования Akt после острого торможения у C57 Bl / 6 животных. В соответствии с нашими наблюдениями, недавнее исследование гипертрофии миофибрилл обнаружило повышение уровня фосфорилирования Akt после аденовирусной избыточной экспрессии миостатина пропептида. Эти изменения свидетельствуют о росте мышц за счет ингибирования миостатина частично опосредованого Smad 2/3, Akt и JNK сигнальных путей и указывают, что миостатин функционально тормозится dnMstat. Неизменное IGF-I содержание в мышцах поддерживает механизм повышения фосфорилирования Akt, и достигается за счет ингибирования миостатина, а не увеличения IGF-I. Кроме того, увеличение активированного миостатина в обработанной мышце показывает, что в условиях подавления сигнализации миостатина может быть компенсаторная регуляция и / или повышенние локальной активации миостатина, чтобы снизить влияние блокады. Регуляция миостатина может быть опосредована через Smad7 зависимые авто-регуляторные циклы, которые активируются блокадой миостатина, но это не было рассмотрено в данном исследовании. У животных MDX торможение миостатина было очень эффективно при увеличении размера мышц и их силы в краткосрочной перспективе, однако долгосрочный анализ дал неоднозначные результаты. Предыдущие исследования, которые использовали антитела, направленные против миостатина в инъекциях или при AAV опосредованной избыточной экспрессия ингибитора продемонстрировали увеличение мышечной массы и увеличение силы после 3-4 месяцев торможения миостатина у молодых животных (1-3 месяцев). Наш анализ животных в возрасте четырех месяцев после трех месяцев торможения миостатина согласуется с ранее опубликованными данными. Существующее увеличение массы всех скелетных мышц рассмотрено на примере камбаловидной и EDL. Однако, после 10-11 месяцев экспрессии dnMstat торможение миостатина не приводит к функциональной пользе в диафрагме или EDL. Это означает, что торможения миостатина в качестве монотерапии не будет достаточно для ослабления дистрофических изменений в наиболее сильно пострадавших скелетных мышцах. В группе MDX 11H диафрагма была эквивалентна силе и степени фиброза мышц по сравнению с контролем (рис. 7). Диафрагма в большей степени, чем мышцы конечностей у мышей, демонстрирует ранние дегенеративные изменения, прогрессирующую потерю сократительной функции и десять раз выше содержание коллагена, чем в других скелетных мышцах. Предыдущие долгосрочные исследования по изучению мембран в условиях пониженной сигнализации миостатина сообщали о некоторй гистологической пользе, но не продемонстрировали улучшение функции. В то время как MDX / MSTAT KO диафрагмы демонстрирует улучшение гистопатологии на более поздний момент времени (18 месяцев), чем рассмотрены в данном исследовании, неясно, если ли очевидное гистологическое улучшение, которое коррелирует с повышенной функцией . Таким образом, в то время как долгосрочное ингибирование миостатина улучшает мягкой дистрофией, в лице MDX мышц конечностей, она не достаточно ездить роста мышц и снижение мышечной активности фибробластов для компенсации тяжелой дистрофией, в лице MDX диафрагмы. Функциональный анализ медленных волокон камбаловидной мышцы и быстро сокращающихся волокон мышцы EDL показали различные эффекты долгосрочного ингибирования миостатина. Камбаловидная мышца содержит типы волокон более сходные с скелетными мышцами человека, и поэтому наблюдаемое увеличение удельной силы в долгосрочной перспективе является обнадеживающей находкой для клинических исследований в будущем. Этот результат можно объяснить сдвигом типов волокна к MHC быстрых изоформ. Однако, не ясно, будут ли скелетные мышцы человека смещаться в том же порядке. В одиннадцать месяцев MDX 11H в EDL снизилась производительная сила. Эти результаты аналогичны блокаде миостатина у мышей, которая демонстрирует уменьшение удельной силы в EDL, но не камбаловидной мышце. Точная этиология пониженной удельной мощности силы в EDL в настоящее время неизвестна. Документированных нарушений EDL при блокаде миостатина, такие как уменьшение числа митохондрий в волокнах, не достаточно, чтобы объяснить падение конкретных производственных сил. Модуляция TGF-β / Smad сигнального пути у мышей и долгосрочное торможение миостатина у MDX мышей приводит к снижению силы EDL, которая имеет сомнительную терапевтическую полезность. Этот эффект повидимому, сводится к быстрым типам волокон. Дальнейшие эксперименты должны определить механизм нарушения силы в зависимости от типа волокна в связи с блокадой миостатина .Отсутствие гипертрофии волокон типа I в ответ на торможение миостатина у мышей прогнозирует, что в организме человека лечение, которое блокирует миостатин, независимо от модальности, будет гораздо менее эффективным, чем в доклинических исследованиях у мышей. По сравнению с грызунами в скелетных мышцах человека имеется гораздо меньше быстрых волокон. Например, человеческая камбаловидная мышца полностью состоит из волокон типа I, когда мышиная камбаловидная мышца состоит приблизительно из 60% волокон IIA и 40% I волокна. Важно отметить, что человеческие скелетные мышцы не содержит волокон типа IIB. Тип IIB волокон содержит высокую плотность активин рецепторов IIB, эндогенной активности промотора миостатина и экспрессии миостатина в нормальных мышцах. Поэтому тип IIB волокон, предположительно, наиболее чувствительный к миостатину. В этом исследовании мы показали, что IIA волокна также подвергаются гипертрофии в ответ на торможение миостатина в камбаловидной и EDL. Этот эффект является критическим для лечения человека, а во взаимодействии с типом волокна и сдвигом к более быстрому MHC, гипертрофия изоформ IIA может привести к увеличению производительной силы, несмотря на почти полное отсутствие типов волокон наиболее чувствительными к торможению миостатина. Это необходимо для установления безопасности торможение миостатина на дистрофическое сердце, потому что кардиомиопатия почти повсеместно развивается у людей 18 лет с мышечной дистрофией Дюшенна. Отсутствие миостатина, как уже сообщалось ранее, не имеют влияния на функцию сердца у животных с блокадой миостатина или MDX / MSTAT KO трансгенных мышей. Исследования этого вопроса были либо краткосрочные или полагаться на генетическую терапию , которая имеет ограниченное клиническое значение. Вагнер и соавт. не наблюдали никаких изменений в размерах сердца и его функциональных параметров в возрасте 24 месяцев у MDX / MSTAT животных KO . Тем не менее, у MDX мышей в этом исследовании не развивается дилатационной кардиомиопатии в возрасте 24 месяцев, как у MDX мышей, и мыши были неотличимы от обычных C57 Bl / 6 по функциональным параметрам. Отсутствие дилатационной кардиомиопатии у старых мышей MDX в отличие от других исследований, в которых эхокардиографические изменения указывают на ее признаки, было впервые отмечено у 9-11 месячных мышей , и прогрессировало сильное снижение фракции выброса до 35% в 21 месяц. В нашем исследовании торможение миостатина не влияет на вес сердца у нормальных животных. Однако у MDX животных был на 20% больше вес сердца в возрасте четырех месяцев и на 40% больше в одиннадцать месяцев. Маловероятно, что увеличение массы сердца произошло просто за счет увеличения в размерах, пропорционально массе тела. Бартон и др.. изучали у MDX мышей экспрессию положительного фактора роста IGF-I только в скелетных мышцах без системных эффектов. В данном исследовании увеличение мышечной массы и веса тела были обнаружены, но не изменяя сердца веса.Хотя воздействие миостатина торможение на прогрессирование дилатационной кардиомиопатии у мышей MDX или в более тяжелых дистрофических кардиомиопатии неизвестна, необходимо дальнейшее расследование до внедрения миостатина основе терапии для лечения болезненных состояний, которые включают в себя вовлечение сердца. Различия в размерах сердца или функции в модели MDX после ингибирования миостатина, возможно, не наблюдалось ранее в связи с менее эффективным торможением миостатина или краткосрочными схемами лечения. Возможным механизмом наблюдаемой гипертрофии сердца является снижение сигнализации миостатина через рецепторы активин IIB, которые экспрессируются на том же уровне (рис. 8). До сообщений об участии миостатина в ремоделировании сердца, есть данные о регуляции миостатина в кардиомиоцитах граничащих с регионом инфаркта в сердце у овец. Эти данные позволяют предположить, что в то время как миостатин не участвует в регуляции размера кардиомиоцитов в нормальном сердце, это может быть важным негативным регулятором размера кардиомиоцитов при патологических состояниях, которые вызывают ремоделирование сердца. Потеря сигнализации миостатина в этих условиях может привести к ускорению гипертрофии кардиомиоцитов и в конечном итоге прогрессированию сердечной недостаточности. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, как наблюдаемые изменения в массе сердца и функции развиваются с течением времени. Печень опосредованная сверхэкспрессия dnMstat имеет ряд важных преимуществ по сравнению с известными экспериментальными подходами, направленными на подавление миостатина. Клинические испытания с использованием нейтрализующих антител, направленных на миостатин, не улучшали функции мышц и увиливали мышечную массу у взрослых пациентов с мышечной дистрофией. Если внедренный в клиническую практику, любой подход, который включает в себя инъекции белка на основе ингибиторов, таких как антитела или растворимый рецептор активин IIB, потребуют пожизненной терапии, при использовании AAV ингибитора требует только одной инъекции для достижения высокого уровня стойкой экспрессии трансгена. Существует ограниченная возможность иммунного признания трансгенных продуктов, таких как dnMstat совпадающих с эндогенным пропептидом, за исключением одной точечной мутации. Кроме того, есть свидетельства того, что производство и секрецию в печени может вызвать толерантность к чужеродным пептидам. Подход с активин рецепторами IIB и другими не специфическо связывающих миостатин белков, таких как фолистатин , могут иметь ограниченное клиническое применение, так как TGF-бета сигнализация в нескольких органах и системах может быть нарушена в связи с широким распределением тканевых рецепторов активин IIB. Печеночная трансдукция позволяет также избежать технических препятствий прямой трансдукции дистрофических мышц. В дополнение к сложности переноса генов на всю мускулатуру в больших моделях животных и людях, долгосрочная трансдукция дистрофических мышц AAV без стабилизации мембран не представляется возможной (неопубликованные наблюдения ER Бартон и HL Суини, [20], [21 ]). Это наблюдение противоречит отчету о торможении миостатина после внутримышечной инъекции AAV 2/1 более двух лет. Однако не представлено никаких доказательств того, что трансгены присутствуют в обращении. Наш подход мог бы быть переведен на более крупных животных, инженерно соответствующих виду трансгенов. Собачья модель мышечной дистрофии Дюшенна более точно воссоздает клиническое течение заболевания человека, чем мыши MDX. Даже тогда, когда в сыворотке крови уровни ингибитора были относительно низкими в группе MDX 11L, впечатляющие успехи в увеличении скелетной мышечной массы, и переключения типа волокон не наблюдалось. Торможение миостатина через печень путем целенаправленного переноса генов хорошо адаптируется к будущим исследованиям генной терапии и имеет потенциал для ослабления мышечной дистрофии у больших моделей животных. Ссылки Lee SJ (2007) Sprinting without myostatin: a genetic determinant of athletic prowess. Trends Genet 23: 475–477. Find this article online Durieux AC, Amirouche A, Banzet S, Koulmann N, Bonnefoy R, et al. (2007) Ectopic expression of myostatin induces atrophy of adult skeletal muscle by decreasing muscle gene expression. Endocrinology 148: 3140–3147. Find this article online Bogdanovich S, Krag TO, Barton ER, Morris LD, Whittemore LA, et al. (2002) Functional improvement of dystrophic muscle by myostatin blockade. Nature 420: 418–421. Find this article online McPherron AC, Lawler AM, Lee SJ (1997) Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member. Nature 387: 83–90. Find this article online Nakatani M, Takehara Y, Sugino H, Matsumoto M, Hashimoto O, et al. (2008) Transgenic expression of a myostatin inhibitor derived from follistatin increases skeletal muscle mass and ameliorates dystrophic pathology in mdx mice. Faseb J 22: 477–487. Find this article online Whittemore LA, Song K, Li X, Aghajanian J, Davies M, et al. (2003) Inhibition of myostatin in adult mice increases skeletal muscle mass and strength. Biochem Biophys Res Commun 300: 965–971. Find this article online Wagner KR, Liu X, Chang X, Allen RE (2005) Muscle regeneration in the prolonged absence of myostatin. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 2519–2524. Find this article online Li ZB, Kollias HD, Wagner KR (2008) Myostatin directly regulates skeletal muscle fibrosis. J Biol Chem 283: 19371– 19378. Find this article online Bogdanovich S, McNally EM, Khurana TS (2007) Myostatin blockade improves function but not histopathology in a murine model of limb-girdle muscular dystrophy 2C. Muscle Nerve 37: 308–316. Find this article online Li ZF, Shelton GD, Engvall E (2005) Elimination of myostatin does not combat muscular dystrophy in dy mice but increases postnatal lethality. Am J Pathol 166: 491–497. Find this article online Parsons SA, Millay DP, Sargent MA, McNally EM, Molkentin JD (2006) Age-dependent effect of myostatin blockade on disease severity in a murine model of limb-girdle muscular dystrophy. Am J Pathol 168: 1975–1985. Find this article online Barton ER, Morris L, Musaro A, Rosenthal N, Sweeney HL (2002) Muscle-specific expression of insulin-like growth factor I counters muscle decline in mdx mice. J Cell Biol 157: 137–148. Find this article online Bogdanovich S, Perkins KJ, Krag TO, Whittemore LA, Khurana TS (2005) Myostatin propeptide-mediated amelioration of dystrophic pathophysiology. Faseb J 19: 543–549. Find this article online Qiao C, Li J, Jiang J, Zhu X, Wang B, et al. (2008) Myostatin propeptide gene delivery by adeno-associated virus serotype 8 vectors enhances muscle growth and ameliorates dystrophic phenotypes in mdx mice. Hum Gene Ther 19: 241–254. Find this article online Haidet AM, Rizo L, Handy C, Umapathi P, Eagle A, et al. (2008) Long-term enhancement of skeletal muscle mass and strength by single gene administration of myostatin inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 4318–4322. Find this article online Hill JJ, Davies MV, Pearson AA, Wang JH, Hewick RM, et al. (2002) The myostatin propeptide and the follistatinrelated gene are inhibitory binding proteins of myostatin in normal serum. J Biol Chem 277: 40735–40741. Find this article online Hill JJ, Qiu Y, Hewick RM, Wolfman NM (2003) Regulation of myostatin in vivo by growth and differentiation factorassociated serum protein-1: a novel protein with protease inhibitor and follistatin domains. Mol Endocrinol 17: 1144–1154. Find this article online Lee SJ, McPherron AC (2001) Regulation of myostatin activity and muscle growth. Proc Natl Acad Sci U S A 98: 9306– 9311. Find this article online Tsuchida K, Arai KY, Kuramoto Y, Yamakawa N, Hasegawa Y, et al. (2000) Identification and characterization of a novel follistatin-like protein as a binding protein for the TGF-beta family. J Biol Chem 275: 40788–40796. Find this article online Bartoli M, Poupiot J, Vulin A, Fougerousse F, Arandel L, et al. (2007) AAV-mediated delivery of a mutated myostatin propeptide ameliorates calpain 3 but not alpha-sarcoglycan deficiency. Gene Ther 14: 733–740. Find this article online Pacak CA, Conlon T, Mah CS, Byrne BJ (2008) Relative persistence of AAV serotype 1 vector genomes in dystrophic muscle. Genet Vaccines Ther 6: 14. Find this article online Gao GP, Alvira MR, Wang L, Calcedo R, Johnston J, et al. (2002) Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 11854–11859. Find this article online Wang Z, Zhu T, Qiao C, Zhou L, Wang B, et al. (2005) Adeno-associated virus serotype 8 efficiently delivers genes to muscle and heart. Nat Biotechnol 23: 321–328. Find this article online Stedman HH, Sweeney HL, Shrager JB, Maguire HC, Panettieri RA, et al. (1991) The mdx mouse diaphragm reproduces the degenerative changes of Duchenne muscular dystrophy. Nature 352: 536–539. Find this article online Yang W, Zhang Y, Li Y, Wu Z, Zhu D (2007) Myostatin induces cyclin D1 degradation to cause cell cycle arrest through a phosphatidylinositol 3-kinase/AKT/GSK-3 beta pathway and is antagonized by insulin-like growth factor 1. J Biol Chem 282: 3799–3808. Find this article online Quinlan JG, Hahn HS, Wong BL, Lorenz JN, Wenisch AS, et al. (2004) Evolution of the mdx mouse cardiomyopathy: physiological and morphological findings. Neuromuscul Disord 14: 491–496. Find this article online Bostick B, Yue Y, Long C, Duan D (2008) Prevention of dystrophin-deficient cardiomyopathy in twenty-one-month-old carrier mice by mosaic dystrophin expression or complementary dystrophin/utrophin expression. Circ Res 102: 121– 130. Find this article online Wagner KR, McPherron AC, Winik N, Lee SJ (2002) Loss of myostatin attenuates severity of muscular dystrophy in mdx mice. Ann Neurol 52: 832–836. Find this article online Grobet L, Pirottin D, Farnir F, Poncelet D, Royo LJ, et al. (2003) Modulating skeletal muscle mass by postnatal, muscle-specific inactivation of the myostatin gene. Genesis 35: 227–238. Find this article online Welle S, Bhatt K, Pinkert CA, Tawil R, Thornton CA (2007) Muscle growth after postdevelopmental myostatin gene knockout. Am J Physiol Endocrinol Metab 292: E985–991. Find this article online Yang J, Ratovitski T, Brady JP, Solomon MB, Wells KD, et al. (2001) Expression of myostatin pro domain results in muscular transgenic mice. Mol Reprod Dev 60: 351–361. Find this article online Girgenrath S, Song K, Whittemore LA (2005) Loss of myostatin expression alters fiber-type distribution and expression of myosin heavy chain isoforms in slow- and fast-type skeletal muscle. Muscle Nerve 31: 34–40. Find this article online Anderson JE, Bressler BH, Ovalle WK (1988) Functional regeneration in the hindlimb skeletal muscle of the mdx mouse. J Muscle Res Cell Motil 9: 499–515. Find this article online Earnshaw JC, Kyprianou P, Krishan K, Dhoot GK (2002) Differentiation of original and regenerated skeletal muscle fibres in mdx dystrophic muscles. Histochem Cell Biol 118: 19–27. Find this article online Marshall PA, Williams PE, Goldspink G (1989) Accumulation of collagen and altered fiber-type ratios as indicators of abnormal muscle gene expression in the mdx dystrophic mouse. Muscle Nerve 12: 528–537. Find this article online Huang Z, Chen D, Zhang K, Yu B, Chen X, et al. (2007) Regulation of myostatin signaling by c-Jun N-terminal kinase in C2C12 cells. Cell Signal 19: 2286–2295. Find this article online Philip B, Lu Z, Gao Y (2005) Regulation of GDF-8 signaling by the p38 MAPK. Cell Signal 17: 365–375. Find this article online Yang W, Chen Y, Zhang Y, Wang X, Yang N, et al. (2006) Extracellular signal-regulated kinase 1/2 mitogen-activated protein kinase pathway is involved in myostatin-regulated differentiation repression. Cancer Res 66: 1320–1326. Find this article online Morissette MR, Cook SA, Buranasombati C, Rosenberg MA, Rosenzweig A (2009) Myostatin inhibits IGF-I-induced myotube hypertrophy through Akt. Am J Physiol Cell Physiol 297: C1124–1132. Find this article online Forbes D, Jackman M, Bishop A, Thomas M, Kambadur R, et al. (2006) Myostatin auto-regulates its expression by feedback loop through Smad7 dependent mechanism. J Cell Physiol 206: 264–272. Find this article online Amthor H, Macharia R, Navarrete R, Schuelke M, Brown SC, et al. (2007) Lack of myostatin results in excessive muscle growth but impaired force generation. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 1835–1840. Find this article online Mendias CL, Marcin JE, Calerdon DR, Faulkner JA (2006) Contractile properties of EDL and soleus muscles of myostatin-deficient mice. J Appl Physiol 101: 898–905. Find this article online Larsson L, Moss RL (1993) Maximum velocity of shortening in relation to myosin isoform composition in single fibres from human skeletal muscles. J Physiol 472: 595–614. Find this article online Smerdu V, Karsch-Mizrachi I, Campione M, Leinwand L, Schiaffino S (1994) Type IIx myosin heavy chain transcripts are expressed in type IIb fibers of human skeletal muscle. Am J Physiol 267: C1723–1728. Find this article online Salerno MS, Thomas M, Forbes D, Watson T, Kambadur R, et al. (2004) Molecular analysis of fiber type-specific expression of murine myostatin promoter. Am J Physiol Cell Physiol 287: C1031–1040. Find this article online Nigro G, Comi LI, Politano L, Bain RJ (1990) The incidence and evolution of cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy. Int J Cardiol 26: 271–277. Find this article online Artaza JN, Reisz-Porszasz S, Dow JS, Kloner RA, Tsao J, et al. (2007) Alterations in myostatin expression are associated with changes in cardiac left ventricular mass but not ejection fraction in the mouse. J Endocrinol 194: 63–76. Find this article online Cohn RD, Liang HY, Shetty R, Abraham T, Wagner KR (2007) Myostatin does not regulate cardiac hypertrophy or fibrosis. Neuromuscul Disord 17: 290–296. Find this article online Spurney CF, Knoblach S, Pistilli EE, Nagaraju K, Martin GR, et al. (2008) Dystrophin-deficient cardiomyopathy in mouse: expression of Nox4 and Lox are associated with fibrosis and altered functional parameters in the heart. Neuromuscul Disord 18: 371–381. Find this article online Van Erp C, Irwin NG, Hoey AJ (2006) Long-term administration of pirfenidone improves cardiac function in mdx mice. Muscle Nerve 34: 327–334. Find this article online Sharma M, Kambadur R, Matthews KG, Somers WG, Devlin GP, et al. (1999) Myostatin, a transforming growth factorbeta superfamily member, is expressed in heart muscle and is upregulated in cardiomyocytes after infarct. J Cell Physiol 180: 1–9. Find this article online Shyu KG, Lu MJ, Wang BW, Sun HY, Chang H (2006) Myostatin expression in ventricular myocardium in a rat model of volume-overload heart failure. Eur J Clin Invest 36: 713–719. Find this article online Wagner KR, Fleckenstein JL, Amato AA, Barohn RJ, Bushby K, et al. (2008) A phase I/IItrial of MYO-029 in adult subjects with muscular dystrophy. Ann Neurol 63: 561–571. Find this article online Mingozzi F, Hasbrouck NC, Basner-Tschakarjan E, Edmonson SA, Hui DJ, et al. (2007) Modulation of tolerance to the transgene product in a nonhuman primate model of AAV-mediated gene transfer to liver. Blood 110: 2334–2341. Find this article online Garg RR, Bally-Cuif L, Lee SE, Gong Z, Ni X, et al. (1999) Cloning of zebrafish activin type IIB receptor (ActRIIB) cDNA and mRNA expression of ActRIIB in embryos and adult tissues. Mol Cell Endocrinol 153: 169–181. Find this article online Cooper BJ, Winand NJ, Stedman H, Valentine BA, Hoffman EP, et al. (1988) The homologue of the Duchenne locus is defective in X-linked muscular dystrophy of dogs. Nature 334: 154–156. Find this article online Harding TC, Koprivnikar KE, Tu GH, Zayek N, Lew S, et al. (2004) Intravenous administration of an AAV-2 vector for the expression of factor IX in mice and a dog model of hemophilia B. Gene Ther 11: 204–213. Find this article online Shimatsu Y, Katagiri K, Furuta T, Nakura M, Tanioka Y, et al. (2003) Canine X-linked muscular dystrophy in Japan (CXMDJ). Exp Anim 52: 93–97. Find this article online Shimatsu Y, Yoshimura M, Yuasa K, Urasawa N, Tomohiro M, et al. (2005) Major clinical and histopathological characteristics of canine X-linked muscular dystrophy in Japan, CXMDJ. Acta Myol 24: 145–154. Find this article online Bish LT, Morine K, Sleeper MM, Sanmiguel J, Wu D, et al. (2008) AAV9 Provides Global Cardiac Gene Transfer Superior to AAV1, AAV6, AAV7, and AAV8 in the Mouse and Rat. Hum Gene Ther. Find this article online Barton ER (2006) Impact of sarcoglycan complex on mechanical signal transduction in murine skeletal muscle. Am J Physiol Cell Physiol 290: C411–419. Find this article online Silcocks PB, Munro JF, Steeds RP, Channer KS (1997) Prognostic implications of qualitative assessment of left ventricular function compared to simple routine quantitative echocardiography. Heart 78: 237–242. Find this article online Оригинал статьи: http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0009176 Переведено проектом МОЙМИО www.mymio.org
