Автореферат разослан « » декабря 2011 г.
реклама
На правах рукописи ХУНОВА Лилия Заудиновна КАЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ РАННЕГО КАНЦЕРОГЕНЕЗА ШЕЙКИ МАТКИ (14.01.12 – онкология) www.rncrr.ru АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва - 2011 2 Работа выполнена в ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздравсоцразвития России (директор - член-корр. РАМН, профессор Солодкий В.А.) Научные руководители: член-корр. РАМН, профессор Ашрафян Левон Андреевич доктор медицинских наук, профессор Боженко Владимир Константинович Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Рожкова Надежда Ивановна доктор медицинских наук, Подистов Юрий Игоревич Ведущая организация: ФБГУ «Медицинский радиологический научный центр» Минздравсоцразвития России (249036, Калужская область, г. Обнинск, ул. Королева, 4) Защита состоится « 23 » января 2012 г в 13.00 часов, на заседании диссертационного совета Д 208.081.01при ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздравсоцразвития России (117997, Москва, ул. Профсоюзная, 86) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздравсоцразвития России (117997, Москва, ул. Профсоюзная, 86) Автореферат разослан « Ученый секретарь диссертационного совета, д.м.н., профессор » декабря 2011 г. З.С. Цаллагова 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Рак шейки матки (РШМ) в настоящее время в России является третьим по частоте злокачественным процессом женских половых органов и встречается с частотой примерно 12,2% на 100. тыс. населения (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2008). Значительным достижением в борьбе за снижение заболеваемости раком шейки матки явилась разработка и внедрение в практическое здравоохранение методов цитологического скрининга, в тоже время активно развиваются разработки молекулярно-биологических методов диагностики и скрининга РШМ. Одним из основных направлений вторичной профилактики рака шейки матки является своевременная диагностика и лечение предопухолевых состояний. Согласно международной классификации основной патологией, предшествующей раку шейки матки, является дисплазия или цервикальная интраэпителиальная неоплазия (CIN), которая подразделяется на 3 степени: легкая, средняя и тяжелая (или прединвазивная карцинома). Согласно эпидемиологическим данным, лишь 15% цервикальных интраэпителиальных неоплазий III степени (CIN III) прогрессирует в инвазивную карциному. При более легких вариантах цервикальных интраэпителиальных неоплазий этот процент еще ниже. Учитывая эти данные, вполне закономерной становится проблема разработки методов прогноза развития цервикальных интраэпителиальных неоплазий. В соответствии с современными представлениями начальные этапы канцерогенеза РШМ представляют собой каскад определенных молекулярно-генетических изменений. При этом изменяется функциональность таких основных клеточных процессов, как пролиферация клетки, апоптоз, межклеточное взаимодействие. Углубленный анализ этих изменений позволяетт расширить спектр методов уточняющей диагностики преодопухолевых 4 и опухолевых процессов шейки матки (Семиглазов В.Ф. и др., 2008). Возможность проспективного прогнозирования за последние годы показана при исследовании тканевых молекулярно-биологических маркеров для таких сложных событий, как рецидив опухоли в период до 10 лет. Ключевыми регуляторами апоптоза являются семейства белков BCL2, BAX,BAG. Белок, кодируемый геном BCL-2, является белкомсупрессором апоптоза. Выключение BCL-2 приводит к массивному р53 зависимому апоптозу. В настоящее время большое внимание уделяется оценке экспрессии мРНК BCL-2 в эпителии шейки матки как потенциального маркера значимых этапов в патогенезе цервикальных интраэпителиальных неоплазий (Koskimaa H.M. и др. 2010). Семейство генов BAG - группа мультифункциональных генов, взаимодеймтвующих с шаперонами (Hsp70) и ингибирующих их. Одна из функций BAG – связывание с BCL2, что приводит к подавлению апоптоза. Процесс пролиферации контролируется большим количеством генов. В тоже время найден ряд ключевых маркеров пролиферации, одним из таких универсальных маркеров пролиферации считается белок, кодируемый геном Ki-67. Он экспрессируется в течении всех фаз клеточного цикла делящейся клетки. В литературе отмечается, что цервикальные интраэпителиальные неоплазии характеризуются его повышенной экспрессией (Saha B. и др. 2007). Другой важный маркер пролиферации – ген CCNB1 (Циклин В), контролирующий прохождение клетками М-фазы клеточного цикла. Ряд исследователей обнаружили его гиперэкспрессию при раке шейки матки. Кроме того, ключевым фактором неограниченной пролиферации принято считать активацию в опухолевых клетках фермента теломеразы. Показано, что около 85% опухолей человека обладают теломеразной активностью, однако количественные закономерности экспрессии данного фермента при различных стадиях неоплазии изучены недостаточно. (Егоров Е.Е. 2001г., Griffith J.D. 1999г.). 5 Необходимо также сказать, что в подавляющем большинстве случаев, канцерогенез в шейке матки происходит на фоне вирусной инфекции. Наиболее часто встречается вирус папилломы человека (ВПЧ). В настоящее время принято считать, что продукты экспрессии вирусного генома – белки E7, E6 непосредственнo участвуют в канцерогенезе. Однако соотношение уровней экспрессии вирусных белков и белков – регуляторов пролиферации и апоптоза изучено недостаточно. В связи с выше сказанным нами были сформулированы следующие цель и задачи. Цель работы. Исследовать соотношение процессов пролиферации и апоптоза и сформировать спектр основных факторов, отражающих процессы начального канцерогенеза в клетках эпителия шейки матки. Задачи исследования: 1. Изучить уровень экспрессии белка Е7 при различных вариантах цервикальных интраэпителиальных неоплазий, инвазивном раке шейки матки и в группе контроля. 2. Изучить степень теломеразной активности при различных вари- антах цервикальных интраэпителиальных неоплазий, инвазивном раке шейки матки и в группе контроля. 3. Изучить уровень экспрессии молекулярных маркеров пролифера- ции (Ki67, CCNB1) и апаптоза (BCL2, BAX, BAG) при различных вариантах цервикальных интраэпителиальных неоплазий, инвазивном раке шейки матки и в группе контроля. 4. Определить молекулярно-биологические критерии раннего кан- церогенеза при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях. Научная новизна. Изучены варианты экспрессии онкобелка Е7. Определен уровень теломеразной активности при различных вариантах цервикальных интраэпителиальных неоплазий, инвазивном раке шейки матки. 6 Впервые проведен сравнительный анализ уровня экспрессии генов пролиферации (Ki67, CCNB1) и генов апаптоза (BCL2, BAX, BAG) при различных вариантах цервикальных интраэпителиальных неоплазий, инвазивном раке шейки матки. Впервые обнаружено отличие экспрессии основных молекулярных маркеров пролиферации и апоптоза в группах, содержащих и не содержащих вирус ВПЧ. Определены молекулярные критерии начальных этапов кацерогенеза РШМ. Практическая значимость. Обнаруженные в работе молекулярные маркеры раннего канцерогенеза могут быть положены в основу метода дифференциальной диагностики интраэпителиальных неоплазий. Полученные молекулярно-генетические данные могут войти в комплекс прогностических маркеров, отражающих возможные пути развития гиперпролиферативных заболеваний шейки матки, что позволит сформировать дифференцированный подход и лечение цервикальных интраэпителиальных неоплазий, широко используя консервативные методы терапии, и улучшить качество медицинской помощи при патологии шейки матки. Основные положения, выносимые на защиту. 1. Большинство наблюдений цервикальных интраэпителиальных неоплазий III ст. (cr in situ) и инвазивный рак шейки матки сопровождаются экспрессией онкобелка Е7 в сочетании с ВПЧ высокого онкологического риска. 2. Высокий уровень теломеразной активности выявляется при СIN III и ивазивном раке шейки матки. 3. При цервикальных интраэпителиальных неоплазиях увеличива- ется экспрессия генов, контролирующих пролиферацию и уменьшение экспрессии генов, контролирующих апоптоз. 7 4. Лечение цервикальных интраэпителиальных неоплазий в группе пациенток раннего репродуктивного возраста должно сопровождаться и опираться на результаты молекулярно-биологических методов Апробация работы. Основные результаты работы представлены и доложены на Всероссийском научном форуме «Радиология 2005», (Москва, Центр международной торговли 31мая-3 июня 2005г.) Российский Форум «Мать и дитя», «Современные технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний» ( Москва, 4-9 июня 2007г. ) Международный конгресс молодых ученых «Актуальные вопросы лучевой диагностики и онкологии» (ФГУ РНЦ РР Москва 2007г.), Международный конгресс молодых ученых «Актуальные вопросы лучевой диагностики и онкологии» (ФГУ РНЦ РР Москва 2008г.). 13th Biennial Meeting of the International Gynecologic Cancer Society which will be held in Prague, Czech Republic. 2010. Материалы диссертации доложены на VIII конгрессе «Человек и лекарство» 11-15 апреля 2011г. Апробация диссертации состоялась 18 июля 2011 года на научнопрактической конференции ФГУ «РНЦ РР» Минздравсоцразвития России. Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 3 статьи в журналах, рецензируемых ВАК. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 103 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов исследования, 2 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 290 источника, из них 84 отечественных и 116 зарубежных. Работа иллюстрирована 13 таблицами, 14 рисунками. 8 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Характеристика пациентов и методов исследования Исследование основано на клинико-морфологическом и молекулярно-биологическом обследовании 76 пациенток, из которых: 16 пациенток с гистологически подтвержденным плоскоклеточным раком шейки матки, средний возраст лет 41,1±9,6 лет, 40 пациенток с гистологически подтвержденным диагнозом цервикальной интраэпителиальной неоплазии различной степени (CIN 1, CIN2, CIN 3 (плоскоклеточный рак in situ)) средний возраст 37,5±10,5 лет, находившихся на лечении в ФГБУ РНЦРР в период с 20062010 год. Контрольную группу составили 20 женщин с морфологически неизмененным эпителием шейки матки, средний возраст составил 38±12,4. Диагностика цервикальной интраэпителиальной неоплазии и рака шейки матки основывалась на комплексном клиническом обследовании, результатах расширенной кольпоскопии (электроконизация шейки матки, аппарат «Сургитрон»), цитологического и гистологического исследования в соответствии с отраслевыми стандартами объемов обследования и лечения в гинекологии (Кулаков В.И. и соавт.,1999) и алгоритмами объемов диагностики и лечения злокачественных новообразований в онкологии (Сухих Г.Т., Солодкий В.А., Ашрафян Л.А., Рожкова Н.И. 2011). Критерием отбора больных являлся морфологически подтвержденный диагноз цервикальной интраэпителиальной неоплазии (CIN) и рака шейки матки. Стадирование эпителиальных дисплазий проводилась в соответствии с МКБ-X (1995), ГКО женского полового тракта ВОЗ (1995) и рака шейки матки в соответствии с классификацией TNM и FIGO (1997). Цитологическое исследование цервикальных мазков и гистологическое исследование биоптатов шейки матки и операционного материала (шейка матки, регионарные лиматические узлы) выполняли по стандартной методике цитологического (Меркулов Г. А., 1969; Лилли Р., 1969) и гистологиче- 9 ского (Хмельницкий О.К., 1994, 1999; Автандилов Г.Г., 2002; Семченко В.В., 2003) методов исследования. Детекция ВПЧ проводилась методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) по стандартной методике (К.Муллис 1983г.). Для оценки экспрессия мРНК генов Ki67, BAG ,ССNB1, BCL2 использован материал соскобов и биопсий шейки матки. Для ПЦР-исследований забор материала соскобов цервикального канала и поражений шейки матки осуществлялся одноразовыми зондами до проведения комплексного обследования и начала лечения заболеваний шейки матки в пробирки со средой для стабилизации РНК. Хранение материала до начала исследования осуществляли при -70°С. Для выделения нуклеиновых кислот использовали наборы “Проба НК” (ДНК-Технология, Россия). Реакцию обратной транскрипции ставили в объеме 40 мкл (в реакцию брали 33 мкл образца). Для обратной транскрипции использовались коммерческие реактивы (ДНК-Технология, Россия). Реакцию проводили при температуре 40º С в течение 30 мин, с последующей инактивацией обратной транскриптазы при 95ºС в течение 5 минут. Исследование количества к-ДНК проводили в режиме “реального времени” в объеме 35 мкл по следующей программе: 1 цикл - 80ºС 30 сек, 94ºС 1 мин 30 сек; 50 циклов - 94ºС 20 сек, 64ºС 20 сек; 10ºС - хранение 94ºС на приборе “ДТ-964”. ДНК-зонды, использовавшиеся для детекции продуктов амплификации исследуемых и референсных генов, были помечены FAM. Для повышения чувствительности и специфичности ПЦР был применен “горячий старт”, который обеспечивался использованием парафина. Измерение уровня флуоресценции проводили на каждом цикле при температуре 64ºС. Реакцию ставили в двух повторах для каждой точки. Нормировка проводилась по пяти референсным генам HPRT1, TBP, B2M, GUSB, ABL. Обработка результатов осуществлялась с помощью 10 программы EXСEL на основании данных, полученных с помощью прибора. Использован метод сравнения индикаторных циклов (метод Δ∆Cq). Статистическая обработка исследуемых переменных выявила, что распределение значений не может быть аппроксимировано нормальной функцией распределения, поэтому для оценки достоверности отличия средних значений в группах на равнее с критерием Стьюдента использовались непараметрические методы: ранговый тест Краскелла-Уолллиса , медианный тест. Данные обрабатывались при помощи пакета статистических программ «STATISTICA-6», разработанного фирмой Statsoft (USA). При этом соблюдались общие рекомендации для медицинских исследований. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Папилломавирусная инфекция и онкобелок Е7 у больных раком шейки матки. С целью определения наличия вирусов в зависимости от стадии заболевания (местной распространенности процесса) и детекции при этом онкобелка Е7. В таблице 1 представлены частоты обнаружения ВПЧ при различной патологии шейки матки. Табл. 1.Частота определения ВПЧ (абс. число/%) в образцах опухолевой и нормальной ткани шейки матки. Группа N ВПЧ-позитивные ВПЧ-негативные исследования образцы образцы CINI 17 13 (78,1%) 4 (21,9%) CINII 11 8 (69,7%) 3 (30,3%) CINIII (cr in situ) 12 10 (91%) 2 (9%) Инвазивный РШМ 16 13(83,8%) 3 (16,2%) Контрольная агуппа 20 9 (49%) 11 (51%) p<0,05 Известно около 100 видов ВПЧ. Мы определяли ВПЧ высокого и низкого риска. Этим объясняется факт достаточно широкого носительства этой инфекции в контрольной группе. Случаи выявления ВПЧ среднего и 11 низкого риска отмечались только в группе CIS – 3 случая (выявили 33 серотип) и в контрольной группе, где с наибольшей частотой обнаруживались вирусы 6 и 11 серотипов (6 наблюдений), а также по 1 наблюдению 33, 52, 83 серотипы. Мы уже упоминали о высокой распространенности ВПЧ в человеческой популяции. Это было отмечено многими исследователями. В большинстве случаев поражение носит транзиторный характер, и даже при дисплазиях различной степени тяжести в большинстве случаев регрессирует. Доказанным фактом является этиологическая связь папилломавирусной инфекции с возникновением злокачественных новообразований шейки матки. Само инфицирование вирусом, однако, не является достаточным условием для заболевания и не означает непременное его развитие. Дан- ные, представленные в таблице демонстрируют неуклонное увеличение количества инфицированных пациенток в зависимости от степени дисплазии и при инвазивном раке шейки матки. Следует также отметить, что при микроивазивном и инвазивном раке шейки матки в 100% вируспозитивных наблюдений мы зарегистрировали наличие ВПЧ высокого риска (16 и 18 серотипы). В то же время ВПЧ-позитивные образцы получены и в контрольной группе. Эти данные свидетельствуют о необходимости разработки дополнительных методов исследования, позволяющих точнее сформировать прогноз заболевания шейки матки и разработать на всех этапах лечебные и профилактические мероприятия. 2. Онкобелок Е7 при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях и инвазивном раке шейки матки. Актуальность изучения онкобелока Е7 обусловлена его трансформирующим эффектом на клетки эптелия шейки матки. В злокачественных опухолях вирусный геном персистирует в интегрированной форме, причем разрыв в вирусном геноме, который необходим для встраивания в клеточный, происходит в области генов Е1-Е2. Таким образом, в трансформированных клетках гены Е6 и Е7 остаются интактными. При этом интеграция ДНК ВПЧ 12 в геном клеток сопровождается двумя молекулярными событиями. Встраивание вирусной ДНК в хромосому всегда сопровождается нарушением структуры гена Е2, который является репрессором Е7. При интеграции ДНК-вируса синтез белка Е2 прекращается вследствие нарушения структуры соответствующего гена и активируется синтез белка Е7. Из этого следует, что наличие онкобелка Е7 в пробах из опухоли может рассматриваться как свидетельство вирус-интегрирования. Неоспоримым достоинством Е7 как маркера, является то, что в норме этот белок в тканях не синтезируется. Его происхождение полностью связано с жизненным циклом интегративной формы ВПЧ-инфекции. Таким образом, измерение уровня онкобелка Е7 позволяет уточнить характер вирусной инфекции, ее обратимость и потенциальную возможность злокачественной трансформации в случае интеграции ВПЧ в клеточный геном. В нашем исследование проведено определении онкобелка Е7 в группах больных CIN I-II, CIN III и инвазивном раке шейки матки. Данные представлены на рисунках 1-3. 5 ВПЧ+ Е7+ ВПЧ -Е7+ ВПЧ+ Е7- 5 16 ВПЧ- Е7- 2 Рис1. Частота выявления ВПЧ и белка Е7 у больных с цервикальными интраэпителиальными неоплазиями I-II ст. (n=28). 13 В группе больных CIN I-II у 16 пациенток из 28 (57 %) определялся как ВПЧ, так и онкобелок Е7. У 5 пациенток (17,9%) в пробах ткани шейки матки отсутствовал ВПЧ и не определялся онкобелок Е7. У таком же количестве исследований 5 (17%) при наличии ВПЧ, онкобелок не определялся. 1 1 ВПЧ+ Е7+ 1 ВПЧ -Е7+ ВПЧ+ Е7ВПЧ- Е7- 9 Рис2. Частота выявления ВПЧ и белка Е7 у больных с преинвазивным раком (CIS) (n=12). 2 ВПЧ+ Е7+ ВПЧ -Е7+ ВПЧ+ Е7- 4 9 ВПЧ- Е7- 1 Рис3. Частота выявления ВПЧ и белка Е7 у больных с инвазивным раком шейки матки (n=16). В группе больных СIN III –CIS одновременное обнаружение в пробах тканей ВПЧ и онкобелка Е7 констатировано у 9 (75%) больных. Остальные варианты распределения ВПЧ и Е7 определялись гораздо реже - в 1 пробе в каждой группе (8,3%). В целом, в группах обследованных больных позитивные результаты анализа на онкобелок Е7 распеределялись следующим образом – 64,3% в 14 группе пациенток с CIN I-II, 83,3% в группе CIN III и 62,5% в группе больных инвазивным РШМ. В контрольной группе из 9 случаев ВПЧ положительных образцов ни в одном случае не было выявлено наличие онкобелка Е7. (Табл. 2) Табл. 2. Частота определения окомаркера Е7 при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях и инвазивном раке шейки матки. Группа N Е7 -позитивные Е7 -негативные исследования образцы образцы CIN I-II 28 18 (64,3%) 10 (35,7%) CIN III (cr in situ) 12 10 (83,3) 2 (16,7%) Инвазивный РШМ 16 10 (62,5%) 6 (37,5%) Контрольная группа 9 9 (100%) p<0,05 В группе больных ивазивным раком шейки матки отмечено уменьшение числа наблюдений с позитивными анализами на ВПЧ и одновременным обнаружением онкобелка Е7 (56,3%), что свидетельствует о присоединении других механизмов злокачественной трансформации в ситуации обширного, прогрессирующего опухолевого процесса. Таким образом, установлено, что вариант ВПЧ+, Е7+ чаще всего встречается в группе CIN III-CIS (75%), Данное сочетание реже обнаруживается в группе больных с CIN I-II и инвазивным раком. Полученные результаты свидетельствуют о значительной роли онкобелка Е7, как маркера начальных этапов злокачественной неоплазии шейки матки. Несомненно, наибольший клинический интерес представляет выявление Е7 при сr in situ (CIN 3), а также CIN 1-2. 3. Экспрессия теломеразы при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях и инвазивном раке шейки матки. Теломераза (TERT) являет ферментом, который способен не только поддерживать размер теломерного повтора , но и синтезировать теломеры de novo. Его активация является необходимой для поддержания неограниченного деления клетки. Представляет интерес вопрос, на какой стадии канцерогенеза происходит включение этого механизма. В таблице 5 показан относи- 15 тельный уровень экспрессии мРНК гена TERT в ткани шейки матки в зависимости от различной степени неоплазии. Табл. 3. Значения уровня экспрессия TERT при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях и инвазивном раке шейки матки. Группа N Уровень р исследования экспрессии CIN I-II 40 0,42±1,16 Инвазивный РШМ 16 0,91±1,22 p3=0,109 p4=0,096 Контрольная группа 20 0,08±0,18 р¹=0,0558 р2=0,0146 р¹ - статистическая значимость различий по сравнению с группой CIN Ш, р2 - достоверность отличия в группах норма-рак, р3-достоверность отличия в группах CINII-рак, р4 - в группах CIN1-рак. Обнаруживается существенное, статистически достоверное (на уровне менее р<0,1) повышение уровня экспрессии теломеразы при CIN Ш и инвазивном РШМ по сравнению с контрольной группой. Интересно, что если CINIII объединить в одну группу с группой рака шейки матки, то достоверность отличия между объединенной группой и группой объединяющей CIN I+CINII повышается до 0,03 (при этом отличие между объединенной группой CINIII + рак и группой «норма» составляет 0,02). При этом достоверных отличий в уровне экспрессии мРНК гена TERT при CIN I-II не обнаружено. График средних (Результаты_03_03_11 31v*75c) 1,6 1,4 1,2 TERT 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 -0,2 норма CIN I CIN II CIN III рак Mean Mean±0,95*SE Диагноз Рис.4. Средние значения и стандартная ошибка изменений относительного количества мРНК теломеразы в эпителии шейки матки. 16 На рисунке 4 приводятся значения средней активности теломеразы при различных стадиях интраэпителиальной неоплазии. Приведенные результаты четко показывают, что критическое увеличение активности теломеразы в клетках эпителия шейки матки происходит только при переходе неопластического процесса в стадию CIN III и ее высокая активность сохраняется при раке. 1. Гены пролиферации и апоптоза при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях и раке шейки матки. В современной литературе большое значение уделяется разработке объективных молекулярно-генетических критериев прогнозирования течения заболеваний шейки матки. Особый интерес вызывает анализ изменений генов пролиферации, апоптоза и дифференцировки в цервикальных интраэпителиальных неоплазиях (CIN) и раке шейки матки. Мы исследовали экспрессию мРНК генов регулирующих апоптоз: Bcl2 и BAG – антиапоптотические, BAX- проапоптотический ген. В качестве генов, отражающих активность пролиферации были выбраны: ген Ki67 – который экспрессируется только в пролиферирующих клетках и ген циклина В1 – активирующийся только в SG2 фазах клеточного цикла и не экспрессирующийся в неделящихся клетках. Как видно из рис. 5-6 активность исследованных генов, контролирующих пролиферацию, возрастает в ряду «нормальная ткань эпителия шейки матки» -«группа CIN»-«рак». Отличия статистически достоверны. График средних (Резу льтаты_03_03_11 31v *75c) 0,9 0,8 0,7 Ki_67 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 норма CIN COD диагноз рак Mean Mean±0,95*SE 17 Рис.5 .Изменение количества мРНК гена Ki67 в ткани шейки матки. Анализ количества мРНК генов, контролирующих апотоз (гены BCL2, BAX, BAG) показал, что в отличии от генов Ki67 и циклина В1, активирующихся при процессах пролиферации, их активность снижается. График средних (Результаты_03_03_11 31v*75c) 1,4 1,2 CCNB1 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 норм а CIN рак Mean Mean±0,95*SE COD диагноз Рис.6 . Изменение относительного количества мРНК гена циклина В1 в ткани шейки матки. График средних (Результаты_03_03_11 31v*75c) 3,4 3,2 3,0 2,8 2,6 2,4 BCL2 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 норма CIN рак Mean Mean±0,95*SE COD диагноз Рис.7 . Изменение относительного количества мРНК гена BCL2 в ткани шейки матки График средних (Результаты_03_03_11 31v*75c) 2,0 1,8 1,6 BAG 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 норм а CIN COD диагноз рак Mean Mean±0,95*SE Рис.8 . Изменение относительного количества мРНК гена BAG в ткани шейки матки. 18 При этом достоверное снижение наблюдается в группе больных раком шейки матки (Рис. 8,9,10). Таким образом, сравнение этих групп генов, контролирующих пролиферацию и апоптоз, обнаружило обратную направленность изменений при развитии злокачественной трансформации. Интересно, что снижение уровня экспрессии наблюдается как для антиапоптотических генов (BCL2, BAG), так и для проапоптотического гена BAX. Анализ изменения уровня экспрессии генов пролиферации внутри группы CIN показал, что оно имеет аналогичный вид с изменением активности гена теломеразы (Рис.4), критическое увеличение происходит при переходе процесса неоплазии от CIN II к CIN III. График средних (Результаты_03_03_11 31v*75c) 4,0 3,5 3,0 BAX 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 норма CIN Mean Mean±0,95*SE рак COD диагноз Рис.9 . Изменение относительного количества мРНК гена BAX в ткани шейки матки. График средних (Резу льтаты_03_03_11 31v *75c) 1,4 1,2 CCNB1 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 норма CIN I CIN II CIN III рак Mean Mean±0,95*SE Д иагноз Рис.10 . Изменение относительно количества гена циклина В1 в ткани шейки матки. 19 Как видно из данных, приведенных на рис.10, наибольшие изменения активности гена циклина В1 происходят при переходе процесса трансформации от CINII в CINIII. Высокая экспрессия гена Ki67 и гена циклина В1 сохраняется в группе рака шейки матки. Интерес представляет возможность использования обнаруженных изменения для дифференцировки групп CIN II c группой CIN III и группы CIN III с группой рака шейки матки. С этой целью мы оценили достоверность отличия средних значений уровней экспрессии мРНК проанализированных генов. (Табл. 4-5). Табл. 4 . Сравнение достоверности отличия средних значений уровней экспрессии в группах РШМ –CINIII. Ген/группа Ki67 CCNB1 BAG BCL2 BAX РШМ 0,763242 1,114222 0,809870 1,396958 1,047137 CINIII 0,574298 0,973774 2,104724 2,070176 1,546418 t-value 1,31822 0,39433 -2,59340 -0,84022 -1,18205 Из значений, приведенных в табл.4 p 0,198927 0,696551 0,022283 0,408166 0,260080 N 16 16 10 16 10 N 12 12 5 13 4 видно, что только для проап- оптотического гена BAG наблюдается достоверные изменения для групп РШМ-CINIII. Табл. 5 . Сравнение достоверности отличия средних значений уровней экспрессии в группах CIN II – CIN III. Ген/группа Ki67 CCNB1 BAG BCL2 BAX CIN II 0,276297 0,391481 1,392006 2,402130 0,945415 CIN III 0,574298 0,973774 2,104724 2,070176 1,546418 t-value -2,31417 -1,83593 -1,06277 0,35243 -1,31735 p 0,031410 0,081281 0,318911 0,728025 0,235789 N 10 10 5 10 4 N 12 12 5 13 4 Сравнение достоверности отличий уровней экспрессии генов для групп CIN II и CIN III показывает, что уровни активности генов Ki67 и ССNB1 достоверно отличаются для этих групп. 20 Таким образом, анализ молекулярных процессов в клетках эпителия шейки матки показал, что на фоне вирусной инфекции и активации вирусного генома (экспрессия белка Е7) происходят закономерные изменения процессов пролиферации апоптоза. При этом, критические изменения уровня пролиферации наблюдаются при переходе стадии интраэпителиальной неоплазии с CINII к CIN III. Именно на этой стадии происходит активация теломеразы, обеспечивающая неограниченность деления клеток. Противоположная зависимость (снижение уровня экспрессии) обнаружена для генов, контролирующих апоптоз, однако определить стадию интраэпителиальной неоплазии, на которой происходят наиболее выраженные изменения уровня экспрессии генов, контролирующих апоптоз, выявить не удалось. Снижение их активности происходит постепенно – по мере увеличения степени неоплазии. ВЫВОДЫ 1. Экспрессия белка Е7 при скрининговом обследовании женщин является важным диагностическим критерием неблагоприятного прогноза развития интраэпителиалльных неоплазий шейки матки, требующим углубленной диагностики и мониторинга. Отсутствие экспрессии белка Е7 даже при морфологическом диагнозе СIN может быть критерием широкого использования консервативных методов лечения и наблюдения. 2. Активность теломеразы значительно увеличивается при диспла- зии шейки матки III степени и сохраняется высокой при инвазивном раке шейки матки. 3. Развитие цервикальных интраэпителиальных неоплазий сопро- вождается увеличением экспрессии генов (Ki67 (при CIN 0,47 в группе контроля 0,29), CCNB1 (при CIN 0,61 в группе контроля 0,29)), контролирующих пролиферацию и снижением активности генов (BCL2 (при CIN 1,97, в группе контроля 2,64), BAX и BAG (при CIN 1,59, в группе контроля 1,38), контролирующих апоптоз. 21 4. Определение уровня экспрессия генов циклина B, теломеразы, Ki67 может быть дополнительным диагностическим критерием для дифференциации степени интраэпителиальных неоплазий шейки матки. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Уровень теломеразной активности при CIN дает возможность дифференцировать терапевтическую тактику. Высокий уровень активности теломеразы, циклина В1 и Ki67 являются фактором неблагоприятного прогноза при предраке шейки матки и формируют более активные лечебные мероприятия. 2. Определение ВПЧ при CIN I-III ст. более целесообразно осу- ществлять в комплексе с изучением уровня онкобелка Е7, что позволит более целенаправленно проводить как противовирусную терапию, так и различные диагностические и лечебные воздействия. Во всех ситуациях при положительном анализе Е7 необходимо применение опережающих видов терапии. 3. Комплекс стандартных мероприятий при скрининге рака шейки матки в лечебно-профилактических учреждениях необходимо дополнить анализами на онкобелок Е7 и опредение уровня активности Теломеразы. Список опубликованных работ: 1. Хунова Л.З. Применение рентгеновской денситометрии при склеротическом лишае вульвы / Ашрафян Л.А., Бабаева Н.А., Ивашина С.В., Акопова Н.Б., Хунова Л.З. // Материалы Всероссийского научного форума «Радиология 2005», Москва, 2005.- С.21-23 2. Хунова Л.З. Определение уровня теломеразной активности как раннего маркера злокачественной трансформации эпителия шейки // Материалы научно-практической конференции «Актуальные вопросы лучевой диагностики и онкологии». - Москва, 2007.- С. 68-69. 3. Хунова Л.З. Молекулярно-биологические аспекты злокачественных трансформаций цервикальных интраэпителиальных неоплазий// Ашра- 22 фян Л.А., Антонова И.Б., Бударина С.О., Бабаева Н.А., Басова И.О., Хунова Л.З.//Материалы юбилейной конференции «Современные технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний», Москва, 2007. - С. 440442 4. Хунова Л.З. Теломераза как диагностический маркер цервикальных интраэптителиальных неоплазий и микроинвазивного рака шейки матки // Материалы научно-практической конеренции «Актуальные вопросы лучевой диагностики и онкологии».- Москва, 2008.- С. 21-23. 5. Хунова Л.З. Neoadjuvant chemotherapy in locally advanced cervical carcinoma IIB-IIIB stages /Аshrafyan L.A., Antonova I.B., Aleshikova O.I., Khunova L.Z., Slonov A.V. // 13th Biennial Meeting of the International Gynecologic Cancer Society which will be held in Prague, Czech Republic, 2010. A-2140001-01373 P. 305-307. 6. Хунова Л.З. Анализ экспрессии генов пролиферации и апоптоза при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях и раке шейки матки / Ашрафян Л.А, Боженко В.К.,.Антонова И.Б, Мельникова Н.В., Бурменская О.Н., Трофимов Д.Ю., Кудинова Е.А., Хунова Л.З., Слонов А.В., Близнюков О.П.// «Опухоли женской репродустивной системы». 2011. - №4. - С. 54-59. 7. Хунова Л.З Экспрессия генов пролиферации и апоптоза при цервикальной интраэпителиальной неоплазии и раке шейки матки./ Боженко В.К., Ашрафян Л.А., Антонова И.Б., Мельникова Н.В., Бурменская О.Н., Трофимов Д.Ю., Кудинова Е.А., Хунова Л.З.// Вестник Российского научного центра рентренорадиологии, 2011. (URL : http//vesynik.rncrr/vestnik /v3/v11.htm) 8. Хунова Л.З. Особенности экспрессии генов пролиферации и апоптоза, ассоциированные с вирусом папилломы человека при цервикальной интраэпителиальной неоплазии и раке шейки матки // Боженко В.К., Ашрафян Л.А., Антонова И.Б., Мельникова Н.В., Бурменская О.Н., 23 Трофимов Д.Ю, Кудинова Е.А., Хунова Л.З., Близнюков О.П. // «Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии». – 2011.№12. - С28-32 Список сокращений. РШМ - рак шейки матки ПЦР - полимеразная цепная реакция ВПЧ (HPV) - вирус папилломы человека CIN - цервикальная интраэпителиальная неоплазия TERP - теломераза CCNB1 - циклин В1 Р53 - транскрипционный фактор, регулирующий клеточный цикл Е7 - онкобелок вируса папилломы человека BCL2 - белок (маркер) пролиферативной активности BAG - белок (маркер) апоптозной активности BAX - белок (маркер) апоптозной активности Ki67 - белок (маркер) пролиферативной активности