Биотехнологические параметры разработки фагового препарата Bacillus subtilis пищевом сырье и продуктах питания
реклама
На правах рукописи Мустафин Али Хамзеевич Биотехнологические параметры разработки фагового препарата для индикации и идентификации бактерий Bacillus subtilis в пищевом сырье и продуктах питания 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.02.03 – микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов – 2012 2 Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Васильев Дмитрий Аркадьевич кандидат биологических наук, доцент Феоктистова Наталья Александровна Официальные оппоненты: Дыкман Лев Абрамович доктор биологических наук, старший научный сотрудник ФГБУН «Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН», ведущий научный сотрудник лаборатории иммунохимии Морозов Николай Васильевич доктор биологических наук, профессор ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (г. Казань) заведующий лабораторией биотехнологии с основами микробиологии Ведущая организация: ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Защита диссертации состоится «31» мая 2012 года в 1200 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» (410005, Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал). С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова». Автореферат диссертации разослан «27» апреля 2012 года. Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ученому секретарю диссертационного совета. Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Л.В. Карпунина 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБ ОТЫ Актуальность темы. Контаминация пищевого сырья и продуктов питания бактериями Bacillus subtilis на всех этапах технологического процесса – это серьезная проблема перерабатывающей промышленности. Эти почвенные сапрофиты встречаются повсеместно, отличаются высокой температурной устойчивостью, солетолерантны и способны продуцировать токсины (Крючков, 2006; Бахаровская, 2011). При контаминации бациллами пищевое сырье и выработанные из него продукты питания зачастую не изменяют свои органолептические свойства, поэтому определить их присутствие в пище невозможно до тех пор, пока у потребителя не появятся симптомы интоксикации (Мерчина, 2004; Калдыркаев, 2009). Пищевые токсикозы, вызванные бактериями B. subtilis, характеризуются острым течением болезни и могут вызвать летальный исход (Мирзоева 1957; Пучкова, 2005, Медведев, 2010). Учитывая сложность лабораторной диагностики, остается актуальной проблема унифицированной схемы бактериологического исследования, повышается значимость бактериофагов как высоко специфичного инструмента для индикации микроорганизмов, позволяющего точно идентифицировать пищевые контаминанты, а также осуществлять более детальную дифференциацию отдельных биотипов и фаговаров внутри вида. Возможность фагоидентификации вытекает из специфичности действия бактериофагов, которая может быть настолько выражена, что позволяет дифференцировать не только отдельные виды, но и серологически неотличимые штаммы в пределах одного вида (Ковалева, 2009; Шестаков, 2010). Поэтому все большее число исследователей предпочитают использовать фаговые тесты, как высокоспецифичный метод, способный дифференцировать близкородственные штаммы (Золотухин, 2007; Феоктистова, 2011). Типовые высокоспецифичные бактериофаги – это биоиндикаторы, благодаря которым можно проводить определение бактерий отдельных видов, иметь возможность установить источник и путь передачи инфекционного заболевания, т.е. провести его эпидемиологический анализ. Так в Канаде в промежуток с 1986 по 1993 было отобрано 146 изолятов Bacillus cereus, причастных к 18 вспышкам пищевого отравления. Из них 142 штамма было разделено на 17 типов фагов (Ahmed, 1995). В настоящий момент в Российской Федерации не разработаны методики фагоиндикации и фагоидентификации бактерий B. subtilis в объектах санитарного надзора. Использование подобных методик позволит в сжатые сроки типировать бактерии вида B. subtilis, используя минимальное количество расходных материалов и трудозатрат в течение 25 часов. Цель работы – разработать биотехнологические параметры изготовления фагового препарата для индикации и идентификации бактерий Bacillus subtilis в пищевом сырье и продуктах питания. Задачи работы: 1. Изучить распространение бактерий B. subtilis в пищевых продуктах. 2. Выделить бактериофаги, активные в отношении бактерий B.subtilis. 3. Селекционировать и изучить основные биологические свойства (морфологию негативных колоний, литическую активность и ее спектр, специфичность, 4 температурную устойчивость, устойчивость к хлороформу, изменение литической активности при хранении) выделенных бактериофагов. 4. Подобрать оптимальный набор выделенных фагов и сконструировать на их основе новый биопрепарат. 5. Разработать технологические параметры изготовления биопрепарата для фагодиагностики бактерий B. subtilis. 6. Разработать схему ускоренной индикации бактерий B. subtilis в объектах санитарного надзора методом реакции нарастания титра фага с использованием созданного биопрепарата. 7. Разработать схему идентификации бактерий B. subtilis с помощью бактериофагов. Научная новизна. Выделены из объектов санитарного надзора и изучены по заданным биологическим свойствам бактериофаги B. subtilis, из них отобраны наиболее оптимальные специфические бактериофаги Bs–13 УГСХА и Bs–16 УГСХА для создания биопрепарата. Разработаны биотехнологические параметры изготовления биопрепарата и усовершенствована схема фагоиндикации B. subtilis в объектах внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов c применением созданного биопрепарата. Усовершенствована схема выделения и идентификации бактерий вида B. subtilis в объектах санитарного надзора с помощью созданного фагового биопрепарата. Практическая значимость работы. Предложенная в диссертационной работе схема фагоидентификации и дифференциации позволяет выделять и типировать штаммы бактерий B. subtilis из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. Сконструирован диагностический биопрепарат на основе специфичных бактериофагов и усовершенствована схема индикации бактерий B. subtilis методом реакции нарастания титра фага (РНФ) в течение 25 часов. По материалам диссертационной работы разработаны и утверждены ректором УГСХА (от 10 февраля 2010 г.) «Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии фагов Bs–13 УГСХА и Bs–16 УГСХА для индикации и идентификации бактерий B. subtilis», «Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации бактерий B. subtilis в объектах санитарного надзора с применением специфичных бактериофагов», для сотрудников медико-биологических научных учреждений и специалистов бактериологических лабораторий. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций, на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту: 1. Схема выделения бактериофагов из объектов санитарного надзора применительно к бактериям B. subtilis, изучены биологические свойства выделенных и селекционированных фагов. 2. Биопрепарат, созданый из селекционированных фагов бактерий B. subtilis и технологические параметры его изготовления. 5 3. Схема идентификации бактерий B. subtilis разработана с применением биопрепарата на основе фагов Bs–13 УГСХА и Bs–16 УГСХА ускоряющая определение видовой принадлежности B. subtilis. 4. Схема ускоренной индикации бактерий B. subtilis в объектах санитарного надзора разработана с помощью реакции нарастания титра фага (РНФ) и использованием созданного биопрепарата. Апробация работы: Материалы диссертации представлены на: Международной научнопрактической конференции посвященной 65-летию УГСХА «Актуальные вопросы аграрной науки и образования» (Ульяновск, 2008); Всероссийской научнопрактической конференции «Вклад молодых ученых в отраслевую науку с учетом современных тенденций развития АПК» (Москва, 2009); Международной научно– практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути решения» (Ульяновск, 2009); III Международной научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь и наука ХХI века» (Ульяновск, 2010); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов прошлое, настоящее, будущее» (Москва, 2011); Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина XXI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2011). Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» Публикации По теме диссертации опубликовано 14 работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов, списка использованных литературных источников и приложений. Материалы диссертации изложены на 147 страницах, включают 33 таблиц и 7 рисунков. Список использованных литературных источников включает 157 наименования, в том числе 30 зарубежных. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект, материалы и методы исследований Объекты исследований: 40 штаммов бактерий Bacillus subtilis, из них 5 музейных штаммов из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской ГСХА; 5 музейных штаммов из лаборатории санитарной микробиологии ВНИИВСГиЭ; 30 штаммов выделены из проб пищевых продуктов и объектов санитарного надзора. Штаммы бактерий гетерологичных видов, родов и семейств: Morganella, Klebssiella, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas, Y.enterocolitica, B. cereus, B. mycoides, B. megaterium, B. mesentericus, B. thuringiensis полученных из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГОУ ВПО 6 «Ульяновская ГСХА». Штаммы бактериофагов – 22 изолята бактериофагов B. subtilis, выделенные из объектов санитарного надзора Ульяновской и Самарской областей. В качестве объектов использовали пищевые продукты, купленные на продовольственных рынках г. Ульяновска, г. Самары, г. Геленджика, г. Сочи и г. Сенгилея, комбикорм, пробы почвы и сточных вод. Методы: Для выделения бактерий B. subtilis использовали общепринятые схемы (Затула, 1973; Смирнов, 1982). Выделение и изучение биологических свойств бактериофагов проводили методами, предложенными М. Адамсом (1961), Д.М. Гольдфарбом (1961), Л.И. Адельсоном (1962), С. Лурия, Д. Дарнелом (1970), А.С. Тихоненко (1968), Т.Г. Чинашвили (1968), И.М. Габриловичем (1973), И.П. Ревенко (1978), В.Я. Ганюшкиным (1988). Селекцию бактериофагов и повышение их литической активности проводили по методике, описанной И.М. Габриловичем (1992), С.Н. Золотухиным (1994). Обнаружение бактерий B. subtilis в водопроводной воде, кормах и пищевых продуктах проводили с помощью реакции нарастания титра фага. Реакцию нарастания титра фага ставили по методикам В.Д. Тимакова и Д.М. Гольдфарба (1962), В.Я. Ганюшкина (1988). Статистическую обработку результатов исследований проводили общепринятыми статистическими методами (Бейли, 1962; Ашмарин, Васильев, Амбросимов, 1974; Урбах, 1975). Расчет результатов осуществляли с применением пакета прикладных программ Statistica 6.0. (for Windows; «Stat Soft Ins.», США), Microsoft Exsel 2003 (for Windows XP). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУ ЖДЕНИЕ Выделение бактерий B. subtilis из объектов санитарного надзора Первоочередной задачей наших исследований стало выделение бактерий B. subtilis из объектов санитарного надзора. В период с 2008 по 2010 год было исследовано на наличие бактерий B. subtilis 74 пробы пищевых продуктов, приобретенных в Ульяновской, Самарской областях и Краснодарском крае, уровень контоминации исследованых пищевых продуктов бактериями B. subtilis составил 41 %. В результате проведенных исследований было выделено 30 культур бактерий, которые мы классифицировали по ферментативным свойствам (на основании тестов, описанных в литературных источниках и результатах изучения биохимических свойств штаммов бактерий вида B. subtilis, полученных из музея кафедры МВЭ и ВСЭ УГСХА) и отнесли к B. subtilis (табл. 1). 7 Таблица 1– Выделенные культуры бактерий B. subtilis № п.п Номер культуры и присвоенное название Объект выделения культуры Место получения пробы 1 2 1. №1 – Bacillus subtilis 1 3 Перец черный 4 Прод. рынок г. Ульяновска 2. №2 – Bacillus subtilis 2 Мускатный орех Прод. рынок г. Ульяновска 3. №3 – Bacillus subtilis 3 Кориандр Прод. рынок г. Ульяновска 4. №4 – Bacillus subtilis 4 Смесь специй для плова Прод. рынок г. Ульяновска 5. №5 – Bacillus subtilis 5 Смесь специй для шашлыка Прод. рынок г. Ульяновска 6. №6 – Bacillus subtilis 6 Мука пшеничная Прод. рынок г. Ульяновска 7. №7 – Bacillus subtilis 7 Мука пшеничная 8. №8 – Bacillus subtilis 8 Молоко коровье Прод. рынок г. Сенгилей 9. №9 – Bacillus subtilis 9 Молоко коровье Прод. рынок г. Ульяновска 10. №10 – Bacillus subtilis 10 Молоко коровье Прод. рынок г. Самары 11. №11 – Bacillus subtilis 11 Мясной фарш Прод. рынок г. Ульяновска 12. №12 – Bacillus subtilis 12 Лавровый лист Прод. рынок г. Сочи 13. № 13 – Bacillus subtilis 13 Сухой чеснок Прод. рынок г. Геленджик 14. № 14 – Bacillus subtilis 14 Смесь специй для мяса Прод. рынок г. Ульяновска 15. №15 – Bacillus subtilis 15 Перец черный Прод. рынок г. Ульяновска 16. №16 – Bacillus subtilis 16 Мясо свинина Прод. рынок г. Самары 17. № 17 – Bacillus subtilis 17 Мясной фарш Прод. рынок г. Самары 18. № 18 – Bacillus subtilis 18 Молоко коровье Прод. рынок г. Самары Прод. рынок г. Самары 8 Продолжение таблицы 1 1 19. 2 №19 – Bacillus subtilis 19 3 Смесь специй для плова 4 Прод. рынок г. Геленджик 20. №20 – Bacillus subtilis 20 Лавровый лист 21. №21 – Bacillus subtilis 21 Мясо баранина 22. №22 – Bacillus subtilis 22 Мясной фарш 23. №23 – Bacillus subtilis 23 Мясо говядина 24. №24 – Bacillus subtilis 24 Мука пшеничная 25. №25 – Bacillus subtilis 25 Перец черный 26. №26 – Bacillus subtilis 26 Мука пшеничная 27. №27 – Bacillus subtilis 27 Корица 28. №28 – Bacillus subtilis 28 Молоко коровье 29. №29 – Bacillus subtilis 29 Молоко коровье 30. №30 – Bacillus subtilis 30 Сухой чеснок Прод. рынок г. Ульяновска Прод. рынок г. Самары Прод. рынок г. Ульяновска Прод. рынок г. Самары Прод. рынок г. Ульяновска Прод. рынок г. Ульяновска Прод. рынок г. Ульяновска Прод. рынок г. Самары Прод. рынок г. Ульяновска Прод. рынок г. Ульяновска Прод. рынок г. Сочи Все выделенные бактерии имели форму палочки размером 3 – 5 x 0,6 мкм, споры имели овальную форму не превышающие размер клетки. Грамположительные, подвижные, колонии сухие, мелкоморщинистые, бархатистые, в основном бесцветные. Положительно реагировали на глюкозу, сахарозу, сорбит, маннозу, арабинозу, маннит, с ферментацией сахара и образованием кислоты, газа. Поиск и селекция бактериофагов Следующим этапом работы было выделение фагов бактерий B. subtilis из имеющихся штаммов бактерий B. subtilis. Мы предполагали возможное наличие лизогенных культур, так как бактериофаги, выделенные из них, обладают более выраженной специфичностью (Жугова, 1985; Шестаков, 2010). В первой серии опытов использовали методику выделения бактериофагов бацилл без воздействия на них индуцирующего фактора. Во второй серии опытов на культуры, исследуемые как «лизогенные», воздействовали индуцирующим фактором (применялось воздействие на бактерии ультрафиолетовых лучей в течение 5-20 минут при помощи бактерицидной лампы, 80 % энергии которой приходится на длину волны 2537 Ǻ, на расстоянии 50 см между лампой и объектом). Полученный фильтрат исследовали на наличие фага на имеющихся культурах B. subtilis методом агаровых слоев. В наших исследованиях нам не удалось выделить фаги бактерий B. subtilis. Дальнейшая наша работа была посвящена выделению бактериофагов из 9 объектов внешней среды (Адамс, 1962; Адельсон, 1962). При исследовании 10 проб сточных вод, 32 проб почвы и 40 проб пищевых продуктов удалось выделить 22 изолята фагов бактерий B. subtilis. Для получения чистой линии фага проводили до десяти пассажей из изолированных негативных колоний (Габрилович, 1992, Золотухин,1994). Характеристика выделенных фагов бактерий B. subtilis Морфология негативных колоний. Морфологию негативных колоний изучали при посевах фагов методом агаровых слоев (Грациа, 1936). Негативные колонии, образуемые выделенными бактериофагами, были разделены нами на два типа. 1 тип: прозрачные негативные колонии округлой формы, 1,0 – 2,5 мм в диаметре; 2 тип: прозрачные негативные колонии округлой формы, 2,6 – 4,0 мм в диаметре. Спектр литического действия. Для изучения спектра литического действия селекционированных фагов использовали 35 штаммов бактерий B. subtilis, исследования проводили методом нанесения фага на газон бактериальной культуры (Ганюшкин, 1988). Наиболее широким спектром литической активности по отношению к изучаемым культурам обладают штаммы фагов Bs–13 УГСХА и Bs–16 УГСХА, которые лизировали 32 штамма B. subtilis из 35 изученных штаммов, что составляет 91,5 % (табл. 2) Литическая активность. Литическую активность выделенных бактериофагов определяли методом агаровых слоев (Грациа, 1936; Ревенко, 1978). Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что выделенные бактериофаги обладали различной литической активностью, показатели которой колебались от 1,7 х 106 до 8,0 х 109 корпускул в 1 мл фага (табл. 2). Наиболее высокой литической активностью обладали фаги Bs–13 УГСХА и Bs–16 УГСХА: титр по Грациа 2,8 х 109 и 8,0 х 109, соответственно. Для дальнейших исследований по конструированию биопрепарата было отобрано два фага Bs–13 УГСХА и Bs–16 УГСХА, которые обладали наиболее высокими титрами литической активности и широким спектром литического действия. Биопрепарат на основе бактериофагов должен быть высокоспецифичным, термоустойчивым, сохранять свою литическую активность при хранении в течение 12 месяцев. Таблица 2 – Характеристика выделенных фагов бактерий B. subtilis № Бактериальная культура B. subtilis / название фага Хар-ка негативных колонии, мм в диаметре 1 1. 2 Bacillus subtilis 61/ Bs – 1 УГСХА Bacillus subtilis 3/ Bs – 2 УГСХА Bacillus subtilis 3П/ Bs – 3 УГСХА 2. 3. Количество корпускул в 1 мл фага (Грациа, 1936) 3 2,6 – 3,0 Спектр литического действия на 35 штаммах,% 4 48,6 3,0 – 4,0 42,9 1,0 х 108 1,0 71,4 2,2 х 107 5 3,5 х 107 10 Продолжение таблицы 2 4 5 1. 2 3 4. Bacillus subtilis 98 / Bs – 4 УГСХА Bacillus subtilis 8 / Bs – 5 УГСХА Bacillus subtilis 21 / Bs – 6 УГСХА Bacillus subtilis 17 / Bs – 7 УГСХА Bacillus subtilis 5 / Bs – 8 УГСХА Bacillus subtilis 16 / Bs – 9 УГСХА Bacillus subtilis 32 / Bs – 10 УГСХА Bacillus subtilis 10 / Bs – 11 УГСХА Bacillus subtilis 12 / Bs – 12 УГСХА Bacillus subtilis 26 / Bs – 13 УГСХА Bacillus subtilis 23 / Bs – 14 УГСХА Bacillus subtilis 12 / Bs – 15 УГСХА Bacillus subtilis 4 / Bs – 16 УГСХА Bacillus subtilis 19 / Bs – 17 УГСХА Bacillus subtilis 4 / Bs – 18 УГСХА Bacillus subtilis 31 / Bs – 9 УГСХА Bacillus subtilis 25 / Bs – 20 УГСХА Bacillus subtilis 27 / Bs – 21 УГСХА Bacillus subtilis 14 / Bs – 22 УГСХА 1,0 – 1,5 51,4 2,4 х 108 0,5 – 1,0 37,1 2,0 х 107 1,0 – 1,3 34,2 6,0 х 108 1,0 – 1,5 20,0 4,0 х 107 1,0 – 1,5 28,6 1,7 х 106 1,0 22,9 2,4 х 107 1,0 – 1,5 25,7 3,0 х 108 2,6 – 3,0 31,4 1,0 х 108 1,0 – 1,5 34,3 4,0 х 107 6,0 – 8,0 80,0 2,8 х 109 1,0 22,9 2,4 х 108 1,5 28,6 4,0 х 107 2,6 – 3,0 88,6 8,0 х 109 1,5 17,1 1,5 х 107 1,0 – 1,5 54,3 5,1 х 108 1,0 – 1,5 37,2 3,0 х 107 3,0–3,5 20,0 1,2 х 107 2,6 – 3,0 51,4 2,0 х 107 2,0 – 2,5 28,6 3,4 х 108 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 11 Разработка технологических параметров изготовления и контроля биопрепарата Результаты определения оптимальных температурных показателей культивирования свидетельствуют о том, что оптимальной является температура культивирования биопрепарата на основе фагов − 37 ºC. Нами решено инкубировать систему специфических бактериофагов Bs – 13 УГСХА и Bs – 16 УГСХА с клетками B. subtilis при температуре 37 ºС. Установлено оптимальное соотношение бактериофага Bs – 13 УГСХА и культуры B. subtilis 26 – 1 : 5, т.е. 0,2 мл фагах 1 мл индикаторной культуры, оптимальное время пассажа при температуре 37 оС составляет 6 часов (параметры культивирования бактериофага Bs – 16 УГСХА с культурой B. subtilis 4 аналогичны). За это время происходил лизис индикаторной культуры (растворение характерной пленки на поверхности МПА по сравнению с контролем). Очистка фагов от бактериальных клеток осуществлялась нами методом фильтрации с использованием мембранных фильтров фирмы Millipore (filter type: 0,22 µm GV). Спектр литического действия биопрепарата Для изучения спектра литического действия биопрепарата на основе бактериофагов Bs – 13 УГСХА и Bs – 16 УГСХА мы использовали дополнительно 5 штаммов бактерий B. subtilis из музея ВНИИВСГиЭ. Результаты опыта представлены в таблице 2. Совокупный процент лизиса биопрепаратом на 40 штаммах бактерий B. subtilis составил 95,0 % (табл. 3). Таблица 3 – Спектр литического действия биопрепарата Название бактериофага Количество Из них Процент исследуемых чувствительны к лизируемых культур фагу культур Bs – 13 УГСХА 40 31 77,5 Bs – 16 УГСХА 40 34 85,0 Процент лизиса исследуемых культур бактериофагами 95,0 Bs – 13 УГСХА; Bs – 16 УГСХА Специфичность действия биопрепарата Изучение специфичности двух бактериофагов B. subtilis (Bs – 13 УГСХА, Bs – 16 УГСХА) проводили по отношению к представителям гетерологичных семейств и родов с использованием штаммов: spp. Morganella – 6 штаммов, spp. Klebssiella – 6 штаммов, spp. Salmonella – 6 штаммов, spp. Staphylococcus – 4 штамма, spp. Streptococcus – 2 штамма, spp. Pseudomonas – 4 штамма, Y.enterocolitica – 12 штаммов; и гомологичного рода: B. cereus – 25 штаммов, B. mycoides – 15 штаммов, B. megaterium – 14 штаммов, B. mesentericus – 18 штаммов, B. thuringiensis – 4 штамма. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что биопрепарат неактивен к представителям бактерий гетерологичных видов, родов и семейств. В рамках диссертационных исследований проведены исследования по изучению температурной 12 устойчивости биопрепарата и его устойчивости к воздействию хлороформа. Установлено, что бактериофаги B. subtilis (Bs – 13 УГСХА, Bs – 16 УГСХА) при воздействии температуры в диапазоне 64 – 76 0С не понижали своей литической активности. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о выраженной устойчивости биопрепарата к воздействию хлороформа. Разработка схемы ускоренной идентификации бактерий B. subtilis Прогревание в течение 45 минут при 70 0 С Среда Гаузе № 2, среда Громыко Подращивание в условиях термостата в течение 6 Выделение чистой культуры по методу Дригальского 18 часов 20 минут 0 часов при 37 С Посев на чашки с МПА газоном Фагоиденфикация сенной палочки при помощи бактериофагов С-13 и С16 серии УГСХА положительны й отрицательный бактерии вида B. subtilis I Итого: 25 часов Пересев на МПБ Среда Кларка, 1% глюкозный агар, картофельный агар, МПБ с мочевиной, мясо-пептонный желатин, МПБ с яичным желтком, МПБ с нитратами в анаэростате положительный 48 часов Подготовка исследуемого материала в соответствии с НТД 24 часа Подготовка исследуемого материала в соответствии с НТД 24 часа 6 часов Используя строгую специфичность биопрепарата, нами была разработана схема ускоренной идентификации бактерии B. subtilis по показателям лизиса культур на плотной питательной среде («метод стекающей капли»). Разработанная нами схема (рис. 1) позволяет идентифицировать бактерии B. subtilis за 48 часов (2 суток). Срок бактериологического исследования по традиционной схеме выделения и дифференциации бацилл первой морфологической группы (Gordon, 1973), составил 96 часов (4 суток) при больших затратах посуды и реактивов. I II отрицательный бактерии вида B. subtilis II Итого: 96 часа (4 суток) Рис. 1. Схема ускоренной идентификации бактерий B. subtilis с помощью селекционированных нами бактериофагов (I) в сравнении со схемой выделения и дифференциации бацилл первой морфологической группы (II) 13 Изменение литической активности при хранении Для разработки технологических параметров изготовления биопрепатара из фагов Bs – 13 УГСХА и Bs – 16 УГСХА необходимо было установить изменение литической активности указанных штаммов при хранении в условиях 2 – 4 0С. Полученные результаты свидетельствуют о том, что селекционированные бактериофаги B. subtilis при хранении в условиях 2 – 4 0С в течение 12 месяцев незначительно снижали литическую активность до 10 8 фаговых корпускул в 1 см3 . Определение параметров постановки реакции нарастания титра фага с биопрепаратом на основе фагов B. subtilis Определение параметров постановки реакции нарастания титра и разработку количественного показателя реакции, имеющего диагностическое значение, проводили по методике, предложенной В.Д. Тимаковым и Д.М. Гольдфарбом (1962). Проведены эксперименты с использованием МПБ, контаминированного 18 часовыми индикаторными культурами B. subtilis 26 (для фага Bs – 13 УГСХА) и B. subtilis 4 (для фага Bs – 16 УГСХА) от 101 до 105 м.к./мл. В качестве контроля был использован интактный МПБ. Учет результатов проводили через 18 часов инкубирования, согласно оценке, предложенной В.Я. Ганюшкиным (1988). Установлено, что количество фаговых частиц более чем в 5 раз превышает количество фаговых частиц в контрольных пробах при контаминации бактериями B. subtilis МПБ в концентрации 102 м.к./мл. Для определения оптимального времени, обеспечивающего наиболее полное взаимодействие фага с бактериями необходимо было провести эксперименты на тест-объекте по выявлению наиболее эффективного временного показателя взаимодействия фага и индикаторной культуры при сохранении остальных параметров (температурный режим, концентрация бактериальной культуры и фаговых корпускул в 1 мл) постановки РНФ. В качестве тест – объекта использовали МПБ, контаминированный бактериями B. subtilis. Полученные экспериментальные данные позволяют считать наиболее оптимальным временной режим реакции нарастания титра фага (РНФ) при 6 часовой экспозиции исследуемого материала с фагом без дополнительного подращивания, когда удается провести индикацию бактерий бактерии B. subtilis в количестве 102 м.к. в миллилитре исследуемого субстрата. На исследование затрачивается 25 часов (0,5 часа – подготовка реакции + 6 часов – время экспозиции субстрата с фагом + 0,5 часа – постановка реакции + 18 часов – время термостатирования). Увеличение времени инкубирования до 10 – 24 часов не повышает чувствительность метода. Схема постановки РНФ с применением биопрепарата (рис. 2). Реакция считается положительной, если количество негативных колоний, образовавшихся на чашке Петри №1 превышает количество негативных колоний, образовавшихся на чашке Петри №3 в 5 и более раз (Ганюшкин, 1988) Исследуемый материал 9,0мл 9,0мл Пробирка №1 6 ч 37 ºС 0,25мл Пробирка с 4,5 мл МПБ ч\з мембранный фильтр 1,0 мл Пробирка с 2,5мл 0,7% МПА + 0,2мл индикаторной культуры чашка Петри №1 1,5% МПА 18 ч 37 ºС 14 Биопрепарат 1,0мл 1,0мл Пробирка №2 6 ч 37 ºС 0,25мл МПБ 1,0мл 9,0мл Пробирка №3 6 ч 37 ºС 0,25мл Пробирка с 4,5 мл МПБ ч\з мембранный фильтр 1,0 мл Пробирка с 4,5 мл МПБ ч\з мембранный фильтр 1,0 мл Пробирка с 2,5мл 0,7% МПА + 0,2мл индикаторной культуры Пробирка с 2,5мл 0,7% МПА + 0,2мл индикаторной культуры чашка Петри №2 1,5% МПА 18 ч 37 ºС чашка Петри №3 1,5% МПА 18ч 37 ºС Рис. 2. Cхема постановки реакции нарастания титра фага с использованием биопрепарата Разработка схемы постановки реакции нарастания титра при помощи селекционированных бактериофагов с образцами объектов санитарного надзора Пробы образцов объектов санитарного надзора (водопроводная вода, комбикорм, специи, мясо) в объеме 10 г (мл) вносили в колбы и контаминировали штаммами B. subtilis 26 и B. subtilis 4 в концентрации 101 – 105 м.к./мл, заливали МПБ из расчета 10 мл бульона на 1 г (мл) пробы. Пробы мяса (кусочки свинины) растирали в фарфоровой ступке. Для контроля использовали колбы с пробами, неконтаминированными бактериями B. subtilis 26 и B. subtilis 4 (рис. 2). По результатам проведенных опытов установлено, что увеличение титра фагов Bs–13 и Bs–16 серии УГСХА в 5 раз произошло при концентрации 102 м.к. бактерий B. subtilis в 1 мл водопроводной воды и 103 м.к. бактерий B. subtilis – в 1 г комбикорма, специй и мяса. 15 Для оценки эффективности реакции нарастания титра фага в условиях производства нами были проведены исследования по фагоиндикации бактерий B. subtilis в пробах молока. Обнаружение проводили бактериологическим методом и с помощью РНФ. При исследовании 11 проб молока бактериологическим методом бактерии вида B. subtilis выделялись в концентрации 104 – 105 м.к./мл, а в РНФ – 103 м.к./мл Результаты исследований свидетельствуют о более высокой чувствительности РНФ при обнаружении бактерий B. subtilis в пробах молока в сравнении с бактериологическим методом исследования при меньшей затрате времени (96 часов), реактивов и посуды. Выводы 1. Обнаружено 30 культур бактерий вида B. subtilis при исследовании 74 проб объектов санитарного надзора. Уровень контаминации исследуемых пищевых продуктов бактериям B. subtilis составил 41 %. 2. Выделено из объектов внешней среды 22 изолята фагов, активных по отношению к бактериям B. subtilis, и изучены биологические свойства их изолятов (морфология негативных колоний, спектр литического действия, литическая активность). 3. Изучены биологические свойства бактериофагов и выбраны два штамма фагов Bs – 13 УГСХА и Bs – 16 УГСХА, которые имели титр 2,8 х 109 – 8,0 х 109 по Грациа, обладали выраженной специфичностью к штаммам бактерий B. subtilis, не лизироваликультуры представителей родов Morganella, Klebssiella, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas, вида Yersinia enterocolitica; и гомологичного рода: Bacillus cereus, Bacillus mycoides, Bacillus megaterium, Bacillus mesentericus, Bacillus thuringiensis, сохраняли литическую активность в пределах 108 – 109 в течении 12 месяцев при хранении в условиях 2 – 4 0С, были термостабильными и хлороформоустойчивыми. 4. Установлено что оптимальными технологическими показателями для изготовления специфического биопрепарата на основе фагов Bs – 13 УГСХА и Bs – 16 УГСХА с высокой литической активностью являются: соотношение количества фаговых корпускул к количеству бактериальных клеток индикаторного штамма 1 : 5, оптимальное время инкубирования при температуре 37 ºС – 6 часов. 5. Разработаны биотехнологические параметры изготовления фагового препарата для фагодиагностики бактерий B. subtilis. 6. Разработана схема ускоренной индикации бактерий B. subtilis с помощью реакции нарастания титра фага в объектах санитарного надзора с использованием биопрепарата на основе фагов Bs – 13 УГСХА и Bs – 16 УГСХА, которая позволяет обнаружить их за 25 часов. 7. Разработана схема идентификации бактерий B. subtilis с помощью сконструированного фагового препарата, позволяющая идентифицировать их в два раза быстрее (48 часов), в отличие от бактериального метода. 16 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Мустафин А.Х., Феоктистова Н.А. Методика выделения Bacillus subtilis // Актуальные вопросы аграрной науки и образования: материалы международной научно – практической конференции посвященной 65 – летию УГСХА. Ульяновск, 2008. Ч.IV. С. 100–102. 2. Мустафин А.Х., Феоктистова Н.А. Контаминация бактериями вида Bacillus subtilis пищевых продуктов // Актуальные вопросы аграрной науки и образования: материалы междунар. науч. практ. конф. посвященной 65-летию УГСХА. Ульяновск, 2008. Ч.IV. С. 102–104. 3. Воздействие теотропина на бактерии видов Bacillus сereus и Bacillus subtilis / А.Х. Мустафин, Н.А. Феоктистова, Н.Х. Курьянова [и др.] // Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути решения: материалы междунар. науч. практ. конф. Ульяновск, 2009. Т.4. С. 55–57. 4. Мустафин А.Х., Феоктистова Н.А., Васильев Д.А. Роль Bacillus subtilis в обсеменении пищевых продуктов // Вклад молодых ученых в отраслевую науку с учетом современных тенденций развития АПК: материалы всероссийской науч. практ. конф. Москва, 2009. Т.2. С. 70–72. 5. Изучение биологических свойств выделенных фагов бактерий вида Bacillus subtilis / А.Х. Мустафин, Н.А. Феоктистова, Д.А. Васильев [и др.] // Молодежь и наука ХХI века: материалы междунар. науч. практ. конф. молодых ученых. Ульяновск, 2010. Т.3. С. 65–70. 6. Выделение бактерий вида Bacillus subtilis из объектов санитарного надзора / А.Х. Мустафин, Н.А. Феоктистова, Д.А. Васильев [и др.] // Молодежь и наука ХХI века: материалы междунар. науч. практ. конф. молодых ученых. Ульяновск, 2010. Т.3. С. 72–76. 7. Поиск фагов бактерий вида Bacillus subtilis / А.Х. Мустафин, Н.А. Феоктистова, Д.А. Васильев [и др.] // Молодежь и наука ХХI века: материалы междунар. науч. практ. конф. молодых ученых. Ульяновск, 2010. Т.3. С. 76–78. 8. Разработка фаговых препаратов индикации и идентификации бактерий рода Bacillus в пищевом сырье и продуктах питания / А.Х. Мустафин, Н.А. Феоктистова, Д.А. Васильев [и др.] // Биологически активные вещества микроорганизмов прошлое, настоящее, будущее: материалы всероссийского симпозиума с международным участием: посвященного 90 – летию Заслуженного профессора Московского университета Н.С. Егорова. Москва, 2011. С. 86–87. 9. Анализ изменений литической активности фагов бактерий видов Bacillus сereus и Bacillus subtilis при хранении / А.Х. Мустафин, Н.А. Феоктистова, М.А. Юдина [и др.] // Ветеринарная медицина ХХI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения: материалы международной науч. практ. конф. Ульяновск 2011. Т.1. С. 188–189. 10. Изменение чувствительности бактерий рода Bacillus subtilis к различным концентрациям хлорида натрия / А.Х. Мустафин, Н.А. Феоктистова, А.И. Калдыркаев [и др.] // Ветеринарная медицина ХХI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения: материалы международной науч. практ. конф. Ульяновск, 2011. Т.1. С. 185–186. 11. Характеристика биологических свойств бактериофагов вида Bacillus subtilis / А.Х. Мустафин, Н.А. Феоктистова, Д.А. Васильев [и др.] // Вестник 17 Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. 2011. №1 (13). С. 79. 12. Методика выделения фагов бактерий вида Bacillus сereus и Bacillus subtilis, перспективы их применения / А.Х. Мустафин, Н.А. Феоктистова, Д.А. Васильев [и др.] // Естественные и технические науки. 2011. №2 (52). С. 83–84. 13. Диагностика картофельной болезни хлеба, вызываемой бактериями видов Bacillus subtilis и Bacillus mesentericus / А.Х. Мустафин, Н.А. Феоктистова, Д.А. Васильев [и др.] // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. 2011. №1 (13). C. 61–67. 14. Мустафин А.Х., Феоктистова Н.А., Калдыркаев А.И. Разработка схемы исследования материала с целью выделения и ускоренной идентификации бактерий видов Bacillus cereus и Bacillus subtilis // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. 2011. №4 (32). С. 288–291.
