Штамм Bacillus subtilis 12 В

Штамм Bacillus subtilis 12 В.
Штамм Bacillus subtilis 12 В-ДЕП выделен из компоста в Уфимском
районе (Башкирия). Принадлежит к спорообразующим аэробным бактериям
рода Bacillus.
Штамм депонирован 7.10.1999 г во Всероссийской государственной
коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и
животноводстве, под номером Bacillus subtilis 12В-ДЕП. Местом хранения
штамма определена коллекция микроорганизмов отдела пробиотиков и
биологически активных препаратов (ВГНКИ ветпрепаратов).
БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ШТАММА
Бактерии представляют собой грам-положительные спорообразующие
палочки. Не растут в анаэробных условиях, гидролизуют мочевину и
крахмал, разжижают желатину. Дают положительную реакцию ФогесПроскауэра. Сбраживают лактозу, глюкозу, сахарозу, маннит, мальтозу,
слабо ферментирует сорбит, галактозу, арабинозу, рафинозу, не
ферментирует дульцит. Бактерии не патогенны, характеризуются высокой
антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных
и условно-патогенных микроорганизмов и устойчивостью к целому ряду
антибиотиков.
БЕЗОПАСНОСТЬ ШТАММА
Культура штамма B. subtilis 12 В проверена на
(вирулентность, токсичность и токсигенность).
безвредность
Для исследования вирулентности штамм выращивали на мясопептонном агаре в течение 24 часов при температуре 37 С. Выросшую
биомассу смывали 0,9 %-ным раствором натрия хлорида и готовили
бактериальные суспензии с концентрацией клеток от 0,5 до 5,0 млрд/ на 1
гол. Полученные суспензии вводили белым беспородным мышам массой
(161) г двумя способами: однократно внутрибрюшинно и пятикратно
перорально (по одной дозе ежедневно в течение 5 дней).
Исследование показало, что все животные остались живыми и
набирали вес быстрее, чем животные контрольной группы.
С целью
более полного изучения безопасности штамма при
пероральном введении, были испытаны высокие дозы штамма при разовом
пероральном введении мышам. Установлено, что разовое введение per os
высоких доз штамма - (10-20)х109 кл/на 1 гол не приводит к снижению веса
животных даже на первые сутки после введения, а в последующие дни вес
животных увеличивается.
Для исследования токсичности штамм выращивали на мясопептонном
агаре в течение 24 часов при 37 С, смывали 0,9 %-ным раствором хлорида
натрия, готовили суспензию, содержащие от 1,0 до 5,0 млрд клеток в 1 мл,
которые затем инактивировали прогреванием при 100 С в течение 1 часа.
Суспензии вводили способами, описанными при изучении вирулентности.
Для изучения токсигенности штамм выращивали в течение 10 суток
на мясо-пептонном бульоне при температуре 37 С. По истечении срока
культуральную жидкость центрифугировали при 8000 об/мин в течение 30
мин.
Для
введения мышам использовали надосадочную жидкость.
Контролем служила группа мышей,
получавших стерильный
мясопептонный бульон.
Наблюдения за животными проводили на протяжении 5 суток после
окончания курса инъекций или перорального введения. В этот период все
животные оставались активными, хорошо поедали пищевые рационы,
прибавляли в весе, физиологические отправления и поведенческие реакции у
них не изменялись. Полученные данные свидетельствуют о безопасности
штамма.
АНТАГОНИСТИЧЕСКАЯ
АКТИВНОСТЬ
ШТАММА
В
ОТНОШЕНИИ
ПАТОГЕННЫХ
И
УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ
БАКТЕРИЙ.
Для определения специфической активности штамма исследовали
антагонистическую активность в отношении тест культур патогенных
микроорганизмов, вызывающих заболевания животных. Исследование
осуществляли методом отсроченного антагонизма. Для этого культуру
штамма высевали петлей в центре чашки Петри с агаризованной средой
Гаузе N2. Посевы инкубировали в термостате при 37 С в течение 72 часов.
Затем к выросшей культуре подсевали штрихом тест-микроорганизмы (500миллионные суспензии суточных культур в физиологическом растворе).
Учет результатов проводили через 18 ч инкубирования при 37 С по величине
зон отсутствия роста тест-культур. Контролем роста тест-культур служило
параллельное выращивание их на чашках с агаризованной средой Гаузе N2
без культуры исследуемого штамма. Полученные данные результатов
испытания представлены в таблице 1.
Таблица 1.
Спектр антагонистической активности штамма Bacillus
subtilis 12B с разным содержанием живых бактериальных клеток
Тест –культуры
Зоны задержки роста (мм) тестовых штаммов,
мм
1х108 кл/мл
5х108
2
3
1
1х109
4
5х109
5
10х109
6
Shigella sonne 2586
12-15
12-15
15-20
15-20
18-20
Shigella HK
20-25
20-25
25-30
25-30
28-30
Proteus mirabilis 40
15-20
15-20
20-25
20-25
25-27
P. mirabilis 36
15-18
15-18
15-20
15-20
18-20
P. mirabilis 35
15-20
15-20
20-25
20-25
22-25
Proteus vulgaris 12
10-12
10-12
15-18
15-20
17-20
1
2
3
4
5
6
P. vulgaris 48
12-15
12-15
15-20
15-20
17-20
P. vulgaris 41
10-12
10-12
15-20
15-20
18-22
Pseudomonas aeruginosa 126
15-20
15-20
15-20
15-20
15-20
P. aeruginosa 8
12-15
12-15
15-20
15-20
15-22
Escherihia coli 154
12-15
12-15
15-20
15-20
18-25
E. coli 140
12-15
12-15
15-20
15-20
15-20
Streptococcus 321
10-15
10-15
15-18
15-18
15-18
Streptococcus 325
12-15
12-15
15-20
18-20
18-20
Streptococcus 191
10-12
10-12
15-20
15-20
15-20
Staphylococcus aureus 66
15-16
15-16
15-18
20-25
20-22
St. aureus 67
8-10
8-10
10-15
10-15
12-15
St. aureus 80
12-15
12-15
15-20
15-20
17-20
Paratyhv 269
12-15
12-15
18-20
18-20
17-20
Paratyhv 15
15-20
15-20
20-25
20-25
22-25
Hexaere II 1230
22-25
22-25
25-30
25-30
28-30
Как следует из данных таблицы культура штамма Bacillus subtilis 12B
характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении
широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов,
вызывающих инфекционные заболевания у животных.
ИЗУЧЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ШТАММА BACILLUS
SUBTILIS 12B К АНТИБИОТИКАМ.
Широкий спектр антагонистической активности позволяет рекомендовать
пробиотики на основе штамма Bacillus subtilis 12B вместо антибиотиков для
вытеснения патогенной микрофлоры, особенно при острых кишечных
инфекциях.
В отличии от готовых антибиотиков, к споровым пробиотикам не
возникает привыкания и не вырабатывается устойчивости у болезнетворных
микроорганизмов, поскольку бациллы продуцируют не отдельные
антибиотики, а «семейства» пептидных антибиотиков сходных по базовой
структуре, но отличающихся по концевым группировкам. Антибиотическое
действие их оказывается разнообразным, а формирование устойчивых
вариантов микроорганизмов замедленным (Филин В.А. и др., 1998).
Преимущество химически-синтезированных антибиотиков в
скорости терапевтического эффекта, антибиотики действуют быстрее.
Поэтому в острый период заболевания, как правило, ветеринары не могут
отказаться от антибиотиков и в первые 1-2 дня назначают одновременно и
антибиотики и пробиотики на основе сенной палочки, но сокращают срок
дачи антибиотика до 1-2-3 дней, в зависимости от состояния. При
невозможности
использовать
антибиотики
(непереносимости
или
неэффективности имеющихся антибиотиков) можно использовать только
пробиотик, но повысить дозу в 5-10 раз в первые 3 дня лечения, поскольку
пробиотики, как правило, безвредны.
Поскольку в некоторых случаях лечения инфекционных
заболеваний необходимо одновременное назначение антибиотика и
пробиотика проведено изучение чувствительности штамма Bacillus
subtilis 12B к антибиотикам.
Определение чувствительности штамма к антибиотикам изучали дискодиффузионным методом, используя стандартне диски, пропитанные
антибиотиками. Штамм высевали на агаризованную питательную среду и
раскладывали диски с антибиотиками, по 5 на чашку Петри. Посевы
инкубировали при 37 50 0С в течение 24 ч. Чувствительность культур к
антибиотикам выражали в мм диаметра зон задержки роста. Резистентными
считали штаммы, зоны задержки роста которых составили - (0-5) мм;
малочувствительными (6-10) мм чувствительными - (11-20) мм;
высокочувствительными – более 22 мм. Результаты исследования
представлены в таблице 2.
Из данных таблицы следует, что штамм B. subtilis 12B обладает
широкой устойчивостью к антибиотикам, в том числе : линкомицину,
тетрациклину, мономицину, полимиксину, оксациллину, стрептомицину,
ампицилину, бензилпенициллину.
№
Антибиотики
эритромицин
олеандомицин
карбенициллин
линкомицин
левомицитин
тетрациклин
мономицин
полимиксин
оксациллин
ампициллин
гептомицин
неомицин
цепарин
канамицин
Таблица 2
Зона задержки роста, мм
8-10
10-12
18-20
6-8
20-22
6-9
8-10
0
0
0
10-15
6-8
15-20
10-15
новограмон
20-25
5-НОК
20-25
бисенгиол
10-15
тобрамицин
0
клафоран
15-20
бензилпенициллин
0
рифампицин
8-10
гентамицин
8-10
стрептомицин
0
ристомицин
8-10
доксициклин
10-12
Препарат-пробиотик на основе штамма Bacillus subtilis 12B можно
назначать одновременно с антибиотиками к действию которых он проявляет
устойчивость, без существенного снижения активности препарата.