АНТИОКСИДАНТНЫЙ СТАТУС ОРГАНИЗМА И ОСНОВНЫЕ

АНТИОКСИДАНТНЫЙ СТАТУС ОРГАНИЗМА И ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ЕГО
ОЦЕНКИ
Орешко Н.А., Киселев П.А.
Институт биоорганической химии НАН Беларуси, г. Минск, Беларусь
oreshko_nat@mail.ru
Одной из основных причин патологических изменений в человеческом организме,
приводящих к преждевременному старению и развитию многих болезней (известно более
100) является избыточное содержание в биологических жидкостях различного типа
соединений радикальной природы. Постоянное повышенное содержание в межклеточных
и внутриклеточных биологических жидкостях свободных радикалов (СР) создает условия
для развития оксидантного стресса, выражающегося с биохимической точки зрения в том,
что СР окисляют стенки сосудов, белки, ДНК, липиды. Свободные радикалы способны
разрывать связи в молекуле ДНК, повреждать генетический аппарат клеток,
регулирующий их рост, что приводит к онкологическим заболеваниям. Липопротеиды
низкой плотности после окисления могут откладываться на стенках сосудов, что вызывает
развитие атеросклероза и сердечно-сосудистых заболеваний. От воздействия свободных
радикалов здоровый организм защищает естественная антиоксидантная система,
содержащая ферментные и неферментные вещества. Снижение активности естественной
антиоксидантной системы человека и, следовательно, возрастание концентрации
свободных радикалов в организме связано со многими неблагоприятными факторами: это
радиоактивное и ультрафиолетовое облучение, ухудшение экологической обстановки,
широкое распространение социальных заболеваний (алкоголизм, курение, наркомания),
постоянные стрессы, потребление загрязненной пищи, неконтролируемый прием
некоторых лекарственных препаратов.
Поэтому неудивительно, что в последнее время все более серьезное внимание
уделяется разработке подходов для оценки антиоксидантного статуса организма и поиску
путей при необходимости его направленной коррекции.
При характеристике антиоксидантного статуса организма можно выделить два
основных направления. Первое из них связано с прямым анализом содержания и/или
активности низкомолекулярных (например, глутатион, мочевая кислота, аскорбиновая
кислота и ее формы, токоферолы, полифенолы, каротиноиды, ретинол и др) либо
высокомолекулярных (например, ферменты системы глутатиона, супероксиддисмутаза,
каталаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, декарбоксилирующая малатдегидрогеназа,
изоцитратдегидрогеназа, редокс-чувствительные факторы транскрипции и др.)
регуляторов окислительных процессов. Второе основано на оценке общей
антиокислительной активности (АОА). Действительно, определение концентрации
отдельного соединения, обладающего свойствами антиокислителя, часто более сложно и
менее информативно по сравнению с определением общей антиокислительной
активности. Это обусловлено сложным составом системы антиоксидантной защиты и
различиями в механизмах действия ее компонентов. Для оценки АОА разработано
большое количество методов, которые можно распределить по нескольким группам. В
самой многочисленной из них представлены методы, основанные на генерировании и
регистрации окислительной эффективности активных форм кислорода.
В свою очередь, в этом ряду на сегодня самой используемой методикой
интегральной оценки общего антиоксидантного статуса биологических жидкостей
является ORAC-assay (the oxygen radical absorbance capacity) - адсорбционная емкость по
отношению к кислородным радикалам [1].
Он применяется в нескольких вариантах, отличающихся способами генерирования
и регистрации активных форм кислорода. Так, в системе [2] в качестве источника
пероксидных радикалов используется 2,2′-азо-бис-(2-амидинопропан) дигидрохлорид, а
регистрация сигнала осуществляется путем измерения интенсивности флуоресценции В-
фикоэритрина либо флуоресцеина. Второй подход [3] основан на определении
антиокислительной активности образцов по их способности связывать гидроксидрадикалы НО., которые образуются из кислорода при участии комплексов двухвалентного
железа с этилендиаминтетрауксусной кислотой. При взаимодействии НО.с терефталевой
кислотой образуется флуоресцирующий продукт - 2-гидрокситерефталевая кислота.
Антиокислительная эффективность образца определяется из прямо пропорциональной
зависимости в логарифмических координатах между количеством добавленного
соединения и отношением интенсивностей флуоресценции в отсутствие и в присутствии
антиоксиданта. Метод, основанный на поглощении кислородных радикалов (ORAC)
достаточно прост и отличается высокой чувствительностью, которая может быть еще
повышена при использовании хемилюминесцентных подходов детекции. К его основному
недостатку следует отнести относительно узкий динамический диапазон, что обусловлено
высокой реакционной способностью RO2. и, особенно, НО. радикала, который способен
взаимодействовать практически со всеми органическими соединениями, не выделяя среди
них «истинных» антиоксидантов.
Этого недостатка лишены модельные системы, в которых в качестве действующего
агента выступает супероксидный радикал – О2˚-. Поскольку супероксидный радикал
рассматривается как предшественник многих других АФК, ингибирование процессов с
участием О2˙-достаточно адекватно отражает АОА биологических жидкостей и
антиоксидантные свойства фармсубстанций. В этом плане можно особо отметитить
коммерческую систему фирмы Analytik Jena AG (Германия). Генерирование О2˙- в этой
системе реализуется за счет фотоокисления рибофлавина. Вместе с тем, прямая
регистрация супероксидного радикала является сложной задачей. Фирмой Analytik Jena
AG
для
этой
цели
разработан
подход,
основанный
на
регистрации
фотосенсибилизированной люминесценции, что резко повысило (до 1000 раз)
чувствительность метода и сократило время анализа до нескольких минут. В качестве
сенсибилизаторов используется люминол либо люцигенин.
Отличительной чертой второй группы модельных систем для анализа АОА
является то, что свободные радикалы в системе не генерируются, а определяется
способность антиоксидантов в пробе восстанавливать ион железа Fe3+ до Fe2+. Метод
получил название «железо-восстанавливающая активность», сокращенный английский
вариант - FRAP . Для его реализации предложено несколько соединений, имеющих в
своей структуре ион железа. Наиболее часто восстановление Fe3+ осуществляется в
комплексе трипиридилтриазина Fe (III)(TPTZ)2, приводя к окрашенному в синий цвет
комплексу Fe(II)(TPTZ)2. Регистрация процесса проводится по увеличению оптической
плотности при длине волны 593 нм [4]. Достаточно широко для оценки
восстанавливающей активности используется реакция восстановления феррицианида
калия. Гексаферрицианид калия K3[Fe3+(CN)6], в присутствии вещества, обладающего
антиокислительными свойствами, восстанавливается до K4[Fe2+(CN)6], что приводит к
образованию окрашенного в синий цвет соединения с максимумом поглощения на 700 нм
[5]. Общая антиоксидантная активность в данном методе – это общая восстановительная
способность (активность). Однако способность антиоксидантов связывать свободные
радикалы не всегда соответствует их способности восстанавливать железо Fe3+ до Fe2+.
Поэтому, данным методом невозможно оценить антиоксидантную активность SH—
содержащих соединений (GSH, альбумин, некоторые аминокислоты). Также некоторые
антиоксиданты, как например аскорбиновая кислота, не только восстанавливают Fe3+ до
Fe2+, но и способны взаимодействовать с Fe2+, генерируя дополнительные свободные
радикалы, что затрудняет оценку антиоксидантной активности таких соединений.
Нельзя не сказать пару слов об электрохимических методах оценки АОА. Их делят
на две группы. В первой из них проводится вольтамперометрическое определение
содержания в пробе антиоксидантов, которые могут влиять на протекание окислительновосстановительных процессов. Метод основан на измерении электрического тока,
возникающего при электрохимическом окислении исследуемого вещества (или смеси
веществ). Метод наиболее эффективен при наличии в образцах соединений фенольной и
полифенольной природы. Предел их обнаружения лежит в интервале 10 –9÷10 -12 г, а в
некоторых случаях достигает 10-15 г
Другая группа методов [6–8] основана на непосредственном измерении
окислительно-восстановительных потенциалов, поскольку эти параметры в целом
коррелируют с АОА. В частности, речь идет об измерении потенциала полуволны
окисления на проточном колоночном электроде [6]. Указывается, что электрохимическая
активность соединений коррелирует со способностью подавлять перекисное окисление
липидов. Тем не менее, электрохимические методы пока не нашли широкого применения
при анализе АОА биологических образцов. Во многом это обусловлено большой
продолжительностью анализа и трудностями при его автоматизации.
Все большее внимание привлекают к себе модельные системы четвертой группы,
основанные на использовании специфических радикалов – иминоксильного стабильного
радикала, 1,1-дифенил-2-пикрилгидразила (DPPH ) и катион-радикала 2,2'-азинобис(3этилбензотиазолин 6-сульфоната (АБТС). Обусловлено это тем, что такие системы
позволяют не только характеризовать эффективность соединений с антиоксидантными
свойствами в отношении высокоактивных АФК, но и оценивать роль вторичных
радикалов, которые по современным представлениям могут накапливаться в организме, в
т.ч. при приеме лекарств и тех же антиоксидантов, и приводить к нежелательным
патологическим процессам.
Разработки на базе иминоксильных радикалов интенсивно велись в Институте
химической физики РАН. К сожалению, они не получили такого распространения в
клинической практике, которого, несомненно, заслуживают, что во многом связано со
сложностью необходимого для их регистрации оборудования (спектрометр электроннопарамагнитного резонанса).
Существенно больше известны системы на основе DPPH- и АБТС-радикалов.
DPPH-радикал, растворенный в метаноле, взаимодействует с образцом
антиоксиданта (АН) по схеме:
DPPH* + AH → DPPH-H + A*
В результате восстановления радикала DPPH антиоксидантом его оптическая
плотность при 514 нм снижается, что контролируется обычными методами
спектрофотометрии. Авторы [9] применили оптотермический детектор поглощения, что
позволило увеличить чувствительность определений на два порядка и расширить в 16 раз
линейный диапазон измерений по сравнению с традиционными способами
спектрофотометрии.
Модельная система, основанная на измерении активности антиоксидантов по
отношению к катион-радикалу AБTС существует в нескольких модификациях. В
пероксидазном методе используется хромогенная система, включающую пероксидазу
хрена в качестве биокатализатора и Н2О2 в качестве окислителя. В псевдопероксидазном
варианте биохимическая система содержит в качестве катализатора метгемальбумин или
гемоглобин. Широко известный коммерчески доступный набор реактивов для
определения общей антиоксидантной активности фирмы Randox (Великобритания)
реализует метод, где в качестве псевдопероксидазы выступает метмиоглобин.
Восстанавливающим агентом во всех случаях является AБTС. Это соединение
характеризуется химической стабильностью, низкой токсичностью, хорошей
растворимостью в воде. Главным же его достоинством является способность окисляться в
ходе пероксидазной или псевдопероксидазной реакции с образованием метастабильного
катион-радикала, имеющего высокий коэффициент молярной экстинции на длинах волн,
отличных от спектральных характеристик самого AБTС. Считается, что в тест-системе на
первом этапе происходит окисление гемопротеида пероксидом водорода с образованием
феррильного радикала (ФМБ), в котором железо обладает степенью окисления +4, что
делает данное соединение очень реакционноспособным в отношении доноров электронов.
В ходе реакции между ФМБ и AБTС из последнего образуется окрашенный катионрадикал (AБTС+). По мере накопления катион-радикала реакционная смесь приобретает
характерную зеленовато-голубую окраску. Появлению характерного окрашивания
препятствуют содержащиеся в сыворотке крови ферментные и неферментные
антиоксиданты, которые, как предполагается, не влияют на образование ФМБ, но
восстанавливают AБTС + по мере его образования. Скорость процесса накопления
AБTС+ обратно пропорциональна активности и содержанию антиоксидантов в пробе.
Такие тест-системы нашли применение для определения антиоксидантной активности
биологических жидкостей, а также для характеристики антиокислительных свойств
фитопрепаратов, экстрактов растительного и животного происхождения, природных и
синтетических фармсубстанций, косметических средств, напитков, продуктов питания.
В Беларуси на базе ГНУ «Институт биоорганической химии Национальной
академии наук Беларуси» разработан набор реагентов для определения общей
антиоксидантной активности сыворотки крови. Принцип метода мало отличается от
используемого в Randox-TEAC. Метод адаптирован к отечественному аппаратноизмерительному комплексу и может применяться в любом учреждении системы
клинической лабораторной диагностики Беларуси вплоть до районных больниц.
При всех положительных характеристиках тест-система фирмы Randox и, как
следствие, ее отечественный аналог, обладают рядом недостатков, главным из которых
является возможность получения некорректных результатов за счет прямого
взаимодействия компонентов сыворотки крови с Н2О2 и/или ФМБ, а не с AБTС+. Кроме
того, стоит учитывать возможность перекрывания областей поглощения некоторых
компонентов сыворотки и AБTС+, необходимость использования специального
оборудования при автоматизации анализа, а также высокую стоимость набора.
Рисунок 1. Спектр поглощения AБTС•+ в отсутствие (верхняя кривая) и в присутствии
антиоксиданта (нижняя кривая)
С учетом этих факторов на базе разработанной тест-системы создана более
совершенная, принцип работы которой заключается в одноэтапной оценке степени
восстановления антиоксидантами предварительно сформированного метастабильного
радикала АБТС: для его постановки не требуется предварительно создавать
пероксидазную или псевдопероксидазную систему, а вместо 3-х реагентов используется
всего лишь один. Главным преимуществом используемого в этом наборе метода
обесцвечивания (decolorization assay) является присутствие в реакционной смеси только
одного окислителя, а именно катион-радикала АБТС. Проведение анализа осуществляется
по схеме: 1,98 мл реагента + 0,02 мл пробы (стандарта, дистиллированной воды) –
инкубация 3 минуты – замер оптической плотности. При взаимодействии антиоксидантов
с AБTС+ наблюдается уменьшение оптической плотности катион-радикала в диапазоне
длин волн 600-800 нм пропорционально концентрации и активности антиоксиданта
(рис.1). Получив значения оптической плотности бланка, стандарта и исследуемой пробы,
по формуле рассчитывается значение ТЕАС.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Литература
Cao G., Alessio H.M., Cutler R.G. (1993) Oxygen-radical absorbance capacity assay for
antioxidants. Free Radical Biology and Medicine, vol. 14, no 3, pp. 303–311
B., Hampsch-Woodill M., Prior R.L. (2001) Development and validation of an improved
oxygen radical absorbance capacity assay using fluorescein as the fluorescent probe.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 49, no 10, pp 4619–4626.
Nile S.H., Khobragade C.N., Park S.W. (2012) Optimized and comparative antioxidant
assays and its applications in herbal and synthetic drug analysis as an antioxidants. Mini
Reviews in Medicinal Chemistry, vol. 12, no 10, pp. 1007–1014.
Benzie I.F., Strain J.J. (1996) The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure
of “antioxidant power”: the FRAP assay. Analytical Biochemistry, vol. 239, no 1, pp. 70–
76.
Rozanova S.L., Rozanova E.D., Nardid O.A., Karpenko V.G. (2011) Antioxidant activity
of placenta extracts after low temperature and hypothermic storage. Problems of
cryobiology, vol. 21, no 3, pp. 291–300.
Yang B., Kotani A., Arai K., Kusu F. ( 2001) Estimation of the antioxidant activities of
flavonoids from their oxidation potentials. Analytical Sciences, vol. 17. pp. 599–604.
Psotova J., Zahalkova J., Hrbač J., Šimanek V., Bartek J. (2001) Determination of total
antioxidant capacity in plasma by cyclic voltammetry. Two case reports. Biomedical
Papers, vol. 145, no 2, pp. 81–83.
Stephanson C.J., Stephanson A.M., Flanagan G.P. (2002) Antioxidant capability and
efficacy of Mega-H silica hydride, an antioxidant dietary supplement, by in vitro cellular
analysis using photosensitization and fluorescence detection. Journal of Medicinal Food,
vol.5, pp. 9–16.
Buijnsters M., Bicanic D., Mihai Chirtoc M., Nicoli M.C., Min-Kuo Y. (2001) Evaluation
of Antioxidative Activity of Some Antioxidants by Means of a Combined Optothermal
Window and a DPPH* Free Radical Colorimetry. Analytical Sciences, vol. 17, pp.544–
546.